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Genetics

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Summary

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Introduction

Em 1998, Fire and Mello relatado que o RNA de cadeia dupla (ARNcd) pode induzir a inibição da função do gene em Caenorhabditis elegans 1. Esta resposta desencadeada por ARNdc foi denominado ARN de interferência (RNAi), e tal silenciamento de genes mediada por ARNi foi relatado para ser conservado em animais, plantas, fungos e 2-7. Em alguns animais e plantas, as funções de ARNi sistemicamente, o que significa que o efeito pode espalhar a outras células / tecidos onde ARNcd não é introduzida directamente (revisto em 8-10). Os cientistas fizeram uso desta resposta RNAi celular endógeno através da concepção de dsRNAs para alvejar genes de interesse, batendo assim, reduzir a função do gene, sem manipular diretamente o genoma (revisto em 11-14).

RNAi é uma poderosa ferramenta para estudos funcionais devido às seguintes vantagens. Em primeiro lugar, mesmo com informação da sequência do gene mínimo, um gene pode ser alvejado usando RNAi. Isto é especialmente importante para rudies de organismos não-modelo que faltam dados genômicos ou transcriptomic. Em segundo lugar, em organismos em que a resposta é robustamente ARNi sistémica, RNAi mediada por silenciamento de genes pode ser realizado em praticamente qualquer estágio de desenvolvimento. Este recurso é muito útil para estudar a função de genes pleiotrópicos. Em terceiro lugar, em alguns casos, os efeitos de ARNi para espalhar as gónadas e descendência, tais fenótipos que são observadas em prole 15,16. Este fenómeno, conhecido como parental RNAi (pRNAi), é especialmente vantajoso para os genes que afetam o desenvolvimento embrionário, tão numerosos descendentes produzidos por um único pai injetada podem ser examinados sem manipulação direta de ovos. Por estas razões, pRNAi é o método de escolha. No entanto, se pRNAi é ineficaz, por exemplo, para os genes necessários para a oogénese, então embrionário RNAi (eRNAi) deve ser usado. Em quarto lugar, o RNAi pode ser utilizado para gerar o equivalente a uma série de alelos em que a quantidade de ARNcd entregues pode ser variada ao longo de uma gama para produzir fraco para defeitos fortes. Tal gradação de fenótipos podem ser úteis para a compreensão da função do gene quando o gene está envolvido num processo complexo e / ou perda completa da função é letal. Em quinto lugar, a entrega de dsRNA é geralmente fácil e viável, especialmente em animais que mostram robustos respostas RNAi sistémicos. dsRNA pode ser introduzido por microinjeção 1,5, alimentação / ingestão 17,18, imersão, 19,20 e vírus / entrega de bactérias mediadas 21,22. Em sexto lugar, ao contrário de alguns genes métodos de segmentação / edição, não há necessidade para triagem de organismos portadores da mutação ou para realizar cruzamentos genéticos para gerar homozigotos ao usar RNAi. Portanto, em comparação com muitas outras técnicas para o estudo da função dos genes, RNAi é rápido, barato, e pode ser aplicado para telas de grande escala 23-25.

A ampla utilidade de RNAi fornece meios para realizar estudos funcionais em uma ampla gama de organismos, ampliando a gama de espécies disponíveis para estudo beyond os sistemas de modelos tradicionais para as quais foram desenvolvidas ferramentas genéticas. Por exemplo, estudos usando sistemas não-modelo são obrigados a dar insights sobre a evolução de genes e redes de genes, comparando as funções de ortólogos de espécies que representem os diferentes modos de desenvolvimento ou exibindo características morfológicas distintas 26-29. Estes tipos de estudos irá proporcionar uma melhor compreensão da diversidade biológica, com impactos para a pesquisa aplicada e básica.

Sendo o maior grupo de animais no planeta, insetos fornecem uma grande oportunidade para explorar os mecanismos diversidade subjacente. Além disso, os insetos são geralmente pequenos, têm ciclos de vida curtos, alta fecundidade, e são fáceis de criar em laboratório. Nas últimas duas décadas, RNAi tem sido aplicado com sucesso em insetos abrangendo encomendas, incluindo Diptera (moscas verdadeiras) 5, Lepidoptera (borboletas e mariposas) 30, Coleoptera (besouros) 16,31, Hymenoptera (Sawfmentiras, vespas, formigas e abelhas) 32, Hemiptera (percevejos), Isoptera (cupins) 34, Blattodea (baratas) 35, Orthoptera (grilos, gafanhotos, gafanhotos e gafanhotos) 36 e Phthiraptera (piolhos) 37. Aplicação bem sucedida de RNAi forneceu dados funcionais para estudos de padronização na embriogênese precoce (eixo ântero-posterior 32, eixo dorso-ventral 28, segmentação 26,38), a determinação do sexo 39,40, quitina / cutícula biossíntese 41, ecdisona sinalização 42, comportamento social 43, e muito mais. ARNi métodos desenvolvidos para diferentes espécies de insectos pode ser um benefício adicional na medida em que eles são susceptíveis de serem úteis para o controlo de pragas (revisto em 44-46). efeitos de RNAi será tão bem como específicas de espécies específicas de gene, enquanto regiões não conservados são escolhidos para segmentação. Para as espécies de insetos benéficos como abelhas e bichos da seda, tendo como alvo genes vitais para a sobrevivência devírus ou parasitas para controlar a infecção pode proporcionar uma nova estratégia para proteger estas espécies 47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), nome comum hide besouro, é distribuído em todo o mundo, exceto na Antártida. Como um inseto holometabolous, o ciclo de vida D. maculatus inclui embrionário, larval, pupal e estágios adultos (Figura 1). Porque se alimenta de carne, D. maculatus é usado em museus para esqueletizar animais mortos e entomologistas forenses podem usá-lo para estimar o tempo de morte 49,50. D. maculatus alimenta de produtos de origem animal, incluindo carcaças, carne seca, queijo e as pupas / casulos de outros insetos e, assim, provoca danos às famílias, alimentos armazenados, e a seda, queijo e indústrias de carne 51,52. Aplicando RNAi neste besouro poderia fornecer uma maneira eficiente e ambientalmente amigável para minimizar o seu impacto económico. Nosso laboratório tem usado D. maculatus como um novo modelo inseto para estudar segmentação 53. Além de ser passível de criação do laboratório, D. maculatus é de interesse para a investigação fundamental, pois é um desenvolvedor intermediário de germes, tornando-se uma espécie úteis para estudar a transição entre o curto eo desenvolvimento a longo germe.

figura 1
Figura 1: Ciclo de Vida de D. maculatus. Fotografias de D. maculatus em diferentes fases da vida, como indicado. O ciclo de vida de ovo a adulto demora três semanas a 30 ° C, mas mais tempo em temperaturas mais baixas. (A, F) de embriões recentemente estabelecidas são de cor branca a amarelo claro e oval, aproximadamente 1,5 mm de comprimento. Embriogênese leva ~ 55 h a 30 ° C. (B, C e G) As larvas têm listras escuras pigmentados e são cobertas com cerdas. As larvas passam por vários estádios, dependendo do ambiente e seu comprimento pode estender-se a mais de 1 cm. (D, H) (E, I) Logo após a eclosão, pigmentação escura aparece sobre o corpo adulto besouro. Os adultos podem viver até vários meses e uma fêmea pode colocar centenas de embriões sobre sua vida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Anteriormente, mostramos que a RNAi é eficaz para derrubar a função do gene em D. maculatus 53. Aqui a nossa experiência criação de colônias de D. maculatus em laboratório é compartilhada junto com o passo-a-passo protocolos para ambos embrionário e parental RNAi set-up, injeção, cuidados pós-injeção, e análise fenotípica. O knockdown e métodos de análise de genes dsRNA mediadas introduzidas aqui não só fornecer informações detalhadas para abordar questões em D. maculatus, mas também têm potencial relevância for aplicação de RNAi em outros não-modelo besouro / espécies de insetos.

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Protocol

1. Criação de D. maculatus

NOTA: A colônia de reprodução de D. maculatus foi criado em laboratório dos autores usando adultos e larvas adquiridos comercialmente. A identidade da espécie foi verificada utilizando DNA barcoding 53.

  1. Para configurar uma nova gaiola no laboratório, espalhe uma fina camada de aparas de madeira em uma gaiola de insetos de tamanho médio (30,5 x 19 x 20,3 cm3). Coloque a ~ 10 x 6 x 3 cm 3 pedaço de isopor na gaiola para deixar hide larvas para pupation. Adicionar 20 - 50 besouros (adultos ou larvas tarde). Besouros vai esconder nas aparas de madeira.
  2. Adicionar comida de gato molhado em uma placa de Petri ou um barco de pesagem. Cobrir a gaiola com um pano de malha e colocar a gaiola numa incubadora.
  3. Para a manutenção de uma colónia de reprodução no laboratório, ajustar a temperatura entre 25 e 30 ° C. D. maculatus cresce mais rapidamente a temperaturas mais elevadas, mas isto também promove o crescimento de fungos e ácaros. Para manter uma curartua colónia, use 25 - 28 ° C para a manutenção estoque regular e 30 ° C para a rápida expansão da colônia. O ciclo de vida leva aproximadamente três semanas a quatro meses, dependendo de fatores ambientais 50 (Figura 2).

Figura 2
Figura 2: D. maculatus Lab Colony. Fotografia de uma típica inseto gaiola D. maculatus é mostrado. aparas de madeira são espalhadas para deixar os besouros esconder. comida de gato é adicionado em uma pequena placa de Petri ou pesando barco. Isopor é colocado na gaiola como um refúgio para larvas final para pupate. A gaiola mostrado aqui é 30,5 x 19 x 20,3 cm3 e abriga algumas centenas de larvas, pupas e adultos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. pradove ovos na gaiola para amadurecer. Para expandir a colônia, estabelecer novas gaiolas com ovos (recolhidos como descrito na Seção 2), larvas ou adultos, como acima. D. maculatus põem ovos em toda a gaiola, especialmente perto da fonte de alimento.
  2. Substitua alimentos gato molhado cerca de duas vezes por semana.
    NOTA: Devido ao odor desagradável de comida de gato molhado, fontes alternativas de alimentos também foram testadas (ver discussão).

Coleção 2. Embrião

  1. Para configurar uma coleção, separar, pelo menos, 50 machos e 50 fêmeas da colônia. Os jovens adultos são os melhores. Adultos lugar em um tamanho mini-cage (17,8 x 10,2 x 12,7 cm3) sem aparas de madeira. Adicionar comida de gato em um barco de pesagem.
  2. Antes de iniciar a coleta, verifique a gaiola cuidadosamente qualquer embriões presentes e removê-los. Coloque uma bola de algodão esticado na gaiola, e deixar a gaiola em um 30 ° C incubadora. Após a janela de tempo adequado, a bola de algodão estará pronto para a colheita de embriões.
  3. Dobraum pedaço de papel de construção preto (tamanho A4) ao meio para criar um vinco, em seguida, desdobre.
  4. Retire a bola de algodão esticado da gaiola. Remover adultos da bola de algodão e colocá-los de volta para a jaula.
  5. Ao ajeitar a bola de algodão esticada muito suavemente, rasgá-la lentamente em filamentos de algodão fino para deixar os ovos caem no papel preto.
    NOTA: embriões D. maculatus são frágeis e difíceis de ver em algodão. Eles podem ser facilmente esmagado se segurando a bola de algodão com muita força.

3. Preparação dsRNA

  1. Preparação molde de ADN para síntese de dsRNA
    1. Executar 4 - 6 reacções de PCR de 50 ul, utilizando iniciadores contendo sequências do promotor T7 em ambos os terminais 5 'para amplificar molde de ADN de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Purifica-se o produto de PCR, utilizando um kit de purificação de PCR comercial, seguindo as instruções do fabricante. A concentração final ideal de molde de ADN é ≥100 ng / ul.
  2. Injecção tampão de preparação de
    1. Preparação de 100 ml de tampão de injecção (0,1 mM de NaH 2 PO 4, 5 mM de KCl). Ajustar o pH para 6,8 com NaOH 5 M.
    2. alíquotas armazenar a -20 ° C.
  3. dsRNA Síntese
    1. Defina-se uma reacção em um tubo de 0,2 mL de PCR em gelo e levar a cabo uma reacção de transcrição in vitro com polimerase de T7, seguindo as instruções do fabricante, usando o modelo de ~ 500 ng por reacção.
    2. Incubar o tubo a 37 ° C durante a noite.
    3. Digerir o molde de ADN com ADNase, seguindo as instruções do fabricante.
    4. Aqueça o tubo a 94 ° C e manter a 94 ° C durante 3 min.
    5. Para emparelhar o ARNcd, lentamente arrefecer o tubo de 1 ° C / min até atingir 45 ° C após 1 hora.
      NOTA: As etapas através 3.3.2 3.3.5 pode ser realizada em um termociclador.
    6. Ao etanol precipitado de dsRNA, adicione 280 mLda RNase água livre de 20 ul de reacção para ajustar para um volume final de 300 ul. Adicionar 30 uL de NaOAc 3 M (pH 5,2) e 650 ul de etanol. Coloque tubo no freezer -20 ° C durante a noite.
    7. Após centrifugação a 15682 xg durante 30 min a 4 ° C, lava-se a pelete ARNcd com 70% de etanol. sedimento seco e dissolve-se em 20 ul de tampão de injecção.
    8. Medir a concentração de ARNcd utilizando um espectrofotómetro a A260. A concentração ideal é 3-5 mg / mL. Para verificar a qualidade de execução 5 ul de uma diluição 1:25 de ARNcd num gel de agarose a 1%, a 90 V durante 30 min. Uma única banda de tamanho esperado será facilmente visível.
    9. Armazenar o ARNcd a -20 ° C ou mais frio.
      NOTA: Para cada experimento knockdown RNAi, inclui um controlo do ARNcd, o qual não seria de esperar que o processo de impacto a ser estudada. GFP dsRNA é um excelente controle para a maioria dos experimentos. Preparar e injectar os ARNcd de controlo de lado-a-lado com o experimental dsRNA.

4. Montagem de microinjetor e Micromanipulator

NOTA: Ver Figura 3.

  1. Conectar azoto ou outro fornecimento de ar para a entrada de pressão de um instrumento de bomba pneumática. Se uma bomba pneumática não é possível, aplicar a pressão, utilizando uma seringa de 50 ml ligado a tubos finos.
  2. Ligar um interruptor de pé para o conector remota da bomba para controlar o fluxo da pressão de ejecção.
  3. Anexar um suporte capilar de vidro à porta de pressão de ejeção da bomba com tubo.
  4. Fixar o suporte do capilar em um micromanipulador perto de um microscópio de dissecação.

5. Embryonic RNAi

NOTA: A Figura 4 mostra um fluxograma de D. maculatus embrionário RNAi.

  1. eRNAi Preparação
    1. Prepara-se uma recolha de embriões tampa placa de Petri (90 mm de diâmetro). Coloque um pedaço de papel de filtro de C pretosobre o interior da tampa. Coloque uma lâmina de microscópio padrão no papel preto.
    2. Dilui-se a concentração adequada de ARNcd com tampão de injecção. Use 2-3 mg / mL para as experiências iniciais. Manter sempre ARNcd em gelo antes da injecção.
    3. Adicionar corante alimentar à diluição 1:40 para o ARNcd e pipeta suavemente várias vezes para misturar bem.
  2. Coleta de embriões para Injection
    NOTA: A 25 ° C, os núcleos em embriões de 6 - 8 horas após a postura de ovos (AEL) migram para o ovo periferia 53. A blastoderm celular é estabelecido 8-10 hr AEL 53. Para garantir embriões antes da fase blastoderm celulares são usados para injeção, 0 - embriões AEL 3 hr são recomendados para uso 53. de colheita de embriões, preparação e injeção geralmente levam menos de 2 horas, se os capilares de vidro estão em boa forma. Portanto, todo o processo pode ser concluído no prazo de 5 horas AEL.
    1. Recolhe embriões como descrito nos passos 2.2-2.5.
    2. Toque no papel de construção preto para transferir embriões em recolher tampa placa de Petri.
    3. Cole fita dupla face ao longo da borda do slide.
    4. Usando um pincel, alinhar os embriões na fita perpendicularmente à aresta de corrediça com o anterior ou extremidade posterior na extremidade. Note-se que as extremidades anterior e posterior de embriões precoces não são facilmente distinguíveis, assim, em média metade vai ser injectado na extremidade posterior, que é o ideal.
  3. Carregando o dsRNA no capilar de vidro
    1. Tome-se 2 - 4 ul de dsRNA em um 20 l ponta microloader pipeta.
    2. Insira a ponta de um capilar de vidro pré-puxado (referido como agulha) e gentilmente pipeta a solução de ARNdc para o capilar. Prepare agulhas de capilares de vidro comerciais, utilizando um extrator micropipeta. Um exemplo de uma agulha puxada ideal é mostrada na Figura 5. O comprimento e conicidade de agulhas pode precisar de ser optimizada afensaios de injecção ter.
    3. Fixar o capilar de vidro no suporte do capilar de vidro.
    4. Montar o suporte do capilar para o micromanipulador.
  4. Injetando dsRNA em embriões
    1. Transferir cuidadosamente a lâmina com embriões na fase de microscópio de dissecação.
    2. Mover a corrediça para trazer um embrião para o centro do campo e foco microscópio.
    3. Posicionar a ponta do capilar com o micromanipulador ao olhar para o microscópio de dissecação. Coloque a extremidade perto do final do primeiro embrião na linha.
    4. Ligue o azoto ou outro abastecimento de ar.
    5. Colocar o seletor de entrada do solenóide de vácuo.
    6. Ajuste o regulador de pressão de ejeção para 10 - 15 psi. Ajuste da pressão em função do aparelho.
    7. Abra o capilar se necessário. Uma vez que a ponta é aberta, a solução ARNcd colorida irá encher a ponta.
    8. Mova a ponta capilar para a frente para perfurar o embryo. Se o ajuste de pressão é ideal, nenhum fluido embrionário fluirá no capilar.
    9. Passo sobre o interruptor de pé para ejectar solução de ARNdc para o embrião até que uma quantidade adequada de solução é ejectado. A Figura 5 mostra exemplos de morfologia do embrião após montantes adequados e inadequados de solução foram injetados.
    10. Mantenha a ponta capilar no interior do embrião para ~ 2 segundos e, em seguida, removê-lo.
    11. Mova o capilar para a próxima embrião e repita os passos 5.4.8 - 5.4.10 até que todos os embriões são injetados. Alterar capilar de vidro se ele fica obstruído ou quebras.
  5. A recuperação pós-injeção e Incubação
    1. Após a injeção, coloque o slide em uma placa de Petri.
    2. Adicionar uma bola de algodão molhado para a placa de Petri. Não deixe a bola de algodão tocar o slide.
    3. Cubra o prato Petri e envolvê-la com vedação filme. Rotular o prato com o nome do ARNcd, concentração, data, hora e número de injectadoembriões.
    4. Colocar a placa de Petri numa incubadora a 30 ° C até que a escotilha embriões.

6. RNAi Parental

  1. Isolando Pupae para pRNAi
    1. Recolha pupas da colônia.
    2. Ordenar masculino e pupas fêmeas sob o microscópio (veja a Figura 6). Mantê-los em duas placas de Petri separadas em uma incubadora a 30 ° C para assegurar que não ocorre acoplamento antes da injecção.
    3. Verifique todos os dias para adultos eclosed. Pupation normalmente leva 5 - 7 dias a 30 ° C.
    4. Transferência eclosed machos e fêmeas (veja Figura 6) para duas placas de Petri separadas e alimentá-los comida de gato a cada dois dias até que estejam prontos para injecção.
    5. Avance para injecção uma vez que há suficientes mulheres e homens em idade apropriada. As fêmeas 4 a 8 dias pós-eclosão são as melhores. Para uma análise típica, 8 - 12 fêmeas são usados. Um número igual de homens são necessários para acasalamento 54.
    Injetando dsRNA em Feminino Abdome
    1. Prepare dsRNA no gelo (5.1.2 e 5.1.3).
    2. Coloque uma agulha 32-gauge a uma seringa de 10 mL.
    3. Anestesiar fêmeas sobre o CO 2 palco.
    4. Coloque solução dsRNA para a seringa sem ocupar qualquer ar.
    5. Segure um lado ventral do sexo feminino com uma mão e segure a seringa com a outra.
    6. Suavemente penetrar no segmacoria (membrana) entre esternitos 2 e 3 com a ponta da agulha. A Figura 7 mostra uma fêmea durante a injecção. Se a agulha não penetra no tecido com facilidade, aponte a seringa para cima e pressione lentamente para baixo. Inserção de aproximadamente 2 mm de comprimento da agulha no corpo.
    7. Verifique a escala da seringa, enquanto lentamente empurrando o êmbolo, injectando ~ 2 l por fêmea.
    8. Depois de injectar, segure a agulha ainda por pelo menos 5 segundos antes de a retirar do abdômen da fêmea.
    9. Transferir as fêmeas injectados para uma placa de Petri (diâmetro 90 mm) e se alimentam com comida de gato.
    10. Rotular a placa de Petri com o nome de dsRNA, quantidade injectada, a data eo número de fêmeas.
  2. A recuperação pós-injeção e Acasalamento
    1. Incubar a placa de Petri numa incubadora a 30 ° C.
    2. Após 24 horas, a transferência injetado fêmeas para um mini gaiola.
    3. Adicionar à gaiola igual número de uninjected jovens do sexo masculino, e rotular a gaiola.
    4. Adicionar um barco de pesagem, com comida de gato na gaiola.
    5. Deixar a gaiola em uma incubadora a 30 ° C para permitir que o acasalamento. Após 24 horas, as fêmeas devem começar a pôr ovos e embriões podem ser coletadas diariamente ou em intervalos de tempo necessários.

7. Análise fenotípica após ARNi

NOTA: A 30 ° C, leva ~ 55 horas para os ovos para chocar 50.

  1. Análise de Viabilidade eRNAi
    1. Calcule a taxa de eclosão, comparando o número de larvas eclodidas ao nu total dember dos embriões injectados. Certifique-se de incluir uma injecção de controlo negativo como embriões podem ser prejudicados ou mortos pelo procedimento de injeção. taxas de escotilha típicos variam de 30% - 60%. Cuidado com larvas eclodidas comer ovos não eclodidos.
  2. Análise de Viabilidade pRNAi
    NOTA: Se a viabilidade do sexo feminino é impactado pelo gene alvo de RNAi, as fêmeas injetados com dsRNA específica, mas não controle negativo dsRNA vai começar a morrer. Se a produção de ovos ou a colocação de ovo é afetado, as fêmeas vão expor esterilidade parcial ou completa. Pontuação sobrevivência do sexo feminino em comparação com controles negativos ou comparar número total de ovos postos pelas fêmeas experimentais e de controlo (7.2.3).
    1. Configure de colheita de embriões passo seguinte 2.2.
    2. Após 24 horas, recolher embriões seguintes passos 2.4 - 2.5.
    3. Contar o número total de embriões.
    4. Transferir os embriões para uma placa de Petri de 90 milímetros. Rotular o prato de Petri com o gene alvo, a data de recolha, e o número de embriões. Incubar os embriões em um C incubadora de 30 ° até que choquem. Desde larvas alimentam-se chocado com embriões não eclodidos, verifique a placa de Petri com frequência e separada larvas eclodiram a partir de embriões não eclodidos usando uma pinça (ver discussão).
    5. Contar o número de embriões eclodidos e calcular a taxa de eclosão.
  3. Examinando Defeitos cutícula larvas eclodidas
    1. Recolhe larvas eclodidas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Em um exaustor, adicionar 1 ml de Fixation Solution.
    3. Deixar o tubo de microcentrífuga a 4 ° C, pelo menos durante a noite para permitir que a solução penetrar no tecido das larvas.
    4. Para visualizar, remover tanto fixador do tubo quanto possível.
    5. larvas de enxaguamento, pelo menos, três vezes com PBST.
    6. Transferência das larvas para uma placa de vidro multi-poços com PBST utilizando uma ponta de pipeta P-1000 com a extremidade cortada a alargá-la.
    7. Sob um microscópio de dissecação, esticar larvas usando uma pinça para examinar defeitos. Eut é fundamental para esticar as larvas para examinar defeitos como seu contrato corpos em fixador.
  4. Examinando Defeitos cutícula Unhatched Larvas
    Nota: Este procedimento é útil para análise de fenótipos embrionárias precoces, especialmente para embriões que não sobrevivem até a eclosão.
    1. Para pRNAi, adicionar PBST para a placa de Petri (7.2.4) e transferência de embriões não eclodidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando uma ponta de pipeta P-1000 com a extremidade cortada. Para eRNAi, adicione PBST na placa de Petri (5.5.4), escova embriões não eclodidos fora da lâmina de microscópio e transferi-los para um tubo de microcentrífuga.
    2. Fixar os embriões com Fixation Solution e lavá-los com PBST para visualização seguindo os passos 7.3.2 - 7.3.6.
    3. Utilizando uma pinça, dissecar embriões para fora da casca do ovo sob um microscópio de dissecação em PBST.
    4. Transferir os embriões de volta ao tubo de 1,5 ml de microcentrífuga (~ 200 ul de embriões em cada tubo).
    5. Remover o máximo de solution possível.
    6. Adicionar 1 ml de 90% ácido láctico / EtOH a 10%. Deixar o tubo de centrifugação numa incubadora a 60 ° C, pelo menos durante a noite.
      NOTA: Os embriões podem ser deixados a 60 ° C durante vários dias.
    7. Para montar os embriões, Pipeta-los para uma lâmina de microscópio utilizando uma ponta de pipeta P-1000 com o fim cortado.
    8. posicionar manualmente os embriões com uma pinça para uma orientação ideal.
    9. Cobrir os embriões com uma tampa-derrapante e visualizar ao microscópio utilizando DIC.
  5. Examinando Defeitos Celular e Molecular
    NOTA: Este procedimento é útil para investigar as causas subjacentes da fenótipos cutícula ou letalidade que não é acompanhado por defeitos cutícula.
    1. Para pRNAi, embriões separados de bolas de algodão em fase de desenvolvimento apropriado e transferi-los para uma cesta de embrião de coleta. O cesto de recolha pode ser o mesmo ou semelhante ao utilizado para conjuntos de embriões de Drosophila.
      1. Façoo cesto de ovo a partir de um frasco de cintilação de 25 ml de plástico com o fundo do frasco removido, e um corte de círculo para fora da tampa (cerca de 1 cm de diâmetro). Coloque um círculo de super fino de malha de cerca de 2,5 cm de diâmetro no interior da tampa, e aperte o frasco de cintilação e usar de cabeça para baixo.
      2. À medida que a malha pode ser facilmente removida uma vez que os embriões são lavados, imergir a malha num tubo de microcentrífuga com água para se recuperar quaisquer embriões que furam para a malha.
    2. Para eRNAi, na fase adequada, adicionar PBST para a placa de Petri. Escovar os embriões fora da lâmina de microscópio e transferi-los para uma cesta de embrião de coleta.
      NOTA: Fixação, hibridação in situ, de coloração de anticorpos, e protocolos de coloração nuclear pode ser encontrado em Xiang et al. 2015 53.

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Representative Results

Laboratório dos autores tem utilizado tecnologia de RNAi para estudar a evolução funcional dos genes que regulam a segmentação em insetos 53,55. Enquanto todos os insetos são segmentadas, os genes que regulam este processo parecem ter divergido durante radiações insetos 26,38,56-63. Telas genéticos em Drosophila identificou um conjunto de nove genes de segmentação par de regras que são responsáveis por promover a formação de segmentos corporais 64-70. Aqui, o ortólogo de um destes genes, emparelhado (PRD), é usada para documentar o utilitário de ARNi para estudar a função de genes em D. maculatus.

eRNAi e pRNAi foram cada eficaz em demonstrar papéis para dmac - prd na formação segmento nesta espécie. 2-3 ug / ul de ARNcd concebido para orientar DMAC - prd (Figuras 8B, 8D e 8F de GFP, injectadas como controlo negativo (Figuras 8A, 8C e 8E).

Controle prole chocado com uma faixa pigmentada por segmento. As listras pigmentadas vizinhos foram separadas por um intervalo de não-pigmentadas (Figura 8A). Após pRNAi prd, prole afetada chocado com listras pigmentadas vizinhos fundidos, indicando limites segmentares estavam com defeito (Figura 8B). Dependendo da gravidade fenotípica, uma ou várias fusões foram detectados em larvas afectada. No entanto, as fusões de forma consistente apareceu nas regiões limítrofes entre T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, indicando defeitos pair-rule-like. Fenótipos cutícula após knockdown prd mostrou perda de segmentos abdominais, bem como o comprimento do corpo encurtado (Figura 8D). Engrailed (En) de coloração de anticorpo foi realizada para analisar defeitos moleculares em precoceembriões após knockdown prd. Enquanto embriões de controle mostrou listrado En expressão com igual intensidade em todos os segmentos (Figura 8E), reduzida expressão En foi detectado em listras alternadas em prole de DMAC-prd dsRNA injetado fêmeas (asteriscos na Figura 8F). O padrão de expressão En reduzida é consistente com o padrão de cutícula com defeito observado em larvas eclodidas afetada. Para resultados mais detalhados dos fenótipos após knockdown prd em D. maculatus, consulte Xiang et al. 2015 53.

Figura 3
Figura 3: Injecção Aparelho. Fotografia do microscópio de dissecação e micromanipulador usada para injetar embriões D. maculatus é mostrado. fornecimento de azoto é ligado à porta de entrada de pressão de uma bomba pneumática. titular capilar de vidro, é ligada ao ejecporta de pressão t da bomba. interruptor de pé é conectado à bomba. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: um fluxograma para D. maculatus Embryonic RNAi. (AD) Recolha embriões para injecção. As fêmeas colocam embriões (laranja) em bolas de algodão (círculo cinza). embriões separados de bolas de algodão e deixá-los cair sobre um pedaço de papel de construção preto. As barras brancas indicam lágrimas em bola de algodão. Transferência de embriões para uma tampa placa de Petri coleta, forradas com papel preto. (E, F) Injecção de dsRNA em embriões. Alinhar embriões em lâminas em fita dupla pau e injetá-las individualmente sob um microscópio de dissecação. Agulha com corante alimentar verde é mostrado. (GJ) Pós-injeção de recuperação e incubção. Coloque uma bola de algodão molhado na placa de Petri para fornecer umidade. Cubra o prato Petri e envolvê-la com vedação filme (azul claro). Colocar a placa de Petri num incubador e remover larvas eclodidas para análise fenotípica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Good vs Bad embrionárias Exemplos de injeção. Embrião (A) não injectado. (B) de embriões injectados com muito pouco dsRNA. (C) de embriões injectados com a quantidade adequada de ARNcd. (D) embrião quebrado com transbordante dsRNA causado pelo excesso de injeção. Corante alimentar foi adicionado ao ARNcd para visualização. (E) Exemplos de tubos capilares puxados utilizados na forma de agulhas de injecção. Observe o cone e o comprimento da ponta fou dois exemplos de agulhas funcionais. Barras de escala para AD representam 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Macho e fêmea adultos e pupas. (A) vista ventral de uma pupa masculino. "Ampliação da parte posterior do A. (A") Ilustração da genitália pupa masculino. (B) vista ventral de uma pupa do sexo feminino. (B (A) ') Ampliação da parte posterior B. Feminino pupas ter dois papilas genitais (branca setas). (B ") Ilustração da genitália pupa feminino. (C) vista ventral de um macho adulto. (C ') de visualização ampliada da parte posterior da C. Note-se que os adultos do sexo masculino têm genitália e uma como tridente-estrutura circular lobo-like no dia 4 esternito (setas brancas e negras, respectivamente). (D) vista ventral de um adulto do sexo feminino. (D ') de visualização ampliada da parte posterior D. Para todos os painéis, barras de escala indicam 1 mm. Para mais detalhes, consulte Xiang et al. 2015 53. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7: A fêmea durante a injeção. As fêmeas são anestesiados e colocados ventral para cima. Uma agulha penetrar as segmacoria entre a 2ª e 3ª sternites para injetar dsRNA é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 8: Phenotypes Representante, após pRNAi dmac-prd. Injecção (A) de controlo. Vista lateral de um tipo selvagem, como GFP pRNAi prole chocado com três segmentos torácicos e dez segmentos abdominais. Cada segmento tem cerdas e listras pigmentadas. (B) Visão lateral de uma prole pRNAi prd chocado. O fosso entre listras pigmentadas vizinhos rotulados é reduzida ou completamente ausente. Fenótipo (C) cutícula de um selvagem controle unhatched embrião tipo-like. Fenótipo (D) cutícula de uma prole prd unhatched pRNAi com menos segmentos abdominais. (E, F) dissecado germband de: (E) de controle, GFP pRNAi manifestou uniformemente En em todos os segmentos, (F) expressão pRNAi, En prd é reduzida em segmentos alternados (asteriscos). Por tudo painells, barras de escala indicam 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Enquanto um pequeno número de sistemas de modelos sofisticados (ratos, moscas, vermes) foram desenvolvidos durante o século 20, o século 21 tem visto uma onda de novos sistemas animais sendo desenvolvidos em laboratórios de todo o mundo. Estes novos sistemas permitem aos cientistas para abordar questões comparativas, evolutivos que não podem ser sondados utilizando apenas os sistemas de modelo 'padrão'. Essa implantação de novos modelos requer o rápido desenvolvimento de métodos para a cultura de laboratório, identificação de genes, e as abordagens funcionais em novas espécies. Aqui, os procedimentos para criação de D. maculatus no laboratório e passo-a-passo protocolos para embrionária RNAi, RNAi parental, e análise fenotípica neste besouro foram apresentados. O objetivo é que essas descrições incentivar outras pessoas a usar D. maculatus em suas próprias experiências e fazer uso das abordagens aqui apresentadas para desenvolver novas espécies modelo adicionais.

Enquanto D. maculatus lcolónias ab são incrivelmente fácil de manter, uma limitação da criação desta espécie é o odor desagradável da comida de gato molhado dado aos besouros como a sua fonte de alimento. Para evitar isto, os alimentos alternativos, tais como o pó de soro de leite / proteína de soja, queijo, alimentos para cães chão, e leite em pó, foram testadas com ou sem algodão molhado para alterar humidade. comida de cachorro-do-chão foi a alternativa mais eficaz e pode ser utilizado para a alimentação colônia regular. A sobrevivência foi excelente (> 90%) de ovo a adulto em gaiolas criados em alimentos para cães apenas seco em 80% de umidade relativa, com ou sem algodão molhado acrescentou. No entanto, completando esta dieta com alimentos gato molhado ao coletar ovos para aumentar a fecundidade pode ser necessário ao recolher um grande número de ovos. Se o alimento de cão é usado, comida antiga deve ser removida regularmente, como comida de cachorro condicionado foi encontrado para inibir a postura de ovos 54. Dog croquetes alimentares (KR, os resultados preliminares), cortiça, madeira, papel e outros materiais também podem ser usadas como refúgios 71.Curiosamente, biodegradação de isopor usando larvas mealworm besouro tem sido relatada 72. Portanto, esta foi testada em larvas de D. maculatus. Jovem D. maculatus larvas sobreviveram até a idade adulta com apenas isopor ou materiais que contêm amianto e algodão molhado (dados não mostrados), mas se comer e digerir esses materiais ainda não foi determinado.

Este relatório é o primeiro protocolo detalhado para a realização de estudos genéticos funcionais D. maculatus. O uso de ARNi aqui representa uma expansão desta técnica para um novo sistema modelo. Várias observações específicas são dignos de nota no que diz respeito às experiências knockdown RNAi em D. maculatus e outras espécies não-modelo. Em primeiro lugar, para garantir que a RNAi será eficaz em D. maculatus, da mesma estirpe de D. maculatus utilizado aqui deve ser empregue. Há evidências de Tribolium castaneum que diferentes cepas apresentaram variação em RNAi phenotypes 24,73, e fenótipos mutantes muitas vezes mostram a dependência do fundo genético das espécies modelo 74-76. Além disso, há evidências anedóticas para strain-dependência em outros protocolos, incluindo hibridação in situ. Em segundo lugar, o momento adequado de injecção é fundamental para RNAi bem-sucedidas em D. maculatus. Um pouco contraintuitivamente, o segmacoria é mais facilmente penetrada após a cutícula foi completamente sclerotized, pelo menos, dois dias após a eclosão. Portanto, fêmeas virgens 4 - 8 dias após a eclosão deve ser usado. fêmeas mais velhas experimentam fecundidade mais baixa do que as fêmeas recém-eclosed e, portanto, não são apropriadas para injecção. Em terceiro lugar, injetado dsRNA pode ser empurrado para fora pela pressão interna do abdômen feminino. Para minimizar a possibilidade de perder uma grande quantidade de dsRNA após a injeção, segure a agulha no abdômen por ~ 5 segundos após a injecção e depois removê-lo lentamente (6.2.8). Enquanto isso, evite pressionar o abdômen da fêmea durante ou logoapós a injecção. Para contornar resultados tendenciosos causados ​​por este problema, injetar pelo menos 8 fêmeas para cada dsRNA para obter prole suficiente (~ 200 embriões por dia) para a análise fenotípica. Em quarto lugar, alto rendimento de ovo é importante para fornecer dados imparciais para análise fenotípica após a injeção. Em média, cada fêmea D. maculatus produz cerca de 35-55 embriões diária. Produção de ovos depende do tamanho da população, a idade do sexo feminino, a humidade, a disponibilidade de alimentos, temperatura (dados não mostrados), e outros factores ambientais 54. Normalmente, as fêmeas colocam mais a 30 ° C do que a 25 ° C. Em quinto lugar, os embriões não eclodidos podem ser canibalizados por larvas eclodiram. Como larvas eclodidas são geralmente wild-tipo similar ou apenas ligeiramente afectada, enquanto que os embriões não eclodidos são geralmente mais gravemente afectado, este hábito de larvas de D. maculatus podem causar resultados tendenciosos em uma análise fenotípica quantitativa. Portanto, a remoção de larvas eclodidas o mais cedo possível é fortemente recomendado.

Nosso laboratório tem se concentrado em D. maculatus segmentação, embora muitos aspectos deste-espécies, incluindo a fisiologia, ecologia e controle de pragas-são de grande interesse. Para estudar a embriogénese e segmentação, uma série de listras pigmentadas no lado dorsal de larvas de D. maculatus pode servir como um marcador natural para o desenvolvimento anormal. Além disso, cerdas característica enraizada nas listras pigmentadas de larvas podem ser utilizados como uma indicação de segmentos. Estas características morfológicas, juntamente com a constatação de que os embriões ligeira ou moderadamente afetados podem sobreviver a eclosão, são vantagens do modelo D. maculatus para estudar os mecanismos envolvidos na padronização do plano básico do corpo.

Finalmente, a importância da realização de experiências-incluindo um controlo negativo altamente controlados, tais como dsRNA GFP e testando duas regiões-alvo não sobrepostos para cada gene é essencial para evitar erros de interpretação devido à effecst de injeção de per se e efeitos fora do alvo. Para D. maculatus, 4-6 ug (2 ul de 2 ou 3 mg / mL) ARNcd foram injectadas em cada fêmea e o ARNcd foi de 200-250 pb de comprimento. Valores e outros detalhes do protocolo pode precisar ser otimizado se segmentação genes funcionam mais tarde no desenvolvimento ou em diferentes processos fisiológicos / metabólicas. Descobertas anteriores mostraram que os efeitos de RNAi pode ser transmitido às gerações posteriores além da geração F1 em C. elegans 15. Uma minoria de larvas eclodidas D. maculatus com defeitos de segmentação devido a RNAi pode sobreviver até a idade adulta e pode se reproduzir. Experimentos preliminares não revelaram defeitos óbvios na geração F2. Estudos futuros poderão revelar efeitos transgeracionais de RNAi nesta espécie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

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Genetics Edição 118 RNAi silenciamento de genes inseto besouro, Segmentação gene pair-rule embrião microinjecção dsRNA evo-devo
Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em
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Xiang, J., Reding, K., Pick, L.… More

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

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