Abstract
Die Zellen durch Apoptose sterben, auch bezeichnet als regulierte Zelltod, mehrere neue Aktivitäten zu erwerben, die es ihnen ermöglichen, die Funktion von benachbarten lebenden Zellen zu beeinflussen. Vitale Aktivitäten, wie das Überleben, die Proliferation, das Wachstum und die Differenzierung, gehören zu den vielen Zellfunktionen durch apoptotische Zellen moduliert. Die Fähigkeit, apoptotische Zellen zu erkennen und zu reagieren scheint ein universelles Merkmal aller Zellen zu sein, unabhängig von Lineage oder Organ des Ursprungs. Allerdings ist die Vielfalt und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen vor, dass große Sorgfalt, die für ein bestimmtes Ergebnis in sezieren die Signalereignisse und Wege genommen werden. Insbesondere muß man unter den mehreren Mechanismen unterscheiden, durch die apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen beeinflussen können, einschließlich: Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zellen, die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch die apoptotische Zelle und / oder Eingriff der phagocytic Maschinen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignissen, die lebensfähige Responderzellen nach ihrer Exposition gegenüber apoptotischen Zellen induziert werden. Ein Hauptvorteil des Protokolls liegt in der Aufmerksamkeit es Dissektion des Mechanismus zahlt, durch die apoptotischen Zellen Ereignisse innerhalb reagiert Zellen modulieren signalisiert. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierten Mausniere proximalen röhrenförmigen Zelllinie (BU.MPT Zellen) spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien, die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen als der Niere nicht-epithelialen sind. Die Verwendung von toten Zellen als Stimulus stellt einige einzigartige Faktoren, die den Nachweis von intrazellulären Signalereignisse behindern. Diese Probleme sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Die Anwendung dieses Protokolls sollte unsere wachsenden Wissen der breiten Einfluss unterstützen, die toten oder sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in den Bereichen Gesundheit und in disease.
Introduction
Apoptosis oder regulierte Zelltod 1 trägt in wesentlicher Weise zur Erhaltung und Entwicklung von Geweben. Gesehen am einfachsten, Apoptose Genehmigungen im Alter, beschädigt oder überschüssige Zellen ohne Schaden für das umgebende Gewebe 2,3 beseitigt werden. Der Beitrag der Apoptose Gewebshomöostase jedoch wesentlich dynamischer und vielfältig. Die Zellen durch Apoptose erwerben mehrere neue Aktivitäten zu sterben, beide abgesondert und zellassoziierte, die es ihnen ermöglichen 4-10 die Funktion benachbarter lebenden Zellen zu beeinflussen. Frühere Untersuchungen über die Fähigkeit von apoptotischen Zellen konzentriert Entzündung 11-16, aber apoptotischen Zellen zu unterdrücken , auch ein breites Spektrum von Zellfunktionen modulieren, einschließlich solcher vital Aktivitäten als Überleben 4,9,10, 4,9,10 - Proliferation, Differentiation 17, Migration 18 und 19 das Wachstum. Außerdem sind diese Wirkungen nicht auf professionelle Phagozyten beschränkt ist, wie Makrophagens, aber auf praktisch allen Zelltypen und Abstammungslinien erstrecken, einschließlich traditionell nicht-phagozytische Zellen, wie Epithelzellen und Endothelzellen 7,9,10,18-21.
Die spezifische Reaktion benachbarter lebenden Zellen zu apoptotischen Zellen nach der Exposition, hängt von mehreren Faktoren, die sowohl die lebensfähigen reagierenden Zellen beziehen, und den apoptotischen Zellen selbst. Obwohl beispielsweise Exposition gegenüber apoptotischen Zellen hemmt , die Proliferation von sowohl murinen Makrophagen und Nieren proximalen tubulären Epithelzellen (ptecs), wobei diese beiden Zelltypen unterscheiden sich erheblich in ihrem Überleben Reaktion auf apoptotische Zellen 4,6,9,10. Apoptotischen Zellen fördern das Überleben von Makrophagen, aber der apoptotischen Tod von ptecs 4,6,9,10 induzieren. Bemerkenswert ist , kann die Reaktion auf apoptotische Zellen unterscheiden sich auch Zellen der gleichen Abstammungslinie, abhängig von der Reaktion Zelle Ursprungsorgan 10 (beispielsweise Nieren ptecs Vergleich Brustepithelzellen unter reagiertZellen) oder Zustand der Aktivierung 22 (zB Neutrophile). Umgekehrt kann apoptotischen Zellen unterschiedliche Antworten in der gleichen Zelle evozieren von der Art des apoptotischen Stimulus abhängig 10,23 oder das Stadium der Apoptose 10,14.
Da müssen die Verschiedenheit und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen, große Sorgfalt in sezieren die Signalereignisse und Wege für einen bestimmten Ergebnis verantwortlich gemacht werden. Erstens Antworten direkte physikalische Interaktion zwischen lebens- und apoptotischen Zellen erfordern , müssen von den durch lösliche Mediatoren durch die apoptotische Zelle 3,6-10 freigesetzt oder erzeugt ausgelöst differenziert werden. Wenn physikalische Wechselwirkung erforderlich ist, dann sollte eine weitere Differenzierung vorgenommen werden. Signalisierungsereignisse können auf Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zelle, unabhängig von nachfolgenden engulfment abhängen, oder Phagozytose, unabhängig von dem spezifischen Rezeptor, der die apoptotische Zelle bindet 3-7,9,10,19. Im letzteren Fall ist die Antwort auf apoptotischen Zellen nicht spezifisch, und kann von jedem Material phagozytischen 4,6 ausgelöst werden.
Die Bedeutung dieser Unterscheidung kann wiederum durch kontras die Antworten von Makrophagen und Nieren ptecs geschätzt. Für beide Zelltypen, Exposition gegenüber apoptotischen Zellen verändert die Aktivität des Pro-Überleben kinase Akt. Die Modulation ist abhängig von physikalischen Wechselwirkung, da die Trennung von Reaktion und apoptotischen Zellen durch eine 0,4 um Polycarbonatmembran hebt die Antwort 4,9,10,19. Jedoch ist die Reaktion von ptecs rezeptorvermittelten und unabhängig von Phagocytose, während die Reaktion der Makrophagen durch Phagozytose 4,9,10,19 angetrieben wird. Diese Schlussfolgerung wird durch die Tatsache verstärkt , dass die Exposition gegenLatexKügelchen, einem neutralen phagozytischen Reiz, keine Auswirkungen auf die Akt - Aktivität in ptecs hat, sondern ahmt die Wirkung von apoptotischen Zellen in Makrophagen 4,9.
"> Obwohl weniger gut untersucht, sterbende Zellen durch Nekrose oder zufälligen Zelltod 1, modulieren auch die Funktion der lebensfähigen Zellen in der Nähe 3-10,19. Wie apoptotischen Zellen, nekrotische Zellen üben ihre Wirkungen durch eine Vielzahl von Mechanismen, insbesondere der Leckage der intrazellulären Inhalte durch ihre geplatzten Zellmembran 3,5,6,9,24. Viele Zellen, einschließlich ptecs und Makrophagen besitzen ausgeprägte nicht-konkurrierende Rezeptoren für durch Nekrose 5,9 sterbende Zellen. Verpflichtungs dieser Rezeptoren signal~~POS=TRUNC induziert, die durch den Eingriff der Rezeptoren für apoptotische Zellen zu denen häufig entgegengesetzte 4-10,19 induziert , z. B. in ptecs erhöhen nekrotischen Zellen die Phosphorylierung von Akt, während apoptotischen Zellen Phosphorylierung 9,10,19 verringern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignisse induziert in lebensfähige Niere ptecs durch Rezeptor-vermittelte Erkennung von benachbarten apoptotischen ptecs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitungen
Anmerkung: In diesem Protokoll werden zwei oder mehrere Zelllinien oder primäre Zellkulturen werden unabhängig hergestellt unter spezifischen Bedingungen. Diese Präparate enthalten apoptotischen Zellen (Protokoll 1), nekrotische Zellen (Protokoll 2) und gesunden Responderzellen (Protokoll 3). Nach unabhängige Herstellung sind apoptotischen oder nekrotischen Zellen zu Responderzellen zugegeben und die erhaltene Signaltransduktion wird überwacht (Protocols 4, 5 und 6).
- Bereiten Kulturmedien und Reagenzien
- Bereiten Sie 500 ml Kulturmedium A (für den Einsatz, wenn die Zellen unter permissiven Bedingungen wachsen, siehe Abschnitt 1.2) durch die Kombination der folgenden: 1x Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 4,5 g / l Glucose, 584 mg / l ʟ-Glutamin, 110 mg / l Natriumpyruvat, 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin, 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 10 Einheiten / ml Interferon-γ (IFN-γ).
- Bereiten 500 ml Kulturmedium B (zur Verwendung when Serum-hungernde Zellen unter nicht-permissiven Bedingungen, Abschnitt 1.2) von FBS und IFN-γ aus dem Rezept des Kulturmediums A. Auslassen Um Zellen unter nicht-permissiven Bedingungen (vor der Serum-Hunger) wachsen, mit 10% v sehen / v FBS Kulturmedium B.
- Bereiten 0,4% (v / v) Paraformaldehyd, pH 7,2, in 1x Dulbecco-phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) von 4% Paraformaldehyd Lager zur Fixierung von toten Zellen.
Hinweis: Paraformaldehyd ist giftig und entsprechende Vorsicht ist bei seiner Verwendung ausgeübt werden.
- Kultur BU.MPT Zellen
- Tauen aus flüssigem Stickstoff ein Fläschchen BU.MPT Zellen.
Hinweis: BU.MPT ist eine Maus Niere proximale röhrenförmige Epithelzellen (PTEC) Linie von einer transgenen Maus abgeleitet ist eine temperaturempfindliche (ts) Mutation (tsA58) des SV40 großen Tumor Antigen (Tag) unter der Kontrolle des Maus-tragenden Haupt Histocompatibility Complex (MHC) H-2K b Klasse I - Promotor 25,26. - Platten-Zellen auf sterile polystyrene Vakuum-Gasplasma behandelten Gewebekulturschalen (~ 5 × 10 6 Zellen pro 100 mm Durchmesser - Schale).
- Wachsen Zellen unter permissiven Bedingungen in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre.
Anmerkung: permissiven Bedingungen, die als Kultur definiert werden bei 33 bis 37 ºC in Gegenwart von IFN-γ, ermöglichen eine stabile Expression des tsA58-mutierten TAg Transgen. Im Gegensatz zu Primärkulturen von Maus Niere PTEC, die mehr überleben nicht als eine einzige Passage oder zwei, kultiviert BU.MPT unter permissiven Bedingungen unbegrenzt passagiert werden.- Passage-Zellen mindestens dreimal nach dem Auftauen vor ihnen in einem Experiment verwendet wird.
- Zur Passage - Zellen, 1 ml von 0,05% Trypsin pro 100 - mm - Schale, und Inkubation in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 5 min. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 10 ml Medium A. aspirieren die abgelösten Zellen und Split im Verhältnis 1: 3 bis 1: 5 in neue 100 mm sterile Polystyrol Vakuum-Gasplasma behandelt tissue Kulturschalen. In Medium A das Volumen zu bringen, bis zu einer Gesamtmenge von 10 ml pro 100 mm Schale.
- Passage-Zellen mindestens dreimal nach dem Auftauen vor ihnen in einem Experiment verwendet wird.
- In Vorbereitung für die experimentelle Verwendung als Zellen reagiert, Zellen wachsen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter nicht-permissiven Bedingungen (dh bei 39 ºC in Abwesenheit von IFN-γ [Medium B mit 10% v bis zur Konfluenz / v FBS]).
Hinweis: Unter nicht-permissiven Bedingungen, die Expression des tsA58 mutierten TAg Transgen gehemmt durch> 95%, und BU.MPT Zellen verhalten sich wie Primärkulturen von Maus Niere PTEC.
- Tauen aus flüssigem Stickstoff ein Fläschchen BU.MPT Zellen.
2. Herstellung von apoptotischen Zellen BU.MPT (Protokoll 1)
Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von apoptotischen Zellen und Staurosporin als Verfahren zur Apoptoseinduktion spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur, kann als Quelle für apoptotische Zellen verwendet werden, wobei die Apoptose durch standardisierte Protoco induziertels für diesen bestimmten Zelltyp und ein Verfahren zur Induktion der Apoptose.
- Nach dem Durchgang auf 100 mm Durchmesser sterile Polystyrolvakuumgasplasma behandelte Gewebekulturschalen wachsen BU.MPT Zellen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter permissiven Bedingungen zur Konfluenz (dh bei 37 ºC in Kulturmedium A an 10 ml pro 100-mm-Schale), wie in Abschnitt 1.2.3 beschrieben.
- Spülen Sie die adhärenten Zellschicht dreimal mit Kulturmedium B, unter Verwendung von 10 ml pro Spülung.
- Apoptose induzieren , indem die Zellen in Kulturmedium B enthält Staurosporin Inkubieren einer nicht - selektiven Proteinkinase - Inhibitor, bei 1 & mgr; g / ml für 3 Stunden in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ºC.
- Saugen Sie das Staurosporin haltigen Medium "schwebenden" apoptotischen Zellen enthalten, die von der einschichtigen abgelöst haben. Zentrifuge dieses Medium für 10 Minuten bei 500 · g, den Überstand verwerfen, waschen Sie das Pellet dreimal mit Kulturmedium B, undfügen Sie das Pellet zurück zu den Zellen im nächsten Schritt gesammelt, 2.5.
- Lösen sich die verbleibenden adhärenten Zellen aus den Schritten 2.3 und 2.4 durch Zugabe von 5 mM (Ethylendiamintetraessigsäure) EDTA in 1x Ca 2 + - und Mg 2 + -freien DPBS bei 1 ml pro Schale für 5 min. Saugen Sie das EDTA-haltige Medium abgelöst apoptotischen Zellen enthält, und bündeln die abgelösten Zellen mit den "schwebenden" apoptotischen Zellen aus Schritt 2.4 in einem sterilen 15 ml Polystyrol-Zentrifugenröhrchen.
- Waschen Sie die apoptotischen Zellen dreimal durch Zentrifugation für 10 min bei 500 xg und Resuspension in 10 ml 1x Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS pro Waschung.
- Nach der letzten Waschung unterbrechen die apoptotischen Zellen in frischem Kulturmedium B bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml vor der Verwendung zu Responderzellen zu stimulieren. Alternativ fixieren gewaschen apoptotischen Zellen in 0,4% (v / v) Paraformaldehyd in 1x DPBS für 30 Minuten, und dann dreimal waschen mit KulturMedium B, vor Suspension in Kulturmedium B.
- Gegebenenfalls bestätigen Induktion von Apoptose mittels Durchflusszytometrie eine getrennte Herstellung von apoptotischen Zellen (oder durch einige Zellen für diesen Zweck reserviert), wie zuvor beschrieben 6,9,10,15.
Anmerkung: Frühe apoptotische Zellen intakte Zellmembranen und erscheinen als Propidiumiodid (PI) -negativen und Annexin V-positive Zellen verringerte Zellgröße (bezogen auf den lebensfähigen Zellen). Späten haben apoptotische Zellen nicht intakten Zellmembranen und erscheinen als PI-positive und Annexin V-positive Zellen der Zellgröße verringert. Mit dem aktuellen Protokoll, typische Zubereitungen enthalten ~ 85% früh apoptotischen und ~ 15% spät apoptotischen Zellen. - apoptotischen Zellen In den Responderzellen (Protokoll 3) an einem apoptotischen-to-Responderzellverhältnis von 1 BU.MPT: 1, entweder direkt oder nach der Fixierung von apoptotischen Zellen für 30 min mit 0,4% (v / v) Paraformaldehyd in 1x DPBS .
Hinweis: Die apoptotischen Zellfixierung vor der Stimulation der Responder solltenbeeinflussen die Ergebnisse nicht, es sei denn , die beobachteten Signalereignisse aufgrund Freisetzung eines löslichen Mediator (Tabelle 1) sind.
3. Herstellung von Nekrotischer BU.MPT Zellen (Protokoll 2)
Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von nekrotischen Zellen und Erhitzen als Verfahren zur Nekrose Induktions spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur kann als Quelle von nekrotischen Zellen verwendet werden, wobei durch standardisierte Protokolle für diesen bestimmten Zelltyp und ein Verfahren zur Nekrose Induktion induzierte Nekrose.
- Nach dem Durchgang auf 100 mm Durchmesser sterile Polystyrolvakuumgasplasma behandelte Gewebekulturschalen wachsen BU.MPT Zellen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter permissiven Bedingungen zur Konfluenz (dh bei 37 ºC in Kulturmedium A an 10 ml pro Schale), wie in Abschnitt 1.2.3 beschrieben.
- Spülen Sie die adhärenten Zellschicht dreimal mit Kulturmedium B, unter Verwendung von10 ml pro Spülung.
- Lösen sich die Zellen durch Zugabe von 5 mM EDTA in 1x Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS bei 1 ml pro Schale für 5 min. Saugen Sie das EDTA-haltige Medium abgelösten Zellen enthält, und fügen Sie in ein steriles 15 ml Polystyrol-Zentrifugenröhrchen die Zellsuspension.
- Waschen Sie die Zellen dreimal durch Zentrifugation für 10 min bei 500 xg und Resuspension in 10 ml Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS pro Waschung.
- Nach der letzten Waschung, um die Zellen in frischem Kulturmedium B bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml einzustellen.
- Induce Nekrose von Zellen auf 70 ° C für 45 min in einem Wasserbad, sanft verwirbelt die Zellsuspension alle 10 min erhitzt wird.
- Inkubiere Zellen für 2 h in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C. alle 15 min vorsichtig Vortex, um die Zellsuspension.
- Gegebenenfalls bestätigen die Induktion von Nekrose mittels Durchflusszytometrie eine separate Herstellung ne mitcrotic Zellen (oder durch einige Zellen für diesen Zweck reserviert), wie zuvor beschrieben 6,9,10,15.
Hinweis: Nekrotische Zellen Zellmembranen aufgebrochen sind, und erscheinen als PI-positive Zellen mit erhöhter Zellgröße (bezogen auf den lebensfähigen Zellen). Mit dem aktuellen Protokoll, typische Zubereitungen enthalten ≥ 95% nekrotischen Zellen. Alternativ Induktion von Nekrose und den Verlust der Membranintegrität kann durch Trypan-Blau-Färbung bestätigt.
4. Herstellung von BU.MPT Responderzellen (Protokoll 3)
Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von Responderzellen spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur, können als Responderzellen verwendet werden. Vor der experimentellen Verwendung kann quiescence kann über Nacht durch standardisierte Protokolle im Labor induziert.
- Wachsen BU.MPT Zellen in sterilen 100-mm-Gewebekulturschalen unter permissiven Bedingungen in Kulturmedium A bei 10 ml pro Schale, bis sie erreichen ~85% Konfluenz.
- Absaugen Kulturmedium A, und spülen Sie die Zellen dreimal mit Kulturmedium B bei 10 ml pro Spülung. Serum-verhungern die Zellen über Nacht für 18 bis 24 h in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter nicht-permissiven Bedingungen (dh bei 39 ºC in Kulturmedium B bei 10 ml pro Schale), wie im Abschnitt 1.2 0,4, um Ruhe zu induzieren. Alternativ wachsen Zellen in Kulturmedium B plus 10% (v / v) FBS bei 39 ºC für einen Tag, bevor Serum Zellen hungern ohne FBS über Nacht in Kulturmedium B.
- Beschriften Sie eine separate Gewebekulturschale konfluierender BU.MPT Zellen für jede Versuchsbedingung.
- Umfassen die folgenden sechs Bedingungen: Stimulation von lebensfähigem BU.MPT Responder mit entweder Vehikel oder epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) für 15 min, nach ihrer Belichtung für 30 min bis entweder keine Zellen, apoptotische Zellen oder nekrotischen Zellen.
Hinweis: Die Einwirkung der toten Zellen können entweder stimulieren oder den Grad der Aktivität eines gi hemmenven Signalmolekül. Die Stimulation wird am besten über einem niedrigen Ausgangswert nachgewiesen (zB Abwesenheit von EGF), während die Hemmung wird am besten von einem hohen Ausgangswert nachgewiesen (zB Vorhandensein von EGF). Da die Wirkung der Stimulation mit toten Zellen a priori nicht bekannt ist, wird empfohlen , alle Studien sowohl in der Abwesenheit und Anwesenheit von EGF auszuführen.
5. Die Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen und nekrotischen Zellen (Protokoll 4)
- Absaugen Kulturmedium B aus voretikettierten Gerichte der Ruhe (Serum-ausgehungert) BU.MPT Responderzellen (Protokoll 3).
Hinweis: Nach der Nacht-Kultur unter nicht-permissiven Bedingungen, BU.MPT Zellen wie Primärkulturen von Maus Niere PTEC verhalten soll. - Pro 100-mm-Schale, 2 ml eines der folgenden: Kulturmedium B (keine Zellen); apoptotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 1); oder nekrotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro mL in Kulturmedium B (Protokoll 2).
- Verteilen Sie die 2 ml Suspension von toten Zellen gleichmäßig über die 100-mm-Schale, und halten Sie die Zeit für sie, auf ein Minimum zu begleichen. Um dies zu erreichen, verteilen die tote Zellsuspension tropfenweise mit einer breiten Spitze Pipette über die gesamte Oberfläche der Responderzell Gerichte. Verwenden Sie ein Volumen von 2 ml als Kompromiss zwischen der Einschwingzeit minimiert und die Verklumpung von toten Zellen zu vermeiden.
Hinweis: Die Verwendung einer Suspension von toten Zellen als Anregung eine Reihe von speziellen Überlegungen zur Folge hat , die im Folgenden näher beschrieben werden (Tabelle 2 und Diskussion). - Erreichen Sie einen Toten-to-Responder - Zellen - Verhältnis von ~ 1: 1 durch Zugabe von 2 ml toten Zellen bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml zu einem konfluenten 100 - mm - Schale, die ~ 10 x 10 6 Zellen enthält. Alternativ kann, um die Dosisabhängigkeit von irgendwelchen beobachteten Signalereignisse zu etablieren, variieren das Verhältnis von Toten zu Responderzellen kontinuierlich durch progressive Verdünnung in Kulture Medium B der toten Zellsuspensionen in den Protokollen 1 und 2 hergestellt.
- Verteilen Sie die 2 ml Suspension von toten Zellen gleichmäßig über die 100-mm-Schale, und halten Sie die Zeit für sie, auf ein Minimum zu begleichen. Um dies zu erreichen, verteilen die tote Zellsuspension tropfenweise mit einer breiten Spitze Pipette über die gesamte Oberfläche der Responderzell Gerichte. Verwenden Sie ein Volumen von 2 ml als Kompromiss zwischen der Einschwingzeit minimiert und die Verklumpung von toten Zellen zu vermeiden.
- Vorsichtig die Teller wirbeln, dann in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ºC inkubiert.
- Nach 30 Minuten Stimulierung entweder die Responderzellen mit Vehikel oder 50 nM EGF, entsprechend der vorge Kennzeichnung der Kulturschale.
- In einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 15 min inkubieren.
- Waschen Sie die toten Zellen entfernt durch Zugabe von 5 ml eiskaltem 1x DPBS, wirbeln die Schüssel, und Absaugen der Waschflüssigkeit. Dreimal wiederholen.
- Ab sofort legen Sie die Responderzellschalen auf Eis für die weitere Verarbeitung.
- Bereiten Sie Zelllysaten
- Bereiten Zelllysepuffer folgendes enthält: 1 × Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), 10 mM Natriumpyrophosphat, 0,5% w / v Desoxycholat, 0,1% w / v SDS, 10% Glycerin und 25 mM Natriumfluorid.
- Unmittelbar vor der Lyse der Zelle, die folgende in der exakten Reihenfolge im ind gegeben hinzufügencated Konzentrationen: mini EDTA-freie Proteaseinhibitorcocktail (1 Tablette pro 10 ml Lyse-Puffer), 10% (v / v) Triton X-100, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und 10 mM Natriumorthovanadat.
- In 700 ul eiskaltem Zelllysepuffer pro 100 mm Schale frisch stimuliert Responderzellen auf Eis aus Schritt 5.7. Scrape-Zellen mit einem Zellschaber und übertragen das Lysat vorab gekühlt 1,5 ml Mikroröhrchen. Pflegen Sie die Röhrchen auf Eis für 15 min.
- Beschallen Lysaten auf Eis mit 10 Impulsen von 20 Hz, weniger als eine Sekunde pro Dauer. Vermeiden Sie die Erstellung von Schaum an der Gas / Flüssig-Grenzfläche, da dies die Proben überhitzen kann. Tauchen Sie voll und ganz die Beschallungsgerät Sonde in die Mikroröhrchen Lysaten vor der Beschallungsgerät einschalten, und schalten Sie das Beschallungsgerät aus, bevor die Sonde aus den Lysaten zu entfernen.
- Zentrifuge bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C, übertragen Sie die Überstände in frische vorgekühlte Mikroröhrchen, Und lagern bei -70 ºC.
- Führen Gelelektrophorese und Immunoblotting auf Überständen von Lysaten, wie zuvor beschrieben 6,9,10,15.
- Bereiten Zelllysepuffer folgendes enthält: 1 × Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), 10 mM Natriumpyrophosphat, 0,5% w / v Desoxycholat, 0,1% w / v SDS, 10% Glycerin und 25 mM Natriumfluorid.
6. Vermeiden von direkter physischer Kontakt zwischen Targets und Responders Mit einem Semipermeable Polycarbonat-Membran (Protokoll 5)
- Bereiten Sie BU.MPT Responderzellen gemäß Protokoll 3, mit einer Ausnahme; wachsen Zellen in sterilen Kultur Polystyrol Gewebe behandelt 12-Well-Clustern.
- In ausgewählten Wells, legen Sie ein durchlässiges Trägersystem eine 0,4 um Polycarbonatmembran enthält physikalische Wechselwirkung zwischen toten und Responderzellen zu verhindern. Umfassen Kontrollvertiefungen ohne Membran in dem gleichen Experiment.
- Absaugen Kulturmedium B aus experimentellen Vertiefungen von Serum-ausgehungert BU.MPT Responderzellen.
- Folgen Protokoll 4 zur Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen oder nekrotischen Zellen, mit den folgenden Modifikationen:
- Pro Vertiefung der 12-Well-Cluster, mit 0,1 ml eines der folgenden: Kulturmedium B (keine Zellen); apoptotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 1); oder nekrotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 2).
Hinweis: Da ein konfluenter Vertiefung einer 12-Well - Cluster enthält ~ 0,5 × 10 6 Zellen, Zugabe von 0,1 ml der toten Zellen bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml ergibt eine dead-to-Responderzellenverhältnis von ~ 1: 1. - Um Brunnen die durchlässige Trägersystem enthält, fügen Sie die toten Zellen auf der Oberseite des 0,4 um Polycarbonatmembran innerhalb des durchlässigen Trägersystem, so gibt es keine direkte physikalische Wechselwirkung zwischen toten und Responderzellen.
- Pro Vertiefung der 12-Well-Cluster, mit 0,1 ml eines der folgenden: Kulturmedium B (keine Zellen); apoptotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 1); oder nekrotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 2).
7. Die Hemmung der Phagozytose mit Cytochalasin D (Protokoll 6)
- Bereiten Sie BU.MPT Responderzellen gemäß Protokoll 3.
- Bereiten Sie den Cytoskelettinhibitor Cytochalasin D in dimethyl Sulfoxid (DMSO) bei 4 mg / ml (1000 ×). In den vormarkiert Speisen der BU.MPT Responderzellen entweder 10 & mgr; l Vehikel (DMSO) oder 10 & mgr; l von Cytochalasin D eine Endkonzentration von 4 ug / ml in 10 ml Kulturmedium zu erreichen, B.
Hinweis: Bei dieser Konzentration von Cytochalasin D, Phagozytose von BU.MPT Zellen und Makrophagen - Zelllinie von ≥90% 9,10 gehemmt wurde. - Inkubieren für 2 h bei 37 ºC in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre.
- Folgen Protokoll 4 zur Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen oder nekrotischen Zellen.
- Gegebenenfalls bestätigen die Hemmung der Phagozytose von abgestorbenen Zellen mittels Durchflusszytometrie eine getrennte Herstellung von Toten und Responderzellen (oder für diesen Zweck reservierten Zellen), wie zuvor beschrieben 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Abbildung 1 stellen wir eine schematische Darstellung der Timing- und kritischen Schritte bei der Herstellung von apoptotischen Zellen beteiligt (Protokoll 1) und nekrotischen Zellen (Protokoll 2) und die Stimulation von Responderzellen mit Suspensionen von apoptotischen und nekrotischen Zellen (Protokoll 4).
In Figur 2 stellen wir repräsentative Ergebnisse , die Wirkung von apoptotischen Zellen , die auf die Phosphorylierung der zwei Isoformen der Serin-Threonin - Kinase Glykogensynthasekinase-3 (GSK-3), GSK-3α und GSK-3β zeigt. GSK-3α / β hat eine herausragende Rolle bei der Regulation der zellulären Proliferation und Überleben, sowie seine wichtige Rolle in den Glukosestoffwechsel. Phosphorylierung von GSK-3α am Serin-21 und GSK-3β an Serin-9 hemmt Kinaseaktivität und führt wiederum zu einer verminderten Phosphorylierung und erhöhte Stabilisierung von β-Catenin. ß-Catenindann transloziert in den Zellkern, wo sie die Transkription von Genen bekannt, fördert die Zellproliferation zu stimulieren und die Apoptose hemmen. Daher erhöhte Phosphorylierung von GSK-3α / β ist mit einer erhöhten Proliferation und das Überleben verbunden ist, während die Phosphorylierung von GSK-3α / β verringert korreliert mit einer verminderten Proliferation und Überleben.
Exposition der Ruhe BU.MPT Responder - Zellen für 30 min stark gehemmt basale Phosphorylierung von GSK-3α / β (2A) zu apoptotisch. In ähnlicher Weise hemmte vorherige Exposition gegenüber apoptotischen Ziele für 30 min stark nachfolgenden epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) -induzierte Phosphorylierung von GSK-3α / β (2A). Im Gegensatz dazu Exposition von BU.MPT Responder nekrotischen Zellen hatte keine Wirkung auf entweder die basale oder EGF-induzierte Phosphorylierung von GSK-3α / β.
Um Prevent physikalische Wechselwirkung zwischen BU.MPT Responder und apoptotischen Zellen, BU.MPT Responder wurden durch eine 0,4 um Polycarbonatmembran aus apoptotischen Ziele in einem durchlässigen Trägersystem und getrennt gewachsen. Verhinderung der physikalischen Wechselwirkung zwischen BU.MPT Respondern und apoptotischen Zellen beseitigte die Fähigkeit von apoptotischen Ziele Phosphorylierung von GSK-3α / β (2B) zu verhindern. Um die Rolle der Phagozytose zu bewerten, haben wir den Cytoskelettinhibitor Cytochalasin D zur Phagozytose von toten Zellen zu verhindern. Hemmung der Phosphorylierung von GSK-3α / β als Reaktion auf apoptotische Zellen erfolgte in Abwesenheit von Phagozytose (Abbildung 2C). Wir haben zuvor gezeigt , dass Cytochalasin D, bei der verwendeten Konzentration hemmt PTEC und Makrophagen - Phagozytose von ≥90% 9,10. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass apoptotische Zellen vermittelte Hemmung der Phosphorylierung von GSK3α / β direkte physikalische Interaktion betwe erfordert en Ziele und Responder-Zellen, ist aber unabhängig von der Phagozytose.
Abbildung 1. Schema für Induktion intrazellulärer Signal Events in führbare Responder - Zellen durch physikalische Wechselwirkung mit benachbarten Zellen unterziehen Zelltod. Die Liniendiagramme zeigen die Timing und kritische Ereignisse bei der Herstellung von (A) apoptotischen (Apo) Zelle und (B) nekrotischen (Necro) Zellsuspensionen von BU.MPT Zellen, und in der (C) Stimulation von lebenden BU.MPT Responder Zellen, die mit Suspensionen von apoptotischen oder nekrotischen Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
Abbildung 2. Die Hemmung der Phosphorylierung von GSK3α / β in BU.MPT Responder - Zellen nach Exposition gegenüber apoptotischen Zellen erfordert eine direkte Zell-Zell - Interaktion ist aber unabhängig von Phagozytose. Serum-ausgehungert BU.MPT Responder - Zellen wurden für 2 h vorbehandelt mit (A, B) Fahrzeug oder (C) Cytochalasin D (4 ug / ml), und dann für 30 min stimuliert ohne Zellen (-), apoptotische Zellen (Apo ) oder nekrotischen Zellen (Nec) , bei einer toten Zelle Zellverhältnis von 1 bis responder: 1. Die Responderzellen wurden dann gewaschen und für weitere 15 min in Abwesenheit oder in Gegenwart von EGF (50 nM) inkubiert, vor der Ernte. Die Quelle von apoptotischen Zellen war Staurosporin behandelten BU.MPT Zellen. Die Quelle von nekrotischen Zellen wurde wärmebehandelt BU.MPT Zellen. Die Interaktion zwischen toten Zellen und BU.MPT Responder war entweder (A, C) ungehindert die direktentote Zelle-responder physikalische Interaktion, oder (B) unter Abtrennung der toten Zellen und Responder durch eine 0,4 um Polycarbonatmembran in einem durchlässigen Trägersystem. Tote Zellen und nicht-anhaftende Responder-Zellen wurden durch Waschen entfernt und BU.MPT responder Zelllysate wurden mit anti-phosphoryliertes GSK3α / β-Antikörpern sondiert, wie gezeigt. Gleiche Beladung wurde durch Sondieren für insgesamt Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) bestätigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Auswirkung auf die Signalereignis diesen Mechanismus unter der Annahme , | |||||||
| Intervention | Lösliche Vermittler | Rezeptor-vermittelte Erkennungs | Phagozytose | ||||
| Fixation von apoptotischen Zellen * | Beseitigung | Ausdauer | Ausdauer | ||||
| Die physische Trennung von apoptotischen und Responderzellen † | Ausdauer | Beseitigung | Beseitigung | ||||
| Ultrazentrifugiert konditionierte Medium aus Zellen, die Apoptose als stimulus¶ läuft | Ausdauer | Beseitigung | Beseitigung | ||||
| Nekrotischen Zellen als Stimulus | Beseitigung | Beseitigung oder entgegengesetzt gerichtete Reaktion (zB Hemmung gegenüber Stimulation) | Ausdauer | ||||
| Latexkügelchen als Stimulus | Beseitigung | Beseitigung | Ausdauer | ||||
| Pharmakologische Hemmung der Phagozytose | Ausdauer | Ausdauer | Beseitigung | * Prognostizierte Ergebnisse davon aus, dass Fixierung nicht kritisch Oberflächendeterminanten Rezeptor-vermittelte Erkennung und / oder Phagozytose verantwortlich für nicht verändert. | |||
| † Vorhergesagte Ergebnisse zur Folge haben zwei Annahmen: erstens, daß die lösliche Mediator durch die Poren der Membran zu passieren klein genug ist , die apoptotische und reagierenden Zellen trennt, und zweitens, dass alle Schuppen Vesikel oder Mikrovesikel, oft als apoptotische Körper, sind zu groß , um gehen durch die Poren der Membran. Eine Rolle für Vesikel oder Mikrovesikel würde durch fehlende Übereinstimmung in dem Signalisierungsereignisse mit physikalischen Trennung von apoptotischen und Responderzellen gegenüber ultrazentrifugiert konditionierten Medium beobachtet vorgeschlagen. | |||||||
| ¶ Ultrazentrifugation (20.000 × g für 30 min) ist notwendig , um apoptotische Körper oder andere Schuppen unlösliche Material zu entfernen, die die effe nachahmencts der intakten apoptotischen Zelle. | |||||||
Tabelle 1. Bezeichnung des Mechanismus (n) Verantwortlich für Veranstaltungen in lebenden Zellen nach Exposition mit apoptotischen Zellen Signalisierung. Mehrere unkompliziert sind experimentelle Strategien zur Verfügung gestellt unter den potentiellen Mechanismus (n) verantwortlich für die Signalisierung Ereignisse beobachtet nach Exposition gegenüber apoptotischen Zellen zu unterscheiden. Diese Mechanismen sind: physikalische Wechselwirkung der apoptotischen Zelle mit spezifischen Rezeptoren auf der Antwortzelle, die Freisetzung von löslichen Mediatoren aus der apoptotischen Zelle, und das Engagement der phagozytischen Maschinerie der Responderzelle.
| Experimentelle Ausgabe | Erhältlich Strategien zur Minimierung und / oder Umgehung |
| Eingeschränkte Anzahlapoptotischer Zellen pro Reaktion Zelle (~ 1: 1-Verhältnis). | 1. Die Anzahl der apoptotischen Zellen erhöhen, aber die apoptotische-to-responder sollte Zellverhältnis gehalten werden <2: 1. * |
| Sie benötigen für die Schwerkraft abhängige Absetzen von apoptotischen Zellen. | 1. Minimieren Sie das Volumen des Mediums, in dem apoptotischen Zellen suspendiert sind. |
| 2. Zentrifugieren Sie die Schüssel oder Platte, die die apoptotischen Zellen durch das Suspensionsmedium schneller zu fahren. | |
| Ungleichmäßige räumliche Verteilung von apoptotischen Zellen. | 1. verteilen Sie vorsichtig die apoptotische Zellsuspension tropfenweise mit einer breiten Spitze Pipette über die gesamte Oberfläche der Responderzell Gerichte. |
| 2. Vermeiden Kulturschalen oder Brunnen mit einem Durchmesser von <35 mm, in denen meniscal Effekte zu einer ungleichmäßigen Verteilung führen kann. | |
| Die Heterogenität der apoptotischen Zellpopulation. | 1. Verwenden Sie ein starker Induktorder Apoptose. |
| 2. Nach der Induktion, fixieren die apoptotischen Zellen mit Paraformaldehyd und Art durch Durchflusszytometrie eine einheitliche Population zu erhalten. | |
| * Bei apoptotischen-to-Responderzell Verhältnisse> 2: 1, werden die apoptotischen Zellen eine konfluente Teppich und zusätzliche apoptotischen Zellen werden mit Responderzellen direkten Kontakt machen nicht mehr bilden | |
Tabelle 2. Experimentelle Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung einer Zellsuspension als Stimulus intrazellulärer Signal Events. Mehrere experimentelle Hindernisse bei der Verwendung einer Zellsuspension als Anregung zugeordnet sind, sowie Strategien für ihre Teil Mittel aufgeführt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir stellen hier ein Protokoll, um die intrazelluläre Signalisierungsereignisse für die Charakterisierung in lebenden Zellen induziert nach ihrer Exposition gegenüber Zellen, die einer Apoptose unterliegen, oder anderen Formen von Zelltod. Das Protokoll betont die mehrere Mechanismen, durch die Exposition gegenüber apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen modulieren können. Diese Mechanismen sind: die Interaktion (über Moleküle oder Oberflächendeterminanten auf die tote Zelle oder seine Schuppen Vesikeln und microvesicles Bridging, oft apoptotische Körper bezeichnet) mit spezifischen Rezeptoren auf der Antwortzelle; die Freisetzung von löslichen Mediatoren (oder sogar ihre extrazellulären Generation 27); und der Eingriff der phagozytischen Maschinen. Unter Umständen , in denen erhebliche Phagozytose auftritt, wird ein zusätzlicher Mechanismus in Betracht gezogen werden , ist die Lieferung von Mediatoren, wie MikroRNA, 21 innerhalb der apoptotischen Zelle oder ihre Vesikel angereichert. Die Bedeutung unserer Protokoll im Vergleich zu other Methoden liegt in der sorgfältigen Präparation der mehrere Mechanismen, durch die apoptotischen Zellen Signaltransduktion innerhalb reagierenden Zellen modulieren können. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, dass die meisten der erforderlichen Techniken sind einfach und Standard-Zellkultur.
Während das Protokoll für BU.MPT Zellen spezifisch ist, ist einer immortalisierten Mausniere PTEC Linie, als die Quelle der beiden Toten und reagierenden Zellen, die Anpassung des Protokolls zu anderen Zelllinien oder primäre Zellkulturen unkompliziert und einfach zu implementieren. Außerdem ist , wie in unseren früheren Veröffentlichungen, müssen die Quelle der toten und reagierenden Zellen nicht notwendigerweise die gleiche sein 9,10,19. Während wir die Verwendung von Staurosporin und Wärme als Induktoren der Apoptose und Nekrose bzw. der Modus und Triggern des Zelltods beschreiben kann ebenfalls variieren. Während die Signalereignisse in BU.MPT Responder nach Exposition gegenüber apoptotischen Zellen induziert werden, weitgehend unabhängig von der Art der Apoptose-Induktion sind ha wir9,10 habe einige Unterschiede beobachtet. Aus diesem Grund empfehlen wir replizierenden wichtigsten Ergebnisse mit verschiedenen Auslösern der apoptotischen Zelltod. Wenn beispielsweise hoch phagozytische Zellen, wie Makrophagen, als Responder verwendet werden , 4,6 oder wenn die Dauer der Wechselwirkung zwischen Responder und toten Zellen ist lang genug , um erhebliche Phagozytose auftritt, dann könnte man ein nicht-toxisches Induktor von betrachten Apoptose, wie Ultraviolett- oder Gamma-Bestrahlung 4,9,10, potentielle phagozytischen Lieferung des Toxins auszuschließen. Alternative Verfahren der Induktion von Nekrose kann auch in Betracht gezogen werden. Während wir identische Ergebnisse mit Heizung und Gefrier-Auftau von Zellen erhalten haben, stellen Sie die umfangreiche Zelle Verklumpung und Schutt mit Gefrier-Auftau auftretenden seine Verwendung problematisch.
Mehrere einfache Strategien können helfen , den besonderen Mechanismus verantwortlich für alle Signalereignisse beobachtet nach Exposition mit apoptotischen Zellen (Tabelle 1 zu erläutern Tabelle 1 aufgeführt, ist die Wirkung auf die beobachtete Signalereignis kann die verantwortliche Mechanismus lokalisieren. Beispielsweise im Falle der Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zelle sollte die Signalisierungsereignis persistieren trotz Fixierung der apoptotischen Zelle, und sollte mit dem Austausch von apoptotischen Zellen durch konditioniertes Medium oder Latexkügelchen, sowie physikalische Trennung eliminiert werden von Toten und reagierenden Zellen. Als Reaktion auf nekrotischen Zellen, sollte die Signalereignis entgegengesetzt eliminiert sein oder werden gerichtet (zB Inhibierung gegen Stimulation).
Es gibt mehrere Folgen dieser eingeschränkten dead-to-Responder-Verhältnis Zelle, die könnenführen zu einer Verringerung oder Verschleierung von Signalereignissen. Um körperlich mit einer tragfähigen Responder Zelle interagieren, eine apoptotische Zelle muss absetzen zunächst durch die Säule des Mediums suspendiert. Selbst bei minimalem Volumen, kann die Zeit für das Absetzen von Zellen beträchtlich sein, so lange wie 10 bis 20 min. Intrazellulärer Signalereignisse werden somit unter reagierenden Zellen unkoordiniert. Somit kann der anfängliche Kontakt zwischen Responder und tote Zellen nicht präzise zeitgesteuert werden, sondern fällt in einen etwas breiten Bereich von Zeiten. Für Veranstaltungen Signalisierung, die auf einer Zeitskala kürzer als die für die Abrechnung erforderliche auftreten, kann dieser Mangel an Synchronisation zu einer Verdunkelung des Signals führen, so dass es nicht mehr von Hintergrund unterscheidbar ist. Auch Signale der Verlängerung der Laufzeit, wenn nicht von ausreichender Größe, kann dieses Problem anfällig sein.
Zusätzlich zu diesen zeitlichen Fragen kann die räumliche Angelegenheiten auch negativ auf Ergebnisse auswirken. Meniscal Wirkungen, vor allem in Brunnen und Gerichte der sMall Durchmesser (zB Kultur Polystyrol Gewebe behandelt 96-Well - Cluster) oder Flüssigkeit durch zu kraftvollen Pipettieren erzeugten Ströme zu einer ungleichmäßigen Verteilung der toten Zellen führen kann, wodurch unter Responderzellen einen Zustand Fest oder Hunger zu schaffen. Da das Messsignal von dem aller Responder-Zellen in einer einzigen gut oder Platte ableitet, Variation in der Erfassung von toten Zellen können schwächere Signale verschleiern.
Eine letzte Frage bezieht sich auf die Heterogenität der apoptotischen Zellpopulation. Selbst bei einem starken Auslöser der Apoptose, wie Staurosporin, jede Herstellung von toten Zellen werden die Zellen in mehreren Stufen des Todesprozesses enthalten. Dies wird relevant, wenn die Stärke der Reaktion auf die apoptotische Zelle auf seiner Bühne innerhalb des 10,14 Todesprozesses abhängt. Da im Durchschnitt jeder reagiert Zelle nur eine apoptotische Zelle trifft, Heterogenität kann in diesem Fall zu einer Schwächung des gesamten erfassten Signalereignis führen. Tabelle 2
Es gibt mehrere andere experimentelle betrifft eindeutig mit der Verwendung von toten Zellen als Stimulus zugeordnet ist. Wichtig kann, Kulturbedingungen haben Auswirkungen auf die reagierenden Zellen nicht nur, sondern auch die toten Zellen selbst. Beispielsweise Serumproteine, falls vorhanden, kann auf der Oberfläche der tote Zelle befestigen und zu verbessern oder seine Erkennungs hemmen durch Zellen reagieren. In einem inkonsistenten Ergebnis der Fehlersuche oder ein Ergebnis aus, dass in der Literatur unterschiedliche sollte ein besonderes Augenmerk auf die folgenden Kulturbedingungen gegeben werden (sowohl für Responder und tote Zellen): Grad der Einmündung, Passage-Nummer, die Anwesenheit von Serum, Hitzeinaktivierung des Serums und Art und Dauer der Ruhe. Schließlich muss man sich bewusst sein, dass der Zelltod ein unerbittlicher Aspekt aller Zellkultur ist, und Responderzellen deshalb immer wieder auf ein niedriges Niveau von toten ausgesetztZellen. Diese Exposition kann möglicherweise Auswirkungen auf die experimentelle Antwort auf einen Bolus von toten Zellen, da die sehr Signale untersucht werden kontinuierlich induziert werden. Signalmodulation kann erfolgen durch normale Rückkopplungswege, oder auch durch die Auswahl einer Subpopulation von Responderzellen, insbesondere wenn die induzierte Signalisierungsereignisse Überleben oder Proliferation beteiligt.
Zusammenfassend haben wir ein Protokoll zur Bestimmung der intrazellulären Signalereignisse in lebenden Zellen durch ihre physische Wechselwirkung mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert beschrieben. Obwohl der Fokus überwiegend an Veranstaltungen auf Signalisierung durch rezeptorvermittelte Erkennung von toten Zellen induziert wird, erlaubt das Protokoll auch die Identifizierung von Ereignissen, induziert durch Phagozytose oder die Freisetzung von löslichen Mediatoren aus den toten Zellen signalisiert. Die Verwendung von toten Zellen als Stimulus stellt einige einzigartige Faktoren, die den Nachweis von intrazellulären Signalereignisse behindern. Das Bewusstsein für diese unique Faktoren sowie die mehreren Mechanismen, durch die abgestorbenen Zellen intrazelluläre Signalgebung modulieren, ist entscheidend für die Konzeption und Auslegung von Experimenten in diesem wachsenden Bereich der Studie. Das Protokoll soll hier das Verständnis der Mechanismen unterstützen beschrieben, durch die toten oder sterbenden Zellen ihre Live-Nachbarn beeinflussen sowohl in Gesundheit und Krankheit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
