Introduction
O objetivo deste trabalho é apresentar um método reprodutível para medir de forma não invasiva in vivo a função mitocondrial do músculo esquelético em indivíduos que possuem uma ampla gama de habilidades. disfunção mitocondrial aberrante é uma indicação de uma ampla gama de síndromes metabólicas e doenças genéticas, a partir de condições comuns, tais como o envelhecimento e a diabetes de doenças raras tais como a ataxia de Friedreich.
Síndrome metabólica e disfunção mitocondrial
A síndrome metabólica foi mostrado para interromper a função mitocondrial, deprimir OXPHOS músculo esquelético, e levar ao armazenamento de lípidos ectópica em músculos esqueléticos 1, 2. Organelas tão crítica que regulam a homeostase metabólica e energia, as mitocôndrias são implicados na fisiopatologia da obesidade 3, 4, 5 resistência à insulina (DM2) 6, 7, relacionada com a diabetes micro- 8, 9, 10, 11 e complicações macrovasculares 12, 13 e doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) 14, 15, 16, entre outros .Insulin resistência é caracterizada por profundas mudanças na atividade mitocondrial do músculo esquelético, incluindo diminuição da taxa mitocondrial do ácido tricarboxílico (TCA) de fluxo, taxa de síntese de ATP e citrato sintase e NADH: O 2 actividade de oxidoredutase 5. Uma hipótese é que estas alterações pode ser devido à acumulação de ácidos gordos livres (FFA) metabólitos no músculo, que são marcadamente aumentada durante a obesidade e outras obesidade-rdoenças exaltados 2, 17. A exposição de músculo de FFAs elevados e intermediários lipídicos podem diminuir a expressão de genes na via oxidativa lipídica, bem como o ciclo de TCA e de electrões da cadeia de transporte de carga (ETC) 18. Esta redução de capacidade OXPHOS músculo esquelético mitocondrial na definição de uma sobrecarga lipídica é acompanhado por um declínio no quantitativa (conteúdo e biogênese das mitocôndrias) 19 e função qualitativa das mitocôndrias do músculo esquelético 20. Expondo o músculo esquelético e os miócitos para FFAs conduz a resistência severa à insulina, e aumento da absorção de FFA no músculo é associado à resistência à insulina em humanos e roedores 21. A ceramida intermediários lipídicos e diacilglicerol (DAG) foram mostrados para inibir directamente a via de sinalização de insulina, alterando a actividade de cinases, tais como a proteína-quinase C e Protein quinase B 21. Consequentemente, as moléculas derivadas de lípidos parecem desempenhar um papel importante no desenvolvimento de resistência à insulina muscular esquelético e DMT2. No entanto, ainda não está claro se as mudanças na capacidade mitocondrial são uma causa ou uma consequência da resistência à insulina 22.
Ataxia e Disfunção Mitocondrial de Friedrich
Diminuição OXPHOS também podem surgir de defeitos genéticos. Ataxia de Friedrich (FA), a forma mais comum de ataxia hereditária, é uma desordem genética causada por uma mutação no frataxin gene (FXN), resultando na acumulação de ferro intra-mitocondrial, a produção de espécies de oxigénio reactivo, e anomalias da fosforilação oxidativa 23, 24, 25, 26. Esta importante descoberta conduziu ao desenvolvimento de terapias específicas, which objectivo de melhorar a função mitocondrial ao nível sub-celular. Apesar deste conhecimento, tem havido desenvolvimento limitada in vivo, os biomarcadores reprodutíveis para FA investigação clínica. Na verdade, uma barreira crítica na avaliação eficaz de terapias-alvo em FA é a incapacidade de acompanhar as mudanças na função mitocondrial. medidas funcionais atuais, por exemplo, pode identificar diminuição do débito cardíaco; no entanto, eles são incapazes de determinar o nível em que a disfunção ocorre (Figura 1). O desenvolvimento de um marcador fiável da função mitocondrial que pode ser utilizado para identificar e avaliar a progressão da doença na ataxia de Friedrich é crucial para avaliar o impacto mecânico relevante de terapias específicas.
OXPHOS prejudicada e disfunção cardíaca
função mitocondrial aberrante, adquirida ou genética, pode contribuir para o desenvolvimento ou progressão de cardidisfunção AC. Nas condições de sobrecarga de pressão e a insuficiência cardíaca, a energia primária preferência substrato interruptores de FFA em glicose. Isto é associado com diminuição da atividade ETC e fosforilação oxidativa 27. A fisiopatologia do bioenergética mitocondrial na disfunção cardíaca pode ser diferente, consoante a origem primária da lesão mitocondrial. Diabetes e síndrome metabólica resulta em anormalidades mitocondriais em miocárdio, tais como biogênese prejudicada e metabolismo de ácidos graxos, que levam a flexibilidade reduzida substrato, a eficiência energética, e, eventualmente, disfunção diastólica 28, 29. Em FA, por outro lado, uma deficiência resulta em acumulação frataxin ferro mitocondrial significativa em cardiomiócitos 30, 31. Acumulação de ferro conduz à produção de radicais livres através da reacção de Fenton 32 </ Sup> e aumenta a chance de danos livre de cardiomiócitos induzida por radicais. Acúmulo de ferro intra-mitocondrial está também associada a um aumento da sensibilidade ao estresse oxidativo e uma capacidade oxidativa reduzida 30, 31. Acúmulo de ferro e subsequente função mitocondrial aberrante, devido à deficiência de frataxina, pode, portanto, ser responsável por a energética cardíaca comprometida e cardiomiopatia observadas na FA 33, 34. É também interessante notar que a capacidade oxidativa reduzida em mitocôndrias do músculo esquelético é paralela à intolerância ao exercício e a redução da capacidade metabólica na insuficiência cardíaca (HF) 35. Medição da capacidade OXPHOS músculo esquelético, tal como aqui descrito, é facilmente implementável e robusto; juntamente com o significado da OXPHOS músculo esquelético em HF, estas características fazem dele um biomarcador atraente em estudos abrangentes de ouvirdoença de t 36.
OXPHOS prejudicada ea disfunção cardíaca que o acompanha não é um aspecto inconsequente de metabólica e doença mitocondrial. Indivíduos com diabetes e doença metabólica estão em maior risco de desenvolver doença cardiovascular e têm excesso de mortalidade após infarto do miocárdio (MI) 37, 38, 39, 40, 41; mais da metade dos indivíduos FA tem cardiomiopatia, e muitos morrem de arritmia cardíaca ou insuficiência cardíaca 42. Assim, a quantificação de OXPHOS reduzida não só poderia permitir a detecção e tratamento da disfunção cardíaca precoce, mas ele também pode aliviar um fardo clínico importante nestas doenças.
terapias direcionadas para aumentar diretamente a capacidade OXPHOS é uma área promissora para melhorar o tratamento de assuntos, wheterap a causa de disfunção metabólica é genética ou adquirida. Actualmente, o desenvolvimento de novas drogas que aliviam tanto a função mitocondrial anormal 43 ou corrigir o defeito genético primário 44 pode melhorar a característica bioenergética demente de FA alvo. No caso de disfunção mitocondrial adquirida, o aumento da actividade física pode melhorar a função mitocondrial 45, 46, 47.
31 Fósforo espectroscopia de ressonância magnética como biomarcador não invasivo da função mitocondrial
Independentemente da terapia testada, uma integrada na avaliação in vivo da bioenergética do músculo esquelético é uma ferramenta fundamental para avaliar o impacto das intervenções dirigidas, especialmente em indivíduos com intolerância ao exercício grave ou incapacidade de se submeter metabo convencionaltestes lic. Espectroscopia de ressonância magnética sintonizado de fósforo (31 PMRS), um núcleo endógena encontrado em vários substratos de alta energia no interior das células em todo o corpo, tem sido utilizada para quantificar a capacidade oxidativa mitocondrial usando uma variedade de abordagens, incluindo em-íman protocolos de exercício de recuperação e estimulação muscular protocolos 48. Os protocolos de exercícios de recuperação dependem de uma variedade de aparelhos que variam em complexidade de ergômetros MRI-compatíveis que regulam e medir carga de trabalho para simples configurações de correias e almofadas permitindo tipo explosão resistiva e exercício quase estático. Um dos principais objetivos de qualquer um destes protocolos é produzir um desequilíbrio de energia para os quais a demanda por trifosfato de adenosina (ATP) é inicialmente recebida através da quebra enzimática da fosfocreatina (PCr), através da creatina quinase reacção 49. Após interrupção do exercício, a taxa de produção de ATP é dominado por Pho oxidativosphorylation e representa o máximo de capacidade in vivo das mitocôndrias 50. Além disso, OXPHOS durante a recuperação pós-exercício pode ser descrita por uma reação velocidade de primeira ordem 51. A recuperação pós-exercício da PCr pode, portanto, ser quantificada pela instalação de uma constante de tempo exponencial (τ PCr), com menores valores de τ PCr representando maior capacidade para a síntese de ATP oxidativo. Esforços significativos foram feitos para validar 31 PMRS contra ex vivo e medidas mais diretas de OXPHOS e demonstrar o potencial de aplicabilidade clínica desta técnica 52, 53, 54, 55.
Notavelmente, o protocolo descrito no presente trabalho pode ser implementado em scanners clinicamente disponíveis, e isto tem sido amplamente validado como um biomarcador não invasivo Ofunção mitocondrial f 56. No entanto, um protocolo PMRS exercício 31 otimizado para aplicação em indivíduos com diferentes gravidades do comprometimento neuromuscular ou mobilidade não tem sido bem estabelecida 57. Um bem definida, protocolo de exercício amplamente aplicável e 31 PMRS técnica seria particularmente útil na avaliação de doenças com alterações fundamentais na função mitocondrial.
Vários estudos anteriores têm explorado as aplicações de técnicas não invasivas para quantificar a função mitocondrial em indivíduos. Por exemplo, estas técnicas têm mostrado OXPHOS alterada em indivíduos com diabetes tipo 2 36. Lodi et ai. primeiro testada a viabilidade das técnicas PMRs em indivíduos com FA e verificou que 1) o defeito genético fundamental na FA prejudica OXPHOS músculo esquelético e 2) o número de tripleto GAA repete é inversamente proporcional ao músculo esquelético óXPHOS 33. Mais recentemente, Nachbauer et ai. PMRS usado como uma medida de desfecho secundário em um teste de drogas FA com 7 indivíduos. PCr tempos de recuperação foram significativamente mais longa em indivíduos em relação aos controles, reafirmando trabalho anterior de Lodi e indicando que os efeitos da expressão aberrante frataxin em FA pode resultar em um declínio na capacidade mitocondrial que é detectável através de técnicas PMRs 58.
Métodos confiáveis para definir adequadamente em função do músculo esquelético vivo em um, o custo-benefício, e de maneira reprodutível viável são fundamentais para melhorar os resultados dos pacientes em uma série de doenças que afetam a função mitocondrial.
Este trabalho descreve um procedimento robusto para a obtenção da capacidade oxidativa máxima vivo do músculo esquelético usando 31 PMRS. O protocolo de exercício de imã em é bem tolerado por indivíduos que abrangem uma ampla gama de física e functional habilidades e oferece uma configuração simplificada assunto usando o equipamento barato e amplamente disponível.
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Protocol
Este protocolo é aprovado pelo e segue as diretrizes da Ohio State University Institutional Review Board para a investigação seres humanos. É extremamente importante que todos os procedimentos que envolvem equipamentos MR são realizadas por pessoal com formação adequada que aderiram aos mais altos padrões de segurança MR 59.
1. Materiais e Preparação
- Certifique-se de que todos os materiais necessários estão disponíveis antes do experimento (Figura 2).
- Ligue a bobina 31 P no conector bobina em-quadro no fim da mesa de exame mais próximo para o orifício. Coloque uma grande almofada de espuma triângulo perto da cabeceira da mesa de exames do MR, mas não diretamente sobre a bobina 31 P. Coloque um descanso de cabeça na outra extremidade da mesa de exame MR, mais distante do furo, para o conforto do sujeito.
2. Objecto de posicionamento (Figura 3a)
- Instrua o assunto mentir supino, pésprimeiro na mesa do MR. Coloque uma almofada de espuma sob os joelhos para apoiar a perna numa posição parcialmente flectida.
- Posicione o motivo perto do lado direito da tabela (o direito do sujeito), a fim de centralizar a coxa esquerda tão de perto ao isocentro ímã possível, garantindo, assim, a homogeneidade B0 ideal no músculo da coxa em exame. Fornecer o assunto com tampões de ouvido e / ou fones de ouvido.
- Posicione a bobina RF 31 P no quadríceps esquerdo aproximadamente no ponto médio entre a patela ea cabeça femoral, e segura para a perna utilizando cintas. Coloque a bobina ao longo da porção lateral da perna, acima do vasto lateral.
- Fixar o óleo para bebé para o aspecto medial da coxa com as mesmas tiras utilizadas para fixar a bobina para a perna. Isso facilita a localização de digitalização.
- Ligam-se as pernas do sujeito em conjunto com uma cinta colocada abaixo da bobina e acima do joelho. Fixe as pernas do sujeito para a mesa de RM com stra adicionalps, um acima do joelho e um meio caminho entre o joelho eo tornozelo.
- Use o guia de luz laser para delinear o centro da bobina e mover a tabela para o isocentro ímã usando este centragem marco.
Protocolo 3. Exercício
- Explique ao assunto que o protocolo de exercício consiste em três fases: uma fase inicial, linha de base; um curto, fase de exercício intenso; e uma fase de recuperação.
- Instrua o assunto para permanecer imóvel e relaxar seus músculos da perna durante a linha de base e recuperação fases da aquisição espectroscopia, a fim de minimizar artefatos de movimento.
- Fornecer uma contagem regressiva para o assunto indicando o início do exercício. Neste ponto, tem o objecto iniciar joelho flexão / extensão tão vigorosamente e tão rapidamente quanto possível contra a resistência das tiras.
NOTA: Os músculos do quadríceps são usados para mover a perna esquerda para cima e para baixo, até que seja instruído a parar. - Terminar o exercício depois de uma queda de 30%na altura do pico de PCR.
- Observe a altura do pico PCr na janela do visualizador de aquisição, e também visualizá-lo após a conclusão da sequência de exercícios.
NOTA: A orientação geral é que uma queda de aproximadamente 30% em PCR altura do pico corresponde a um pico Pi que é 50% da altura do pico de PCR. Se o esgotamento PCr não está ocorrendo rapidamente o suficiente para atingir uma queda de 30% durante a fase de exercício do exame, incentivar o assunto para chutar mais difícil ou mais rápido durante o exercício.
NOTA: Cessação de exercício é determinado pelo monitoramento da altura do pico PCr e duração do exercício. Isso pode resultar em um pouco diferentes durações de exercício em pacientes diferentes e pode ser contabilizado na análise.
- Observe a altura do pico PCr na janela do visualizador de aquisição, e também visualizá-lo após a conclusão da sequência de exercícios.
4. Protocolo de digitalização
- Adquirir um localizador tri-plano para verificar o posicionamento assunto apropriado e identificar a localização da bobina 31 P.
NOTA: A sequência de localizador inicia-se automaticamente e centraliza no Índicoposição ated usando o guia de luz laser (passo 2.9) - Adquirir um segundo localizador tri-avião.
- Abra a vista fatia nas primeiras imagens localizador Tri plano.
NOTA: Este processo pode ser diferente para diferentes sistemas de software e hardware. - Center e girar a orientação fatia clicando com o botão esquerdo e segurando o grupo fatia. Rode o grupo fatia. Assegure-se que a orientação final de fatias coincide com a posição do óleo para bebé.
- Na janela de rotina a sequência, aumentar o número de fatias para cobrir toda a perna na axial e imagens sagital (Figura 3B).
- Abra a vista fatia nas primeiras imagens localizador Tri plano.
- 31 P espectroscopia sequência:
- Utilize os seguintes parâmetros de sequência não localizadas pulse-Adquirir: TR: 1000 ms; TE: 0,34 mseg; largura espectral: 2.000 Hz; flip ângulo: 90 graus; pontos de dados adquiridos: 1.024; 4 médias resultantes em uma resolução de tempo de um espectro de cada 6 segundos.
- 31 P calço box colocação:
- Usando um mouse, arrastar o segundo imagens triplane localizador na janela de visualização na parte superior da tela. Arraste a sequência de espectroscopia na janela de protocolo e clique duas vezes para abrir.
- Use a barra de ferramenta de posição para visualizar a voxel calço (selecione o retângulo preto com linhas horizontais). Depois de selecionar essa opção, observar uma caixa verde nas imagens localizador.
NOTA: Este é o voxel calço. - Mova o voxel clicando com o botão esquerdo e segurando o voxel no centro. Alterar o tamanho e rodar a orientação do voxel clicando com o botão esquerdo e segurando o voxel no canto da caixa. Coloque a caixa de calço, de modo a garantir a homogeneidade campo B0 directamente abaixo da bobina e paralela ao plano dos quadríceps.
NOTA: Este é adequada para garantir calços dentro da região sensível sob a bobina, a qual é o volume de tecido directamente abaixo do centro da bobina. - Use as imagens tri-plano localizador para identificar o sensitive região da bobina e ajustar a caixa de calço para englobar esta região dentro do músculo quadriceps.
NOTA: A caixa de calço pode ser maior do que a verdadeira cobertura da bobina de superfície, a fim de garantir a homogeneidade B0 dentro da aquisição de dados voxel (Figura 3c). - Aquisição de teste 31 P:
- Abra a janela do visualizador de aquisição e selecione o ícone de cabeça na barra de ferramentas de aquisição. Isto irá permitir a visualização da aquisição espectroscopia em tempo real.
- Após a colocação do calço voxel 31P, executar a seqüência para obter um único espectro, clicando no botão "Run" na parte superior da janela do protocolo.
- Examinar a qualidade de calços B0. Observar o espectro resultante na janela de aquisição. Observar um pico de PCr proeminente centrado em 0 ppm e nenhum ruído significativa (Figura 4a, à esquerda).
NOTA: Solução de problemas: Se o espectro parece ter ruído, verifique se a caixa de calço é colocado dentro do músculo. de Anúnciosapenas o tamanho e a posição da caixa de calço para melhorar a relação sinal-ruído. Repetir o teste de aquisição, conforme necessário. - A fim de ver a altura do pico PCr, abrir o espectro na ferramenta de espectroscopia ( "Aplicações" → "Espectroscopia"). Abra a pasta do paciente (ícone da árvore de pastas), selecione a verificação adequada, e clique duas vezes para carregar o espectro.
- imagem T1 pré-exercício:
- Obter uma imagem em T1 axial de corte único, no centro de uma bobina.
- 31 P aquisição pré-exercício:
- Copie a sequência do passo 4.4 (que produziu a melhor qualidade espectral) clicando com o botão esquerdo e arrastando a sequência na janela do protocolo. Use esta sequência para todas as medições posteriores.
- Na janela de rotina a sequência, aumentar o número de medições de 1 a 10. selecione Executar para adquirir 10 medições enquanto o assunto está em repouso.
- 31 </ Sup> P aquisição de exercício:
NOTA: Tome nota cuidadosa dos horários de início e de exercício final, como isso vai ser importante para a análise.- Resto: Aplicar as configurações de calços da verificação anterior e definir a sequência de adquirir 20 medições. Instrua o assunto para começar a retroceder após uma contagem regressiva. Instrua o assunto a permanecer em repouso por 2 medições.
- Exercício: Peça ao sujeito para realizar o exercício de extensão do joelho para ~ 30 segundos (ou o tempo necessário para atingir uma diminuição de 30% no pico de amplitude PCr). Após o sujeito consegue esgotamento PCr suficiente, pedir-lhes para descansar.
- 31 P pós-exercício aquisições:
- Adquirir um adicional de 20 medições em repouso. Certifique-se de que as aquisições pós-exercício começará imediatamente após a sequência de exercícios, sem pausa ou calços (Figura 4a, à direita).
NOTA: A subdivisão deste período de recuperação em duas aquisições separadas permite a análise do initial 20 espectros dinâmica durante a aquisição do espectros de segunda 20 dinâmico, permitindo que o operador evite aquisição do período de recuperação completa se o exercício necessita de ser repetida.
- Adquirir um adicional de 20 medições em repouso. Certifique-se de que as aquisições pós-exercício começará imediatamente após a sequência de exercícios, sem pausa ou calços (Figura 4a, à direita).
- Assegurar a qualidade do exercício:
- Comparar as alturas de pico de PCr no início e no final do exercício. sessões de exercícios de alta qualidade resultar em uma diminuição ~ 30% na concentração de PCR.
- Verificar que a altura do pico de PCR é a mesma no início do repouso e no final de recuperação (tipicamente, <é desejada diferença de 10%). Isto assegura que não havia perda desprezível de homogeneidade campo durante a aquisição.
NOTA: Se a repartição PCr é insuficiente, ou se houve uma perda de homogeneidade campo, em seguida, repita a parte de exercícios / recuperação do exame (tendo o cuidado de evitar a fadiga), certifique-se de que a bobina e alças estão bem presos, e estender a duração do exercício e / ou incentivar o exercício mais vigoroso (Figura 4b).
NÃOE: Uma comparação das imagens obtidas nas etapas 6 e 11 permite um passo de controle de qualidade adicional para visualizar qualquer deslocamento da coxa e bobina em função do exercício, garantindo assim que o movimento mínima ocorreu durante o protocolo, o que poderia afetar de forma significativa os dados adquiridos .
- Seguindo pós-exercício de imagens T1, repita o pré-exercício axial imagem T1 (passo 4.5) usando os mesmos parâmetros de aquisição.
- Em adição à depleção suficiente de PCr, medir o pH exercício final para garantir que o exercício não induziu a acidose do músculo.
- Executar esta medindo a mudança química entre Pi e PCR (õP i) e usando a seguinte equação 60:
pH = 6,77 + log [(õP i -3,29) / (5,68-õP i)]
NOTA: O pH deve permanecer superior a 6,8 61. Se a desagregação de PCR é suficiente, mas o pH é demasiado baixo, repetir a sessão de exercício por um curtoer duração e / ou com uma intensidade diminuiu.
- Salvando dados:
- Salve todos os espectros adquiridos como arquivos DICOM e exportá-los para processamento usando JMRUI.
- Se estiver usando um scanner, selecione todas as aquisições de espectroscopia na janela "Navigator".
- Em "Aplicações", selecione "Ferramentas Dicom" → "Export MR espectroscopia," e salvar os arquivos DICOM (* .dcm) para C: / user / MedCom / temp / CDROFFLINE
(A ferramenta escolhe automaticamente a localização). - Em "Transferência", selecione "Exportar para Off-line." Guardar para o local desejado.
5. Processamento e Análise de Dados 62
- Analisar o MR espectros com software JMRUI livremente disponível (versão 5.2; http://www.jmrui.eu/).
- Apodize e fase de deslocar o espectro de assegurar a uniformidade sobre todos os pontos de tempo adquiridas (Figura 5). O pico PCr será centrado umt 0 ppm no espectro.
- Usar o algoritmo AMARES incorporada para quantificar a amplitude do pico de PCR, em cada espectro adquirido. A amplitude de pico representa a concentração da PCR dentro da região sensível da bobina de superfície nesse ponto de tempo particular.
- No software computacional, traçar as concentrações de PCR como uma função do tempo de aquisição. Usando o built-in ferramenta de ajuste de curva software computacional, ajustar os dados do período de recuperação de PCR para a seguinte equação 52, 63:
- Grave os valores da PCr linha de base (
), O menor PCR ( 
), E o tempo de recuperação ( 
. - Assegurar que as condições apropriadas forem atendidas durante o exercise sessão através do cálculo da depleção de PCR, a diferença percentual entre a linha de base de PCr e o menor PCR. sessões de exercício ideais resultar numa 20 - esgotamento de 50%.
NOTA: A qualidade do ajustamento de curva pode ser assegurada por meio da verificação de que o valor de R2 é maior do que 0,75. Valores de R 2 são calculados automaticamente pelo software de adaptação.
), O menor PCR ( 
), E o tempo de recuperação ( 
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Representative Results
Estudo reprodutibilidade
Seis voluntários (4 homens e 2 mulheres, idade média: 24,5 ± 6,2 anos) com nenhum coração auto-reportados, metabólica ou doença mitocondrial foram submetidos a sessões do exercício técnica e de imagem 31 PMRS descrito em 2 dias diferentes dentro de 1 semana para avaliar técnica reprodutibilidade (Figura 6a). Os estudos realizados em voluntários normais confirmar a reprodutibilidade do estudo 31 PMRS na quantificação da função mitocondrial. A análise de Bland-Altman da PCr tempo de recuperação demonstra uma diferença desvio padrão médio de 1,03 4,83 seg e um coeficiente entre-ensaios de variação de 4,66 (Figura 6b). Não há alterações para o protocolo de aquisição ou análise descrita na seção métodos eram obrigados a obter dados de boa qualidade, conforme descrito na etapa 4 do protocolo. estes resÜLTS demonstrar a reprodutibilidade das técnicas de aquisição e análise descritos no presente trabalho.
Avaliação técnica em participantes não-ambulatoriais com Ataxia de Friedrich
Quatro participantes (2 homens e 2 mulheres, idade média: 35) foram submetidos a uma única sessão de exercício técnica e de imagem 31 PMRS descrito neste trabalho para avaliar a sua viabilidade em uma população não-ambulatorial com FA. Estes indivíduos foram capazes de realizar os exercícios de ímã para a obtenção de esgotamento suficiente de PCr para ajustar os parâmetros de recuperação apresentado no passo 5.6. No entanto, os tempos mais tempo de exercício (60-90 seg) foram necessárias para suficientemente esgotar os níveis de PCR. Além disso, as oscilações de todo o ajuste que foram causados pela perda progressiva do controle muscular, o que é característico da doença, foram observados (Figura 7). Por estas subjects, usamos duas tiras resistivas adicionais entre os joelhos e os tornozelos, dando um total de três tiras, para limitar o movimento indesejado. Estes resultados demonstram a viabilidade da técnica de aquisição e análise de obter tempos de recuperação de PCr em indivíduos não-ambulatório. No entanto, as modificações necessárias para obter dados de boa qualidade indicam que mais estudos de avaliação e de normalização são necessárias.
Estudo de viabilidade
Nove voluntários sem doença cardiovascular auto-relatado e 15 indivíduos que se refere a um programa de reabilitação cardíaca e prevenção secundária (CRSP) foram incluídos em um conselho de revisão institucional local (IRB) estudo -aprovado. Obtivemos alguns valores clínicos como indicadores de saúde cardiovascular e gravidade da síndrome metabólica. A fração de ejeção do ventrículo esquerdo foi preservada em indivíduos CRSP (56 10%). a maximum capacidade de esforço cardiovascular, medidos antes de iniciar CRSP, foi semelhante em indivíduos com e sem diabetes (3,05 0,6 contra 3,4 0,8 equivalentes metabólicos METs, p = 0,4). Antes de iniciar CRSP, cada participante inscrito foi submetido à técnica 31 PMRS exercício e de imagem, descrito neste trabalho, ea imagem quantificação de gordura intramuscular, descrito anteriormente 64. A constante de tempo de recuperação de PCR foi maior (41,9 contra 32,1 1,4 7,4 seg, p = 0,05), e a percentagem de gordura intramuscular era mais elevada em indivíduos CRSP em comparação com controlos (2,9 contra 8,7 2,54 0,6%, p <0,001). A percentagem de gordura intramuscular era semelhante em indivíduos CRSP com e sem diabetes (p = 0,4), e a constante de tempo de recuperação de PCr tendiam a ser mais longas em indivíduos com diabetes contra naqueles sem diabetes e nos controlos (p = 0,03 para as tendências entre grupos). Preliminares de dados de acompanhamento sugerem uma melhora consideravelmente pior emMET pós-CRSP em indivíduos com diabetes, em comparação com aqueles sem (delta = 1,0 0,8 contra 4,0 2,4, p = 0,06; Figura 8). Estes resultados demonstram a viabilidade desta técnica para quantificar as diferenças de OXPHOS músculo esquelético entre indivíduos com e sem doença metabólica conhecida.
Figura 1. As mitocôndrias, músculo esquelético, e Sistemas cardiopulmonares.
Uma representação da ligação entre a mitocôndria, músculo esquelético, o débito cardíaco, ventilação e capacidade funcional é mostrado. Reproduzido de Milani et al 65.
Figura 2. Materiais.
Os materiais necessários incluem: 1) uma almofada de triângulo,
Figura 3. Posicionamento.
A) Os indivíduos são gravadas em decúbito dorsal, os pés primeiro. A bobina 31 P é colocado sobre os quadríceps esquerdo. tiras resistivas são colocados acima e abaixo do joelho e ligado à mesa. Uma única correia é utilizado para ligar em conjunto as duas pernas acima do joelho. B) O posicionamento fatia é mostrada para o segundo localizador. Note-se que as fatias são centradas no locação da garrafa óleo de bebê, e fatias cobrir os quadríceps inteiras. C) A colocação caixa de calço para 31 PMRS é mostrado. Este volume é colocada directamente por baixo da bobina nos quadríceps e abrange uma profundidade que assegura sinal suficiente e apropriado calços dentro da área da superfície da bobina.
Figura 4. Aquisição de Dados.
A) A aquisição representativa 31 P em repouso é mostrado. O PCr é o grande pico único, e não há o mínimo de ruído (à esquerda). A aquisição típica durante a parte do exercício dos resultados do protocolo em dois grandes picos, Pi e PCR (direita). Como o exercício progride, os picos Pi e PCR irá aumentar e diminuir, respectivamente. B) A comparação da altura do pico PCr em repouso e pós-exercício deve revelar, pelo menos, uma diminuição% ~ 30. este c ÁLCULO deve ser feito no console do scanner, a fim de garantir a conclusão bem sucedida do estudo exercício.
Figura 5. Análise.
A correção de fase e apodization de um espectro representativo é mostrado. A) Um espectro de matéria-mostrando um pico un-faseada e presença de ruído que obscurece os picos. B) Um espectro exibir 0 th - e 1 de correção de fase -order. O pico PCr localizado na frequência central é facilmente identificável, mas outros picos de metabólitos ainda são obscurecidos. C) O espectro após apodização com uma forma de linha de Lorentz, resultando numa redução no ruído e melhor visualização dos 3 picos de ATP e o PDE e Pi pico. Este espectro está pronto para o pico quantificação com a ferramenta AMARES. files / ftp_upload / 54977 / 54977fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. 31 PMRS em indivíduos saudáveis.
A) Esta figura mostra a recuperação da phosphocreatine PCr) concentração (após seu esgotamento com o rápido exercício de extensão do joelho quase estático. A linha representa o ajuste da função de recuperação exponencial descrito na etapa 5.6, com o tempo de recuperação τ constante mostrado; Esta constante de tempo é um biomarcador bem estabelecido de função oxidativa mitocondrial. B) A análise de Bland-Altman do 31 PMRS técnica de reprodutibilidade demonstra uma diferença desvio padrão médio de 1,03 4,83 segundos para o tempo de recuperação PCr entre os ensaios; o coeficiente de variação é de 4,66.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54977/54977fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. 31 PMRS em indivíduos não-ambulatório.
A curva representativa de recuperação de PCr do 31 PMRS exame de um sujeito não-ambulatorial é mostrado. Note-se que um esgotamento PCr de 64% foi alcançado com este protocolo de exercício. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. 31 PMRS em indivíduos CRSP.
Uma comparação da PCR RECOVvezes ery demonstra a capacidade sequencialmente mais pobre oxidativa mitocondrial no controle, não-diabéticos e diabéticos. As barras de erro representam o desvio padrão.
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Discussion
Este documento descreve um protocolo padrão para 31 PMRS exame que permite a medição de série e não-invasivo in vivo da função mitocondrial do músculo esquelético. O protocolo mantém apelo considerável quando se considera a amplitude das investigações que visam a crescente carga de síndrome metabólica e sua morbidade e mortalidade resultante. Este protocolo 31 PMRS requer uma quantidade mínima de tempo scanner e pode ser incorporado em investigações metabólicas abrangentes em indivíduos em qualquer centro com instalações MRS comercialmente disponíveis.
Passos críticos dentro do Protocolo
Contraindications- Antes de exames de RM, é crucial para a tela temas para potenciais contra-indicações. Para além dos critérios típicos de exclusão MR, o seguinte deve ser considerado antes de implementar este protocolo: 1) do joelho ipsilateral ou quadril implantes (independentemente ocompatibilidade f MR) para evitar artefatos, 2) as condições que restringem o fluxo de sangue ou de fornecimento de oxigênio para os membros inferiores (por exemplo, doença arterial, periférico), 3) uma incapacidade para realizar resistiva exercício de extensão do quadríceps, e 4) uma incapacidade de decúbito dorsal para cerca de 30 min.
Movimento artefato redução- O movimento da bobina 31 P com respeito a quadríceps do sujeito e o movimento do objecto da coxa em relação à mesa deve ser minimizado. Certifique-se de que a bobina está bem presa à perna do sujeito e que que as tiras resistivas são firmemente à mesa de exame. Teste isso, garantindo que o calcanhar do sujeito sobe não mais do que 5 pol. De fora da mesa de exame durante o retrocesso e que não há rotação da bobina durante o exercício.
Aquisição
Exercício QUALIDADE O assunto deve exercer a umChieve, pelo menos, uma depleção de 30% na PCR. Para este protocolo, determinamos que 30 segundos de exercício em indivíduos ambulatoriais e 60 s para indivíduos não-ambulatoriais atinge esta meta. Temos observado que indivíduos não-ambulatoriais exercer menos força por chutar e, portanto, requerem um intervalo mais longo para o esgotamento suficiente.
Análisis- Os métodos descritos aqui fornecem um quadro para minimizar a subjetividade e maximizar a automatização. Selecção de parâmetros de entrada de utilizador para a análise dos espectros deve ser feita com cuidado de modo a assegurar reprodutibilidade.
Modificações e resolução de problemas
Qualidade de Spectrum- Se o espectro parece ter ruído, verifique se a caixa de calço é colocado dentro do músculo. Ajustar o tamanho e a posição da caixa de calço para melhorar a relação sinal-ruído. Repetir o teste de aquisição, conforme necessário.
enquantolidade de Exercício-se o exercício resultados iniciais insuficientes em depleção de PCr, há várias modificações que podem ser utilizadas para resolver problemas: 1) as tiras podem ser apertados, para aumentar a resistência; 2) o assunto podem ser instruídos a chutar mais rápido, o que aumenta o esforço; ou 3) a duração do exercício sustentada pode ser aumentada. No entanto, note que o excesso de exercício pode resultar em pH alterado e pode levar a acidose, que pode inibir a cinética de recuperação OXPHOS 61. Isto pode ser evitado através da limitação do tempo de exercício para um máximo de 3 minutos.
Limitações da técnica
Uma análise de biópsia do músculo permite a medição de características específicas mitocondriais, tais como o teor mitocondrial e tamanho, bem como a taxa de síntese de ATP mitocondrial máxima. No entanto, é importante notar que a medição in vivo utilizando 31 PMRS representa um agregado destes direct medidas, para além de factores extra-mitocondrial, tais como o fornecimento de sangue oxigenado microvascular ao músculo. Assim, em situações em que o estatuto da microcirculação está em causa, devido ao fornecimento de oxigénio reduzido ou outros fatores, não iria fornecer um indicador inequívoco do estado mitocondrial. Pelo contrário, ela iria indicar o estado in vivo da síntese de ATP oxidativo máximo do músculo, que pode reflectir alguma combinação de OXPHOS e questões microvasculares.
A limitação do protocolo PMRS exercício 31 detalhado neste trabalho é a falta de padronização da produção do trabalho. Essa falta de padronização simplifica o aparato necessário e, portanto, a implementação deste protocolo. No entanto, se trata à custa de não permitir a avaliação quantitativa de outros parâmetros, tais como a resistência e fadiga, e a sua relação com medidas metabólicas. Como resultado, diferentes níveis de esforço poderia impactar o PCro tempo de recuperação para além da gravidade do defeito subjacente mitocondrial. Pode-se minimizar estes efeitos, garantindo a depleção PCr suficiente e pode padronizar ainda mais o rendimento do trabalho, utilizando ergômetros MR-compatíveis com a resistência ajustável e saídas de trabalho mensuráveis.
Importância da Técnica em Matéria de métodos existentes ou alternativos
A capacidade para quantificar directamente a função mitocondrial do músculo esquelético é o principal vantagem da técnica PMRS 31 quando comparado com o teste de exercício metabólica padrão. Biópsia muscular invasiva permite medições em fibras individuais 66, embora com os riscos inerentes que a tornam menos atraentes para investigações que requerem avaliação seriada. As abordagens baseadas na espectroscopia de infravermelho próximo 67 pode ser limitada pela profundidade de penetração, particularmente nos doentes obesos, em que tão pouco como 5 mm de gordura atenua a NIRS signal em 20% 68. Além disso, a técnica não se presta para a avaliação multidimensional de músculos e outros sistemas proporcionados por técnicas à base de MR. Além disso, ao contrário dos métodos de biópsias invasivas para quantificar energéticas musculares, esta medida não-invasivo e não-destrutiva permite medidas do estado metabólico no músculo intacto repetida, tornando-se vantajoso para a avaliação das populações de sujeitos e intervenções terapêuticas.
Aplicações futuras
As aplicações potenciais Depois de dominar esta técnica 31 PMRS incluir a avaliação de doenças com defeitos mitocondriais específicos ou qualquer um de uma ampla variedade de distúrbios metabólicos. Em pacientes com débito cardíaco pobre, as técnicas actuais podem identificar prejudicada a capacidade funcional, mas não é possível estabelecer o nível em que a disfunção ocorre (por exemplo, o músculo esquelético, o coração, ou pulmões). Seria particularmenteinteressante para desenvolver protocolos integrados que combinem 31 PMRS com medidas metabólicas e ensaios cardiopulmonares para identificar as causas da reduzida capacidade de assunto específico, a fim de facilitar a terapias personalizadas.
Nós temos exemplos detalhados de terapias específicas importantes e intervenções que possam beneficiar da utilização de marcadores in vivo da função mitocondrial. Um 31 PMRS exercício protocolo padronizado, tal como o descrito acima, é um passo importante para a utilização mais generalizada deste importante no marcador in vivo de músculo esquelético capacidade mitocondrial em ambos os estudos básicos e intervenção.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 T MR Scanner | Siemens | manufacturer will not affect results | |
| 10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible | PulseTeq | manufacturer will not affect results | |
| 3 fl oz Baby Oil | Johnson & Johnson | manufacturer will not affect results | |
| Foam triangle cushion (Knee) | Siemens | manufacturer will not affect results | |
| (3) plastic buckle resistive straps; table to table | Siemens | manufacturer will not affect results | |
| (1) plastic buckle resistive strap; self-connecting | Siemens |
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