Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle, Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Summary

Här presenterar vi protokoll för uppfödning en medel bakterie skalbagge, rävänger (D. maculatus) i labbet. Vi delar också protokoll för embryonal och föräldra RNAi och metoder för att analysera embryonala fenotyper för att studera geners funktion i denna art.

Introduction

1998, Fire och Mello rapporterade att dubbelsträngat RNA (dsRNA) kan inducera hämning av geners funktion i Caenorhabditis elegans 1. Detta utlöses av dsRNA utsågs RNA-interferens (RNAi), och sådana RNAi-medierad geners uttryck rapporterades bevaras i djur, växter och svampar 2-7. I växter och vissa djur, RNAi fungerar systemiskt, vilket innebär att effekten kan spridas till andra celler / vävnader där dsRNA inte är direkt införs (granskade i 8-10). Forskarna har använt sig av detta endogena cellulära RNAi svar genom att utforma dsRNAs att rikta gener av intresse, och därmed slog ner geners funktion utan direkt manipulering av genomet (ses över 11-14).

RNAi är ett kraftfullt verktyg för funktionella studier på grund av följande fördelar. Först, även med minimal gensekvens information en gen kan riktas med hjälp av RNAi. Detta är särskilt viktigt för studies icke-modellorganismer som saknar iska eller transcriptomic data. För det andra, i organismer där RNAi svaret är robust systemisk, RNAi-medierad gen knockdown kan utföras på nästan alla utvecklingsstadiet. Denna funktion är mycket användbar för att studera funktionen av pleiotropa gener. För det tredje, i vissa fall, RNAi effekter spridit sig till könskörtlarna och avkomma, så att fenotyper observerades hos avkomman 15,16. Detta fenomen, som kallas föräldra RNAi (pRNAi), är speciellt fördelaktig för gener som påverkar embryonal utveckling, lika många avkommor som produceras av en enda injiceras förälder kan undersökas utan direkt manipulering av ägg. Av dessa skäl är pRNAi metoden för val. Men om pRNAi är ineffektiv, exempelvis för gener som krävs för oogenes, då embryonala RNAi (eRNAi) måste användas. För det fjärde kan RNAi användas för att generera motsvarande en allelisk serie i att mängden av dsRNA levereras kan varieras över ett område för att producera svaga till starka defekter. En sådan gradering av fenotyper kan vara till hjälp för att förstå genfunktion när genen är involverad i en komplex process och / eller fullständig förlust av funktion är livsfarlig. Femte, är leverans av dsRNA i allmänhet lätt och genomförbart, i synnerhet i djur som visar robusta system RNAi svar. dsRNA kan införas genom mikroinjektion 1,5, utfodring / förtäring 17,18, blötläggning, 19,20 och virus / bakterie-medierad leverans 21,22. Sjätte, till skillnad från vissa genmålsökning / redigering metoder, finns det ingen anledning att screena för organismer som bär mutationen eller att utföra genetiska korsningar för att generera homozygoter vid användning av RNAi. Därför, jämfört med många andra tekniker för att studera geners funktion, är RNAi snabb, billig, och kan användas för storskaliga skärmar 23-25.

Den breda användbarheten av RNAi ger medel för att utföra funktionella studier i ett brett spektrum av organismer, öka antalet arter som finns för studier beyond traditionella modellsystem för vilka genetiska verktyg har utvecklats. Till exempel studier med icke-modellsystem som krävs för att ge insikter i utvecklingen av gener och genprodukter nätverk genom att jämföra funktioner ortologer från arter som representerar olika utvecklingslägen eller uppvisar tydliga morfologiska funktioner 26-29. Dessa typer av undersökningar kommer att ge en bättre förståelse för den biologiska mångfalden, med konsekvenser för både tillämpad forskning och grundforskning.

Är den största djurgrupp på planeten, insekter ger en stor möjlighet att utforska mekanismerna bakom mångfalden. Dessutom, insekter är i allmänhet små, har korta livscykler, hög fruktsamhet, och är lätta att bak i labbet. Under de senaste två decennierna har RNAi med framgång använts i insekter spänner över order, inklusive Diptera (sanna flugor) 5, Lepidoptera (fjärilar och mal) 30, Coleoptera (skalbaggar) 16,31, Hymenoptera (sawflögner, getingar, myror och bin) 32, Hemiptera (skinnbaggar), Isoptera (termiter) 34, Blattodea (kackerlackor) 35, Orthoptera (syrsor, gräshoppor, gräshoppor och katydids) 36 och Phthiraptera (löss) 37. Framgångsrik tillämpning av RNAi har gett funktionella data för studier av mönstring i början av embryogenes (främre-bakre axeln 32, dorsal-ventral axel 28, segmente 26,38), könsbestämning 39,40, kitin / nagelband biosyntesen 41, ekdyson signalering 42, socialt beteende 43, och mer. RNAi metoder som utvecklats för olika insektsarter kan vara av ytterligare fördel i att de sannolikt kommer att vara till nytta för skadedjursbekämpning (översikt i 44-46). RNAi effekterna blir genspecifika liksom artspecifika, så länge som icke-konserverade regioner väljs för inriktning. För nyttiga insektsarter som honungsbin och silkesmaskar, riktar gener avgörande för överlevnaden avvirus eller parasiter för att kontrollera infektion kan ge en ny strategi för att skydda dessa arter 47,48.

Rävänger (D. maculatus), allmänt namn dölja skalbagge, distribueras över hela världen utom Antarktis. Som en holometabolous insekt, innefattar D. maculatus livscykel embryonala, larver, pupal, och vuxenstadier (Figur 1). Eftersom det livnär sig på kött, är D. maculatus används i museer att skeletonize döda djur och rättsmedicinska entomologer kan använda den för att uppskatta tidpunkten för dödsfallet 49,50. D. maculatus livnär sig på djur, inklusive kadaver, torkat kött, ost och puppor / kokonger av andra insekter och orsakar därmed skada hushåll, lagras mat och silke, ost och kött industrin 51,52. Tillämpa RNAi i detta skalbagge kan ge ett effektivt och miljövänligt sätt att minimera dess ekonomiska effekter. Vårt laboratorium har använt D. maculatus som en ny mOdel insekt att studera segmente 53. Förutom att vara mottagliga för lab uppfödning, är D. maculatus av intresse för grundforskning, eftersom det är en medel bakterie utvecklare, vilket gör det till ett användbart art att studera övergången mellan kort och lång groddar utveckling.

Figur 1
Figur 1: Life Cycle D. maculatus. Fotografier av D. maculatus vid olika livsstadier, såsom anges. Livscykeln från ägg till vuxen tar tre veckor vid 30 ° C men längre vid lägre temperaturer. (A, F) nylagda embryon är vita till ljusgula och ovala, ca 1,5 mm i längd. Embryogenes sker ~ 55 h vid 30 ° C. (B, C och G) Larver har mörka pigmenterade ränder och är täckta med hårkanten. Larver gå igenom flera instars beroende på miljön och deras längd kan sträcka sig upp till över 1 cm. (D, H) (E, I) Strax efter eclosion verkar mörk pigmentering över den vuxna skalbaggen kroppen. Vuxna kan leva upp till flera månader och en hona kan lägga hundratals embryon över hennes livstid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tidigare visade vi att RNAi är effektiv i att knacka ner geners funktion i D. maculatus 53. Här vår erfarenhet uppfödning D. maculatus kolonier i laboratoriet delas tillsammans med steg-för-steg-protokoll för både embryonala och föräldra RNAi set-up, injektion, efter injektion vård och fenotypisk analys. DsRNA-förmedlade gen knockdown och analysmetoder som införts här inte bara ge detaljerad information för att ta itu med frågor i D. maculatus, men också ha potentiell betydelse for tillämpa RNAi i andra icke-modell skalbagge / insektsarter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Uppfödning av D. maculatus

OBS: En avels koloni av D. maculatus inrättades författarnas laboratorium med hjälp av vuxna och larver köpas kommersiellt. Arten identitet verifierades med hjälp av DNA-streckkodning 53.

  1. För att ställa in en ny bur i labbet, sprida ett tunt lager av träspån i en medelstor insekt bur (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Placera en ~ 10 x 6 x 3 cm 3 bit av frigolit i buren för att låta larver dölja för förpuppning. Tillsätt 20 - 50 skalbaggar (antingen vuxna eller sena stadiet larver). Skalbaggar kommer gömma sig i träspån.
  2. Lägg våt kattmat i en petriskål eller en vägnings båt. Täck buren med mesh tyg och placera buren i en inkubator.
  3. För att upprätthålla en avelskoloni i labbet, ställa in temperaturen mellan 25 och 30 ° C. D. maculatus växer snabbare vid högre temperaturer, men detta främjar även tillväxten av svamp och kvalster. För att upprätthålla en läkadin koloni, använder 25-28 ° C för regelbunden lager underhåll och 30 ° C för snabbt växande kolonin. Livscykeln tar cirka tre veckor till fyra månader beroende på miljöfaktorer 50 (Figur 2).

figur 2
Figur 2: D. maculatus Lab Colony. Fotografera av en typisk D. maculatus insekt bur visas. Träspån är spridda för att låta de skalbaggar dölja. Kattmat tillsättes i en liten petriskål eller som väger båt. Frigolit placeras i buren som en tillflykt för slutlig stadiet larver att förpuppas. Buren som visas här är 30,5 x 19 x 20,3 cm 3 och inrymmer ett par hundra larver, puppor och vuxna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. leave ägg i buren för att mogna. Att expandera kolonin, etablera nya burar med ägg (som samlats som beskrivs i avsnitt 2), larver eller vuxna, som ovan. D. maculatus lägga ägg under hela buren, speciellt nära matkälla.
  2. Ersätt våt kattmat om två gånger i veckan.
    OBS: På grund av den obehagliga lukten av våt kattmat, var alternativa matkällor också testas (se diskussion).

2. embryosamlings

  1. För att ställa in en samling, separera minst 50 hanar och 50 honor från kolonin. Unga vuxna är bäst. Placera vuxna i en mini-sized bur (17,8 x 10,2 x 12,7 cm 3) utan träspån. Lägg kattmat i en vägnings båt.
  2. Innan du börjar insamling, kolla buren noggrant för eventuella embryon närvarande och ta bort dem. Sätt en sträckt bomullstuss i buren, och lämna buren i en 30 ° C inkubator. Efter lämplig tid, kommer bomullstuss vara redo för embryosamlings.
  3. Vika ihopen bit svart konstruktion papper (A4) på ​​mitten för att skapa ett veck, och sedan vika.
  4. Ta det sträckta bomullstuss från buren. Ta vuxna från bomullstuss och sätta dem tillbaka in i buren.
  5. Samtidigt som du klämmer den sträckta bomullstuss mycket försiktigt, riva sönder långsamt i tunna bomullstrådar för att låta äggen falla på svart papper.
    OBS: D. maculatus embryon är ömtåliga och svåra att se i bomull. De kan lätt krossas om att hålla bomullstuss för hårt.

3. dsRNA Framställning

  1. DNA-mall Förberedelse för dsRNA syntes
    1. Köra 4-6 50 | il PCR-reaktioner med användning av primrar som innehåller T7-promotorsekvenser på både 5 'ändar för att amplifiera DNA-mall enligt tillverkarens protokoll.
    2. Rena PCR-produkt med användning av ett kommersiellt PCR-reningskit, enligt tillverkarens instruktioner. Den idealiska slutlig koncentration av DNA-schablon är ≥100 ng / | il.
  2. Injektion Buffert Framställning
    1. Bered 100 ml injektionsbuffert (0,1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM KCl). Justera pH till 6,8 med 5 M NaOH.
    2. Förvara alikvoter vid -20 ° C.
  3. dsRNA Syntes
    1. Inrätta en reaktion i ett 0,2 ml PCR-rör på is och genomföra en in vitro transkriptionsreaktion med T7-polymeras, enligt tillverkarens instruktioner, med ~ 500 ng mall per reaktion.
    2. Inkubera röret vid 37 ° C över natten.
    3. Smälta DNA-templatet med DNas, enligt tillverkarens instruktioner.
    4. Värm röret till 94 ° C och håll vid 94 ° C under 3 min.
    5. Att glödga dsRNA, långsamt kyla röret med 1 ° C / min tills den når 45 ° C efter en timme.
      OBS: Steg 3.3.2 genom 3.3.5 kan utföras i en termocykler.
    6. Till etanol fällning av dsRNA, tillsätt 280 plav RNas fritt vatten till 20 | il av reaktionen för att anpassa sig till en slutlig volym av 300 | il. Tillsätt 30 pl 3 M NaOAc (pH 5,2) och 650 pl etanol. Placera röret i -20 ° C frys över natten.
    7. Efter centrifugering vid 15.682 xg under 30 min vid 4 ° C, tvätta dsRNA pelleten med 70% etanol. Torr pelleten och lös upp i 20 | il injektionsbuffert.
    8. Mäta koncentrationen av dsRNA med hjälp av en spektrofotometer vid A260. Den idealiska koncentrationen är 3-5 ug / ul. Kontrollera kvaliteten genom att köra 5 | il av en 1:25 spädning av dsRNA på en 1% agarosgel vid 90 V under 30 min. Ett enda band av förväntad storlek kommer att vara väl synlig.
    9. Lagra dsRNA vid -20 ° C eller kallare.
      OBS: För varje RNAi knockdown experiment inkluderar en kontroll dsRNA, som inte skulle förväntas påverka processen som studeras. gfp dsRNA är en utmärkt kontroll för de flesta experiment. Förbereda och injicera kontroll dsRNA sida vid sida med den experimental dsRNA.

4. Montering av microinjector och mikromanipulator

OBS: Se figur 3.

  1. Ansluta kväve eller annan lufttillförseln till tryckingången hos en pneumatisk pump instrument. Om en pneumatisk pump inte är tillgänglig, applicera tryck med användning av en 50 ml spruta som är ansluten till fina slang.
  2. Anslut en fotpedal till fjärr kontakten på pumpen för att styra eject tryckflödet.
  3. Bifoga en glaskapillär hållaren eject tryckport av pumpen med röret.
  4. Fixera kapillär hållaren på en mikromanipulator nära ett dissektionsmikroskop.

5. Embryonal RNAi

OBS: Figur 4 visar ett flödesschema över D. maculatus embryonal RNAi.

  1. eRNAi Framställning
    1. Förbered ett embryo samla petriskål lock (90 mm diameter). Placera en bit svart filterpapper till cöver insidan av locket. Sätt en standardobjektsglas på svart papper.
    2. Späd dsRNA till lämplig koncentration med injektion buffert. Använd 2-3 mikrogram / l för inledande experiment. hålla alltid dsRNA på is före injektion.
    3. Lägg karamellfärg på 1:40 utspädning till dsRNA och pipett försiktigt flera gånger för att blanda väl.
  2. Samla embryon för injektion
    OBS: Vid 25 ° C, kärnor i embryon 6 - 8 h Efter äggläggning (AEL) migrerar mot ägget periferi 53. En cellulär BLASTODERM är etablerad inom 8-10 timmar AEL 53. För att säkerställa embryon före cellulär BLASTODERM scenen används för injektion, 0-3 tim AEL embryon rekommenderas för användning 53. Embryosamlings, förberedelse och injicering brukar ta mindre än två timmar om glas kapillärerna är i gott skick. Därför kan hela processen vara avslutad inom 5 h AEL.
    1. Samla embryon som beskrivs i steg 2.2-2,5.
    2. Tryck på svart konstruktion papper för att överföra embryon till att samla petriskål lock.
    3. Stick dubbelhäftande tejp längs kanten av sliden.
    4. Med hjälp av en pensel, rikta embryona på bandet vinkelrätt mot glid kant med den främre eller bakre änden vid kanten. Notera att de främre och bakre ändarna av tidiga embryon inte är lätt urskiljbara, alltså i genomsnitt hälften kommer att injiceras vid den bakre änden, som är idealiskt.
  3. Fylla på dsRNA i glaskapillär
    1. Ta upp 2 - 4 | il av dsRNA i en 20 | il micro pipettspetsen.
    2. In spetsen i en pre-drog glaskapillär (kallad nål) och försiktigt pipettera dsRNA lösningen i kapillären. Förbered nålar från kommersiella glaskapillärer med hjälp av en mikropipett avdragare. Ett exempel på en ideal dras nålen visas i figur 5. Längden och avsmalning av nålar kan behöva optimeras after injektion prövningar.
    3. Fäst glaskapillär i glaskapillär hållaren.
    4. Montera kapillär hållaren i mikromanipulator.
  4. Injektion dsRNA i embryon
    1. Försiktigt överföra bilden med embryon på scenen av dissekera mikroskop.
    2. Flytta bilden för att ta ett embryo till mitten av fältet och fokus mikroskop.
    3. Placera spetsen på kapillär med mikromanipulator medan du tittar in dissekera mikroskop. Föra spetsen nära änden av det första embryot i raden.
    4. Slå på kväve eller annan lufttillförsel.
    5. Ställ magnetingångsväljaren till vakuum.
    6. Justera eject tryckregulator till 10 - 15 psi. Justera trycket beroende på apparaten.
    7. Öppna kapillären vid behov. När spetsen är öppen, kommer den färgade dsRNA lösning fylla spetsen.
    8. Flytta kapillärspetsen framåt för att punktera embryo. Om tryckinställningen är perfekt, kommer ingen embryonal vätska strömma in i kapillär.
    9. Steg på fotpedalen för att mata dsRNA lösning i embryot tills en lämplig mängd lösning matas ut. Figur 5 visar exempel på embryo morfologi efter lämpliga och olämpliga mängder av lösning har injicerats.
    10. Håll kapillärspetsen inuti embryot för ~ 2 sek, och sedan ta bort den.
    11. Flytta kapillär till nästa embryot och upprepa steg 5.4.8 - 5.4.10 tills alla embryon injiceras. Ändra glaskapillär om det blir igensatt eller raster.
  5. Efter injektionen Recovery och inkubation
    1. Efter injektion, placera bilden i en petriskål.
    2. Lägga till en våt bomullstuss till petriskål. Låt inte bomullstuss röra bilden.
    3. Täck petriskål och slå in den med tätningsfilmen. Märk skålen med namnet på dsRNA, koncentration, datum, tid och antal injiceradeembryon.
    4. Placera petriskålen i en 30 ° C inkubator tills embryon kläcks.

6. Föräldra RNAi

  1. Isolera Puppor för pRNAi
    1. Samla puppor från kolonin.
    2. Sortera manliga och kvinnliga puppor under mikroskop (se figur 6). Förvara dem i två separata petriskålar i en 30 ° C inkubator för att säkerställa att ingen parning sker före injektion.
    3. Kontrollera varje dag för eclosed vuxna. Förpuppning brukar ta 5 - 7 dagar vid 30 ° C.
    4. Överför eclosed hanar och honor (se figur 6) till två separata petriskålar och mata dem kattmat varannan dag tills de är redo för injektion.
    5. Fortsätt injektion när det finns tillräckligt med honor och hanar vid lämplig ålder. Honor 4 till 8 dagar efter eclosion är bäst. För en typisk analys, 8 - är 12 honor används. Ett lika stort antal män behövs för att passa ihop 54.
    Injektion dsRNA till Kvinna Buk
    1. Förbered dsRNA på is (5.1.2 och 5.1.3).
    2. Fäst en 32-nål till en spruta 10 l.
    3. Bedöva kvinnor på CO2 scenen.
    4. Ladda dsRNA lösning i sprutan utan att ta upp någon luft.
    5. Håll en kvinnlig ventralsidan med ena handen och håll sprutan med den andra.
    6. tränger försiktigt segmacoria (membran) mellan sternites 2 och 3 med spetsen på nålen. Figur 7 visar en kvinnlig under injektion. Om nålen inte penetrerar vävnaden enkelt vinkla nålen uppåt och tryck långsamt ner. Sätt ca 2 mm av nålen i kroppen.
    7. Kontrollera sprutans skala medan långsamt trycka kolven, injicera ~ 2 l per hona.
    8. Efter injektion, hålla nålen fortfarande minst fem sekunder innan du tar bort det från honans buken.
    9. Överföra de injicerade honorna till en petriskål (90 mm diameter) och foder med kattmat.
    10. Märka petriskål med dsRNA namn, belopp injiceras, datum och antal honor.
  2. Efter injektionen Återvinning och Parning
    1. Inkubera petriskål i en 30 ° C inkubator.
    2. Efter 24 timmar, injiceras överföring honor till en mini bur.
    3. Lägg till buren lika många uninjected unga män, och märka buren.
    4. Lägg till en vägnings båt med kattmat i buren.
    5. Lämna buren i en 30 ° C inkubator för att möjliggöra parning. Efter 24 timmar, bör honorna börjar lägga ägg och embryon kan samlas dagligen eller krävs tidsintervall.

7. Fenotypisk analys efter RNAi

OBS: Vid 30 ° C tar det ~ 55 timmar för äggen att kläckas 50.

  1. eRNAi Viabilitet Analys
    1. Beräkna kläckningsfrekvens genom att jämföra antalet kläckta larverna till den totala number av injicerade embryon. Var noga med att inkludera en negativ kontroll injektion som embryon kan skadas eller dödas av injektionsproceduren. Typiska hatch variera från 30% - 60%. Akta dig för kläckta larverna äter okläckta ägg.
  2. pRNAi Viabilitet Analys
    OBS: Om kvinnliga livskraft påverkas av genen måltavla RNAi, kvinnlig injiceras med specifik dsRNA men inte negativ kontroll dsRNA börjar dö. Om äggproduktion eller äggläggning påverkas, kommer honorna uppvisar partiell eller fullständig sterilitet. Betyg kvinnliga överlevnad jämfört med negativa kontroller eller jämföra det totala antalet ägg som försöks- och kontroll honor (7.2.3).
    1. Inrätta embryosamlings efter steg 2,2.
    2. Efter 24 timmar, samla embryon följande steg 2,4 - 2,5.
    3. Räkna det totala antalet embryon.
    4. Överföra embryon till en 90 mm petriskål. Märka petriskål med genen riktade, uppsamlingsdatum och antal embryon. Inkubera embryona i en 30 ° C inkubator tills de kläcks. Eftersom kläckta larverna livnär sig på okläckta embryon kontrollerar petriskål ofta och separat kläckta larverna från okläckta embryon med hjälp av pincett (se diskussion).
    5. Räkna antalet kläckta embryon och beräkna luckan hastigheten.
  3. Undersöka nagel Defekter i kläckta larverna
    1. Samla kläckta larverna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    2. I ett dragskåp, tillsätt 1 ml fixeringslösning.
    3. Lämnar mikrocentrifugrör vid 4 ° C åtminstone över natten för att låta lösningen penetrerar larv vävnaden.
    4. Att visualisera, ta bort så mycket fixativ från röret som möjligt.
    5. Skölj larver åtminstone tre gånger med PBST.
    6. Överföring larver till en med flera brunnar glasplatta med PBST med hjälp av en P-1000 pipettspetsen med änden avskurna för att vidga den.
    7. Under ett dissektionsmikroskop, sträcka larver använder pincett för att undersöka defekter. jagt är viktigt att sträcka ut larver att undersöka defekter som deras kroppar kontrakt i fixativ.
  4. Undersöka nagel Defekter i okläckta Larver
    Obs: Denna procedur är användbar för undersökning av tidiga embryonala fenotyper, särskilt för embryon som inte överlever till kläckning.
    1. För pRNAi, till PBST i petriskålen (7.2.4) och överför okläckta embryon till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med hjälp av en P-1000 pipettspetsen med änden avskuren. För eRNAi lägger PBST i petriskålen (5.5.4), borsta okläckta embryon från objektglas och överföra dem till ett mikrocentrifugrör.
    2. Fäst embryon med fixeringslösning och skölj dem med PBST för visualisering efter steg 7.3.2 - 7.3.6.
    3. Använd pincett, dissekera embryon ur äggskal under ett dissektionsmikroskop i PBST.
    4. Transfer tillbaka till 1,5 ml mikrocentrifugrör (~ 200 | il av embryon i varje rör) embryona.
    5. Ta bort så mycket solution som möjligt.
    6. Tillsätt 1 ml 90% mjölksyra / 10% EtOH. Lämna centrifugröret i ett 60 ° C inkubator åtminstone över natten.
      OBS: Embryon kan lämnas vid 60 ° C under flera dagar.
    7. För att montera embryona, pipettera dem på ett objektglas med användning av en P-1000 pipettspetsen med änden avskuren.
    8. Placera manuellt embryon med pincett till en idealisk orientering.
    9. Täck embryon med en cover-slip och visualisera under mikroskop med hjälp av DIC.
  5. Undersöka cellulära och molekylära defekter
    OBS: Detta förfarande är användbart för att undersöka de bakomliggande orsakerna till nagelband fenotyper eller dödlighet som inte åtföljs av nagelband defekter.
    1. För pRNAi separata embryon från bomullstussar på lämpliga utvecklingsstadiet och överföra dem till ett embryo samla korg. Insamling korg kan vara samma eller liknande den som användes för Drosophila embryo samlingar.
      1. Göraägget korgen från en 25 ml plast scintillationsflaska med botten av flaskan avlägsnades och en cirkel som revs loss från locket (ungefär 1 cm diameter). Placera en cirkel av super finmaskigt ca 2,5 cm i diameter på insidan av locket, och sedan skruva fast scintillationsflaska på och använda upp och ner.
      2. Eftersom nätet kan lätt bort när embryona tvättas, sänk nätet i ett mikrocentrifugrör med vatten för att återkräva embryon fastnar på nätet.
    2. För eRNAi, vid lämpligt skede lägga PBST till petriskål. Borsta embryon från objektglas och överföra dem till ett embryo uppsamlingskorg.
      OBS: Fixering, in situ hybridisering, antikroppsfärgning, och nukleära färgningsprotokoll kan hittas i Xiang et al. 2015 53.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Författarnas labb har använt RNAi-teknik för att studera den funktionella utvecklingen av gener som reglerar segmente hos insekter 53,55. Även om alla insekter segmenterade, de gener som reglerar denna process tycks ha avvikit under insekts strålning 26,38,56-63. Genetiska skärmar i Drosophila identifierat en uppsättning av nio par-regeln segmente gener som är ansvariga för att främja bildningen av kroppssegment 64-70. Här är ortolog av en av dessa gener, parade (PRD), används för att dokumentera nyttan av RNAi för att studera geners funktion i D. maculatus.

eRNAi och pRNAi var varje effektiv i att visa roller för DMAC - prd i formation segmentet i denna art. 2-3 ug / ul av dsRNA utformade för att rikta DMAC - PRD (figurerna 8B, 8D och 8F gfp dsRNA, injiceras som negativ kontroll (figurerna 8A, 8C och 8E).

Kontroll avkomma kläckts med en pigmenterad rand per segment. Angränsande pigmenterade ränder var åtskilda av en icke-pigmenterad gap (figur 8A). Efter PRD pRNAi, påverkade avkomma kläckts med kondenserade grannpigmente ränder, indikerar segmentgränser var defekta (Figur 8B). Beroende på fenotypisk svårighetsgrad, en eller flera fusioner upptäcktes i drabbade larver. Ändå fusioner verkade konsekvent vid gränsområdena mellan T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, vilket tyder på par-regeln liknande defekter. Nagelband fenotyper efter prd knockdown visade förlust av buken segment samt förkortad kroppslängd (figur 8D). Engrailed (SW) antikroppar färgning utfördes för att undersöka molekylära defekter i börjanembryon efter prd knockdown. Medan embryon kontroll visade randig En uttryck med samma intensitet i varje segment (Figur 8E), reducerades En uttryck detekterades i alternativa ränder i avkomma från DMAc-prd dsRNA injicerade kvinnor (asterisker i fig 8F). Mönstret av reducerad Sv uttryck är konsekvent med den defekta ytterhud mönster som observerats i drabbade kläckta larverna. För mer detaljerade resultat av fenotyper efter prd knockdown i D. maculatus, se Xiang et al. 2015 53.

Figur 3
Figur 3: Injektion Apparatus. Fotografera av dissektion mikroskop och mikromanipulator används för att injicera D. maculatus embryon visas. Kväveförsörjningen är kopplad till tryckingångsport hos en pneumatisk pump. Glaskapillär hållaren är ansluten till eject tryckport av pumpen. Fotomkopplaren är ansluten till pumpen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: ett flödesschema för D. maculatus Embryonala RNAi. (AD) Samla embryon för injektion. Honorna lägger embryon (orange) i bomullstussar (grå cirkel). Separata embryon från bomullstussar och låta dem falla på en bit svart konstruktion papper. Vita staplar anger tårar i bomullstuss. Överför embryon till en uppsamlingspetriskål lock, fodrad med svart papper. (E, F) Injektion dsRNA i embryon. Rikta embryon på diabilder på dubbel tejp och injicera dem individuellt under ett dissektionsmikroskop. Nål med grön mat färg visas. (GJ) efter injektion återhämtning och incubation. Placera en våt bomullstuss i petriskålen för att ge fuktighet. Täck petriskål och slå in den med tätningsfilm (ljusblå). Placera petriskål i en inkubator och avlägsna kläckta larverna för fenotypisk analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Good vs Bad Embryonala Injection exempel. (A) icke-injicerade embryot. (B) Embryo injiceras med för lite dsRNA. (C) Embryo injiceras med lämplig mängd dsRNA. (D) Brutna embryo med överfulla dsRNA som orsakas av över injektion. Karamellfärg tillsattes till dsRNA för visualisering. (E) Exempel på drog kapillärrören som används som nålar för injektion. Notera avsmalningen och spetslängden feller två exempel på funktionella nålar. Skala barer AD representerar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: vuxna män och kvinnor och Puppor. (A) Ventrala tanke på en manlig puppa. (A ') Förstoring av bakre delen av A. (A ") Illustration av manlig puppa könsorgan. (B) Ventral vy av en kvinnlig puppa. (B') Förstoring av bakre delen av B. Kvinna puppor har två genitalpapiller (vitt pilar). (B ") Illustration av kvinnliga puppa könsorgan. (C) Ventrala tanke på en vuxen man. (C ') Förstorad vy av bakre delen av C. Observera att manliga vuxna har Trident-liknande genitalier och encirkulär lob-liknande struktur på 4: e sternite (vita och svarta pilar, respektive). (D) Ventrala vy av en kvinnlig vuxen. (D ') Förstorad vy av bakre delen av D. För alla paneler, skal staplar indikerar 1 mm. För mer information, se Xiang et al. 2015 53. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7: En Kvinna under injektion. Honor bedövas och placeras ventrala sidan uppåt. En nål penetrerar segmacoria mellan 2: a och 3: e sternites att injicera dsRNA visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 8: Representativa Fenotyper efter DMAC-prd pRNAi. (A) Kontroll injektion. Lateral vy av en kläckt vild typ liknande gfp pRNAi avkomma med tre bröstkorg segment och tio buken segment. Varje segment har borst och pigmenterade ränder. (B) Lateral vy av en streckat prd pRNAi avkomma. Gapet mellan märkta angränsande pigmente ränder är smalare eller helt saknas. (C) Cuticle fenotypen av en unhatched kontroll vildtyp liknande embryo. (D) Cuticle fenotypen av en unhatched PRD pRNAi avkomma med färre buken segment. (E, F) Dissekerade germband från: (E) Kontroll, gfp pRNAi har jämnt uttryckt En i varje segment, är (F) prd pRNAi, En uttryck reduceras i alternerande segment (asterisker). För alla rutanls, skala staplar indikerar 500 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medan ett litet antal avancerade modellsystem (möss, flugor, maskar) utvecklades under 20-talet, har 21-talet sett en våg av nya djursystem utvecklas i laboratorier över hela världen. Dessa nya system kan forskare att ta itu med jämförande, evolutionära frågor som inte kan sonde endast med hjälp av de "vanliga" modellsystem. Denna utbyggnad av nya modeller kräver den snabba utvecklingen av metoder för labb odling gen identifiering och funktionella metoder i nya arter. Här har rutiner för uppfödning D. maculatus i labbet och steg-för-steg-protokoll för embryonal RNAi, föräldra RNAi, och fenotypisk analys i denna skalbagge presenteras. Målet är att dessa beskrivningar uppmuntra andra att använda D. maculatus i sina egna experiment och att använda sig av de metoder som presenteras här att utveckla ytterligare nya modellarter.

Medan D. maculatus lab kolonier är otroligt lätt att underhålla, är en begränsning av uppfödning denna art den obehagliga lukten av våt kattmat ges till skalbaggar som deras källa till mat. För att undvika detta, alternativa livsmedel såsom vassle / soja proteinpulver, ost, jord hundmat, och mjölkpulver, testades med eller utan våt bomull för att ändra luftfuktigheten. Mark hundmat var det mest effektiva alternativet och kan användas för vanlig koloni utfodring. Överlevnad var utmärkt (> 90%) från ägg till vuxen i burar föds upp på bara torrfoder i 80% relativ fuktighet, med eller utan våt bomull sattes. Emellertid kan komplettera denna diet med våt kattmat när du samlar ägg för att öka fertiliteten vara nödvändigt när man samlar in stora mängder ägg. Om hundmat används, bör gamla livsmedel tas bort regelbundet, som kondition hundmat befanns hämma äggläggning 54. Hundmat foderbitarna (KR, preliminära resultat), kork, trä, papper och andra material kan också användas som Refuges 71.Intressant nog har biologisk nedbrytning av frigolit med hjälp av matt mjölbagge larver rapporterats 72. Därför var detta testades för D. maculatus larver. Young D. maculatus larver överlevde till vuxen ålder med endast frigolit eller asbesthaltiga material och våt bomull (data visas ej), men om de äter och smälta dessa material återstår att fastställa.

Denna rapport är den första detaljerat protokoll för att utföra funktionella genetiska studier i D. maculatus. Användningen av RNAi här representerar en utvidgning av denna teknik för att ett nytt modellsystem. Flera specifika observationer är värda att notera när det gäller RNAi knockdown experiment i D. maculatus och andra icke-modellarter. Först, för att garantera att RNAi kommer att vara effektiva i D. maculatus, samma stam av D. maculatus används här bör användas. Det finns belägg från Tribolium castaneum att olika stammar visar variation i RNAi phenotypes 24,73 och muterade fenotyper visar ofta beroende på genetisk bakgrund i modellarter 74-76. Det finns också anekdotiska bevis för dragberoende i andra protokoll, inklusive in situ hybridisering. För det andra, är lämplig tidpunkt för injektion avgörande för framgångsrika RNAi i D. maculatus. Något counterintuitively är segmacoria lättast trängde efter nagelbanden har helt sclerotized, åtminstone två dagar efter eclosion. Därför jungfru kvinnor 4 - bör åtta dagar efter eclosion användas. Äldre kvinnor upplever lägre fruktsamhet än nyligen eclosed honor och därför inte är lämpliga för injektion. Tredje, injicerad dsRNA kan få skjuts ut genom det inre trycket i den kvinnliga delen av magen. För att minimera risken att förlora en stor mängd dsRNA efter injektion, hålla nålen i buken för ~ 5 sekunder efter injektion och sedan ta bort det långsamt (6.2.8). Samtidigt, undvika att trycka på honans buk under eller kortefter injektion. Att kringgå partiska resultat orsakade av denna fråga, injicera åtminstone 8 honor för varje dsRNA att få tillräckligt med avkommor (~ 200 embryon dagligen) för fenotypisk analys. För det fjärde är viktigt för att ge objektiva uppgifter för fenotypisk analys efter injektion hög ägg avkastning. I genomsnitt producerar varje D. maculatus hona cirka 35-55 embryon dagligen. Ägg avkastning beror på befolkningsstorlek, kvinnlig ålder, luftfuktighet, mat tillgänglighet, temperatur (data visas ej), och andra miljöfaktorer 54. Vanligtvis honor lägger mer vid 30 ° C än 25 ° C. För det femte kan okläckta embryon cannibalized av kläckta larver. Som kläckta larverna är oftast vildtyp liknande eller endast lindrigt, medan okläckta embryon är oftast drabbas hårdare, kan denna vana av D. maculatus larver orsaka partiska resulterar i en kvantitativ fenotypisk analys. Därför är avlägsnande av kläckta larverna så tidigt som möjligt rekommenderas starkt.

Vårt laboratorium har fokuserat på D. maculatus segmentering, även om många aspekter av denna art-inklusive fysiologi, ekologi och skadedjursbekämpning-är av stort intresse. För att studera embryogenes och segmentering, kan en serie mörkt pigmenterade ränder på ryggsidan av D. maculatus larver fungera som en naturlig markör för onormal utveckling. Dessutom kan karakteristisk setae rotade på de pigmenterade ränder av larver användas som en indikation på segment. Dessa morfologiska egenskaper, tillsammans med konstaterandet att milt eller måttligt påverkade embryon kan överleva kläckning, är fördelarna med D. maculatus modell för att studera de mekanismer som är involverade i mönstring grundkroppen planen.

Slutligen-är-genen vikten av att genomföra mycket kontrollerade experiment-inklusive en negativ kontroll såsom gfp dsRNA och testa två icke-överlappande målregioner för varje kritisk för att undvika missförstånd på grund av effekts injektion per se och off-target effekter. För D. maculatus, 4-6 | j, g (2 | al av 2 eller 3 ug / ul) dsRNA injicerades i varje hona och dsRNA var 200-250 bp lång. Belopp och annan information i protokollet kan behöva optimeras om riktad genmodifiering fungerar senare i utvecklingen eller i olika fysiologiska / metaboliska processer. Tidigare upptäckter visar att RNAi effekter kan föras vidare till kommande generationer bortom F1-generationen i C. elegans 15. En minoritet av kläckta D. maculatus larver med segmente defekter på grund av RNAi kan överleva till vuxen ålder och kan föröka sig. Preliminära experiment misslyckades med att avslöja uppenbara brister i F2-generationen. Framtida studier kan avslöja transgenerational effekterna av RNAi i denna art.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208 (2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822 (2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674 (2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440 (2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602 (2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32 (2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490 (2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5 (2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

Tags

Genetik RNAi gen knockdown insekt skalbagge, Segmentering par-regeln genen embryomikroinjektion dsRNA evo-devo
Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Rävänger</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiang, J., Reding, K., Pick, L.… More

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter