Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle, Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Summary

Her præsenterer vi protokoller for opdræt en mellemliggende-kim bille, Dermestes maculatus (D. maculatus) i laboratoriet. Vi deler også protokoller for embryonale og forældreorlov RNAi og metoder til at analysere embryonale fænotyper at studere genfunktion i denne art.

Introduction

I 1998 Fire og Mello rapporterede, at dobbeltstrenget RNA (dsRNA) kan fremkalde hæmning af gen funktion i Caenorhabditis elegans 1. Denne reaktion udløst af dsRNA blev opkaldt RNA-interferens (RNAi), og sådan RNAi-medieret gen silencing blev rapporteret at være bevaret i dyr, planter og svampe 2-7. I planter og nogle dyr, RNAi fungerer systemisk, hvilket betyder, at virkningen kan sprede sig til andre celler / væv, hvor dsRNA ikke er direkte indført (gennemgået i 8-10). Forskere har gjort brug af denne endogene cellulære RNAi respons ved at designe dsRNA'er at målrette gener af interesse, og dermed vælte gen funktion uden direkte at manipulere genomet (revideret i 11-14).

RNAi er et stærkt værktøj til funktionelle undersøgelser på grund af følgende fordele. Første, selv med minimal gensekvensinformation, et gen kan målrettes ved hjælp af RNAi. Dette er især vigtigt for studies af ikke-modelorganismer mangler genomiske eller transkriptom data. For det andet, i organismer hvor RNAi respons er robust systemisk, RNAi-medieret gen knockdown kan udføres på næsten alle udviklingstrin. Denne funktion er meget nyttig til undersøgelse af funktionen af ​​pleiotrope gener. For det tredje, i nogle tilfælde spredes RNAi effekter til gonaderne og afkom, således at fænotyper hos afkommet 15,16. Dette fænomen, kendt som forældrenes RNAi (pRNAi), er særligt fordelagtigt for gener påvirker fosterudviklingen, så talrige afkom af en enkelt indsprøjtet forælder kan undersøges uden direkte manipulation af æg. Af disse grunde, pRNAi er den foretrukne fremgangsmåde. Men hvis pRNAi er ineffektiv, for eksempel for gener, der er nødvendige for oogenesen derefter embryonale RNAi (eRNAi) skal anvendes. For det fjerde kan RNAi anvendes til at frembringe hvad der svarer til en allelisk serie ved, at mængden af ​​dsRNA leverede kan varieres over et område for at frembringe svage til stærke defekter. En sådan graduering af fænotyper kan være nyttigt for forståelsen genfunktioner når genet er involveret i en kompleks proces og / eller fuldstændigt tab af funktion er dødelig. Femte, levering af dsRNA er generelt let og muligt, især i dyr, der viser robuste systemiske RNAi svar. dsRNA kan indføres ved mikroinjektion 1,5, fodring / indtagelse 17,18, iblødsætning, 19,20 og virus / bakterie-medieret levering 21,22. Sjette, i modsætning til nogle genmålretning / redigering metoder, er der ingen grund til at screene for organismer, der bærer mutationen eller foretage genetiske krydsninger at generere homozygoter ved brug RNAi. Derfor sammenlignet med mange andre teknikker til at studere genfunktion, RNAi er hurtig, billig, og kan anvendes til store skærme 23-25.

Den brede anvendelighed af RNAi tilvejebringer midler til at udføre funktionelle studier i en lang række organismer, udvide række arter til rådighed til undersøgelse beyond de traditionelle modelsystemer for hvilke der er udviklet genetiske værktøjer. For eksempel er undersøgelser med anvendelse af ikke-modelsystemer forpligtet til at give indblik i udviklingen af gener og gen-netværk ved at sammenligne funktionerne i ortologer fra arter, der repræsenterer forskellige udviklingsprojekter tilstande eller udstilles distinkte morfologiske træk 26-29. Disse typer af undersøgelser vil give en bedre forståelse af den biologiske mangfoldighed, med konsekvenser for både anvendt forskning og grundforskning.

Som den største dyregruppe på planeten, insekter giver en stor mulighed for at udforske de mekanismer, der ligger mangfoldighed. Derudover insekter er generelt små, har korte livscyklus, høj frugtbarhed, og er lette at opdrætte i laboratoriet. I de seneste to årtier har RNAi blevet anvendt med succes i insekter spænder ordrer, herunder Diptera (sande fluer) 5, Lepidoptera (sommerfugle og møl) 30, Coleoptera (biller) 16,31, Hymenoptera (sawfløgne, hvepse, myrer og bier) 32, Hemiptera (sande bugs), Isoptera (termitter) 34, Blattodea (kakerlakker) 35, Orthoptera (fårekyllinger, græshopper, græshopper og katydids) 36 og Phthiraptera (lus) 37. Vellykket anvendelse af RNAi har givet funktionelle data for studier af mønstre i tidlig embryogenese (anterior-posterior akse 32, dorsal-ventral akse 28, segmentering 26,38), kønsbestemmelse 39,40, kitin / neglebånd biosyntese 41, ecdyson signalering 42, social adfærd 43, og mere. RNAi metoder udviklet til forskellige insektarter kan være af yderligere fordel ved, at de sandsynligvis vil være nyttige til skadedyrsbekæmpelse (gennemgået i 44-46). RNAi effekter vil være genspecifikke samt artsspecifik, så længe ikke-konserverede regioner valgt til målretning. For gavnlige insektarter som honningbier og silkeorme, rettet mod gener vitale for overlevelsevira eller parasitter at kontrollere infektion kan tilvejebringe en ny strategi til at beskytte disse arter 47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), almindelig betegnelse skjul bille, fordeles over hele verden med undtagelse af Antarktis. Som holometabolous insekt, D. maculatus livscyklus omfatter embryonale, larve, puppe og voksne stadier (Figur 1). Fordi det feeds på kødet, er D. maculatus bruges i museer at skeletonize døde dyr og retsmedicinske Entomologer kan bruge det til at vurdere dødstidspunktet 49,50. D. maculatus feeds på animalske produkter, herunder kroppe, tørret kød, ost og den pupper / kokoner af andre insekter og forårsager dermed skade på husholdninger, opbevarede fødevarer, og silke, ost, og kødbranchen 51,52. Anvendelse RNAi i denne bille kunne give en effektiv og miljøvenlig måde at minimere dens økonomiske virkninger. Vores laboratorium har brugt D. maculatus som en ny model insekt at studere segmentering 53. Ud over at være modtagelig for lab opdræt, D. maculatus er af interesse for grundforskning, da det er et mellemprodukt-kim udvikler, hvilket gør det til et nyttigt art at studere overgangen mellem kort og langt kim udvikling.

figur 1
Figur 1: Life Cycle of D. maculatus. Fotografier af D. maculatus på forskellige livsstadier, som angivet. Den livscyklus fra æg til voksen tager tre uger ved 30 ° C, men længere ved lavere temperaturer. (A, F) frisk fastsat embryoner er hvide til lys gul og ovale, ca. 1,5 mm i længde. Embryogenese tager ~ 55 timer ved 30 ° C. (B, C og G) Larver har mørke pigmenterede striber og er dækket med setae. Larver gå gennem flere instars afhængig af miljøet, og deres længde kan strække sig op til over 1 cm. (D, H) (E, I) Kort efter eclosion synes mørk pigmentering i den voksne bille krop. Voksne kan leve op til flere måneder og en kvindelig kan lægge hundredvis af embryoner i hendes levetid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tidligere viste vi, at RNAi er effektivt til at vælte genfunktion i D. maculatus 53. Her vores erfaring opdræt D. maculatus kolonier i laboratoriet deles sammen med trin-for-trin protokoller for både embryonale og forældreorlov RNAi set-up, injektion, efter injektion pleje, og fænotypisk analyse. De dsRNA-medieret gen Knockdown og analysemetoder indført her ikke kun give detaljerede oplysninger til adressering spørgsmål i D. maculatus, men også have potentiel betydning for anvendelse af RNAi i andre ikke-model bille / insektarter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opdræt af D. maculatus

BEMÆRK: En ynglende koloni af D. maculatus blev oprettet i forfatternes lab hjælp voksne og larver købes kommercielt. Arten identitet blev verificeret ved hjælp af DNA-stregkodning 53.

  1. Hvis du vil oprette en ny bur i laboratoriet, sprede et tyndt lag af træspåner i en mellemstor insekt bur (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Placer en ~ 10 x 6 x 3 cm 3 luns af Styrofoam i buret til at lade larverne skjule for pupation. Tilføj 20 - 50 biller (enten voksne eller sent stadium larver). Biller vil gemme sig i træspåner.
  2. Tilføj våd kattefoder i en petriskål eller et vejebåd. Dæk buret med mesh klud og placere buret i en inkubator.
  3. For at opretholde en avlskoloni i laboratoriet, indstille temperaturen mellem 25 og 30 ° C. D. maculatus vokser hurtigere ved højere temperaturer, men det fremmer også væksten af svamp og mider. For at opretholde en helbrededin koloni, bruge 25-28 ° C for regelmæssig bestand vedligeholdelse og 30 ° C i hastigt ekspanderende kolonien. Den livscyklus tager cirka tre uger til fire måneder, afhængigt af miljøfaktorer 50 (figur 2).

Figur 2
Figur 2: D. maculatus Lab Colony. Fotografi af en typisk D. maculatus insekt bur er vist. Træspåner spredes at lade biller skjule. Kattefoder tilsættes i en lille petriskål eller vejebåd. Styrofoam er placeret ind i buret som et tilflugtssted for den endelige stadie larver at forpuppe. Den her viste bur er 30,5 x 19 x 20,3 cm 3 og huser et par hundrede larver, pupper og voksne. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Leave æg i buret til at modnes. At udvide kolonien, etablere nye bure med æg (indsamlet som beskrevet i afsnit 2), larver eller voksne, som ovenfor. D. maculatus lægge æg i hele buret, især nær fødekilde.
  2. Udskift vådt kattefoder om to gange om ugen.
    BEMÆRK: På grund af den ubehagelige lugt af våd kattefoder, blev alternative fødekilder også testet (se Diskussion).

2. Embryo Collection

  1. At oprette en samling, skal du adskille mindst 50 mænd og 50 kvinder fra kolonien. Unge voksne er bedst. Placer voksne i en mini-størrelse bur (17,8 x 10,2 x 12,7 cm 3) uden høvlspåner. Tilføj kattemad i en afvejning båd.
  2. Før du starter indsamling, tjek buret omhyggeligt for eventuelle embryoner nuværende og fjerne dem. Sæt en strakt vat ind i buret, og lad buret i en 30 ° C inkubator. Efter et passende tidspunkt vinduet, vil vat være klar til embryonindsamlingsteam.
  3. Foldeet stykke sort bygning papir (A4-størrelse) i halvdelen til at oprette en krølle, og derefter folde.
  4. Fjern den strakte vat fra buret. Fjern voksne fra vat og sætte dem tilbage i buret.
  5. Mens klemme den strakte vat meget forsigtigt, rive det fra hinanden langsomt i tynde bomuld tråde til at lade æggene falde ned på sort papir.
    BEMÆRK: D. maculatus embryoner er skrøbelige og svære at se i bomuld. De kan nemt knuses, hvis du holder vat for hårdt.

3. dsRNA Forberedelse

  1. DNA Skabelon Forberedelse til dsRNA Synthesis
    1. Køre 4 - 6 50 pi PCR-reaktioner under anvendelse af primere indeholdende T7-promotorsekvenser i begge 5'-ender til amplifikation DNA-skabelon ifølge producentens protokol.
    2. Oprens PCR-produkt under anvendelse af et kommercielt PCR oprensningskit, efter producentens anvisninger. Den ideelle slutkoncentration af DNA-template er ≥100 ng / pl.
  2. Injektion Buffer Fremstilling
    1. Fremstilling af 100 ml injektion puffer (0,1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM KCI). Justér pH til 6,8 med 5 M NaOH.
    2. Opbevar portioner ved -20 ° C.
  3. dsRNA Synthesis
    1. Opsæt en reaktion i en 0,2 ml PCR-rør på is og udføre en in vitro transkription reaktion med T7-polymerase, efter fabrikantens anvisninger ved hjælp af ~ 500 ng skabelon per reaktion.
    2. Inkubér røret ved 37 ° C natten over.
    3. Fordøje DNA skabelon med DNase, efter producentens anvisninger.
    4. Opvarm røret til 94 ° C og holdes ved 94 ° C i 3 minutter.
    5. At anneale dsRNA'et, langsomt afkøle røret ved 1 ° C / min, indtil den når 45 ° C efter 1 time.
      BEMÆRK: Trin 3.3.2 gennem 3.3.5 kan udføres i en thermocycler.
    6. For at ethanol bundfald af dsRNA, tilsættes 280 piaf RNase-frit vand til 20 pi reaktion at tilpasse til et endeligt volumen på 300 pi. Tilsæt 30 pi 3 M NaOAc (pH 5,2) og 650 pi ethanol. Placer røret i -20 ° C fryser natten over.
    7. Efter centrifugering ved 15.682 xg i 30 minutter ved 4 ° C, vaskes dsRNA'et pellet med 70% ethanol. Tør pellet og opløses i 20 pi injektion buffer.
    8. Måle koncentrationen af dsRNA'et under anvendelse af et spektrofotometer ved A260. Den ideelle koncentration er: 3 - 5 ug / ul. Kontrollere kvaliteten ved at køre 5 pi af en 1:25 fortynding af dsRNA på en 1% agarosegel ved 90 V i 30 min. Et enkelt bånd af den forventede størrelse vil være let synlig.
    9. Opbevar dsRNA'et ved -20 ° C eller koldere.
      BEMÆRK: For hver RNAi knockdown eksperiment, omfatter en kontrol dsRNA, som ikke forventes at påvirke processen blive undersøgt. GFP dsRNA er en fremragende kontrol for de fleste forsøg. Forbered og injicere kontrol- dsRNA side om side med experimental dsRNA.

4. Montering af mikroinjektor og mikromanipulator

BEMÆRK: Se figur 3.

  1. Tilslut nitrogen eller anden luftforsyning til trykket indgangen af ​​en pneumatisk pumpe instrument. Hvis en pneumatisk pumpe ikke er tilgængelig, anvender tryk under anvendelse af en 50 ml sprøjte forbundet til fint slange.
  2. Tilslut en fodkontakt til den fjerne stikket af pumpen til at styre eject trykket flow.
  3. Vedhæft et glas kapillar holder til eject pres porten på pumpen med røret.
  4. Fastgør kapillær holder på en mikromanipulator tæt på et dissektionsmikroskop.

5. Embryonale RNAi

BEMÆRK: Figur 4 viser et rutediagram for D. maculatus embryonale RNAi.

  1. eRNAi Forberedelse
    1. Forbered et foster indsamle petriskål låg (90 mm diameter). Læg et stykke sort filtrerpapir til cover indersiden af ​​låget. Sætte en standard mikroskopobjektglas på sort papir.
    2. Fortynd dsRNA til passende koncentration med injektion buffer. Brug 2 - 3 i pg / pl for indledende forsøg. Hold altid dsRNA på is før injektion.
    3. Tilføj frugtfarve ved 1:40 fortynding til dsRNA og pipette forsigtigt flere gange for at blande godt.
  2. Indsamling Embryoner til injektion
    BEMÆRK: Ved 25 ° C, kerner i embryoner 6 - 8 timer efter æglægning (AEL) migrere til ægget periferien 53. En cellulær blastoderm er etableret i 8-10 timers AEL 53. For at sikre fostre før cellulær blastodermstadiet anvendes til injektion, 0 - 3 timers AEL embryoner anbefales til brug 53. Embryo indsamling, forberedelse, og injektion normalt tage mindre end 2 timer, hvis glasset kapillærer er i god form. Derfor kan hele processen fuldføres inden 5 timer AEL.
    1. Saml embryoner som beskrevet i trin 2.2-2.5.
    2. Tryk på den sorte bygning papir til at overføre fostre til indsamling petriskål låg.
    3. Stick dobbeltklæbende tape langs kanten af ​​dias.
    4. Ved hjælp af en malerpensel, tilslutter embryonerne på båndet vinkelret på objektglasset kant med forreste eller bageste ende ved kanten. Bemærk, at de forreste og bageste ender af tidlige embryoner er ikke lette at skelne, således gennemsnitligt halvdel vil blive injiceret ved den bageste ende, som er ideel.
  3. Ilægning af dsRNA'et i Glass Kapillær
    1. Tag 2 - 4 pi dsRNA ind i en 20 pi microloader pipettespids.
    2. Sæt spidsen ind i en præ-trukket glas kapillarrør (benævnt nål) og forsigtigt pipetteres dsRNA'et opløsningen i kapillarrøret. Forbered nåle fra kommercielle glaskapillarer Med en mikropipette aftrækker. Et eksempel på en ideel trukket nålen er vist i figur 5. Længden og tilspidsning af nåle kan være nødvendigt at optimere AFter injektion forsøg.
    3. Fastgør glas kapillar ind glasholderen kapillar.
    4. Saml holderen kapillarrøret i mikromanipulator.
  4. Injektion dsRNA i Embryoner
    1. overføre forsigtigt glider med embryoner på scenen af ​​dissektionsmikroskop.
    2. Flyt dias til at bringe et embryon til midten af ​​feltet og fokus mikroskop.
    3. Placer spidsen af ​​kapillaret med mikromanipulator samtidig leder ind i dissektionsmikroskop. Bringe spidsen tæt på enden af ​​den første embryo i rækken.
    4. Tænd for nitrogen eller anden lufttilførsel.
    5. Indstil magnetventil input omskifter til vakuum.
    6. Juster eject trykregulator til 10 - 15 psi. Juster trykket afhængigt af apparatet.
    7. Åbn kapillær om nødvendigt. Når spidsen er åben, vil den farvede dsRNA opløsning fylde spidsen.
    8. Flyt kapillære spids frem til at punktere embryo. Hvis indstillingen trykket er ideel, vil ingen embryonale væske strømme ind i kapillarrøret.
    9. Træd på fodkontakten for at skubbe dsRNA opløsningen i foster indtil en passende mængde opløsning skubbes ud. Figur 5 viser eksempler på embryo morfologi efter passende og upassende mængder af løsningen er blevet injiceret.
    10. Hold kapillære spids inde i embryo for ~ 2 sek, og derefter fjerne det.
    11. Flyt kapillar til næste embryo og gentage trin 5.4.8 - 5.4.10, indtil alle embryoner injiceres. Skift glas kapillar hvis det bliver tilstoppet eller pauser.
  5. Post-injektion Recovery og inkubation
    1. Efter injektion, skal du placere dias i en petriskål.
    2. Tilføj en våd vat til petriskålen. Lad ikke vat røre dias.
    3. Dæk petriskålen og pak det med forsegling film. Mærk skål med navnet på dsRNA'et, koncentration, dato, tid, og antallet af injiceretembryoner.
    4. Anbring petriskålen i en 30 ° C inkubator indtil embryoner lugen.

6. Parental RNAi

  1. Isolering Pupper for pRNAi
    1. Saml pupper fra kolonien.
    2. Sorter mandlige og kvindelige pupper under mikroskop (se figur 6). Holde dem i to separate petriskåle i en 30 ° C inkubator for at sikre, at ingen parring forekommer før injektion.
    3. Tjek hver dag i eclosed voksne. Pupation tager normalt 5 - 7 dage ved 30 ° C.
    4. Overfør eclosed hanner og hunner (se figur 6) til to separate petriskåle og fodre dem kattefoder hver anden dag, indtil de er klar til injektion.
    5. Fortsæt til injektion én gang der er nok hunner og hanner ved passende alder. Hunnerne 4 til 8 dage efter eclosion er bedst. For en typisk analyse, 8 - der anvendes 12 hunner. Der er behov for et lige antal hanner til sammenpasning 54.
    Injektion dsRNA ind Female Abdomen
    1. Forbered dsRNA på is (5.1.2 og 5.1.3).
    2. Vedhæft en 32-gauge kanyle til en 10 pi sprøjte.
    3. Bedøve hunner på CO 2 scenen.
    4. Load dsRNA opløsningen op i sprøjten uden at optage nogen luft.
    5. Hold en kvindelig ventrale side op med den ene hånd og hold sprøjten med den anden.
    6. trænger forsigtigt segmacoria (membran) mellem sternites 2 og 3 med spidsen af ​​nålen. Figur 7 viser en hun under indsprøjtning. Hvis nålen ikke trænger vævet let, vinkel nålen opad og langsomt tryk ned. Indsæt ca. 2 mm af nålen ind i legemet.
    7. Tjek sprøjten skalaen, mens langsomt skubbe stemplet, indsprøjtning ~ 2 pi per kvinde.
    8. Efter injektion, holde nålen stadig i mindst 5 sek, før du fjerner den fra kvindens underliv.
    9. Overfør de injicerede hunner til en petriskål (90 mm i diameter) og foder med kattemad.
    10. Mærk petriskålen med dsRNA'et navn, beløb indsprøjtet, dato og antallet af hunner.
  2. Post-injektion Recovery og Parring
    1. Inkubér petriskålen i en 30 ° C inkubator.
    2. Efter 24 timer, overførsel injicerede hunner til en mini bur.
    3. Tilføj til buret et lige antal uinjicerede unge mænd, og mærke buret.
    4. Tilføj et vejebåd med kattefoder ind i buret.
    5. Efterlad buret i en 30 ° C inkubator for at tillade parring. Efter 24 timer, bør kvinder begynder at lægge æg og embryoner kan indsamles dagligt eller krævede tidsintervaller.

7. Fænotypisk analyse efter RNAi

BEMÆRK: Ved 30 ° C, det tager ~ 55 timer for æg at klække 50.

  1. eRNAi Levedygtighed Analyse
    1. Beregn Udklækningsgraden ved at sammenligne antallet af udklækkede larver til det samlede number af injicerede embryoner. Vær sikker på at medtage en negativ kontrol injektion som embryoner kan blive skadet eller dræbt af injektionsproceduren. Typiske hatch varierer fra 30% - 60%. Pas på udklækkede larver spiser udklækkede æg.
  2. pRNAi Levedygtighed Analyse
    BEMÆRK: Hvis kvindelige levedygtighed er påvirket af genet målrettet efter RNAi, hunner injiceret med specifik dsRNA men ikke negativ kontrol dsRNA vil begynde at dø. Hvis ægproduktion eller æglægning er påvirket, vil hunnerne udviser delvis eller fuldstændig sterilitet. Score kvindelige overlevelse sammenlignet med negative kontroller eller sammenligne samlede antal æg lagt af eksperimentelle og kontrol kvinder (7.2.3).
    1. Opsæt embryonindsamlingsteam efter trin 2.2.
    2. Efter 24 timer, indsamle embryoner følgende trin 2,4 - 2,5.
    3. Tæl det samlede antal af embryonerne.
    4. Overfør embryoner til en 90 mm petriskål. Mærk petriskålen med genet målrettet, indsamling dato, og antallet af embryoner. Inkuber embryoner i en 30 ° C inkubator indtil de udklækkes. Da udklækkede larver lever af uklækkede embryoner, kontrollere petriskålen hyppigt og separat udklækket larver fra uklækkede embryoer med en pincet (se diskussion).
    5. Tæl antallet af udklækkede embryoner og beregne lugen sats.
  3. Undersøgelse neglebånd Fejl i skraverede Larver
    1. Indsamle skraverede larver i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. I et stinkskab, tilsættes 1 ml Fiksering Solution.
    3. Lad mikrocentrifugerør ved 4 ° C i det mindste natten over for at lade opløsningen penetrere larvernes væv.
    4. At visualisere, fjerne så meget fiksativ fra røret som muligt.
    5. Skyl larver mindst tre gange med PBST.
    6. Overførsel larver til en multi-brønd glasplade med PBST under anvendelse af et P-1000 pipettespids med enden afskåret for at udvide den.
    7. Under et dissektionsmikroskop, strække larver med pincet for at undersøge defekter. jegt er afgørende at strække ud larver til at undersøge fejl som deres organer kontrakt fiksativ.
  4. Undersøgelse neglebånd Fejl i uklækkede Larver
    Bemærk: Denne procedure er nyttig til undersøgelse af tidlige embryonale fænotyper, især for embryoner, som ikke overlever til udrugning.
    1. For pRNAi, tilføje PBST ind petriskålen (7.2.4) og overføre uklækkede embryoner til et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved anvendelse af et P-1000 pipettespids med enden afskåret. For eRNAi, tilføje PBST ind petriskålen (5.5.4), børste uklækkede embryoner fra objektglasset og overføre dem til et mikrocentrifugerør.
    2. Fastgør embryoner med Fiksering Solution og skyl dem med PBST til visualisering efter trin 7.3.2 - 7.3.6.
    3. Med pincet, dissekere embryoner ud af æggeskallen under et dissektionsmikroskop i PBST.
    4. Overfør embryoner tilbage til 1,5 ml mikrocentrifugerør (~ 200 pi embryoner i hvert rør).
    5. Fjern så meget solution som muligt.
    6. Der tilsættes 1 ml 90% mælkesyre / 10% EtOH. Efterlad centrifugerøret i en 60 ° C inkubator mindst natten.
      BEMÆRK: Embryoner kan efterlades ved 60 ° C i flere dage.
    7. For at montere embryoner, pipette dem på et objektglas ved hjælp af en P-1000 pipettespids med enden afskåret.
    8. Manuelt placere embryoner med pincet til en ideel orientering.
    9. Dæk embryoner med et cover-slip og visualisere under mikroskopet med DIC.
  5. Undersøgelse Cellulær og Molekylær defekter
    BEMÆRK: Denne procedure er nyttig til at undersøge de underliggende årsager til neglebånd fænotyper eller dødelighed, der ikke er ledsaget af neglebånd defekter.
    1. For pRNAi, separate embryoner fra vatkugler på passende udviklingsstadiet og overføre dem til et foster indsamle kurv. Samlingen kurven kan være den samme eller ligner den, der anvendes til Drosophila embryo samlinger.
      1. Laveægget kurv fra en 25 ml plastik scintillationshætteglas med bunden af ​​hætteglasset fjernes, og en cirkel skåret ud af låget (ca. 1 cm i diameter). Placer en kreds af super fine mesh omkring 2,5 cm i diameter inde i låget, og derefter skrues scintillationshætteglas på og bruge hovedet.
      2. Som masken let kan fjernes, når embryonerne vaskes, fordybe at maskerne i et mikrocentrifugerør med vand inddrive eventuelle embryoner klæber til masken.
    2. For eRNAi, som på rette tidspunkt, tilføje PBST til petriskålen. Børst embryoner fra objektglasset og overføre dem til et foster indsamling kurv.
      BEMÆRK: Fiksering, in situ hybridisering, antistof-farvning, og farvningsprotokoller nukleare kan findes i Xiang et al. 2015 53.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forfatterne 'lab har brugt RNAi teknologi til at studere den funktionelle udvikling af gener, der regulerer segmentering i insekter 53,55. Mens alle insekter segmenteres, de gener, der regulerer denne proces synes at have afveget under insekt stråling 26,38,56-63. Genetiske skærme i Drosophila identificeret et sæt af ni par-regel segmentering gener, der er ansvarlige for at fremme dannelsen af kroppens segmenter 64-70. Her ortholog af et af disse gener, parret (PRD), anvendes til at dokumentere anvendeligheden af RNAi for at studere genfunktion i D. maculatus.

eRNAi og pRNAi blev hver effektive i at påvise roller for DMAC - PRD i formation segment i denne art. 2 - 3 i gg / ul dsRNA designet til at målrette DMAC - PRD (figur 8B, 8D og 8F GFP dsRNA, injiceres som negativ kontrol (figur 8A, 8C og 8E).

Kontrol afkom udklækket med én pigmenteret stribe per segment. Tilstødende pigmenterede striber var adskilt af en ikke-pigmenteret spalte (figur 8A). Efter PRD pRNAi, påvirkede afkom udklækket med kondenserede tilstødende pigmenterede striber, angiver segmenter grænser var defekte (figur 8B). Afhængig af fænotypisk sværhedsgrad, en eller flere fusioner blev påvist i berørte larver. Ikke desto mindre, fusioner konsekvent optrådte på grænseområderne mellem T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, hvilket indikerer pair-regel-lignende defekter. Neglebånd fænotyper efter PRD knockdown viste tab af abdominal segmenter samt forkortet kropslængde (figur 8D). Engrailed (En) antistof farvning blev udført for at undersøge molekylære defekter i begyndelsenembryoner efter PRD knockdown. Mens kontrol embryoer viste stribet En udtryk med samme intensitet i hvert segment (figur 8E), blev reduceret En udtryk påvist i alternative striber i afkom fra DMAC-PRD dsRNA injicerede hunner (Stjernerne i figur 8F). Mønstret af reduceret En ekspression er konsistent med den defekte kutikula mønster observeret i sygdomsramte udklækket larver. For mere detaljerede resultater af fænotyper efter PRD knockdown i D. maculatus, se Xiang et al. 2015 53.

Figur 3
Figur 3: injektionsapparatet. Fotografi af dissektion mikroskop og mikromanipulator anvendes til at injicere D. maculatus embryoer er vist. Kvælstofforsyningen er forbundet med trykket indgangsport en pneumatisk pumpe. Glaskapillar holder er forbundet til eject pres port af pumpen. Fodkontakten er forbundet med pumpen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: et rutediagram for D. maculatus Embryonale RNAi. (AD) Indsamling embryoner til injektion. Hunnerne lægge embryoner (orange) i vatkugler (grå cirkel). Separate embryoner fra vatkugler og lad dem falde ned på et stykke sort bygning papir. Hvide søjler angiver tårer i vat. Overfør embryoner til en indsamling petriskål låg, foret med sort papir. (E, F) Injektion af dsRNA i fostre. Juster embryoner på glider på dobbeltklæbende tape og injicere dem individuelt under et dissektionsmikroskop. Nål med grøn mad farvestof er vist. (GJ) Post-injektion nyttiggørelse og incubation. Placer en våd vat i petriskålen til at give fugt. Dæk petriskålen og pak det med forsegling film (lyseblå). Placer petriskålen i en inkubator og fjern udklækkede larver til fænotypisk analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: God vs Bad Embryonale Injection eksempler. (A) ikke-injiceret embryo. (B) Embryo injiceret med for lidt dsRNA. (C) Embryo injiceret med passende mængde af dsRNA. (D) Broken foster med overstrømmende dsRNA forårsaget af over-injektion. Levnedsmiddelfarvestof sattes til dsRNA til visualisering. (E) Eksempler på trukket kapillarrør anvendes som kanyler til injektion. Bemærk tilspidsning og drikkepenge længde feller to eksempler på funktionelle nåle. Scale barer for AD repræsenterer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: voksne mænd og kvinder og Pupper. (A) ventrale visning af en mandlig puppe. (A ') Forstørrelse af bageste del af A. (A ") Illustration af mandlig puppe kønsorganer. (B) ventrale billede af en kvindelig puppe. (B') Forstørrelse af bageste del af B. Kvinde pupper har to genital papiller (hvid pile). (B ") Illustration af kvindelige puppe kønsorganer. (C) ventrale billede af en mandlig voksen. (C ') Forstørret billede af bageste del af C. Bemærk, at voksne mænd har Trident-lignende kønsorganer og encirkulær lap-lignende struktur på 4 th sternite (hvide og sorte pile, henholdsvis). (D) ventrale billede af en kvindelig voksen. (D) Forstørret billede af bageste del af D. For alle paneler, skala søjler indikerer 1 mm. For detaljer, se Xiang et al. 2015 53. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7: En kvinde under injektion. Hunnerne bedøves og anbringes ventrale side op. En nål gennemtrængende de segmacoria mellem 2. og 3. sternites at injicere dsRNA vises. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 8: Repræsentative fænotyper efter DMAC-PRD pRNAi. (A) Kontrol injektion. Lateral billede af en udklækket vildtype-lignende GFP pRNAi afkom med tre thorax segmenter og ti abdominal segmenter. Hvert segment har setae og pigmenterede striber. (B) fra siden af en skraveret PRD pRNAi afkom. Kløften mellem mærkede tilstødende pigmenterede striber er indsnævret eller helt mangler. (C) Cuticle fænotype af en uklækkede kontrol vildtype-lignende foster. (D) Cuticle fænotype af en uklækkede PRD pRNAi afkom med færre abdominal segmenter. (E, F) dissekeret germband fra: (E) Kontrol, har GFP pRNAi jævnt udtrykte En i hvert segment, er (F) PRD pRNAi, En udtryk reduceret i alternative segmenter (asterisker). For alle rudels, skala søjler indikerer 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens et lille antal avancerede modelsystemer (mus, fluer, orme) blev udviklet i løbet af det 20. århundrede, har det 21. århundrede set en bølge af nye dyr, der udvikles i laboratorier i hele verden. Disse nye systemer give forskerne til at løse sammenlignende, evolutionære spørgsmål, der ikke kan sonderet kun at bruge de 'standard' modelsystemer. Denne implementering af nye modeller kræver den hurtige udvikling af metoder til lab dyrkning, gen-identifikation, og funktionelle tilgange i nye arter. Her blev procedurerne for opdræt D. maculatus i laboratoriet og trin-for-trin protokoller for embryonale RNAi, forældrenes RNAi, og fænotypisk analyse i dette bille præsenteret. Målet er, at disse beskrivelser opfordre andre til at bruge D. maculatus i deres egne eksperimenter og til at gøre brug af de metoder, der præsenteres her at udvikle yderligere nye model arter.

Mens D. maculatus lab kolonier er utrolig nem at vedligeholde, en begrænsning af opdræt denne art er den ubehagelige lugt af den våde kattefoder givet til billerne som deres fødekilde. For at undgå dette, alternative fødevarer såsom valle / sojaprotein pulver, ost, formalet hundemad, og mælkepulver, blev testet med eller uden våd bomuld til at ændre fugtighed. Ground hundefoder var det mest effektive alternativ og kan anvendes til regelmæssig koloni fodring. Overlevelse var fremragende (> 90%) fra æg til voksen i bure opdrættet på bare tørfoder til hunde i 80% relativ fugtighed, med eller uden våd bomuld tilsat. supplere denne diæt med vådt kattefoder når indsamling af æg for at øge frugtbarhed, kan dog være nødvendigt, når indsamle et stort antal æg. Hvis der anvendes hundemad, bør gamle fødevarer fjernes regelmæssigt, som aircondition hundefoder blev fundet at hæmme æglægning 54. Hundemad foderpiller (KR, foreløbige resultater), kork, træ, papir og andre materialer kan også anvendes som tilflugtssteder 71.Interessant bionedbrydning af Styrofoam hjælp mealworm billelarver er blevet rapporteret 72. Derfor er denne blev testet for D. maculatus larver. Young D. maculatus larver overlevede indtil voksenalderen med kun Styrofoam eller asbestholdige materialer og våd bomuld (data ikke vist), men hvorvidt de spiser og fordøje de materialer er endnu ikke fastslået.

Denne rapport er den første detaljeret protokol til at udføre funktionelle genetiske undersøgelser i D. maculatus. Brugen af ​​RNAi her repræsenterer en udvidelse af denne teknik til en ny model system. Flere specifikke observationer er værd at bemærke med hensyn til RNAi Knockdown eksperimenter i D. maculatus og andre ikke-modelarter. For det første at sikre, at RNAi vil være effektiv i D. maculatus, den samme stamme af D. maculatus anvendes her, bør anvendes. Der er beviser fra Tribolium castaneum at forskellige stammer viser variation i RNAi phenotypes 24,73 og mutant fænotyper viser ofte afhængighed af genetiske baggrund i modelarter 74-76. Også, der er anekdotiske beviser for stamme-afhængighed i andre protokoller, herunder in situ hybridisering. For det andet, passende timing af indsprøjtning er kritisk for en vellykket RNAi i D. maculatus. Noget counterintuitively er segmacoria lettest gennemtrænges efter neglebånd er helt sclerotized, mindst to dage efter eclosion. Derfor jomfruelige hunner 4 - bør 8 dage efter eclosion anvendes. Ældre kvinder oplever lavere frugtbarhed end nyligt eclosed hunner og er således ikke egnet til injektion. Tredje, injicerede dsRNA kan blive skubbet ud af det indre tryk i den kvindelige underliv. For at minimere muligheden for at miste en stor mængde af dsRNA efter injektion, holde nålen i maven for ~ 5 sek efter injektion, og derefter fjerne det langsomt (6.2.8). I mellemtiden, undgå at trykke på kvindelige underliv under eller kortefter injektion. For at omgå skæve resultater forårsaget af dette problem, injicere mindst 8 hunner for hver dsRNA at få nok afkom (~ 200 embryoner dagligt) for fænotypisk analyse. For det fjerde, højt æg udbytte er vigtig for at levere uvildige data for fænotypisk analyse efter injektion. I gennemsnit hver D. maculatus kvindelige producerer ca. 35-55 embryoner dagligt. Egg afkast afhænger af befolkningens størrelse, kvindelige alder, fugtighed, mad tilgængelighed, temperatur (data ikke vist), og andre miljømæssige faktorer 54. Normalt, hunner lå mere ved 30 ° C end 25 ° C. For det femte kan uklækkede embryoner blive cannibalized af udklækkede larver. Som udklækkede larver er normalt vildtype-lignende eller kun mildt ramt, mens uklækkede embryoner er normalt mere hårdt ramt, kan denne vane D. maculatus larver forårsage skæve resultater i en kvantitativ fænotypisk analyse. Derfor er fjernelsen af ​​udklækkede larver så tidligt som muligt anbefales kraftigt.

Vores laboratorium har fokuseret på D. maculatus segmentering, selv om mange aspekter af denne art-herunder fysiologi, økologi, og skadedyrsbekæmpelse-er af stor interesse. For at studere embryogenese og segmentering, kan en række af mørkt pigmenterede striber på dorsale side af D. maculatus larver tjene som en naturlig markør for unormal udvikling. Desuden kan karakteristisk setae forankret på de pigmenterede striber af larver anvendes som en indikation af segmenter. Disse morfologiske træk, sammen med konstateringen af, at mildt eller moderat påvirket embryoner kan overleve til udklækning, er fordelene ved D. maculatus model til at studere de mekanismer, der er involveret i mønstring den grundlæggende krop planen.

Endelig betydningen af at gennemføre stærkt kontrollerede forsøg, inklusive en negativ kontrol, såsom GFP dsRNA og afprøvning to ikke-overlappende målregioner for hvert gen-er kritisk at undgå fejlfortolkning på grund af effekts injektion per se og off-target effekter. For D. maculatus, 4 - 6 ug (2 pi 2 eller 3 pg / pl) dsRNA blev injiceret i hver hun, og dsRNA'et var 200-250 bp langt. Beløb og andre detaljer i protokollen kan være nødvendigt at optimeres, hvis målrette gener fungerer senere i udvikling eller i forskellige fysiologiske / metaboliske processer. Tidligere fund viste, at RNAi effekter kan overføres til efterfølgende generationer ud over F1-generationen i C. elegans 15. Et mindretal af udklækkede D. maculatus larver med segmentering fejl, der skyldes RNAi kan overleve indtil voksenalderen og kan reproducere. Indledende forsøg har undladt at afsløre åbenlyse mangler i F2-generationen. Fremtidige undersøgelser kan afsløre transgen virkninger af RNAi i denne art.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208 (2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822 (2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674 (2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440 (2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602 (2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32 (2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490 (2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5 (2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

Tags

Genetik RNAi gen knockdown insekt bille, Segmentering pair-reglen gen embryo mikroinjektion dsRNA evo-Devo
Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiang, J., Reding, K., Pick, L.… More

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter