Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976

Summary

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1998, yangın ve Mello çift zincirli RNA (dsRNA) Caenorhabditis elegans 1 gen işlevinin engellenmesi uyarabilir bildirmiştir. DsRNA ile tetiklenen Bu yanıt bir RNA interferans (RNAi) olarak adlandırılmıştır, ve RNAi aracılı gen susturma hayvan, bitki ve mantar 2-7 korunmuş olduğu bildirilmiştir. Bitkiler ve bazı hayvanlarda, RNAi fonksiyonları sistemik, yani etkisi (8-10 gözden) dsRNA doğrudan tanıtıldı değil diğer hücre / dokulara yayılabilir. Bilim adamları, böylece doğrudan (11-14 gözden) genomu manipüle etmeden gen fonksiyonu aşağı vurma, ilgi genleri hedef dsRNAs tasarlayarak bu endojen hücresel RNAi tepkisinin kullanımı yaptık.

RNAi aşağıdaki avantajları nedeniyle fonksiyonel çalışmalar için güçlü bir araçtır. İlk olarak, daha az gen sekansı bilgileri ile bir gen RNAi kullanılarak hedeflenebilir. Bu st için özellikle önemlidirgenomik veya transkriptomik verileri eksik olmayan model organizmaların udies. İkinci olarak, RNAi yanıtı sağlam sistemik organizmalarda, RNAi aracılı gen yok etme hemen hemen herhangi bir gelişme aşamasında gerçekleştirilebilir. Bu özellik, pleitropik genlerin işlevini çalışmak için çok yararlıdır. Üçüncü olarak, bazı durumlarda, RNAi etkileri fenotipleri yavrular 15,16 görülmektedir, öyle ki gonadlar ve soyu, yayıldı. Tek bir enjekte ebeveyn tarafından üretilen çok sayıda yavru yumurta doğrudan manipülasyonu olmadan muayene edilebilir ebeveyn RNAi (pRNAi) olarak bilinen bu fenomen, embriyonik gelişmeyi etkileyen genler için özellikle avantajlıdır. Bu nedenlerden dolayı, pRNAi tercih edilen bir yöntemdir. pRNAi etkisiz, ancak oogenez için gerekli olan genlerin, örneğin, daha sonra embriyonik RNAi (eRNAi) kullanılmalıdır. Dördüncü olarak, RNAi mutlaka kusurlar zayıf üretilmesi için dsRNA miktarı aralığında değişebilir teslim edilen bir alelik dizi eşdeğer oluşturmak için kullanılabilir. fenotipleri Böyle bir derece geni ölümcül bir kompleks süreci ve / veya fonksiyon tam kaybı söz konusu olduğunda gen fonksiyonu anlamak için yararlı olabilir. Beşinci olarak, dsRNA teslim özellikle sağlam sistemik RNAi yanıtları gösteren hayvanlarda genellikle kolay ve mümkündür. dsRNA mikroenjeksiyon 1,5, beslenme / yutma 17,18, ıslatma, 19,20 ve virüs / bakteri aracılı teslim 21,22 sokulabilir. Altıncı, bazı gen hedefleme / düzenleme yöntemlerin aksine, mutasyonu taşıyan organizmalar için ekrana veya RNAi kullanırken homozigotlarını üretmek için genetik haçlar yürütmek için gerek yoktur. Bu nedenle, gen fonksiyonu incelemek için pek çok teknikler ile karşılaştırıldığında, RNAi ucuz, hızlı ve büyük ölçekli ekranlar 23-25 için uygulanabilir.

RNAi geniş bir kullanım Beyon çalışma için uygun türlerin yelpazesini genişleterek, organizmaların geniş bir fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir araç sağlarGenetik araçlar geliştirilmiştir olan geleneksel model sistemler d. Örneğin, sigara modeli sistemleri kullanılarak çalışmalar farklı gelişim modları temsil veya farklı morfolojik özellikler 26-29 sergileyen türlerden ortologlarda işlevlerini karşılaştırarak genler ve gen ağlarının evrimi anlayışlar vermek zorundadırlar. Bu tür çalışmalar uygulamalı ve temel hem de araştırma için etkileri olan, biyolojik çeşitliliğin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Gezegendeki en büyük hayvan grubunda olmak, böcekler mekanizmaları altta yatan çeşitliliğini keşfetmek için büyük bir fırsat sağlamaktadır. Ayrıca, böcekler, genellikle küçük, kısa yaşam döngüleri, yüksek doğurganlığını var ve laboratuarda arka kolaydır. Son yirmi yılda, RNAi başarıyla Diptera (gerçek sinekler) 5, Lepidoptera (Kelebekler) 30 olmak üzere, emirleri kapsayan böceklerde tatbik edilmiştir, Coleoptera (böcekleri) 16,31, Hymenoptera (sawfyalan, Arı, karınca ve arılar) 32, Hemiptera (gerçek böcek), Isoptera (termitler) 34, Blattodea (hamamböceği) 35, Orthoptera (cırcır, çekirge, çekirgeler ve çekirgeler) 36 ve Phthıraptera (bitler) 37. RNAi başarılı bir uygulama, ekdison 42 sinyalizasyon, erken embriyogenez desenleme çalışmaları için fonksiyonel verileri (ön-arka eksen 32, dorsal-ventral eksen 28, segmentasyon 26,38), cinsiyet tayini 39,40, kitin / manikür biyosentezini 41 sağladı sosyal davranış 43, ve daha fazlası. Farklı böcek türleri için geliştirilmiş RNAi yöntemler de (44-46 gözden) haşere kontrolü için yararlı olması muhtemeldir ki ek bir fayda olabilir. RNAi etkileri olmayan korunmuş bölgeler hedefleme için seçilen sürece, gene özel ve türe özgü olacaktır. yaşaması için hayati genleri hedef bal arıları ve ipek böceği gibi yararlı böcek türlerinin, içinenfeksiyon kontrol etmek için virüs veya parazitler bu türlerin 47,48 korumak için yeni bir strateji sağlayabilir.

Dermestes maculatus (D. maculatus), ortak adı gizlemek böceği, Antarktika hariç tüm dünyada dağıtılır. Bir holometabolous böcek gibi, D. maculatus yaşam döngüsü embriyonik larva, pupa ve erginleri (Şekil 1) içerir. O eti beslenir, çünkü D. maculatus ölü hayvanları iskeletini için müzelerde kullanılan ve adli entomologlar ölüm 49,50 zamanını tahmin etmek için kullanabilirsiniz. D. maculatus gövdeleriçin, kurutulmuş et, peynir ve pupa / diğer böceklerin koza de dahil olmak üzere hayvansal ürünlerde beslenir ve böylece hane zarar, depolanmış gıda ve ipek, peynir ve et endüstrileri 51,52 neden olur. Bu böceği de RNAi uygulayarak ekonomik etkisini en aza indirmek için etkin ve çevre dostu bir şekilde sağlayabilir. Bizim laboratuvar, yeni bir m olarak D. maculatus kullandıodel böcek segmentasyonu 53 incelemek için. O kısa ve uzun mikrop gelişimi arasındaki geçişi incelemek için kullanışlı bir tür yapma, bir ara-germ geliştiricisi olarak laboratuvar yetiştirme mükellef olmasının yanı sıra, D. maculatus temel araştırmalar için ilgi çekicidir.

Şekil 1
Şekil 1: D. maculatus Yaşam Döngüsü. Belirtildiği gibi farklı yaşam evrelerinde D. maculatus Fotoğraf,. yetişkine yumurtadan ömrü daha düşük sıcaklıklarda, üç ila 30 ° C 'de hafta ama daha uzun sürer. (A, K) Yeni bırakılmış embriyolar yaklaşık olarak boyuna 1.5 mm, açık sarı ve oval beyazdır. Embriyo ~ 30 ° C 'de 55 saat sürer. (B, C ve G) Larva koyu pigmentli çizgili ve kıl ile kaplıdır. Larva 1 üzerinde cm'ye kadar uzatabilirsiniz çevre ve uzunluklarına bağlı olarak birkaç instars geçmesi. (D, H) (E, ben), koyu pigmentasyon yetişkin böceği vücut üzerinde görünür. Yetişkin birkaç ay kadar yaşayabilir ve bir kadın yaşamı boyunca embriyo yüzlerce düzenleyebilirsiniz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Daha önce, RNAi D. maculatus 53 gen fonksiyonunu aşağı vurma etkili olduğunu göstermiştir. İşte laboratuvarda D. maculatus kolonileri yetiştirme deneyim embriyonik ve ebeveyn hem RNAi set-up, enjeksiyon, enjeksiyon sonrası bakım ve fenotipik analizi için adım-adım protokolleri ile birlikte paylaşılır. Burada tanıtılan dsRNA aracılı gen demonte ve analiz yöntemleri D. maculatus soruları ele almak için ayrıntılı bilgi sağlar, fakat aynı zamanda fo potansiyel öneme sahip değilr olmayan diğer modeli böceği / böcek türlerinde RNAi uygulamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

D. maculatus 1. Yetiştirme

NOT: D. maculatus bir üreme kolonisi yetişkinler kullanan yazarların laboratuarında kurmak ve larva ticari satın alındı. Türler kimlik DNA barkodu 53 kullanılarak doğrulanmıştır.

  1. Laboratuvarda yeni bir kafes kurmak için, bir orta boy böcek kafes (30.5 x 19 x 20.3 cm 3) içine talaş ince bir tabaka yayıldı. Pupa devresi için larva gizlemek izin kafes içinde strafor bir ~ 10 x 6 x 3 cm 3 yığın yerleştirin. 50 böcekleri (yetişkin veya geç dönem larva ya) - 20 ekleyin. Böcekleri talaş içinde gizler.
  2. Petri kabı veya bir tartı tekne ıslak kedi maması ekleyin. örgü bezle kafes örtün ve bir kuluçka kafesine yerleştirin.
  3. Laboratuvarda bir üreme kolonisi korumak için, 25 ve 30 ° C arasında sıcaklığını ayarlamak. D. maculatus hızlı yüksek sıcaklıklarda büyür, ama bu da mantar ve parazitlerinin büyümesini destekler. Bir iyileşmek sağlamak içinhızla koloni genişletilmesi için düzenli stok bakım ve 30 ° C 28 ° C - senin koloni, 25 kullanın. Yaşam döngüsü çevresel faktörlerin 50 (Şekil 2) bağlı dört ay yaklaşık üç hafta sürer.

şekil 2
Şekil 2: D. maculatus Lab Colony. Tipik bir D. maculatus böcek kafes Fotoğraf gösterilir. Ahşap talaşı böcekleri gizlemek izin yayılır. Kedi maması küçük bir Petri çanağı veya tartım kabı ilave edilir. Strafor pupa son evre larvaları için bir sığınak olarak kafes yerleştirilir. Burada gösterilen kafes 30.5 x 19 x 20,3 cm 3 ve birkaç yüz larva, pupa ve yetişkin ev sahipliği yapmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. otlakolgun kafeste yumurta ettik. , Koloni genişletmek yukarıdaki gibi, larva veya yetişkin (Bölüm 2 açıklandığı gibi toplanan) yumurta ile yeni kafeslerin kurmak. D. maculatus özellikle gıda kaynağına yakın, kafes boyunca yumurtalarını.
  2. haftada iki kez hakkında ıslak kedi maması değiştirin.
    NOT: Islak kedi maması nahoş koku, alternatif gıda kaynakları da test edildi dolayı (Tartışma).

2. Embriyo Koleksiyon

  1. Bir koleksiyon kurmak için, en az 50 erkek ve koloniden 50 kadın ayırın. Genç yetişkinler en iyisidir. Talaş olmadan küçük boyutlu kafes (17.8 x 10.2 x 12.7 cm 3) yerleştirin yetişkinler. Bir tartı tekne kedi maması ekleyin.
  2. toplama başlamadan önce, mevcut herhangi bir embriyolar için dikkatli kafes kontrol edin ve bunları kaldırın. kafesin içine bir gergin pamuk koyun ve 30 ° C inkübatör kafesi bırakın. Uygun zaman penceresi sonra, pamuk embriyo toplama için hazır olacak.
  3. Katyarısında siyah inşaat kağıt (A4 boyutunda) bir parça bir kırışık oluşturabilir ve sonra açılmak.
  4. kafes uzanan pamuk çıkarın. pamuk gelen yetişkin çıkarın ve kafes içine geri koyun.
  5. çok yavaşça gergin pamuk sıkarken, yumurta, siyah kağıda düşürdüm ince pamuklu iplikler halinde ayrı yavaşça gözyaşı.
    NOT: D. maculatus embriyolar pamuk görmek kırılgan ve sert. Çok sıkı bir pamuk topu tutan eğer kolayca ezilebilir.

3. dsRNA Hazırlık

  1. DsRNA Sentezi için DNA şablonu hazırlama
    1. 4 başlat - her ikisi de 5 de T7 hızlandırıcı sekanslar ihtiva eden primerler kullanılarak 6 50 ul PCR reaksiyonları 'üreticinin protokolüne uygun olarak, DNA şablonu amplifiye edilmesi için sona erer.
    2. imalatçının talimatları izlenerek bir ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. DNA örneğinin ideal nihai konsantrasyonu ≥ olduğunu100 ng / ml.
  2. Enjeksiyon Tampon hazırlanması
    1. Enjeksiyon tamponu 100 ml hazırlama (0.1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM KCI). 5 M NaOH ile 6.8'e pH ayarlayın.
    2. -20 ° C'de saklayın alikotları.
  3. dsRNA sentezi
    1. ~ Reaksiyon başına 500 ng şablon kullanılarak, buz üzerinde 0.2 mi PCR tüpü içinde reaksiyonu başlatacak ve imalatçının talimatları izlenerek, T7 polimeraz, bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu yürütmek.
    2. gece boyunca 37 ° C'de tüp inkübe edin.
    3. üreticinin talimatlarına aşağıdaki DNaz DNA şablonu, sindirmek.
    4. 94 ° C'ye kadar tüp ısı ve 3 dakika boyunca 94 ° C'de tutun.
    5. Bu 1 saat sonra 45 ° C'ye ulaşana kadar dsRNA tavlanması için yavaşça 1 ° C / dk, boruyu soğutulur.
      NOT: 3.3.5 ile 3.3.2 PCR yapılabilir adımlar.
    6. dsRNA çökelti etanol, 280 ulReaksiyonun RNaz içermeyen su için 20 ul 300 ul bir son hacme kadar ayarlayın. 3 M NaOAc (pH 5.2) ve etanol içinde 650 | il 30 ul ekle. bir gecede -20 ° C derin dondurucuda tüp yerleştirin.
    7. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15.682 x g'de santrifüj işleminden geçirilmesinden sonra,% 70 etanol ile dsRNA pelet yıkayın. Kuru pelet ve enjeksiyon tampon ul 20 içinde çözülür.
    8. 260 bir spektrofotometre kullanılarak dsRNA'nın konsantrasyonu ölçümü. 5 ug / ul - İdeal konsantrasyon 3'tür. 30 dakika süre ile 90 V bir% 1 agaroz jeli üzerinde dsRNA 1:25 seyreltme 5 ul çalıştırarak kalitesini kontrol edin. beklenen boyutta tek bir bant kolaylıkla görülebilir.
    9. -20 ° C veya altında dsRNA saklayın.
      NOT: Her RNAi demonte deney için, çalışılan süreci etkilemesi beklenmektedir olmaz bir denetim dsRNA içerir. GFP dsRNA çoğu deneyler için mükemmel bir kontroldür. Hazırlayın ve experime kontrol dsRNA yan yana enjektental dsRNA'nın.

Mikropüskürtücü ve Mikromanipülatör 4. Montaj

NOT: Şekil 3 bakınız.

  1. pnömatik pompa aracının basınç girişine azot veya diğer hava kaynağını bağlayın. pnömatik pompa mevcut değilse, ince boru bağlı bir 50 ml şırınga ile basınç uygulanır.
  2. çıkarma basınç akışını kontrol etmek için pompanın uzaktan konnektörüne bir ayak anahtarı bağlayın.
  3. tüp ile pompanın çıkarma basınç portuna bir cam kılcal tutucu takın.
  4. Bir mikroskop yakın bir mikromanipülatör kılcal tutucu sabitleyin.

5. Embriyonik RNAi

Not: Şekil 4, D. maculatus embriyonik RNAi bir akış şemasını göstermektedir.

  1. eRNAi hazırlanması
    1. Petri kabı kapağı (90 mm çapında) toplama bir embriyo hazırlayın. c siyah filtre bir parça kağıt yerleştirinKapağın iç bitti. siyah kağıt üzerinde standart bir mikroskop lamı koyun.
    2. Enjeksiyon tamponu ile uygun bir konsantrasyona kadar dsRNA seyreltilir. İlk deneyler için 3 ug / ul - 2 kullanın. Her zaman enjeksiyondan önce buz üzerinde dsRNA tutun.
    3. iyice karıştırın dsRNA ve pipet yavaşça birkaç kez 01:40 seyreltme gıda boyası ekleyin.
  2. Enjeksiyon için toplanıyor Embriyolar
    NOT: 25 ° C'de, embriyoların 6 çekirdekleri - 8 saat Yumurta Döşeme sonra (AEL) 53 çevre yumurtaya doğru göç ederler. 10 saat AEL 53 - Bir hücresel blastoderm 8 içinde kurulmuştur. 3 saat AEL embriyolar kullanım 53 için önerilen - sağlamak için hücresel blastoderm aşamasında önce embriyolar 0, enjeksiyon için kullanılır. cam kapilerleri iyi durumda olup olmadığını Embriyo toplama, hazırlama ve enjeksiyon genellikle az 2 saat sürebilir. Bu nedenle, tüm süreç 5 saat AEL içinde tamamlanabilir.
    1. adımlarda açıklandığı gibi embriyolar toplayın 2.2-2.5.
    2. Petri kabı kapağı toplama içine embriyo transferine siyah inşaat kağıt dokunun.
    3. slayt kenarı boyunca çift taraflı bant yapıştırın.
    4. Bir boya fırçası kullanarak, kenarında anterior ve posterior ucu ile slayt kenarına dik kasete embriyolar hizalayın. ortalama yarım ideal arka sonunda enjekte edilecektir böylece üzerinde, erken embriyo anterior ve posterior uçları kolayca ayırt olmadığını unutmayın.
  3. Kılcal cam içine dsRNA yükleniyor
    1. 20 ul Microloader pipet içine dsRNA 4 ul - 2 alın.
    2. önceden çekilmiş cam boru içine ucu takın (iğne olarak da adlandırılır) ve yavaşça kapiller dsRNA solüsyonu pipetle. Mikropipet çektirmenin kullanarak ticari cam kılcal damarlardan iğneler hazırlayın. İdeal çekilmiş iğnenin bir örneği Şekil 5'te gösterilmektedir. uzunluğu ve iğne konik af optimize edilmesi gerekebilirter enjeksiyon denemeleri.
    3. kılcal cam tutucu içine cam kapiller sabitleyin.
    4. mikromanipülatör içine kılcal tutucu monte edin.
  4. Embriyolar içine dsRNA enjekte
    1. Dikkatle diseksiyon mikroskobu sahneye embriyolar ile slayt aktarın.
    2. alan ve odak mikroskop merkezine bir embriyo getirmek için slayt taşıyın.
    3. mikroskop içine bakarken mikromanipülatör ile kılcal ucu yerleştirin. satırdaki ilk embriyonun sonuna yakın ucu getir.
    4. azot ya da diğer hava beslemesini açın.
    5. vakum selenoid giriş seçme anahtarını ayarlayın.
    6. 15 psi - 10 çıkarma basınç regülatörü ayarlayın. aparat bağlı basıncını ayarlayın.
    7. Gerekirse kılcal açın. ucu açık olduğunda, renkli dsRNA çözüm ucu dolduracaktır.
    8. e delinme ileri kılcal ucu Taşımbryo. Basınç ayarı idealdir ise, hiçbir embriyonik sıvı kılcal akacaktır.
    9. çözümün uygun bir miktar çıkarılana dek embriyo içine dsRNA çözüm çıkarmak için ayak anahtarı Adım. Çözümün uygun ve uygun olmayan miktarlarda enjekte edildikten sonra Şekil 5 embriyo morfolojisi örneklerini gösterir.
    10. ~ 2 saniye embriyo içinde kılcal ucu tutun ve sonra çıkarın.
    11. Bir sonraki embriyonun kılcal hareket ettirin ve tekrar 5.4.8 adımları - tüm embriyolar enjekte kadar 5.4.10. Tıkanmış veya sonları alırsa cam kapiller değiştirin.
  5. Enjeksiyon sonrası kurtarma ve Kuluçka
    1. Enjeksiyondan sonra, bir Petri kabındaki slayt yerleştirin.
    2. Petri kabı ıslak pamuk ekleyin. pamuk slayt dokunmasına izin vermeyin.
    3. Petri kabı Kapak ve filmi sızdırmazlık ile sarın. Enjekte dsRNA, konsantrasyon, tarih, saat, sayısı ve adı ile çanak Etiketembriyolar.
    4. Embriyoların yumurtadan kadar 30 ° C inkübatör Petri kabı yerleştirin.

6. Ebeveyn RNAi

  1. PRNAi için Pupalar Ayırma
    1. koloniden pupa toplayın.
    2. Sıralama erkek ve mikroskop altında dişi pupa (Şekil 6). Resim birleşme enjeksiyondan önce cereyan etmesini sağlamak üzere 30 ° C kuluçka makinesi içinde, iki ayrı bir Petri tabaklarına tutun.
    3. eclosed yetişkinler için her gün kontrol edin. 30 ° C 'de 7 gün - pupa devresi, genellikle 5 alır.
    4. Aktarım eclosed erkek ve kadın iki ayrı Petri kapları (Şekil 6) ve enjeksiyon için hazır olana kadar her gün onları kedi maması yem.
    5. Yeterince kadın ve uygun yaşta erkek var bir kez enjeksiyon geçin. post-eclosion Dişiler 4 ila 8 gün en iyisidir. Tipik bir analiz için 8-12 kadın kullanılmaktadır. Erkeklerin eşit sayıda 54 çiftleşme için gereklidir.
    Kadın Karın içine dsRNA enjekte
    1. buz (5.1.2 ve 5.1.3) üzerinde dsRNA hazırlayın.
    2. 10 ul şırıngaya 32 gauge iğne takın.
    3. CO 2 sahnede kadın Anesteziyoloji.
    4. herhangi bir hava almadan enjektöre dsRNA çözüm yükleyin.
    5. Bir yandan bir kadın ventral tarafı yukarı tutun ve diğer şırınga tutun.
    6. Yavaşça iğne ucu ile sternites 2 ve 3 arasında segmacoria (membran) nüfuz eder. Şekil 7, enjeksiyon sırasında bir dişi göstermektedir. İğne kolaylıkla dokuya nüfuz etmezse, açı iğne yukarı ve yavaş yavaş aşağı doğru bastırın. vücuda iğne yaklaşık 2 mm yerleştirin.
    7. yavaş yavaş dişi başına ~ 2 ul enjekte dalgıç iterken şırınga ölçeğini kontrol edin.
    8. enjekte ettikten sonra, dişinin karın çıkarmadan önce en az 5 saniye boyunca hareketsiz iğne tutun.
    9. (Petri kabı enjekte kadın aktarın90 mm çap) ve kedi maması ile beslenirler.
    10. dsRNA adı, enjekte edilen miktarın, tarih ve dişilerin sayısı ile Petri kabı etiketleyin.
  2. Enjeksiyon sonrası kurtarma ve Çiftleşme
    1. 30 ° C inkübatör Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır.
    2. 24 saat sonra, transfer mini kafese kadın enjekte edilmiştir.
    3. Kafesin uninjected genç erkeklerin eşit sayıda ekleyin ve kafesi etiketleyin.
    4. kafesin içine kedi maması ile tartı tekne ekleyin.
    5. birleşmesine olanak tanımak için 30 ° C kuluçka makinesi içinde kafes bırakın. 24 saat sonra, dişiler yumurtalarını bırakmak için başlamalı ve embriyolar günlük veya gerekli zaman aralıklarında alınabilir.

7. Fenotipik Analizi sonra RNAi

NOT: yumurta 50 yumurtadan 30 ° C'de, o ~ 55 saat sürer.

  1. eRNAi Canlılık Analizi
    1. toplam nu için yumurtadan larva sayısını karşılaştırarak ambar oranını hesaplamakenjekte edilen embriyoların mber. embriyolar zarar veya enjeksiyon prosedürü tarafından öldürülen edilebilir bir negatif kontrol enjeksiyonu dahil emin olun. % 60 - Tipik ambar oranları% 30 arasında değişmektedir. çıkmamış yumurta yeme yumurtadan larva sakının.
  2. pRNAi Canlılık Analizi
    NOT: kadın canlılığı RNAi tarafından hedeflenen gen tarafından etkilenirse, dişiler belirli dsRNA enjekte değil negatif kontrol dsRNA ölmeye başlayacak. yumurta üretimi veya yumurtlama etkilenirse, dişiler kısmi veya tam kısırlığa sergileyecek. negatif kontrollere kıyasla kadın yaşamını Puan ya da deney ve kontrol kadın (7.2.3) tarafından atılmıştır yumurta sayısını karşılaştırın.
    1. Adım 2.2 Aşağıdaki embriyo toplama ayarlayın.
    2. 2,5-24 saat sonra, adım 2.4 Aşağıdaki embriyolar toplar.
    3. embriyo sayısını saymak.
    4. 90 mm petri embriyoların transferi. embriyoların hedeflenen gen, toplama tarihi ve numarası ile Petri kabı etiketleyin. onlar yumurtadan kadar 30 ° C inkübatör embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. çıkmamış embriyolar üzerinde yumurtadan larva besleme yana, forseps (Tartışma) kullanılarak çıkmamış embriyolardan Petri kabı sık sık ve ayrı yumurtadan larva kontrol edin.
    5. yumurtadan embriyoların sayısını ve ambar oranını hesaplamak.
  3. Yumurtadan larva içinde Kütikül Kusur incelenmesi
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde Yumurtadan Çıkmış Larvalarına toplayın.
    2. Bir duman başlığı içinde, sabitleme çözeltisi 1 ml.
    3. Çözelti larva doku nüfuz için en az bir gece süreyle 4 ° C'de mikrosantrifüj tüpü terk.
    4. görselleştirmek için, mümkün olduğu kadar tüpten kadar fiksatif çıkarın.
    5. PBST ile durulayın larva en az üç kez.
    6. PBST sonu olmayan bir P-1000 pipet kullanarak bir çok kuyu cam plaka Transfer larva bunu genişletmek için kesti.
    7. bir mikroskop altında, kusurları incelemek için forseps kullanarak larva germek. bent sabitleştirici vücutları sözleşme olarak kusurları incelemek için larva germek için kritik öneme sahiptir.
  4. Çıkmamış Larva içinde Kütikül Kusur incelenmesi
    Not: Bu prosedür özellikle kuluçka için hayatta olmayan embriyolar için, erken embriyonik fenotip incelenmesi için yararlıdır.
    1. pRNAi için Petri kabı (7.2.4) içine PBST ekleyin ve son kesti ile P-1000 pipet kullanarak 1.5 ml mikrosantrifüj tüp çıkmamış embriyolar transfer. eRNAi için mikroskop lamı kapalı Petri kabındaki (5.5.4), fırça çıkmamış embriyoların içine PBST ekleyin ve bir mikrosantrifüj tüp aktarabilirsiniz.
    2. Sabitleme Çözümü ile embriyolar Fix ve adımları 7.3.2 Aşağıdaki görselleştirme PBST ile durulayın - 7.3.6.
    3. forseps kullanarak, PBST bir mikroskop altında yumurta kabuğu dışarı embriyolar incelemek.
    4. Lütfen bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (• Her bir tüp içinde embriyo 200 ul) embriyoların transferi.
    5. kadar sol kaldırmümkün Katkı.
    6. % 90 Laktik asit /% 10 EtOH 1 ml ilave edilir. En az gece boyunca 60 ° C'lik bir kuluçka makinesi içinde santrifüj tüpü boş.
      Not: Embriyolar birkaç gün boyunca 60 ° C 'de bırakılabilir.
    7. embriyolar monte etmek için, uç kesti ile P-1000 pipet kullanarak bir mikroskop lamı üzerine onları pipetle.
    8. El ile ideal bir yönelime forseps ile embriyoların yerleştirin.
    9. Bir kapak kayma ile embriyolar Kapak ve DIC kullanarak mikroskop altında görselleştirmek.
  5. Hücresel ve Moleküler Hataları incelenmesi
    Not: Bu yordam manikür kusurları eşlik etmez manikür fenotipleri veya letalitesinin yatan nedenleri araştırmak için yararlıdır.
    1. pRNAi için uygun gelişim aşamasında pamuk topları ayrı embriyolar ve embriyo toplama sepet içine aktarabilirsiniz. Toplama sepeti, aynı veya Drosophila embriyo koleksiyonları için kullanılana benzer olabilir.
      1. Yapmakkaldırıldı şişenin dibinde ile 25 ml'lik plastik sintilasyon flakon yumurta sepeti ve kapağın (kabaca 1 cm çapında) dışında bir daire kesilmiş. süper ince bir daire kapağının iç çapı yaklaşık 2.5 cm örgü yerleştirin ve ardından parıldama ampulünün vida ve baş aşağı kullanın.
      2. Embriyolar yıkanır sonra ağ kolayca çıkarılabilir de, örgü yapışma bir embriyo kurtarma su ile mikrosantrifüj tüpü içinde örgü bırakın.
    2. eRNAi için, uygun bir aşamada, bir Petri kabı PBST ekleyin. mikroskop lamı kapalı embriyolar fırçalayın ve bir embriyo toplama sepeti aktarabilirsiniz.
      NOT: Fiksasyon, in situ hibridizasyon, antikor boyama ve nükleer boyanma protokolleri Xiang vd bulunabilir. 2015 53.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yazarların laboratuar böcekler 53,55 yılında segmentasyon düzenleyen genlerin fonksiyonel evrimini incelemek için RNAi teknolojisini kullandı. Tüm böcekler Parçalara edilirken, bu süreci düzenleyen genlerin böcek radyasyonlar 26,38,56-63 sırasında ayrılmaktadır görünmektedir. Drosophila genetik ekranlar vücut segmentlerinin 64-70 oluşumunu teşvik sorumludur dokuz çift-kural segmentasyon genlerinin bir dizi belirledi. Burada, bu genlerin birinin ortologu, eşleştirilmiş (PRD), D. maculatus gen fonksiyonu incelemek için RNAi yararını belge için kullanılır.

Bu türün segment oluşumunda PRD - eRNAi ve pRNAi her DMAC için roller gösteren etkili olmuştur. 2 - PRD (Şekil 8B, 8D ve 8F - dsRNA'nın 3 ug / ml DMAC hedeflemek için tasarlanmış (Şekil 8A, 8C ve 8E olarak enjekte GFP dsRNA ile karşılaştırılmıştır.

Kontrol yavru segmentinde başına bir pigmente şerit ile yumurtadan. Komşu pigmentli çizgili pigmentsiz bir boşluk (Şekil 8A) ile ayrılmıştır. Prd pRNAi sonra, etkilenen yavrular belirten segmental sınırları (Şekil 8B) kusurlu olduğu, erimiş komşu pigmentli çizgili yumurtadan. fenotipik şiddeti, bir veya birden fazla füzyon bağlı olarak, etkilenen larva tespit edilmiştir. Bununla birlikte, füzyonları sürekli çift-kural-benzeri kusurları belirten T2 arasındaki sınır bölgelerinde / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8 çıktı. Prd demonte sonra manikür fenotipleri karın segmentleri kaybını yanı sıra kısaltılmış vücut uzunluğu (Şekil 8D) gösterdi. Engrailed (En) antikor boyama erken moleküler kusurları incelemek amacıyla yapılmıştırprd demonte sonra embriyolar. Kontrol embriyolar her kesimden (Şekil 8E) eşit yoğunlukta ifade En çizgili gösterdi ederken, azaltılmış En ifade kadın (Şekil 8F de yıldız) DMAC-prd dsRNA'dan yavruların alternatif çizgili enjekte tespit edildi. indirgenmiş En ifade deseni etkilenen yumurtadan larva gözlenen hatalı üst deri deseni ile tutarlıdır. D. maculatus içinde prd demonte sonra fenotipleri daha detaylı sonuçlar için, Xiang ve ark bakın. 2015 53.

Şekil 3,
Şekil 3: Enjeksiyon cihaz. D. maculatus embriyoların enjekte etmek için kullanılan diseksiyon mikroskobu ve mikromanipülatör Fotoğraf gösterilir. Azot kaynağı pnömatik pompa basınç giriş portuna bağlanır. Cam kılcal tutucu ejec bağlıPompanın t basınç noktası. Ayak pedalı pompasına bağlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: D. maculatus Embriyonik RNAi için Akış Şeması. Enjeksiyon için embriyolar Toplama (AD). Dişiler pamuk topları embriyolar (turuncu) (gri daire) yatıyordu. pamuk topları ayrı embriyolar ve onları siyah inşaat kağıt parçası üzerine bırakalım. Beyaz barlar pamuk gözyaşları göstermektedir. siyah kağıt ile kaplı bir toplama Petri kabı kapağı embriyo transferi. Embriyolar içine dsRNA enjekte (E, F). çift ​​sopa kasete slaytlar üzerinde embriyolar hizalayın ve bir mikroskop altında tek tek onları enjekte. yeşil gıda boyası ile iğne gösterilmiştir. (GJ) Post-enjeksiyon kurtarma ve inkubasyontirme. nem sağlamak için Petri kabındaki ıslak pamuk yerleştirin. Petri kabı Kapak ve filmi (açık mavi) sızdırmazlık ile sarın. bir kuluçka Petri kabı yerleştirin ve fenotipik analiz için yumurtadan larva kaldırın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: Bad Embriyonik Enjeksiyon Örnekler Good vs. (A) uninjected embriyo. (B) Embriyo çok az dsRNA enjekte edilmiştir. (C) Embriyo dsRNA'nın uygun miktarda enjekte edilir. (D) dsRNA aşırı enjeksiyonundan kaynaklanan taşan Broken embriyo. Gıda boyama görselleştirme dsRNA ilave edildi. (E) enjeksiyon için iğneler olarak kullanılan çekilmiş kılcal tüpler örnekler. Konik ve ucu uzunluğu f Notveya fonksiyonel iğne iki örnek. AD Ölçek çubukları 200 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: Kadın ve Erkek Yetişkinler ve Pupa. (A) erkek pupa alttan görünüşü. (A ') A. (A ") erkek pupa genital İllüstrasyon arka kısmının Büyütme. (B) dişi pupa alttan görünüşü. (B') B. Kadın pupa arka kısmının Büyütme iki genital papilla var (beyaz oklar). (B ") kadın pupa genital İllüstrasyon. (C) erkek yetişkin alttan görünüşü. (C ') C posterior bölümünün Büyütülmüş görünüm erkek yetişkin Trident gibi olması genital ve Not4. sternite dairesel lob benzeri yapı (siyah ve beyaz ok sırasıyla). (D) bir dişi yetişkin alttan görünüşü. (D ') tüm panelleri için D arka kısmının Büyütülmüş görünüm, ölçek çubukları 1 mm gösterir. Ayrıntılar için, Xiang et al. 2015 53. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7: Enjeksiyon sırasında bir kadın. Dişiler anestezi ve ventral yüzü yukarı yerleştirilir. 2. ve dsRNA'larını enjekte etmek 3 sternites arasındaki segmacoria nüfuz iğne gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 8: DMAC-prd pRNAi sonra Temsilcisi Fenotipleri. (A) Kontrol enjeksiyonu. Üç göğüs segmentleri ve on karın segmentleri ile bir yumurtadan yabani tip benzeri GFP pRNAi yavru Yanal görünümü. Her bölüm kıllı ve pigmentli şeritler vardır. (B) taramalı prd pRNAi yavruların Yanal görünümü. etiketli komşu pigmente çizgileri arasındaki boşluk daralmış veya tamamen eksik olduğunu. Bir çıkmamış kontrol vahşi tip benzeri embriyo (C) Tırnak fenotipi. Daha az karın segmentleri ile çıkmamış prd pRNAi yavru (D) Tırnak Eti fenotip. (E, F) den germband Dissected: (E) Kontrol, GFP pRNAi eşit her segmentte Tu dile getirdi, (F) prd pRNAi, En ifadesi alternatif kesimleri (yıldız) azalır. Tüm bölmede içinls, ölçek çubukları 500 mikron göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gelişmiş model sistemler (fareler, sinekler, solucanlar) az sayıda 20. yüzyılda geliştirilen iken, 21. yüzyılın yeni hayvan sistemlerinin bir dalga tüm dünyada laboratuvarlarında geliştirilen gördü. Bu yeni sistemler bilim yalnızca 'standart' modeli sistemleri kullanılarak tanınacak olamaz karşılaştırmalı evrimsel soruları için izin verir. yeni modellerin Bu dağıtım laboratuvar kültürleme, gen tanımlama ve yeni türlerde fonksiyonel yaklaşımları yöntemleri hızla geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, laboratuar ve embriyonik RNAi, ebeveyn RNAi ve bu böceği fenotipik analizi için adım adım protokoller D. maculatus yetiştirilmesi için prosedürler sunuldu. Amaç bu açıklamaları kendi deneylerinde D. maculatus kullanmak ve ek yeni model türler geliştirmek için burada sunulan yaklaşımların faydalanmak için başkalarını teşvik olmasıdır.

D. maculatus l ikenab kolonileri korumak için son derece kolay olan bu tür yetiştirme bir sınırlama gıda kaynağı olarak böcekleri verilen ıslak kedi maması hoş olmayan koku olduğunu. Bunu önlemek için, bu tür peynir altı suyu / soya protein tozu, peynir, zemin köpek maması ve süt tozu gibi alternatif gıdalar, nem değiştirmek için veya ıslak pamuk olmadan test edildi. Zemin köpek maması en etkili bir alternatif oldu ve düzenli koloni besleme için kullanılabilir. Survival ile veya ıslak pamuk eklendi olmadan,% 80 bağıl nem sadece kuru köpek maması yetiştirilen kafeslerde yumurtadan yetişkine kadar (>% 90) mükemmel oldu. Yumurta çok sayıda toplama Ancak, doğurganlığı artırmak için yumurta toplama ıslakken kedi maması ile bu diyet ilave gerekebilir. Köpek maması kullanılırsa durumunu köpek maması 54 yumurtlama inhibe ettiği bulunmuştur gibi görünüyor, ama, düzenli olarak temizlenmesi gerekmektedir. 71 Sığınma olarak Köpek maması tanecikleri (KR, ön sonuçlar), mantar, ahşap, kağıt ve diğer malzemeler de kullanılabilir.İlginçtir, Strafor mealworm böceği larvaları kullanılarak biyodegradasyon 72 rapor edilmiştir. Bu nedenle, bu D maculatus larvaları için test edildi. Genç D. maculatus larvaları sadece strafor veya asbest içeren madde ve ıslak pamuk ile yetişkinliğe kadar hayatta (veriler gösterilmemiştir) ama yedikleri ve bu malzemeleri sindirmek olup olmadığı belirlenmelidir kalır.

Bu rapor D. maculatus fonksiyonel genetik çalışmalar yürütüyoruz ilk ayrıntılı bir protokoldür. RNAi kullanımı burada yeni bir model sistemine bu tekniğin bir genişleme gösterir. Çeşitli özel gözlemler D. maculatus ve diğer non-modeli türlerinde RNAi demonte deneyleri ile ilgili dikkate değerdir. İlk olarak, RNAi D. maculatus, istihdam edilmelidir Burada kullanılan D. maculatus aynı suşu etkili olacağını garanti etmek. Kanıt farklı suşlar RNAi p değişim göstermektedir ki Tribolium castaneum gelen varhenotypes 24,73, ve mutant fenotipleri genelde model türlerinin 74-76 genetik arka plan bağımlılığı göstermektedir. Ayrıca, in situ hibridizasyon dahil olmak üzere diğer protokoller zorlanma-bağımlılık için anekdot kanıtlar mevcuttur. İkinci olarak, enjeksiyon, uygun zamanlama D maculatus başarılı RNAi için önemlidir. manikür tamamen en az iki gün eclosion sonra, sklerize sonra biraz Sezgilere, segmacoria en kolay nüfuz eder. Bu nedenle, 4 bakire dişi - 8 gün eclosion sonra kullanılmalıdır. Yaşlı kadın, yeni eclosed kadınlara göre daha düşük doğurganlığını deneyim ve böylece enjeksiyon için uygun değildir. Üçüncü olarak, dsRNA kadın karın iç basıncı ile dışarı itti alabilirsiniz enjekte. enjeksiyondan sonra dsRNA büyük miktarda kaybetme olasılığı en aza indirmek için, (6.2.8), enjeksiyondan sonra ~ 5 saniye için karın iğne tutun ve daha sonra yavaş yavaş çıkarın. Bu arada, sırasında veya hemen dişinin karın basmamakenjeksiyondan sonra. Her dsRNA (günlük ~ 200 embriyolar) yeterli yavrular elde etmek için fenotipik analiz için en az 8 kadın enjekte bu sorundan kaynaklanan yanlı sonuçlar aşmak için. Dördüncü olarak, yüksek yumurta verimi enjeksiyonundan sonra fenotipik analizi için tarafsız verilerini sağlamak için önemlidir. Ortalama olarak, her D. maculatus kadın günde yaklaşık 35-55 embriyolar üretir. Yumurta verimi popülasyon boyutu, bir kadın, yaş, nem, gıda temini, sıcaklık (veriler gösterilmemiştir) ve diğer çevresel faktörlere 54 bağlıdır. Genellikle, dişiler 25 ° C den 30 ° C 'de daha ayrıntılı yatmaktadır. Beşinci olarak, çıkmamış embriyolar yumurtadan larva ile cannibalized edilebilir. Çıkmamış embriyolar genellikle daha ağır etkilenen ise yumurtadan larva olarak, genellikle yabani tip benzeri veya sadece hafif etkilenen, D. maculatus larvaları bu alışkanlık bir nicel fenotipik analizi önyargılı sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle, mümkün olduğunca erken yumurtadan larva çıkarılması şiddetle tavsiye edilir.

Pek çok açıdan bu türün dahil fizyoloji, ekoloji ve haşere büyük ilgi kontrolünü-olmasına rağmen bizim laboratuvar, D. maculatus segmentasyon odaklanmıştır. Embriyogenezis ve segmentasyon çalışmaları için, D. maculatus larvaların sırt tarafında koyu pigmentli çizgili bir dizi anormal gelişimi için doğal bir belirteç olarak hizmet verebilir. Ayrıca, larvaların pigmentli şeritlerindeki köklü özelliği kıl bölümlerinin bir gösterge olarak kullanılabilir. Bu morfolojik özellikleri, birlikte hafif ya da orta derecede etkilenen embriyolar kuluçka için hayatta bulgu ile, temel vücut planı desenlendirme katılan mekanizmaları incelemek için D. maculatus modelinin avantajları vardır.

Son olarak, son derece kontrollü deneyler dahil bir negatif kontrol gibi GFP dsRNA olarak yürütülmesi ve her biri için iki örtüşmeyen hedef bölgelerini test önemi nedeniyle effec için yanlış yorumlanmasından kaçınmak için kritik gen-isbaşına enjeksiyon ts ve hedef dışı etkileri. D. maculatus 4 - ug 6 dsRNA (2 ya da 3 mg / ml 2 ul), her bir kadın içine enjekte edilmekte ve dsRNA bp uzunlukta 200-250 idi. Tutarlar ve protokol diğer ayrıntıları geliştirme veya farklı fizyolojik / metabolik süreçlerde daha sonra işleyen genleri hedef ise optimize edilmesi gerekebilir. Önceki keşifler C. F1 nesil 15 elegans ötesinde RNAi etkileri sonraki nesillere aktarılabilir gösterdi. RNAi nedeniyle segmentasyon defektleri ile yumurtadan D. maculatus larvaları bir azınlık yetişkinliğe kadar hayatta ve üretebilir. Ön deneyler F2 neslinde bariz kusurları ortaya çıkarmak için başarısız oldu. Gelecekteki çalışmalar bu türlerde RNAi nesiller etkilerini ortaya çıkarabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208 (2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822 (2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674 (2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440 (2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602 (2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32 (2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490 (2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5 (2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).
Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).More

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter