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Developmental Biology

Murine भ्रूण Metatarsals की संस्कृति: endochondral हड्डी बन जाना के एक शारीरिक मॉडल

Published: December 3, 2016 doi: 10.3791/54978
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Developmental Biology, The Roslin Institute and R(D)SVS, The University of Edinburgh
* These authors contributed equally

Introduction

कंकाल एक अत्यधिक जटिल गतिशील और जटिल अंग है, हरकत से फैले कार्यों की एक सीमा है कि आयन homeostasis है। हड्डी और उपास्थि के शामिल थे, कंकाल कार्यात्मक अलग सेल आबादी जो यह संरचनात्मक जैव रासायनिक और यांत्रिक अखंडता 1 है बनाए रखने के लिए संचालित होते हैं। कंकाल के प्राथमिक कार्यों में से एक विकास और विकास में अपनी भूमिका है। इन प्रक्रियाओं जो तंग अंत: स्रावी और आनुवंशिक नियंत्रण के माध्यम से नियंत्रित कर रहे हैं कई सेलुलर आबादी के आर्केस्ट्रा की आवश्यकता होती है।

फ्लैट हड्डियों जैसे कंधे की हड्डी, कपाल और उरोस्थि के अपवाद के साथ, स्तनधारी कंकाल endochondral हड्डी बन जाना रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से ही बना है। इस प्रक्रिया को विनियमित दोनों molecularly और स्थानिक, mesoderm 2 से मुख्य रूप से ली गई mesenchymal कोशिकाओं का संक्षेपण के साथ शुरू होता है। प्रतिलेखन कारक SOX9 के प्रभाव के तहत, वीं में कोशिकाओंcondensations की ई आंतरिक chondrocytes में अंतर, व्यक्त करने और इस तरह के रूप में प्रकार द्वितीय कोलेजन और aggrecan उपास्थि विशिष्ट बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों स्रावित। संघनन के मार्जिन, पर कोशिकाओं प्रकार मैं कोलेजन और perichondrium फार्म एक्सप्रेस, भावी हड्डी 3 वर्णन। बाद में, perichondrium की osteoprogenitors अस्थिकोरक में अंतर, प्रतिलेखन कारक, Runx2 और osterix 4 की अभिव्यक्ति द्वारा निर्देशित। यह अस्थिकोरक की एक विशेषता की ओर जाता है और इस परत periosteum जो हड्डी के मध्य वर्ग के चारों ओर एक mineralized बोनी कॉलर रूपों नाम बदला है। Periosteum और उपास्थि पाड़ के आक्रमण के संवहनी प्रवेश, इसके साथ लाने होता haematopoetically हड्डी resorbing कोशिकाओं, अस्थिशोषकों, जो उपास्थिकोशिका अवशेष और उपास्थि मैट्रिक्स 5 के ज्यादा resorb निकाली गई। रिक्त स्थान का गठन प्राथमिक हड्डी बन जाना को जन्म दे रही osteoprogenitors से भर रहे हैंकेंद्र जो उत्तरोत्तर diaphysis की कोर रह रहे हैं और periosteum के साथ विलीन हो जाती है। अन्य कोशिकाओं अस्थि मज्जा को जन्म दे। जन्म के आसपास, रक्त वाहिकाओं और osteoprogenitors माध्यमिक हड्डी बन जाना केंद्र के रूप में विकसित करने के लिए diaphysis के दोनों तरफ (एपिफ़ीसिस) में उपास्थि अमीर मैट्रिक्स घुसना। अधिवर्धी विकास की थाली - - जो सभी लंबी हड्डियों 6 के रैखिक विकास समन्वय के लिए जिम्मेदार है लंबी हड्डियों के दोनों छोर पर एपिफ़ीसिस और diaphysis के बीच स्थित कार्टिलेज के एक बैंड है।

विकास की थाली के भीतर Chondrocytes शुरू में पैदा करना और बाद में आकृति विज्ञान के अलग-अलग क्षेत्रों, प्रतिलेखन और वृद्धि कारकों के अनुक्रमिक अभिव्यक्ति द्वारा समन्वित के माध्यम से प्रगति। घटनाओं के इस अनुक्रम की परिणति यह उपास्थि अग्रदूत के केंद्र में सेल चक्र और chondrocytes की अतिवृद्धि से बाहर निकलने के लिए है। हाइपरट्रॉफिक chondrocytes दृढ़ता से अभिव्यक्त प्रकार एक्स कोलेजन और मैट्रिक्स metalloproteinase-13 (MMP13) और अनुदैर्ध्य विकास की दिशा में उनकी काफी मात्रा बढ़ने स्तनधारियों 7.8 में हड्डियों के विकास के लिए सबसे बड़ा योगदान है। इसके अलावा, hypertrophic chondrocytes मैट्रिक्स पुटिकाओं की विज्ञप्ति के माध्यम से अपने आसपास ईसीएम धातु के, झिल्ली घिरा संरचनाओं उनके () ऊतक गैर विशिष्ट क्षारीय फॉस्फेट (TNAP और PHOSPHO1) फास्फेटेजों के शामिल किए जाने और कैल्शियम channeling प्रोटीन (annexins के माध्यम से अनाकार कैल्शियम फॉस्फेट के उत्पादन के लिए विशेष ) 9-11। इस calcified उपास्थि अस्थिशोषक भर्ती और मैट्रिक्स अवशोषण में जिसके परिणामस्वरूप अंतर्निहित मज्जा से रक्त वाहिकाओं द्वारा हमला किया है। यह अस्थिकोरक प्रवास और संरेखण द्वारा calcified उपास्थि अवशेष की सतह जहां वे osteoid की एक परत है जो तेजी से mineralized है नीचे रखना करने के लिए पीछा किया जाता है। प्राथमिक spongiosa का बुना हड्डी बाद में माध्यमिक spongiosa 12 की परतदार हड्डी के लिए remodeled है। में अधिवर्धी संलयन परिणामendochondral हड्डी बन जाना 13 की समाप्ति।

Endochondral हड्डी बन जाना के रूप में इतनी परेशान विकास और / या अनुदैर्ध्य हड्डियों के विकास को रोकने के लिए 14 कई अंत: स्रावी और पैराक्राइन हार्मोन और विकास कारकों से तंग विनियमन के अधीन है। इन प्रक्रियाओं को मजबूती आणविक और सेलुलर तंत्र का एक बेहतर समझ इसलिए मानव लाभ की दिशा में नैदानिक ​​अग्रिमों के हमारे प्रयास में जरूरी है। समानता और अलग अलग उम्र, स्थानों और प्रजातियों के विकास के प्लेटों के बीच मतभेद में पिछले अनुसंधान में काफी विकास की थाली गतिशीलता 15,16 आसपास के शारीरिक तंत्र के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है। हालांकि, अलग-थलग chondrocytes के अध्ययन के रूप में अपने वातावरण से chondrocytes को हटाने, dedifferentiation करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं इस तरह के Col2a1 17 के रूप में महत्वपूर्ण मार्करों की अभिव्यक्ति के नुकसान के साथ, मुश्किल है।

माउस प्रपदिकीय अंग explant संस्कृति, पीआईनीदरलैंड में प्रो एलिजाबेथ बर्गर और उनके सहयोगियों द्वारा oneered, हड्डियों संस्कृति में नकल है कि इन विवो 18 में देखा की विकास दर के रूप में endochondral हड्डी बन जाना और हड्डियों के विकास के अध्ययन के लिए एक अत्यधिक शारीरिक पूर्व vivo मॉडल है। विशिष्ट, प्रपदिकीय अंग संस्कृति इसलिए संस्कृति 19-21 में कोशिकाओं की तुलना में vivo स्थिति के करीब की स्थिति प्रदान उपास्थिजनन के विभिन्न चरणों में chondrocytes की परीक्षा की अनुमति देता है और सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत को बनाए रखता है। इसके अलावा, इस मॉडल रैखिक हड्डियों के विकास का प्रत्यक्ष परीक्षा जो प्राथमिक उपास्थिकोशिका संस्कृतियों में संभव नहीं है के लिए अनुमति देता है। यह भी प्रणालीगत और स्थानीय कारकों इसलिए विकास की थाली पर स्थानीय प्रभाव के विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति के अलग होने के लिए अनुमति देता है।

metatarsals की संस्कृति कई मापदंडों की जांच के लिए अनुमति देता है। कुल लंबाई और mineralized क्षेत्रों के दैनिक मापआरंभ मानक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है। ऊतकीय, सीटू संकरण और immunohistological धुंधला में आसानी से प्रपदिकीय वर्गों, जो दोनों सेलुलर और आणविक संस्थाओं, पारंपरिक सेल संस्कृति तरीकों पर एक बड़ा लाभ के स्थानिक संकल्प के लिए अनुमति देता है पर प्रदर्शन किया जा सकता है। प्रतिरक्षाऊतकरसायन दृष्टिकोण का पता लगाने और के 5 ब्रोमो 2'- deoxyuridine (BrdU) तेज मात्रा का ठहराव chondrocytes 22 proliferating द्वारा भी शामिल है। इसके अतिरिक्त, प्रपदिकीय ऊतकों की आगे की प्रक्रिया mRNA अभिव्यक्ति (आरटी-qPCR), प्रोटीन और intracellular संकेतन विश्लेषण (पश्चिमी सोख्ता) या लिपिड रचना (मास स्पेक्ट्रोमेट्री) के बहाव के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए किया जा सकता है। तिथि करने के लिए सबसे अध्ययन प्रसवोत्तर जानवरों से metatarsals बजाय सुसंस्कृत भ्रूण metatarsals का उपयोग करें। नदीम दोनों मॉडलों जानकारीपूर्ण किया जा सकता, भ्रूण हड्डियों के अध्ययन के कई फायदे हैं: वे तेजी से आगे बढ़ने और विस्फोटक हो सकता हैited दीक्षा और खनिज प्रक्रिया 23-25 की प्रगति का अध्ययन करने के लिए।

इस प्रोटोकॉल भ्रूण दिन 15 (E15) murine भ्रूण की हिंद अंग से भ्रूण metatarsals के जटिल विच्छेदन विस्तार से वर्णन है। इसके अलावा, विकास और संरचनात्मक रूप से अलग metatarsals की खनिज दिखाया गया है।

Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं का अभ्यास संहिता प्रकाशित आवास और देखभाल पशु की नस्ल, आपूर्ति या वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल के लिए ब्रिटेन पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 और जानवरों के गृह मंत्रालय के अनुसार बनाए रखा गया के अनुपालन में आयोजित की गई।

नोट: प्रयोगों जंगली प्रकार C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया जाता है और अच्छी तरह से स्थापित नीचे वर्णित हैं। विभिन्न माउस उपभेदों से भ्रूण metatarsals इसी तरह, इन विट्रो में संवर्धित किया जा सकता है, हालांकि उनके विकास और खनिज दरों के साथ साथ विस्तृत उन लोगों के लिए अलग हो सकता है।

1. विच्छेदन शर्तें और उपकरणों की तैयारी

  1. मीडिया और भ्रूण आरंभ की बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए सभी मीडिया तैयारी, ऊतकों विच्छेदन और एक लामिना का प्रवाह हुड में संस्कृति काम करते हैं।
  2. संस्कृति और विच्छेदन मीडिया एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर का उपयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए संतुलित करने की अनुमति दें।
  3. विच्छेदन जीवाणुरहितकैंची, Dumont # 5 और Dumont # autoclaving द्वारा अति सूक्ष्म Vannas सूक्ष्म कैंची की एक जोड़ी के साथ 4 चिमटी (8 सेमी सीधे, 3 मिमी ब्लेड)। autoclaving के बाद, उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल में विच्छेदन उपकरण विसर्जित कर दिया।

2. विच्छेदन और संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. विच्छेदन के माध्यम से तैयार
    1. Α-न्यूनतम आवश्यक मीडिया (न्यूक्लियोसाइड के बिना, αMEM) पतला फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (1:13) में और 2 मिलीग्राम / एम एल में गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) resuspend फिल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी, 33 मिमी व्यास सिरिंज के माध्यम से स्टरलाइज़ पहले फिल्टर।
      नोट: विच्छेदन के माध्यम बनाया जा सकता है, फिल्टर निष्फल और अनिश्चित काल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहीत।
  2. संस्कृति के माध्यम से तैयार
    1. संस्कृति के माध्यम से 300 μl में संस्कृति भ्रूण metatarsals (प्रत्येक में अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली)। 0.2% w / v बीएसए जोड़कर संस्कृति के माध्यम से तैयार करें; 5 माइक्रोग्राम / एमएल एल ASCOrbic एसिड फॉस्फेट; 1 मिमी β-glycerophosphate (βGP; वैकल्पिक - परिणाम अनुभाग देखें); 0.05 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन और 1.25 माइक्रोग्राम Amphotericin αMEM करने के लिए बी और फिल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी, 33 मिमी व्यास सिरिंज फिल्टर के माध्यम से बाँझ।

3. Murine भ्रूण metatarsal विच्छेदन और संस्कृति

  1. ब्रिटेन में घर कार्यालय के दिशा निर्देशों के अनुसार गर्भवती माउस चुनना, 15 दिन पुराने भ्रूण को शरण देने, ग्रीवा अव्यवस्था से
  2. पशु लापरवाह रखें और 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा त्वचा कीटाणुरहित। का उपयोग कर विच्छेदन कैंची midline में एक बड़ा चीरा बनाने, दोनों त्वचा और पेरिटोनियम उदर गुहा को बेनकाब करने के मर्मज्ञ।
  3. शरीर गुहा के पृष्ठीय क्षेत्र में पशु के दो गर्भाशय सींग का पता लगा। सबसे पहले विच्छेदन कैंची से सावधान चीरों से mesometrium से प्रत्येक गर्भाशय मुक्त कराने और फिर अंत में गर्भाशय सींग उनके आधार पर मुफ्त काटने से गर्भाशय सींग निकालें। Placविच्छेदन माध्यम में ई गर्भाशय सींग।
  4. गर्भाशय सींग के साथ आरोपण साइटों के बीच काटने से प्रत्येक भ्रूण को अलग करें और संदंश का उपयोग अपनी व्यक्तिगत थैलियों से भ्रूण को हटा दें। ब्रिटेन में घर कार्यालय के दिशा निर्देशों के अनुसार कत्ल द्वारा चुनना भ्रूण
  5. 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा त्वचा की कीटाणुशोधन के बाद, Vannas सूक्ष्म कैंची का उपयोग समीपस्थ फीमर के आसपास incising द्वारा भ्रूण से हिंद अंग हटा दें। यह हिंद अंग के रूप में ज्यादा सुनिश्चित करता है संभव के रूप में निकाल दिया जाता है। हिंद अंग विच्छेदन मध्यम प्रपदिकीय विच्छेदन के लिए पहले में डूबे हुए एक पेट्री डिश में रखें।
  6. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, भ्रूण पैर आसपास त्वचा को हटाने के लिए बन्द रखो और स्थिर हिंद अंग पकड़े # 4 चिमटी का उपयोग कर whilst 5 चिमटी का उपयोग कर # इसे खींच द्वारा शुरू करते हैं। यह सबसे अधिक प्रभावी ढंग टिबिया के स्तर के आसपास की त्वचा पर लोभी और phalanges की ओर खींच द्वारा किया जाता है। इस स्तर पर कैंची के उपयोग में कटौती के लिएबहुत पतली त्वचा की आवश्यकता नहीं है।
  7. ध्यान से # 4 चिमटी के साथ भ्रूण पैर की tarsals पकड़ और # 5 चिमटी का उपयोग और त्यागने tarsals के पास बंद pinching द्वारा पहले और पांचवें metatarsals को हटा दें।
  8. पैर में एक ही स्थिति में आयोजित के साथ, शेष तीन phalanges और metatarsals के बीच संयोजी ऊतक को बाधित करने के लिए # 5 चिमटी का उपयोग करें। metatarsals से phalanges दूर करने के लिए phalanges और metatarsals के बीच संयुक्त पर # 5 चिमटी की नोक डालें।
  9. अंत में, tarsals और metatarsals के बीच संयोजी ऊतक को बाधित करने के लिए 5 चिमटी # का उपयोग करें। फिर tarsals और metatarsals और tarsals से धीरे मुक्त metatarsals के बीच संयुक्त अंतरिक्ष में # 5 चिमटी की नोक जगह है।
  10. धीरे # 4 चिमटी और ताजा विच्छेदन माध्यम में जगह के साथ अब स्वतंत्र metatarsals उठाओ।
    ध्यान दें: सावधान विच्छेदन प्रत्येक भ्रूण से 6 metatarsals प्रदान करना चाहिए।
  11. जब सभी आवश्यक metatarsals विच्छेदित कर दिया गया है, carefully जगह व्यक्तिगत रूप से पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया के 300 μl युक्त प्लेटों में metatarsals। अप करने के लिए 14 दिनों के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति metatarsals।
    नोट: कम से कम के रूप में यह उनका खनिज क्षमता को प्रभावित करता है 26 संस्कृति के 5 दिन तक E15 संस्कृतियों के मीडिया मत बदलो। इस के लिए कारण स्पष्ट नहीं कर रहे हैं लेकिन रैखिक वृद्धि और मैट्रिक्स खनिज metatarsals से जारी विकास कारकों से उत्तेजना पर निर्भर हो सकता है।

4. विश्लेषण और metatarsal संस्कृतियों का हेरफेर

  1. विच्छेदन (0 दिन) के दिन पर एक डिजिटल कैमरा जुड़ी है और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रारंभिक अनुदैर्ध्य माप करना। केंद्रीय खनिज क्षेत्र की लंबाई को मापने जब यह संस्कृति के कुछ दिनों के बाद दिखाई देता है।
  2. समय समय पर, के रूप में आवश्यक है, जो बिंदु मीटर की ऊंचाई पर संस्कृति के अंतिम दिन तक आगे माप (आमतौर पर हर दिन 2 एन डी) बनानेetatarsal हड्डियों के लिए आवश्यक परिणामों (परिचय में चर्चा) पर निर्भर कार्रवाई कर रहे हैं।
  3. विभिन्न बहिर्जात कारकों के साथ प्रपदिकीय अंग संस्कृतियों की अनुपूरक मध्यम वृद्धि कारक है, हार्मोन और संस्कृति 22,24 0 दिन से औषधीय एजेंटों जैसे। इस तरह के सभी अध्ययनों में, नियंत्रण इलाज metatarsals आवश्यक हैं।
    नोट: हालांकि यह सलाह दी जाती है कि नियंत्रण हड्डियों contralateral पैर से बराबर आरंभ हो रहा है, वहाँ रैखिक वृद्धि या सुसंस्कृत E15 2 एन डी की खनिज क्षमता में कोई मतभेद नहीं किया गया है, 3 और 4 वें metatarsals (नीचे देखें, चित्रा 2) ।

Representative Results

इस विधि का उद्देश्य अनुदैर्ध्य हड्डियों के विकास और ईसीएम खनिज की परीक्षा के लिए भ्रूण metatarsals और उन्हें संस्कृति को अलग-थलग करने के लिए किया गया था। हमारे प्रोटोकॉल यहाँ बताया उपयोग करना, भ्रूण प्रपदिकीय हड्डियों सफलतापूर्वक विच्छेदित कर रहे थे के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना। प्रपदिकीय हड्डियों के रूप में चित्रा 1 में संकेत आयोजित की माप, अनुदैर्ध्य लंबाई में बढ़ने और उनके ईसीएम धातु के लिए अपनी क्षमता से पता चला है (आंकड़े 2 और 3)। मैट्रिक्स के खनिज पहली हड्डी आरंभ की मध्य diaphysis में उल्लेख किया जाता है और आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है। हालांकि calcein के तेज नवगठित खनिज का बढ़ाया दृश्य प्रदान कर सकता है नहीं धुंधला हो जाना आवश्यक है।

तारीख 22,27,28 को भ्रूण metatarsals उपयोग अध्ययन विच्छेदित 2 एन डी जमा है, 3 और 4 वें (केंद्रत्राल तीन) metatarsals, इन विट्रो विकास और खनिज में यह सोचते बराबर हो। murine metatarsals के vivo विकास, हालांकि, पता चलता है कि 3 और 4 वें अंक अन्य सभी metatarsals और phalanges 29 से पहले खनिज का सबूत है। विकास और व्यक्तिगत रूप से अलग-थलग और सुसंस्कृत E15 2 एन डी की खनिज क्षमता का आकलन, 3 और 4 वें metatarsals संस्कृति के 7 दिन (चित्रा 2) के बाद उपस्थिति या खनिज की हद में कोई महत्वपूर्ण अंतर का पता चला। आधारभूत से प्रतिशत वृद्धि में कोई अंतर संस्कृति की अवधि के दौरान मिला था। के रूप में खनिज क्षमता में कोई मतभेद का उल्लेख किया गया था 2 एन डी 3 और 4 वें metatarsals पूलिंग के मानक प्रोटोकॉल भविष्य के अध्ययन के लिए मान्य होता है।

परंपरागत रूप से, जांचकर्ताओं मीडिया को βGP जोड़ लिया हैईसीएम खनिज बढ़ावा देने के लिए संस्कृति भ्रूण metatarsals करने के लिए इस्तेमाल किया। हालांकि, सेल संस्कृति के अध्ययन में, यह दिखाया गया है कि अगर TNAP एंजाइम βGP युक्त osteogenic मीडिया में जोड़ा जाता है, अस्थानिक हाइड्रॉक्सियापटाइट खनिज बयान अभी भी 30 कोशिकाओं के अभाव में होता गया है। प्रपदिकीय खनिज क्षमता पर विभिन्न खनिज substrates और एगोनिस्ट के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम संस्कृति मीडिया में E15 metatarsals सुसंस्कृत खुराक की एक श्रृंखला से युक्त, और छवियों और लंबाई माप दैनिक दर्ज किए गए। परिणाम संकेत दिया कि E15 प्रपदिकीय हड्डियों अभी भी आगे बढ़ने और βGP के अभाव में उनकी ईसीएम धातु के। E15 प्रपदिकीय एस्कॉर्बिक एसिड में संवर्धित हड्डियों केवल मीडिया की लंबाई और खनिज में तुलनीय बढ़ जाती है के रूप में दिखाया metatarsals βGP (चित्रा 3) की उपस्थिति में सुसंस्कृत।

हम यह भी पता चला है कि lentivirus सुसंस्कृत metata में exogenous डीएनए transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैrsals। यहाँ हम सफलतापूर्वक 2 एक्स 10 6 हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) प्रपदिकीय प्रति वायरस कणों के साथ संस्कृति (विच्छेदन की यानी दिन) के 0 दिन पर प्रपदिकीय हड्डियों ट्रांसफ़ेक्ट। वायरस पारगमन सक्षम करने के लिए एक साथ polybrene 1 पर संस्कृतियों के लिए जोड़ा गया: 500। संस्कृतियों 5 मिनट के लिए 7 दिनों के लिए छोड़ दिया गया, कोई मीडिया परिवर्तन के साथ के रूप में घटित करने के लिए E15 प्रपदिकीय खनिज के लिए आवश्यक है, 4 के साथ incubated जा रहा से पहले ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) दाग और फिर सीधे कल्पना की एक confocal खुर्दबीन (का उपयोग चित्रा 4)। अवधारणा प्रयोगों की हमारी सबूत स्पष्ट रूप से प्रभावी पारगमन दिखा। हालांकि यह उनके अभिकर्मक और प्रभावी जीन में गड़बड़ी का आकलन करने के प्रपदिकीय हड्डी की सम्पूर्णता भर वर्गों की जांच के लिए विवेकपूर्ण होगा।

आकृति 1
चित्रा 1: मानक पद्धति टी मापने के लिए इस्तेमालवह लंबाई और भ्रूण Metatarsals के खनिज क्षेत्र। (ए) संस्कृति के 0 दिन पर E15 metatarsals की कुल लंबाई माप (विच्छेदन के दिन) metatarsal के केंद्र के माध्यम से लिया। (बी) संस्कृति में सात दिनों के बाद एक प्रपदिकीय की कुल अनुदैर्ध्य लंबाई की माप। नोट प्रपदिकीय में मामूली वक्रता। (सी) संस्कृति में सात दिनों के बाद खनिज क्षेत्र लंबाई की माप। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: विकास और anatomically अलग E15 Metatarsals इमेजिंग के खनिज क्षमता और 2 की माप, 3 और 4 metatarsals डब्ल्यू E15 चूहों के हिंद अंग से।प्रदर्शन के रूप में। (ए) 2, 3 और 4 metatarsals संस्कृति अवधि के दौरान के सीरियल छवियों। (बी) का प्रतिशत संस्कृति के प्रत्येक दिन पर दिन 0 से लंबाई में वृद्धि हुई है। (सी) 2, 3 और संस्कृति की अवधि में 4 metatarsals के खनिज लंबाई कुल प्रपदिकीय लंबाई के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया। में डाटा, मतलब की मतलब ± मानक त्रुटि (SEM) के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं (एन = 6)। (डी) संस्कृति के प्रत्येक दिन पर C57BL / 6J प्रपदिकीय लंबाई। में डेटा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं मतलब ± मानक विचलन के रूप में (एन = 6)। काली पट्टी = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: जंगली प्रकार के विकास और खनिज क्षमताविभिन्न osteogenic मीडिया में E15 Metatarsals सुसंस्कृत। (ए) केवल एस्कॉर्बिक एसिड, 1 मिमी βGP, 3 मिमी phosphocholine, 1.5 मिमी कैल्शियम क्लोराइड या 3 मिमी कैल्शियम क्लोराइड युक्त मीडिया में सुसंस्कृत metatarsals के सीरियल छवियों। (बी) metatarsals 0 दिन से लंबाई में प्रतिशत वृद्धि की खुराक के साथ विभिन्न सुसंस्कृत। (सी) विभिन्न मीडिया में सुसंस्कृत metatarsals के खनिज लंबाई कुल प्रपदिकीय लंबाई के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया। डेटा, मतलब ± मतलब की मानक त्रुटि (SEM) प्रतिनिधित्व कर रहे हैं (एन = 6)। काली पट्टी = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: GFP वायरस पी के साथ E15 Metatarsals के अभिकर्मकलेख। (ए) E15 प्रपदिकीय हड्डियों अवधारणा के सबूत के लिए GFP वायरस कणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। (बी) के हड्डियों के डीएनए दृश्य के लिए DAPI के साथ दाग रहे थे। (सी) दोहरी छवियों प्रपदिकीय हड्डियों की सम्पूर्णता भर GFP वायरस के सफल अभिकर्मक संकेत दिया। सफेद सलाखों = 0.5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

murine भ्रूण metatarsals की संस्कृति endochondral विकास और खनिज की एक अत्यधिक शारीरिक मॉडल उपलब्ध कराता है। प्रारंभिक अध्ययन पुष्टि की है कि E15 माउस metatarsals कंकाल विकास और भेदभाव के एक सामान्य पैटर्न से गुजरना। उपास्थि (chondrocytes) और हड्डी (अस्थिकोरक और अस्थिशोषकों) कोशिकाओं और उनके संबंधित श्लेषजनउत्पादी matrices विवो में मनाया उन लोगों से पृथक कर रहे हैं। हालांकि, इस मॉडल के कुछ मान्यता प्राप्त सीमाएं हैं। अस्थिशोषक भेदभाव की गति हड्डियों के विकास के रूप में है (लेकिन भेदभाव उपास्थि नहीं) बिगड़ा हुआ है। हड्डियों के विकास के लिए लगभग 50% विवो में मनाया कि तुलना में धीमी है और प्रणालीगत कारक हैं जो स्थानीय कारकों (जैसे, IGF-1, BMPs, आदि), 31 के उत्पादन को प्रभावित करने में कमियों की वजह से हो सकता है। इसके अलावा, यह अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है कि हड्डी अपने यांत्रिक पर्यावरण के प्रति संवेदनशील है और यह भी सुसंस्कृत metatarsals, जो सी का जवाब के लिए मामला हैयांत्रिक लोड हो रहा 32,33 में hanges। इसलिए, उतार स्थितियों में, के रूप में इस प्रोटोकॉल, खनिज में वर्णित है और खनिज अवशोषण समझौता किया जा सकता है। फिर भी, प्रपदिकीय मॉडल सीधे रैखिक हड्डी विकास जो इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में 2 डी और 3 डी के माध्यम से संभव नहीं है उपाय करने की क्षमता प्रदान करता है।

हम विच्छेदन और E15 murine metatarsals और वास्तव में की संस्कृति में शामिल पहली बार के लिए प्रोटोकॉल के लिए एक व्यापक विवरण प्रदान की है, प्रयोगों के लिए 2 एन डी, 3 और 4 वें metatarsals पूलिंग की वैधता की पुष्टि करें।

E17 / E18 से Metatarsals सामान्यतः (संस्कृति में 14 दिनों से परे यानी) समय की लंबी अवधि के लिए पूर्व vivo विकसित करने के लिए उनकी असाधारण क्षमता के कारण हड्डियों के विकास के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। वे भ्रूण अनुदैर्ध्य हड्डियों के विकास पर विकास के कारकों की भूमिका की जांच करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल हैं।इसके अतिरिक्त, विच्छेदन और प्रसव के बाद metatarsals की संस्कृति सामान्यतः के रूप में यह समझा जाता है कि प्रसव के बाद हड्डियों के विकास और भ्रूण हड्डियों के विकास को अलग ढंग से 21 विनियमित रहे हैं प्रसव के बाद हड्डी विकास आसपास के तंत्र को चित्रित करने के लिए कार्यरत है। हड्डियों के विकास सुसंस्कृत प्रसव के बाद metatarsals में मनाया हालांकि भ्रूण आरंभ 25,34 में मनाया तुलना में काफी कम है, लंबी अवधि के अध्ययन में अपनी क्षमता सीमित है और इस चरण में प्रसव के बाद हड्डियों के विकास पर अधिक प्रणालीगत प्रभाव पर प्रकाश डाला। दरअसल, चूहों से 3 दिन पुराने प्रसव के बाद आम तौर पर metatarsals नवीनतम चरण है कि औसत दर्जे का विकास 34 प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यहाँ हम E15 पर भ्रूण प्रपदिकीय हड्डियों के अलगाव के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन है। E15 प्रपदिकीय हड्डियों में खनिज hydroxyapaptite की अनुपस्थिति का मतलब है कि वे न केवल अनुदैर्ध्य हड्डी विकास आसपास के तंत्र की जांच करने के लिए एक बेजोड़ मॉडल, लेकिन यह भी दीक्षा प्रदान करते हैंकंकाल खनिज की। टर्मिनल hypertrophic उपास्थिकोशिका क्षेत्र के mineralized मैट्रिक्स अस्थिकोरक हमलावर एक हड्डी विशिष्ट मैट्रिक्स (osteoid) जो बाद में mineralized है नीचे रखना करने के लिए एक पाड़ प्रदान करता है, और इस तरह इस प्रारंभिक खनिज के रूप में सफल और कार्यात्मक हड्डी गठन 35 के लिए महत्वपूर्ण है। दरअसल E15 metatarsals उपयोग हाल की रिपोर्ट के एक नंबर खनिज प्रक्रिया 28,36,37 की जांच के लिए उनके अद्वितीय क्षमता की पुष्टि की है। इसके अलावा, शोधकर्ताओं angiogenesis 38 की एक मॉडल के रूप में E15 metatarsals के उपयोग का वर्णन किया है, हड्डियों के विकास / खनिज की स्थापना के बाहर मॉडल के रूप में भ्रूण metatarsals की क्षमता पर प्रकाश डाला।

प्रोटोकॉल का वर्णन हम एक लामिना का प्रवाह हुड, विच्छेदन के प्रदर्शन के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप, और excised आरंभ की संस्कृति के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर सहित केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है। इसके अलावा, एक बहुत ही बुनियादी संस्कृतिमध्यम αMEM, बीएसए, एंटीबायोटिक दवाओं, antimycotics और एल-एस्कॉर्बिक एसिड युक्त संरचना (hydroxyproline और hydroxylysine के संश्लेषण में एक सह-कारक, कोलेजन 39 के उत्पादन के लिए दो आवश्यक अमीनो एसिड) इस तरह के जानवर सीरा के रूप में अपरिभाषित योजक, के उपयोग से बचा जाता है । परंपरागत रूप से, जांचकर्ताओं संस्कृति भ्रूण metatarsals करने के लिए इस्तेमाल करने के लिए मीडिया βGP जोड़ लिया है लेकिन जैसा कि हमारे परिणाम में पता चला, एक अतिरिक्त स्रोत फॉस्फेट का उपयोग इस संस्कृति प्रणाली में सफल खनिज के लिए आवश्यक नहीं है। यह तंत्र ईसीएम खनिज underpinning समझने के हमारे प्रयास में एक महत्वपूर्ण खोज है।

Metatarsals पहले Smad2 के प्रमुख नकारात्मक रूपों युक्त लंबी हड्डी विकास 40 के नियमन में वृद्धि कारक β बदलने की भूमिका का पता लगाने के लिए adenoviruses से संक्रमित किया गया है। यहाँ हम भी GFP वायरस कणों के साथ जंगली प्रकार E15 प्रपदिकीय हड्डियों के सफल अभिकर्मक पता चलता है, टी का संकेतटोपी lentiviral तकनीक आसानी से प्रपदिकीय संस्कृतियों में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए अपनाया जा सकता है। इसी तरह, प्रपदिकीय अंग संस्कृति प्रणाली है जिसमें आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों से हड्डियों के विकास की तुलना करने के लिए बेहतर हड्डियों के विकास की प्रक्रिया में एक विशेष जीन की भूमिका को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। हमारे पिछले अध्ययनों endochondral हड्डियों के विकास में साइटोकाइन का शमन संकेत -2 (SOCS2) की भूमिका निर्धारित करने के लिए प्रपदिकीय अंग संस्कृति प्रणाली का उपयोग किया है। SOCS2 में चूहों की कमी से प्रपदिकीय हड्डियों का उपयोग करना, हम चाहते हैं कि वृद्धि हार्मोन है पता चला है वृद्धि कारक जैसे इंसुलिन के अपने अनुदैर्ध्य विकास स्वतंत्र अनुकरण करने में सक्षम (आईजीएफ -1), जंगली प्रकार प्रपदिकीय हड्डियों जो वृद्धि हार्मोन उपचार 34 का जवाब नहीं है के विपरीत, 41। यह किस हद तक प्रपदिकीय संस्कृतियों अलग जीन और / या endochondral हड्डियों के विकास पर बहिर्जात कारकों के प्रभाव की जांच करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है पर प्रकाश डाला गया।

सारांश में, हम Detai हैसफल निकासी और भ्रूण प्रपदिकीय हड्डियों जो चालाकी से किया जा सकता है की संस्कृति के लिए एक विधि का नेतृत्व किया और विश्लेषण की एक किस्म का उपयोग कर जांच की। इस पूर्व vivo मॉडल इसलिए monolayer या 3 डी संस्कृति में कोशिकाओं की तुलना में एक अधिक शारीरिक मॉडल उपलब्ध कराने, सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत का कहना है के रूप में अच्छी तरह से उपास्थिजनन के विभिन्न चरणों में chondrocytes शामिल हैं। Metatarsal अंग संस्कृतियों इसलिए endochondral हड्डी बन जाना लिए जिम्मेदार आणविक तंत्र की जांच के लिए एक अनूठा मॉडल हैं, और दोनों हड्डी शरीर विज्ञान और pathophysiology के बारे में हमारी समझ को आगे के लिए आवश्यक हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection scissors World Precision Instruments 14393 Autoclave sterilise before use
Dumont #5 tweezers World Precision Instruments 500342 Autoclave sterilise before use
Dumont #4 tweezers World Precision Instruments 500339 Autoclave sterilise before use
SuperFine Vannas scissors World Precision Instruments 501778
Absolute ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17 Dilute to 70% v/v in dH2O
α-MEM without nucleosides Thermo Fischer Scientific  22561021
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3059
Syringe filters (0.22 μm) 33 mm diameter Merck Millipore SLGP033RS
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate Sigma Aldrich P0378 Add directly to the media prior to experimentation
L-ascorbic acid-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 °C
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C5080 Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 °C
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G9422 Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 °C
Gentamicin Thermo Fischer Scientific  15710049
Amphotericin B Thermo Fischer Scientific  15290018
Nunc cell-culture treated 24-well plates Thermo Fischer Scientific  142475
Polybrene Sigma Aldrich H9268
DAPI Thermo Fischer Scientific  D3571

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 118 metatarsal उपास्थिकोशिका बाह्य मैट्रिक्स खनिज murine endochondral हड्डी बन जाना
Murine भ्रूण Metatarsals की संस्कृति: endochondral हड्डी बन जाना के एक शारीरिक मॉडल
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Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. J. Vis. Exp. (118), e54978, doi:10.3791/54978 (2016).

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