Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle, Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Summary

Her presenterer vi protokoller for oppdrett en mellom-bakterie bille, Dermestes maculatus (D. maculatus) i laboratoriet. Vi deler også protokoller for foster og foreldre RNAi og metoder for å analysere embryonale fenotyper å studere gen-funksjon hos denne arten.

Introduction

I 1998, Brann og Mello rapportert at dobbel-strandet RNA (dsRNA) kan indusere hemming av gen-funksjon i Caenorhabditis elegans 1. Dette svaret utløst av dsRNA ble kalt RNA interferens (RNAi), og slik RNAi-mediert genet Slå ble rapportert å være konservert i dyr, planter og sopp 2-7. I planter og noen dyr, RNAi funksjoner systemisk, noe som betyr at effekten kan spre seg til andre celler / vev hvor dsRNA ikke er direkte innført (oversikt i 8-10). Forskere har gjort bruk av denne endogen cellulær RNAi respons ved å designe dsRNAs å målrette gener av interesse, og dermed slå ned gen-funksjon uten direkte å manipulere genomet (anmeldt i 11-14).

RNAi er et kraftig verktøy for funksjonelle studier på grunn av følgende fordeler. Første, selv med minimal gensekvens informasjon, et gen som kan målrettes ved å bruke RNAi. Dette er spesielt viktig for studies av ikke-modellorganismer som mangler genomisk eller transcriptomic data. For det andre, i organismer der RNAi svaret er robust systemisk, RNAi-mediert genet knockdown kan utføres på nesten alle utviklingsstadiet. Denne funksjonen er svært nyttig for å studere funksjonen av pleiotrope gener. For det tredje, i noen tilfeller, RNAi effekter spre seg til gonadene og avkom, slik at fenotyper er observert i avkom 15,16. Dette fenomenet, kjent som foreldre RNAi (pRNAi), er spesielt fordelaktig for gener påvirker embryoutvikling, som mange avkom som produseres av en enkelt injisert forelder kan undersøkes uten direkte manipulasjon av egg. Av disse grunner, er pRNAi metoden for valg. Men hvis pRNAi er ineffektiv, for eksempel for gener som kreves for oogenesen, deretter embryo RNAi (eRNAi) må benyttes. For det fjerde kan RNAi brukes til å generere tilsvarende en allelisk serie ved at mengden av dsRNA levert kan varieres over et område for å frembringe svake til sterke defekter. En slik gradering av fenotypene kan være nyttig for forståelsen av genfunksjon når genet er involvert i en kompleks prosess og / eller fullstendig tap av funksjon er dødelig. Femte, er levering av dsRNA generelt enkelt og gjennomførbart, spesielt i dyr som viser robuste systemiske RNAi svar. dsRNA kan innføres ved mikroinjeksjon 1,5, fôring / inntak 17,18, soaking, 19,20 og virus / bakterier-mediert levering 21,22. Sjette, i motsetning til enkelte gene targeting / redigering metoder, er det ikke nødvendig å screene for organismer som bærer mutasjonen eller til å utføre genetiske kors å generere homozygote når du bruker RNAi. Derfor, sammenlignet med mange andre teknikker for å studere gen-funksjon, er RNAi rask, billig, og kan brukes for store skjermer 23-25.

Den brede nytten av RNAi tilveiebringer midler for å utføre funksjonelle studier i et bredt spekter av organismer, utvide utvalget av arten tilgjengelig for studier beyond de tradisjonelle modellsystemer som genetiske verktøy har blitt utviklet. For eksempel er undersøkelser ved bruk av ikke-modellsystemer er nødvendig for å gi innsikt i utviklingen av gener og gen-nettverk ved å sammenligne funksjonene til ortologer fra arter som representerer forskjellige utviklings modi eller oppviser forskjellige morfologiske egenskaper 26-29. Disse typer studier vil gi en bedre forståelse av biologisk mangfold, med konsekvenser for både anvendt og grunnleggende forskning.

Å være den største dyregruppen på planeten, insekter gir en flott mulighet til å utforske de mekanismene bak mangfold. I tillegg insekter er generelt små, har korte livssykluser, høy fruktbarhet, og er lett å bak i laboratoriet. I de siste to tiårene, har RNAi blitt brukt i insekter spenner bestillinger, inkludert Diptera (sanne fluer) 5, Lepidoptera (sommerfugler) 30, Coleoptera (biller) 16,31, Hymenoptera (sawfløgner, veps, maur og bier) 32, nebbmunner (teger), Isoptera (termitter) 34, Blattodea (kakerlakker) 35, Orthoptera (sirisser, gresshopper, gresshopper og katydids) 36 og Phthiraptera (lus) 37. Vellykket anvendelse av RNAi har gitt funksjonelle data for studier av mønster i tidlig embryogenese (anterior-posterior aksen 32, dorsal-ventral aksen 28, segmentering 26,38), kjønnsbestemmelse 39,40, kitin / cuticle biosyntese 41, -ekdyson signale 42, sosial atferd 43, og mer. RNAi metoder som er utviklet for forskjellige insektarter kan være av en ekstra fordel ved at de sannsynligvis vil være nyttig for skadedyrbekjempelse (oversikt i 44-46). RNAi effekter vil være genspesifikke, så vel som art-spesifikke, så lenge det ikke-konserverte regioner er valgt for målretting. For gunstige insektarter som honningbier og silkeormer, målretting gener viktige for overlevelsen avvirus eller parasitter for å kontrollere infeksjon kan gi en ny strategi for å beskytte disse artene 47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), felles navn skjul bille, er distribuert over hele verden bortsett fra Antarktis. Som et holometabolous insekt, inkluderer D. maculatus livssyklus embryonale, larve, pupal, og adulte stadier (figur 1). Fordi det strømmer på kjøtt, er D. maculatus brukes i museer å skeletonize døde dyr og rettsmedisinske entomologists kan bruke den til å anslå dødstidspunkt 49,50. D. maculatus strømmer på animalske produkter, inkludert skrotter, tørket kjøtt, ost og puppe / kokonger av andre insekter og dermed forårsaker skade husholdninger, lagret mat, og silke, ost og kjøtt bransjer 51,52. Bruk av RNAi i denne billen kunne gi en effektiv og miljøvennlig måte å minimere sin økonomiske konsekvenser. Vårt laboratorium har brukt D. maculatus som en ny mOdel insekt å studere segmentering 53. I tillegg til å være mottagelig for lab oppdragelse, er D. maculatus av interesse for grunnforskning som det er en middels-bakterie utvikler, noe som gjør det en nyttig art å studere overgangen mellom kort og lang bakterie utvikling.

Figur 1
Figur 1: Life Cycle of D. maculatus. Fotografier av D. maculatus på ulike livsstadier, som angitt. Livssyklusen fra egg til voksen tar tre uker ved 30 ° C, men lenger ved lavere temperaturer. (A, F) fersk lagt embryoer er hvite til lys gul og oval, ca 1,5 mm i lengde. Embryogenese tar ~ 55 timer ved 30 ° C. (B, C og G) Larvene har mørke pigmenterte striper og er dekket med børster. Larvene går gjennom flere instars avhengig av miljø og sin lengde kan strekke seg opp til over 1 cm. (D, H) (E, I) Kort tid etter eklosjonshormon, synes mørk pigmentering over voksen bille kroppen. Voksne kan leve opp til flere måneder, og en hunn kan legge hundrevis av embryoer i løpet av sin levetid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tidligere viste vi at RNAi er effektiv i å slå ned gen-funksjon hos D. maculatus 53. Her vår erfaring oppdragelse D. maculatus kolonier i laboratoriet er delt sammen med trinn-for-trinn-protokoller for både foster og foreldre RNAi oppsett, injeksjon, etter injeksjon omsorg, og fenotypeanalyser. De dsRNA-mediert genet knockdown og analysemetoder introdusert her ikke bare gi detaljert informasjon for å ta opp spørsmål i D. maculatus, men også ha potensial betydning for søker RNAi i andre ikke-modellen bille / insektarter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. stell av D. maculatus

MERK: En kolonien av D. maculatus ble satt opp i forfatternes lab ved hjelp av voksne og larver kjøpt kommersielt. Arten identitet ble bekreftet ved hjelp av DNA-strekkoding 53.

  1. Å sette opp et nytt bur i laboratoriet, spre et tynt lag med sagflis i et mellomstort insekt bur (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Plasser en ~ 10 x 6 x 3 cm 3 del av isopor i buret å la larvene skjul for pupation. Tilsett 20 - 50 biller (enten voksne eller sent stadium larver). Biller vil gjemme seg i trespon.
  2. Legg våt kattemat i en petriskål eller en veie båt. Dekk buret med mesh klut og plassere buret i en inkubator.
  3. For å opprettholde en ynglekoloni i laboratoriet, stille inn temperaturen mellom 25 og 30 ° C. D. maculatus vokser fortere ved høyere temperaturer, men den fremmer også veksten av sopp og midd. For å opprettholde en legesdig koloni ved å bruke 25-28 ° C for regelmessig vedlikehold lager og 30 ° C for hurtig voksende koloni. Livssyklusen tar cirka tre uker til fire måneder, avhengig av miljøfaktorer 50 (figur 2).

Figur 2
Figur 2: D. maculatus Lab Colony. Fotografi av en typisk D. maculatus insekt bur vises. Sagflis er spredt til å la billene skjule. Kattemat tilsettes i en liten petriskål eller veie båt. Styrofoam er plassert inn i buret som et fristed for endelig stadium larver til forpupper seg. Buret som vises her er 30,5 x 19 x 20,3 cm 3 og huser noen hundre larver, pupper og voksne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Leave egg i buret til å modnes. Å utvide kolonien, etablere nye bur med egg (samlet inn som beskrevet i punkt 2), larver eller voksne, som ovenfor. D. maculatus legger egg hele buret, spesielt i nærheten av matkilde.
  2. Bytt våt kattemat om to ganger i uken.
    MERK: På grunn av ubehagelig lukt av våt kattemat, ble alternative matkilder også testet (se diskusjon).

2. Embryo Collection

  1. For å sette opp en samling, skille minst 50 hanner og 50 hunner fra kolonien. Unge voksne er best. Plasser voksne i en mini-størrelse bur (17,8 x 10,2 x 12,7 cm 3) uten trespon. Legg kattemat i en veie båt.
  2. Før du starter innsamling, sjekk buret nøye for eventuelle embryoer nåværende og fjerne dem. Sett en strukket bomull ball inn i buret, og la buret i en 30 ° C inkubator. Etter passende tidsvinduet, vil bomullsdott være klar for embryo samling.
  3. Bretteet stykke svart bygging papir (A4-størrelse) i to for å skape et press, og deretter brette.
  4. Fjern strukket bomullsdott fra buret. Fjern voksne fra bomullsdott og legg dem tilbake i buret.
  5. Mens knipe på strukket bomullsdott veldig forsiktig, rive den fra hverandre sakte i tynne bomullstråder å la eggene falle på svart papir.
    MERK: D. maculatus embryoer er skjør og vanskelig å se i bomull. De kan lett knuses hvis du holder bomullsdott for hardt.

3. dsRNA Forberedelse

  1. DNA Mal Forberedelse til dsrna Synthesis
    1. Kjør 4. - 6. 50 pl PCR-reaksjoner ved anvendelse av primere som inneholder T7-promotorsekvenser i begge 5 'ender for å amplifisere DNA-templat i henhold til produsentens protokoll.
    2. Rens PCR-produkt med en kommersiell PCR rensing kit, etter produsentens anvisninger. Den ideelle endelig konsentrasjon av DNA-templat er ≥100 ng / mL.
  2. Injeksjon Buffer Klargjøring
    1. Forbered 100 ml injeksjon buffer (0,1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM KCl). Juster pH til 6,8 med 5 M NaOH.
    2. Oppbevar alikvoter ved -20 ° C.
  3. dsRNA Synthesis
    1. Sett opp en reaksjon i et 0,2 ml PCR rør på is og gjennomføre en in vitro transkripsjon reaksjon med T7 polymerase, etter produsentens anvisninger, ved hjelp av ~ 500 ng mal per reaksjon.
    2. Inkuber røret ved 37 ° C over natten.
    3. Fordøye DNA mal med DNase, etter produsentens anvisninger.
    4. Oppvarme røret til 94 ° C og hold ved 94 ° C i 3 minutter.
    5. For å binde den dsRNA, langsomt avkjøle røret ved 1 ° C / min inntil den når 45 ° C etter 1 time.
      MERK: Trinnene 3.3.2 via 3.3.5 kan utføres i et termo.
    6. Til etanol utfelling av dsRNA, tilsett 280 mLRNase fritt vann til 20 ul reaksjon for å justere til et sluttvolum på 300 ul. Tilsett 30 ul 3 M NaOAc (pH 5,2) og 650 ul etanol. Plasser røret på -20 ° C fryseren over natten.
    7. Etter sentrifugering ved 15 682 xg i 30 min ved 4 ° C, vaskes den dsRNA pellet med 70% etanol. Tørr pellet og oppløses i 20 ul injeksjon buffer.
    8. Måle konsentrasjonen av dsRNA ved hjelp av et spektrofotometer ved 260 A. Den ideelle konsentrasjonen er 3-5 ug / ul. Kontrollere kvaliteten ved å kjøre 5 ul av en 1:25 fortynning av dsRNA på en 1% agarosegel ved 90 V i 30 minutter. Et enkelt bånd med forventet størrelse vil være lett synlig.
    9. Oppbevar dsRNA ved -20 ° C eller kaldere.
      MERK: For hver RNAi knockdown eksperiment, inkluderer en kontroll dsRNA, som ikke kan forventes å påvirke prosessen som studeres. GFP dsRNA er en utmerket kontroll for de fleste eksperimenter. Forbered og injisere kontroll dsRNA side-by-side med experimental dsRNA.

4. Montering av Microinjector og micromanipulator

MERK: Se figur 3.

  1. Koble nitrogen eller annen lufttilførsel til trykket inngangen av en pneumatisk pumpe instrument. Hvis en pneumatisk pumpe ikke er tilgjengelig ved å presse ved hjelp av en 50 ml sprøyte som er koblet til fin-rør.
  2. Koble en fot bryteren til den eksterne kontakten på pumpen for å kontrollere utløsertrykket flyt.
  3. Fest et glass kapillær holder til på utløsertrykkporten av pumpen med tube.
  4. Fest kapillær holderen på en micromanipulator nær en dissekere mikroskop.

5. Embryonic RNAi

MERK: Figur 4 viser et flytskjema av D. maculatus embryonale RNAi.

  1. eRNAi Forberedelse
    1. Forbered et embryo samle petriskål lokk (90 mm diameter). Plassere et stykke svart filterpapir til cover innsiden av lokket. Sett en standard objektglass på svart papir.
    2. Spe dsRNA til passende konsentrasjon med injeksjon buffer. Bruk 2-3 ug / ul for innledende forsøk. Hold alltid dsRNA på is før injeksjon.
    3. Legg konditorfarge på 1:40 fortynning til dsRNA og pipette forsiktig flere ganger for å blande godt.
  2. Samle embryoer for Injection
    MERK: Ved 25 ° C, kjerner i embryoer 6 - 8 timers Etter egglegging (AEL) migrerer mot egget periferien 53. En cellulær blastoderm er etablert innen 8-10 timers AEL 53. For å sikre embryo før mobil blastoderm scenen brukes til injeksjon, 0-3 timers AEL embryoer er anbefalt for bruk 53. Embryo samling, forberedelse og injeksjon vanligvis tar mindre enn 2 timer om glasskapillærer er i god form. Derfor kan hele prosessen være fullført innen fem timer AEL.
    1. Samle embryoer som beskrevet i trinn 2.2-2,5.
    2. Trykk på svart bygging papir til å overføre embryo til å samle petriskål lokk.
    3. Hold deg dobbeltsidig tape langs kanten av rasgropa.
    4. Ved hjelp av en pensel, justere embryoene på båndet vinkelrett på lysbildet kant med den fremre eller bakre enden på kanten. Merk at fremre og bakre ender av tidlige embryoer er ikke lett gjenkjennelig, og dermed i gjennomsnitt halvparten vil bli injisert i bakre enden som er ideelt.
  3. Lasting av dsRNA i glasset Capillary
    1. Ta opp 2 - 4 pl av dsRNA i en 20 mL microloader pipette.
    2. Sett spiss inn i en på forhånd trukket glasskapillar (betegnet som p) og forsiktig pipette dsRNA løsningen inn i kapillaren. Forbered nåler fra kommersielle glasskapillærer ved hjelp av en mikropipette avtrekker. Et eksempel på en ideell trukket nål er vist i figur 5. Lengden og avsmalning av nåler kan ha behov for å være optimalisert after injeksjon studier.
    3. Fest glasskapillær inn i glasskapillære holderen.
    4. Monter kapillær holderen inn i micromanipulator.
  4. Injisering dsRNA inn Embryoet
    1. overføre nøye lysbildet med embryo på scenen av dissekere mikroskop.
    2. Flytt lysbilde for å bringe en embryo til midten av feltet og fokus mikroskop.
    3. Plasser tuppen av kapillær med mikromanipluatoren mens du ser inn dissekere mikroskop. Bringe spissen nær slutten av den første embryoet i rekken.
    4. Slå på nitrogen eller annen lufttilførsel.
    5. Sett solenoid inngangsvelgeren på vakuum.
    6. Juster utløsertrykkregulatoren til 10-15 psi. Juster trykket, avhengig av apparaturen.
    7. Åpne kapillære om nødvendig. Når spissen er åpen, vil den fargede dsRNA løsningen fylle spissen.
    8. Flytt kapillær spissen frem til å punktere embryo. Hvis trykkinnstilling er ideell, vil ingen embryo fluid strømme inn i kapillaren.
    9. Tråkk på pedalen for å løse ut dsRNA løsning i embryoet til en passende mengde løsning kommer ut. Figur 5 viser eksempler på embryo morfologi etter passende og upassende mengder av løsningen har blitt injisert.
    10. Hold kapillær spissen inne i embryo for ~ 2 sekunder, og deretter fjerne den.
    11. Flytt kapillær til neste embryo og gjenta trinn 5.4.8 - 5.4.10 til alle embryoer injiseres. Endre glass kapillær hvis det blir tett eller pauser.
  5. Post-injeksjon Recovery og Inkubasjon
    1. Etter injeksjon, plasserer lysbildet i en petriskål.
    2. Legg en våt bomullsdott til petriskål. Ikke la bomullsdott berøre lysbildet.
    3. Dekk til petriskål og pakk den med forsegling film. Merk fatet med navnet på dsRNA, konsentrasjon, dato, klokkeslett og antall injiserteembryoer.
    4. Sett petriskål i en 30 ° C inkubator inntil embryoer luke.

6. Foreldre RNAi

  1. Isolere puppe for pRNAi
    1. Samle puppe fra kolonien.
    2. Sorter mannlige og kvinnelige puppe henhold mikroskop (se figur 6). Oppbevar dem i to separate petriskåler i en 30 ° C inkubator for å sikre at ingen parring før injeksjon.
    3. Sjekk hver dag for eclosed voksne. Pupation tar vanligvis 5 - 7 dager ved 30 ° C.
    4. Overfør eclosed menn og kvinner (se figur 6) til to separate petriskåler og mate dem kattemat annenhver dag før de er klar for injeksjon.
    5. Fortsett til injeksjon en gang det er nok kvinner og menn i passende alder. Kvinner 4 til 8 dager etter eklosjonshormon er best. For en typisk analyse, 8 - blir 12 hunner benyttes. Et likt antall menn er nødvendig for parring 54.
    Injisering dsRNA inn Kvinne Magen
    1. Forbered dsRNA på is (5.1.2 og 5.1.3).
    2. Fest en 32-gauge nål til en 10 mL sprøyte.
    3. Bedøver kvinner på CO 2 scenen.
    4. Last dsRNA oppløsningen inn i sprøyten uten å ta opp eventuell luft.
    5. Hold en kvinnelig ventral siden opp med den ene hånden og hold sprøyten med den andre.
    6. Forsiktig penetrere segmacoria (membran) mellom sternites 2 og 3 med spissen av nålen. Figur 7 viser et kvinnelig under injeksjon. Hvis nålen ikke trenger inn i vevet lett, vinkel nålen oppover og sakte ned. Sett omtrent 2 mm av nålen inn i kroppen.
    7. Sjekk sprøyten skala mens sakte skyve stempelet, injisere ~ 2 mL per kvinne.
    8. Etter injeksjon, holde nålen stille i minst 5 sek før den fjernes fra kvinnens underliv.
    9. Overfør de injiserte kvinner til en petriskål (90 mm diameter) og mate med kattemat.
    10. Merk petriskål med dsRNA navn, mengde injisert, dato og antall kvinner.
  2. Post-injeksjon Recovery og Mating
    1. Inkuber petriskål i en 30 ° C inkubator.
    2. Etter 24 timer, overføring injisert hunner til en mini-merd.
    3. Legg til buret like mange uninjected unge menn, og merke buret.
    4. Legg en veie båt med kattemat inn i buret.
    5. La bur i en 30 ° C inkubator for å tillate parring. Etter 24 timer, bør hunner begynne å legge egg og embryo kan bli samlet daglig eller ved ønskede tidsintervaller.

7. fenotypeanalyser etter RNAi

MERK: Ved 30 ° C, tar det ~ 55 timer for egg å klekke 50.

  1. eRNAi Livskraftig Analysis
    1. Beregn luke hastighet ved å sammenligne antallet av larver klekket til den totale number av injiserte embryoer. Sørg for å inkludere en negativ kontroll injeksjon som embryoer kan bli skadet eller drept av injeksjonsprosedyren. Typiske luke varierer fra 30% - 60%. Vokt dere for klekket larver spiser unhatched egg.
  2. pRNAi Livskraftig Analysis
    MERK: Hvis kvinnelige levedyktighet er påvirket av genet målrettet av RNAi, kvinner injisert med spesifikk dsRNA, men ikke negativ kontroll dsRNA vil begynne å dø. Hvis eggproduksjon eller egglegging er påvirket, vil kvinner utvise delvis eller fullstendig sterilitet. Resultat kvinnelige overlevelse sammenlignet med negative kontroller eller sammenligne totale antall egg lagt av eksperimentelle og kontroll kvinner (7.2.3).
    1. Sett opp embryoinnsamlings følgende trinn 2.2.
    2. Etter 24 timer samle embryo følgende trinn 2.4 - 2.5.
    3. Telle det totale antall av embryoene.
    4. Overfør embryoene til en 90 mm petriskål. Merk petriskål med genet målrettet, innsamling dato og antall embryoer. Inkuber embryoene i en C inkubator 30 ° før de klekkes. Siden klekket larver lever på unhatched embryo, sjekk petriskål ofte og separat klekket larver fra unhatched embryoer ved hjelp av tang (se diskusjon).
    5. Tell antall klekket embryoer og beregne luken rate.
  3. Undersøke Cuticle Defekter i klekket Larver
    1. Samle skraverte larver i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    2. I en avtrekkshette, tilsett 1 ml Fiksering Solution.
    3. La mikrosentrifugerør ved 4 ° C i det minste over natten for å la løsningen trenge gjennom larve vev.
    4. For å visualisere, fjerne så mye fiksativ fra røret som mulig.
    5. Skyll larver minst tre ganger med PBST.
    6. Overføring larver til en multi-brønn glassplate med PBST ved anvendelse av en P-1000 pipettespissen med enden avskåret for å utvide den.
    7. Under en dissekere mikroskop, strekke larver bruker pinsett til å undersøke defekter. Jegt er kritisk til å strekke ut larver å undersøke defekter som deres organer kontrakt i fiksativ.
  4. Undersøke Cuticle Defekter i unhatched Larver
    Merk: Denne fremgangsmåten er nyttig for undersøkelse av tidlige embryonale fenotyper, spesielt for embryoer som ikke overlever til klekking.
    1. For pRNAi, legge PBST inn i petriskål (7.2.4) og overføre unhatched embryo til et 1,5 ml mikro rør ved hjelp av en P-1000 pipette med slutten avskåret. For eRNAi, legge PBST inn i petriskål (5.5.4), børste unhatched embryo av objektglass og overføre dem til en mikro tube.
    2. Fest embryoer med Fixation Solution og skyll dem med PBST for visualisering følge trinn 7.3.2 - 7.3.6.
    3. Bruk pinsett, dissekere embryoer ut av eggeskallet under et dissekere mikroskop i PBST.
    4. Overfør embryoene tilbake til 1,5 ml mikrosentrifugerør (~ 200 mL av embryoer i hver tube).
    5. Fjern så mye solution som mulig.
    6. Tilsett 1 ml av 90% melkesyre / 10% EtOH. La sentrifugerøret i en 60 ° C inkubator i det minste over natten.
      MERK: Embryoer kan stå ved 60 ° C i flere dager.
    7. For å montere embryoene, pipette dem på et objektglass ved hjelp av en P-1000 pipette med slutten avskåret.
    8. plassere manuelt embryoene med pinsett til en ideell orientering.
    9. Dekk embryoene med en cover-slip og visualisere i henhold til mikroskopet med DIC.
  5. Undersøke cellulært og molekylært Defekter
    MERK: Denne fremgangsmåten er nyttig for å undersøke de underliggende årsakene til skjel fenotyper eller dødelighet som ikke er ledsaget av cuticle defekter.
    1. For pRNAi, separate embryoer fra bomullsdotter på aktuelle utviklingsstadiet og overføre dem til et embryo samle kurv. Samlingen kurv kan være den samme eller lik den som brukes for Drosophila embryo samlinger.
      1. Lageegget kurven fra en 25 ml plast scintillasjonskyvette med bunnen av hetteglasset fjernet, og en sirkel kuttet ut av lokket (omtrent 1 cm diameter). Legg en sirkel av super fin mesh ca 2,5 cm i diameter på innsiden av lokket, og deretter skru scintillasjonsflaske på og bruke opp-ned.
      2. Ettersom maskene lett kan fjernes når embryoene blir vasket, dyppe duken i et mikrosentrifugerør med vann for å gjenvinne eventuelle embryoer stikker til nettingen.
    2. For eRNAi, på riktig tidspunkt, legger PBST til petriskål. Børst embryoene av objektglass og overføre dem til et embryo innsamling kurv.
      MERK: Fiksering, in situ hybridisering, antistoffarging, og nukleær farging protokoller kan bli funnet i Xiang et al. 2015 53.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forfatterne 'lab har brukt RNAi teknologi for å studere den funksjonelle utviklingen av gener som regulerer segmentering i insekter 53,55. Mens alle insekter er segmentert, genene regulerer denne prosessen synes å ha skilt lag under insekt stråler 26,38,56-63. Genetiske skjermer i Drosophila identifisert et sett med ni par-regelen segmentering gener som er ansvarlig for å fremme dannelsen av kroppens segmenter 64-70. Her er den ortolog av en av disse genene, sammenkoblet (PRD), blir brukt til å dokumentere anvendeligheten av RNAi for å studere genfunksjon i D. maculatus.

eRNAi og pRNAi ble hver effektive i å demonstrere roller for DMAC - PRD i segmentet formasjon i denne arten. 2-3 ug / ul av dsRNA utformet for å målrette DMAC - PRD (figurene 8B, 8D og 8F GFP dsRNA, injisert som negativ kontroll (figur 8A, 8C og 8E).

Kontroll avkom klekket med en pigmentert stripe per segment. Nabopigmenterte striper ble separert ved en ikke-pigmentert gap (figur 8A). Etter PRD pRNAi, berørte avkom klekket med fusjonerte nabopigmenterte striper, som angir segmentgrensene var defekt (8B). Avhengig av fenotypiske alvorlighetsgrad, ett eller flere fusjoner ble påvist i berørte larver. Likevel, fusjoner konsekvent dukket opp på grenseområdene mellom T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, som indikerer pair-regel-lignende defekter. Cuticle fenotyper etter PRD knockdown viste tap av abdominal segmenter samt kortere kroppslengde (figur 8D). Engrailed (No) antistoff farging ble utført for å undersøke molekylære defekter i tidligembryoer etter PRD knockdown. Mens kontroll embryoer viste stripete En uttrykk med samme intensitet i alle segment (figur 8E), ble redusert En uttrykk oppdaget i alternative striper i avkom fra DMAC-PRD dsRNA injisert hunner (stjernene i figur 8F). Mønsteret av redusert En uttrykk er i overensstemmelse med den defekte skjelmønsteret observert i berørte klekket larver. For mer detaljerte resultater av fenotyper etter PRD knockdown i D. maculatus, se Xiang et al. 2015 53.

Figur 3
Figur 3: Injeksjon Apparatus. Fotografi av disseksjon mikroskop og micromanipulator brukes til å injisere D. maculatus embryoer er vist. Nitrogentilførsel er forbundet med trykkinngangsporten i en pneumatisk pumpe. Glasskapillar holder er forbundet med den eject trykkporten av pumpen. Fot bryteren er koblet til pumpen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: En Flytskjema for D. maculatus Embryonic RNAi. (AD) Samle embryoer for injeksjon. Kvinner lå embryoer (orange) i bomullsdotter (grå sirkel). Separate embryoer fra bomull baller og la dem slippe på et stykke svart bygging papir. Hvite linjer indikerer tårer i bomullsdott. Overfør embryoene til en oppsamlingspetriskål lokk, foret med svart papir. (E, F) Injisering dsRNA i embryoer. Juster embryoer på lysbilder på dobbeltsidig tape og injisere dem individuelt under et dissekere mikroskop. Nål med grønn konditorfarge vises. (GJ) Post-injeksjon utvinning og incubasjon. Plasser en våt bomullsdott i petriskål for å gi fuktighet. Dekk til petriskål og pakk den med forsegling film (lys blå). Sett petriskål i en inkubator og fjerne klekket larver for fenotypeanalyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: God vs Bad embryonale Injeksjon eksempler. (A) ikke-injiserte embryo. (B) Embryo injisert med for lite dsRNA. (C) Embryo injisert med passende mengde av dsRNA. (D) Broken embryo med overfylte dsRNA forårsaket av over-injeksjon. Konditorfarge ble innført i dsRNA for visualisering. (E) Eksempler på trakk kapillarrør brukes som nåler for injeksjon. Legg merke til taper og tips lengde feller to eksempler på funksjonelle nåler. Skala barer for AD representerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: voksne menn og kvinner og pupper. (A) Ventral visning av en mannlig puppe. (A ') Forstørrelse av bakre del av A. (A ") Illustrasjon av mannlige puppe genitalia. (B) Ventral visning av en kvinnelig puppe. (B') Forstørrelse av bakre del av B. Kvinne puppe har to genital papiller (hvit piler). (B ") Illustrasjon av kvinnelige puppe genitalia. (C) Ventral visning av en mannlig voksen. (C ') Forstørret visning av bakre del av C. Merk at mannlige voksne har Trident-lignende kjønnsorgan og ensirkulær lapp-aktig struktur på 4 th sternite (hvite og svarte pilene, henholdsvis). (D) Ventral visning av en kvinnelig voksen. (D ') Forstørret visning av bakre del av D. For alle paneler, skala barer indikerer 1 mm. For detaljer, se Xiang et al. 2015 53. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7: En Kvinne under injeksjon. Kvinner er bedøvet og plassert ventral siden opp. En nål trenge inn i segmacoria mellom 2. og 3. sternites å injisere dsRNA vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 8: Representative fenotyper etter DMAC-PRD pRNAi. (A) Spenning injeksjon. Lateral visning av en klekket villtype-lignende GFP pRNAi avkom med tre thorax segmenter og ti mage segmenter. Hvert segment har setae og pigmenterte striper. (B) Lateral visning av en skravert PRD pRNAi avkom. Gapet mellom merket nabopigmenterte striper er smalere eller helt mangler. (C) Cuticle fenotypen til en unhatched kontroll villtype-lignende embryo. (D) Cuticle fenotype av en unhatched PRD pRNAi avkom med færre mage segmenter. (E, F) dissekert germband fra: (E) Styre har GFP pRNAi jevnt uttrykt En i hvert segment, er (F) PRD pRNAi, En uttrykk redusert i alternative segmenter (skjult). For all rutenls, skala barer indikerer 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens et fåtall avanserte modellsystemer (mus, fluer, ormer) ble utviklet i løpet av det 20. århundre, har det 21. århundre sett en bølge av nye dyre systemer blir utviklet i laboratorier over hele verden. Disse nye systemene tillate forskere å løse komparative, evolusjonære spørsmål som ikke kan probet med kun de 'standard' modellsystemer. Dette utplassering av nye modeller krever den raske utviklingen av metoder for lab dyrking, genet identifikasjon og funksjonelle tilnærminger i nye arter. Her ble prosedyrer for oppdrett D. maculatus i laboratoriet og trinn-for-trinn-protokoller for embryonale RNAi, foreldre RNAi, og fenotypeanalyser i denne billen presentert. Målet er at disse beskrivelsene oppmuntre andre til å bruke D. maculatus i sine egne eksperimenter og å gjøre bruk av de metoder som presenteres her for å utvikle flere nye modellarter.

Mens D. maculatus lab kolonier er utrolig lett å vedlikeholde, en begrensning av oppdragelse denne arten er den ubehagelige lukten av våt kattemat gitt til biller som sin kilde til mat. For å unngå dette, alternative matvarer som for eksempel myse / soya protein pulver, ost, malt hundemat, og pulverisert melk, ble testet med eller uten fuktig bomull for å endre fuktighet. Bakke hundemat var den mest effektive alternativ, og kan brukes til vanlig mating koloni. Survival var utmerket (> 90%) fra egg til voksen i bur fostret på bare tørr hundemat i 80% relativ fuktighet, med eller uten våt bomull til. Men supplere denne dietten med våt kattemat når innsamling av egg for å øke fruktbarheten kan være nødvendig når du samler inn store mengder egg. Hvis hunden mat er brukt, bør gammel mat fjernes regelmessig, som klimaanlegg hundemat ble funnet å hemme egglegging 54. Hundemat kibbles (KR, foreløpige resultater), kork, tre, papir og andre materialer kan også brukes som oppholdssted 71.Interessant, biologisk nedbrytning av Styrofoam hjelp mealworm bille larver har blitt rapportert 72. Derfor denne ble testet med hensyn til D. maculatus larver. Young D. maculatus larver levde til voksen alder med bare Styrofoam eller asbestholdige materialer og våt bomull (data ikke vist), men om de spiser og fordøye disse materialene gjenstår å fastslå.

Denne rapporten er den første detaljert protokoll for gjennomføring av funksjonelle genetiske studier i D. maculatus. Bruken av RNAi her representerer en utvidelse av denne teknikken i et nytt modellsystem. Flere konkrete observasjoner er verdt å merke seg i forhold til RNAi knockdown eksperimenter i D. maculatus og andre ikke-modellarter. Først, for å garantere at RNAi vil være effektiv i D. maculatus, den samme stamme av D. maculatus anvendt her bør benyttes. Det er bevis fra Tribolium castaneum at ulike stammer viser variasjon i RNAi phenotypes 24,73 og mutante fenotyper viser ofte avhengighet genetisk bakgrunn i modellarter 74-76. Også er det anekdotiske bevis for strekk avhengighet i andre protokoller, inkludert in situ hybridisering. For det andre er riktig tidspunkt for injeksjon avgjørende for vellykkede RNAi i D. maculatus. Noe counterintuitively er segmacoria lettest trengt etter at skjellaget er helt sclerotized, minst to dager etter eklosjonshormon. Derfor jomfruelige kvinner 4 - bør åtte dager etter eklosjonshormon brukes. Eldre kvinner opplever lavere fruktbarhet enn nylig eclosed kvinner, og dermed er ikke egnet for injeksjon. For det tredje, injisert dsRNA kan bli skjøvet ut av det indre trykk av den kvinnelige underliv. For å minimere muligheten for å miste en stor mengde dsRNA etter injeksjon, holde nålen på magen for ~ 5 sekunder etter injeksjon, og deretter ta det sakte (6.2.8). I mellomtiden, unngå å trykke på kvinnens underliv under eller kort tidetter injeksjon. For å omgå partisk resultater som følge av denne saken, injiserer minst 8 kvinner for hver dsRNA å få nok avkom (~ 200 embryoer daglig) for fenotypeanalyser. For det fjerde er høy egg utbytte viktig for å gi objektive data for fenotypeanalyser etter injeksjon. I gjennomsnitt produserer hver D. maculatus kvinnelige ca 35-55 embryoer daglig. Egg avkastning avhenger av bestandsstørrelse, kvinne alder, fuktighet, næringstilgang, temperatur (data ikke vist), og andre miljøfaktorer 54. Vanligvis hunner lå mer ved 30 ° C over 25 ° C. Femte, kan unhatched embryoer bli cannibalized av klekket larver. Som klekket larvene er vanligvis villtype-lignende eller bare mildt rammet, mens unhatched embryoer er vanligvis mer alvorlig rammet, kan denne vanen av D. maculatus larver forårsake partisk resultater i en kvantitativ fenotypeanalyser. Derfor er fjerning av klekkes larver så tidlig som mulig på det sterkeste.

Vår lab har fokusert på D. maculatus segmentering, selv om mange aspekter av denne arts inkludert fysiologi, økologi, og skadedyrbekjempelse-er av stor interesse. For å studere embryogenese og segmentering, kan en rekke mørkt pigmenterte striper på ryggsiden av D. maculatus larver fungere som en naturlig markør for unormal utvikling. Dessuten kan karakteristisk børstene forankret på de pigmenterte striper av larver brukes som en indikasjon på segmentene. Disse morfologiske egenskaper, sammen med det funn at mildt eller moderat påvirket embryo kan overleve til klekking, er fordelene med D. maculatus modell for å studere de mekanismer som er involvert i mønstring av grunnleggende spanteriss.

Endelig-er genet viktigheten av å gjennomføre svært kontrollerte eksperimenter-inkludert en negativ kontroll som GFP dsRNA og testing av to ikke-overlappende målgrupper regioner for hvert kritisk for å unngå feiltolkning på grunn av effekts av injeksjon per se og off-target effekter. For D. maculatus, 4. - 6. ug (2 ul av 2 eller 3 ug / ul) dsRNA ble injisert inn i hver hunn og dsRNA var 200-250 bp langt. Beløp og andre detaljer i protokollen må kanskje være optimalisert hvis targeting gener fungerer senere i utvikling eller i ulike fysiologiske / metabolske prosesser. Tidligere funn har vist at RNAi effekter kan overføres til senere generasjoner utover F1-generasjonen i C. elegans 15. Et mindretall av klekket D. maculatus larver med segmenteringsfeil på grunn av RNAi kan overleve til voksen alder og kan gjengi. Innledende forsøk ikke klarte å avdekke åpenbare mangler i F2 generasjonen. Fremtidige studier kan avsløre transgenerational effekter av RNAi i denne arten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208 (2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822 (2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674 (2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440 (2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602 (2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32 (2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490 (2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5 (2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

Tags

Genetikk RNAi genet knockdown insekt bille, Segmentering par-regelen genet embryo mikroinjeksjon dsRNA evo-devo
Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiang, J., Reding, K., Pick, L.… More

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter