Abstract
תאים מתים על ידי אפופטוזיס, התייחסו גם הוא מוות של תאים מוסדרים, לרכוש פעילויות חדשות מרובות המאפשרות להם להשפיע על התפקוד של תאי חיים סמוכים. פעילויות חיוניות, כגון הישרדות, שגשוג, צמיחה, והבחנה, הן בין התפקודים תאיים הרבים מווסתים על ידי תאים אפופטוטיים. היכולת לזהות ולהגיב תאים אפופטוטיים שנראה תכונה אוניברסלית של כל התאים, מבלי להתחשב בשושלת היוחסין או איבר של המקור. עם זאת, המגוון והמורכבות של בתגובת מנדטי תאים אפופטוטיים כי בזהירות רבה להילקח לשלוף את איתות האירועים ושבילים אחראים לכל תוצאה מסוימת. בפרט, יש להבחין בין מספר מנגנונים שבאמצעותם תאים אפופטוטיים יכול להשפיע מסלולי איתות תאיים בתוך תאים המגיב קיימא, כולל: הכרה בתיווך קולטן של תאים אפופטוטיים, שחרור של מתווכים מסיסים על ידי תאים אפופטוטיים, ו / או מעורבות של phagoמכונה cytic. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי אירועי איתות תאיים כי הם המושרה בתאים המגיבים קיימא הבא חשיפתם תאים אפופטוטיים. יתרון עיקרי של הפרוטוקול טמון התשומה משתלמת דיסקציה של המנגנון שבאמצעותו תאים אפופטוטיים לווסת איתות אירועים בתוך תאים להגיב. בעוד הפרוטוקול ספציפי עבור קו תא צינורי הפרוקסימלי כליות עכבר הונצח על תנאי (תאי BU.MPT), הוא מותאם בקלות שורות תאים שאינן-אפיתל במקורו ו / או נגזרים איברים מלבד הכליה. השימוש של תאים מתים כגירוי מציג מספר גורמים ייחודיים שיכול לעכב את הגילוי של אירועי איתות תאיים. בעיות אלה, כמו גם אסטרטגיות כדי למזער או לעקוף אותם, הם דנו בתוך הפרוטוקול. יישום של פרוטוקול זה אמור לסייע הידע והרחבת שלנו של השפעה רחבה מתים או גוססים תאים להפעיל על השכנים לחיות שלהם, הן בבריאות disease.
Introduction
אפופטוזיס, או מוות של תאי מוסדר 1, תורם באופן מהותי את התחזוקה והפיתוח של רקמות. הנצפים ביותר פשוט, היתרי אפופטוזיס בגילאי, פגומים, או להתבטל תאים עודפים מבלי לפגוע סביב 2,3 רקמות. תרומת אפופטוזיס הומאוסטזיס רקמות, לעומת זאת, היא הרבה יותר דינמית ומגוונת. תאים מתים על ידי אפופטוזיס לרכוש פעילויות חדשות מרובות, הן מופרשות הקשורים תא, אשר מאפשר להם להשפיע על התפקוד של תאי חיים סמוכים 4-10. מחקרים קודמים התמקדו ביכולת של תאים אפופטוטיים לדכא דלקת 11-16, אבל תאים אפופטוטיים גם לווסת מגוון רחב של תפקודים תאיים, כוללים פעילויות חיוניות כגון הישרדות 4,9,10, התפשטות 4,9,10, בידול 17, הגירה 18, והצמיחה 19. יתר על כן, תופעות אלה אינן מוגבלים פגוציטים מקצועיים, כמו מקרופאגים, אבל להאריך כמעט לכל סוגי תאים שושלות, כולל מסורתי שאינו phagocytic תאים, כגון אפיתל ותאי האנדותל 7,9,10,18-21.
התגובה הספציפית של תאי חיים הסמוך בעקבות חשיפת תאי אפופטוטיים תלויה בגורמים מרובים להתייחס לשני התאים להגיב הקיימא ואת תאי אפופטוטיים עצמם. לדוגמה, אם כי חשיפה תאים אפופטוטיים מעכב התפשטות של שניהם מקרופאגים בעכברים ותאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות (PTECs), סוגי תאים שני אלה שונים באופן דרמטי בתגובה ההישרדות שלהם תאים אפופטוטיים 4,6,9,10. תאים אפופטוטיים לקדם את ההישרדות של מקרופאגים, אבל לגרום למותם אפופטוטיים של PTECs 4,6,9,10. יש לציין, כי בתגובת תאים אפופטוטיים עשויה להיות שונה גם בקרב להגיב תאים מאותו השושלת, תלוי האיבר של התא להגיב ממוצא 10 (למשל, כליות PTECs לעומת אפיתל חלבתאים) או מצב הפעלה 22 (למשל, נויטרופילים). לעומת זאת, תאים אפופטוטיים עלולים לעורר תגובות שונות לאותו תא בהתאם לאופי של אפופטוטיים גירוי 10,23 או בשלב של אפופטוזיס 10,14.
בהתחשב diverseness ומורכב בתגובת תאים אפופטוטיים, בזהירות רבה יש לנקוט לנתח את האירועים ואת מסלולי איתות אחראים לכל תוצאה מסוימת. ראשית, תגובות הדורשים אינטראקציה פיזית ישירה בין תאי קיימא אפופטוטיים חייבות להיות מובחנות מאלה שהושרו על ידי מתווכים מסיסים שוחררו או שמופקים על ידי תאי אפופטוטיים 3,6-10. אם אינטראקציה פיזית נדרש, אז בידול נוסף צריך להתבצע. אירועי איתות יכולים להיות תלויים הכרת קולטן בתיווך של התאים אפופטוטיים, העצמאיים של היבלעות עוקבת או על ספיגת phagocytic, העצמאיים של קולטן המסוים שקושר את התאים אפופטוטיים 3-7,9,10,19. במקרה האחרון, התגובה אינה ספציפית תאים אפופטוטיים, והוא יכול להיות מופעל על ידי כל חומר phagocytic 4,6.
חשיבותה של ההבחנות האלה יכול שוב להיות מוערך על ידי מנוגדים התגובות של מקרופאגים PTECs כליות. עבור שני סוגי התאים, חשיפת תאים אפופטוטיים משנה את הפעילות של קינאז פרו-הישרדות Akt. האפנון תלוי אינטראקציה פיזית, מאז פרידה של להגיב תאי אפופטוטיים ידי קרום פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר מבטל את התגובה 4,9,10,19. עם זאת, התגובה של PTECs היא קולטן בתיווך ועצמאי של phagocytosis, ואילו התגובה של מקרופאגים היא מונעת על ידי phagocytosis 4,9,10,19. מסקנה זו מתחזקת לאור העובדה כי חשיפה חרוזים לטקס, גירוי phagocytic נייטרלי, אין כל השפעה על פעילות Akt ב PTECs, אבל מחקה את ההשפעה של תאים אפופטוטיים מקרופאגים 4,9.
"> אמנם פחות טוב למד, תאים מתים על ידי נימק, או מוות של תאי בשוגג 1, גם לווסת את הפונקציה של תאי קיימא הסמוכים 3-10,19. כמו תאים אפופטוטיים, תאי נימקים להשפעות שלהם באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, במיוחד הדליפה תוכן תאיים דרך קרום התא מהקרע שלהם 3,5,6,9,24. תאים רבים, כולל PTECs מקרופאגים, להחזיק קולטנים שאינם מתחרה ברורים עבור תאים מתים על ידי נימק 5,9. אירוסין של קולטנים אלה גורמים אירועי איתות כי הם לעתים קרובות הפוכה לגמרי מזו הנגרמת על ידי מעורבות של קולטנים תאים אפופטוטיים 4-10,19. לדוגמה, ב PTECs, תאים נמקי להגדיל זירחון של Akt, ואילו תאים אפופטוטיים להקטין זירחון 9,10,19. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי אירועי איתות תאיים מושרים PTECs כליות קיימא באמצעות הכרת קולטן בתיווך של PTECs אפופטוטיים סמוך
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנות
הערה: בפרוטוקול זה, שתיים או יותר שורות תאים, או בתרביות תאים ראשוניות, ערוכים באופן עצמאי תחת תנאים מסוימים. היערכות זו כוללת תאים אפופטוטיים (פרוטוקול 1), תאי נימקים (פרוטוקול 2), ותאי מגיב בריאים (פרוטוקול 3). לאחר הכנה עצמאית, תאים אפופטוטיים או נימקים מתווספים תאים המגיב ואת תמרת האות שהתקבלה מנוטר (פרוטוקולים 4, 5, ו -6).
- כן תקשורת ריאגנטים תרבות
- כן 500 מיליליטר של תרבות מדיום (לשימוש כאשר גדלו תאים בתנאי מתירני, ראה סעיף 1.2) על ידי שילוב של הבאים: הבינוני של הנשר השונה של 1x Dulbecco (DMEM) המכילים 4.5 גרמו / גלוקוז L, 584 מ"ג / L ʟ-גלוטמין, 110 מ"ג / L פירובט נתרן, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין, 10% (V / V) בסרום שור עוברית (FBS), ו -10 יחידות / מ"ל של אינטרפרון-γ (IFN-γ).
- הכן 500 מ"ל של B בינוני תרבות (עבור ש"ש שימושen התאים מורעבים סרום בתנאים אוֹסְרָנִי, ראה סעיף 1.2) על ידי השמטת FBS ו-γ IFN מן המתכון של א בינוני תרבות לגדל תאים בתנאים אוֹסְרָנִי (לפני הרעבה בסרום), להוסיף v 10% / v FBS ל B. בינוני תרבות
- הכן 0.4% (v / v) paraformaldehyde, pH 7.2, ב בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS) מן paraformaldehyde המניה 4% עבור קיבעון של תאים מתים.
הערה: Paraformaldehyde רעיל, בזהירות המתחייבת יש להימנע ממתן השימוש בו.
- תרבות תאי BU.MPT
- להפשיר מ חנקן נוזל בקבוקון אחד של תאי BU.MPT.
הערה: BU.MPT הוא תא צינורי הפרוקסימלי כליות עכבר אפיתל (PTEC) קו נגזר עכבר מהונדס נושאת מוטצית טמפרטורה רגישה (TS) (tsA58) של אנטיגן גידול הגדול SV40 (תג) תחת השליטה של העכבר הגדול מורכב histocompatibility (MHC) בכיתה ב H-2K ואני האמרגן 25,26. - פלייט תאים על polystyr סטריליפלזמת ואקום גז פנטן תרבות מנות מטופלי רקמות (~ 5 x 10 6 תאים לכל 100 צלחת בקוטר מ"מ).
- לגדל תאים בתנאים מתירנית ב 5% humidified (v / v) CO 2 באטמוספרה.
הערה: תנאי מתירנית, המוגדרים התרבות ב 33 - 37 ºC בנוכחות-γ IFN, לאפשר ביטוי יציב של transgene תג-מוטציה tsA58. בניגוד תרבויות העיקרי של PTEC כליות העכבר, אשר אינם שורדים יותר מעבר אחד או שניים, BU.MPT מתורבת תחת ניתן passaged תנאי מתירני ללא הגבלת זמן.- תאי המעבר לפחות שלוש פעמים לאחר ההפשרה לפני השימוש בהם בניסוי.
- עד היום תאים המעבר, להוסיף 1 מ"ל של טריפסין 0.05% ל -100 מ"מ צלחת, דגירה של 5% humidified (v / v) CO 2 האווירה ב 37 ºC למשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל של מדיום א לשאוב את התאים מנותקים, ולפצל 1: 3 ל -1: 5 לתוך 100 מ"מ חדש Tiss סטרילית קלקר ואקום גז שטופלו פלזמהתרבות מנות UE. הוספת בינוני כדי להעלות את נפח לסך של 10 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ.
- תאי המעבר לפחות שלוש פעמים לאחר ההפשרה לפני השימוש בהם בניסוי.
- כהכנה לשימוש ניסיוני כתאים להגיב, לגדל תאים כדי מפגש בתוך 5% humidified (v / v) באווירה CO 2 בתנאים אוֹסְרָנִי (כלומר ב 39 ºC בהעדר IFN-γ [B במדיום המכיל נ 10% / v FBS]).
הערה: בתנאים אוֹסְרָנִי, ביטוי של transgene תג tsA58-המוטציה מעוכב על ידי> 95%, ותאי BU.MPT להתנהג כמו תרבויות עיקריות של PTEC כליות עכבר.
- להפשיר מ חנקן נוזל בקבוקון אחד של תאי BU.MPT.
2. הכנת תאים אפופטוטיים BU.MPT (פרוטוקול 1)
הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור תאים BU.MPT כמקור של תאים אפופטוטיים, ו staurosporine כמו שיטת האינדוקציה אפופטוזיס. לחלופין, קו לתא אחר, או תרבית תאים ראשונית, יכול לשמש כמקור תאים אפופטוטיים, עם אפופטוזיס המושרה על ידי protoco הסטנדרטיתls עבור סוג ושיטת תא מסוים של אינדוקציה אפופטוזיס.
- לאחר המעבר על מנות בתרבית רקמה שטופלו פלזמה ואקום גז פוליסטירן סטרילי בקוטר 100 מ"מ, לגדל תאים BU.MPT כדי מפגש בתוך 5% humidified (v / v) באווירה CO 2 בתנאים היתר (כלומר ב 37 ºC במדיום התרבות 10 מ"ל לכל 100 מ"מ צלחת), כמפורט בסעיף 1.2.3.
- שוטפים את monolayer תא חסיד שלוש פעמים עם B בינוני תרבות, באמצעות 10 מ"ל לכל לשטוף.
- להשרות אפופטוזיס על ידי דוגרים התאים B בינוני תרבות המכיל staurosporine, מעכב קינאז חלבון לא סלקטיבי, ב 1 מיקרוגרם / מ"ל למשך 3 שעות באווירה 5% CO 2 humidified (v / v) בשעה 37 ºC.
- לשאוב את המדיום המכיל staurosporine המכיל "צף" תאים אפופטוטיים כי יש מנותקת מן בשכבה. צנטריפוגה המדיום הזה במשך 10 דקות ב 500 XG, וזורקים supernatant, לשטוף את הכדור שלוש פעמים עם B בינוני תרבות, ולהוסיף הגלולה חזרה תאים שנאספו בשלב הבא, 2.5.
- לנתק את התאים חסיד שנותרו מן הצעדים 2.3 ו -2.4 על ידי תוספת של 5 מ"מ (חומצה ethylenediaminetetraacetic) EDTA ב 1x Ca 2 + - ו Mg 2 + -חינם DPBS ב 1 מ"ל לכל צלחת למשך 5 דקות. לשאוב את המדיום EDTA המכילים המכיל תאים אפופטוטיים מנותקת, ובריכת התאים מנותקים עם תאים "צף" אפופטוטיים משלב 2.4 ב צינור צנטריפוגות פוליסטירן סטרילי 15 מ"ל.
- שוטפים את התאים אפופטוטיים שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 XG ו resuspension ב 10 מ"ל של 1x Ca + 2 - ו Mg + 2 -חינם DPBS לכל לשטוף.
- לאחר לשטוף האחרון, להשעות את תאי אפופטוטיים B בינוני תרבות הטרי ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר לפני השימוש כדי לעורר תאים מגיבים. לחלופין, לתקן שטף תאים אפופטוטיים 0.4% (v / v) paraformaldehyde ב 1x DPBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם תרבותB בינוני, לפני להשעיה ב בינוני תרבות
- בהתאם לצורך, לאשר אינדוקציה של אפופטוזיס על ידי cytometry זרימה באמצעות תכשיר נפרד של תאים אפופטוטיים (או על ידי הזמנה כמה תאים למטרה זו), כפי שתוארה לעיל 6,9,10,15.
הערה: יש תאים אפופטוטיים מוקדם קרום תא ללא פגע, ומופיעים כמו יודיד propidium (PI) תאי -שלילית ו Annexin V-החיובי של ירידת גודל תא (יחסית תאי קיימא). מאוחר תאי אפופטוטיים יש ממברנות תאים הלא-שלמים, ומופיעים כמו PI-חיובי Annexin V חיוב תאים של ירידת גודל תא. באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, הכנות טיפוסיות מכילות ~ 85% אפופטוטיים מוקדם ~ 15% תאי אפופטוטיים מאוחר. - הוספת תאים אפופטוטיים כדי BU.MPT תאים המגיב (פרוטוקול 3) ב יחס תאים אפופטוטיים אל המגיב של 1: 1, במישרין או לאחר קיבוע של תאים אפופטוטיים למשך 30 דקות עם 0.4% (v / v) paraformaldehyde ב 1x DPBS .
הערה: קיבוע תאים אפופטוטיים לפני הגירוי של מגיבים צריכיםלא השפיע על תוצאות, אלא אם אירועי האיתות שנצפה הם בשל השחרור של מתווך מסיס (טבלה 1).
3. הכנת תאים נקרוטי BU.MPT (פרוטוקול 2)
הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור תאי BU.MPT כמקור של תאי נימקים, והחימום כמו שיטת האינדוקציה נימקת. לחלופין, קו לתא אחר, או תרבית תאים ראשונית, יכול לשמש כמקור לתאי נימקים, עם נימק מושרה על ידי פרוטוקולים סטנדרטיים עבור סוג תא מסוים ואת שיטת האינדוקציה נימקת.
- לאחר המעבר על מנות בתרבית רקמה שטופלו פלזמה ואקום גז פוליסטירן סטרילי בקוטר 100 מ"מ, לגדל תאים BU.MPT כדי מפגש בתוך 5% humidified (v / v) באווירה CO 2 בתנאים היתר (כלומר ב 37 ºC במדיום התרבות 10 מ"ל לכל צלחת), כמפורט בסעיף 1.2.3.
- שוטפים את monolayer תא חסיד שלוש פעמים עם B בינוני תרבות, באמצעות10 מ"ל לכל לשטוף.
- לנתק את התאים על ידי תוספת של 5 מ"מ EDTA ב 1x Ca + 2 - ו Mg + 2 -חינם DPBS ב 1 מ"ל לכל צלחת למשך 5 דקות. לשאוב את המדיום EDTA המכילים המכיל תאים מנותקים, ומוסיפים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגות 15 מ"ל פוליסטירן סטרילי.
- שוטפים את התאים שלוש פעמים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 XG ו resuspension ב 10 מ"ל של Ca + 2 - ו Mg + 2 -חינם DPBS לכל לשטוף.
- לאחר לשטוף האחרון, להשעות את התאים B בינוני תרבות הטרי ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
- להשרות נמק ידי חימום תאים ל -70 ºC במשך 45 דקות באמבט מים, vortexing ההשעיה תא בעדינות כל 10 דקות.
- דגירה תאים עבור 2 שעות באווירה 5% CO 2 (v / v) humidified על 37 מעלות צלזיוס. בעדינות מערבולת ההשעיה תא כל 15 דקות.
- בהתאם לצורך, לאשר גיוס של נמק על ידי cytometry זרימה באמצעות הכנה נפרדת של neתאי crotic (או על ידי הזמנה כמה תאים למטרה זו), כפי שתוארו לעיל 6,9,10,15.
הערה: תאי נקרוטי יש מקרע קרום תא, ומופיע כתאי PI-החיובי של גודל תא גדל (יחסית תאי קיימא). באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, הכנות טיפוסיות מכילות תאי נימקי ≥ 95%. לחלופין, אינדוקציה של נמק ואובדן שלמות הממברנה עשויה להיות מאושרת על ידי מכתים כחול Trypan.
4. הכנת תאים המגיב BU.MPT (פרוטוקול 3)
הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור תאי BU.MPT כמקור תאים מגיבים. לחלופין, קו לתא אחר, או תרבית תאים ראשונית, יכול לשמש תאים מגיבים. קודם לשימוש ניסיוני, קפאון עלול להיגרם הלילה על ידי פרוטוקולים סטנדרטיים בתוך המעבדה.
- לגדל תאים BU.MPT במנות בתרבית רקמה סטרילית 100 מ"מ בתנאים מתירנית במדיום התרבות ב 10 מ"ל לכל צלחת עד להשגת ~85% מפגש.
- לשאוב בינוני תרבות A, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם B בינוני התרבות ב 10 מ"ל לכל לשטוף. סרום להרעיב את התאים לילה עבור 18 עד 24 שעות ב 5% humidified (v / v) באווירה CO 2 בתנאים אוֹסְרָנִי (כלומר ב 39 ºC בתרבות B הבינוני ב 10 מ"ל לכל צלחת), כמתואר בסעיף 1.2 .4, על מנת לגרום קפאון. לחלופין, לגדל תאים B בינוני תרבות בתוספת 10% (v / v) FBS ב 39 ºC ליום אחד לפני בתאי הרעבה סרום לילה B במדיום תרבות ללא FBS.
- לייבל צלחת בתרבית רקמה נפרדת של תאים ומחוברות BU.MPT עבור כל תנאי ניסוי.
- כלול את השישה התנאים הבאים: גירוי של מגיבי BU.MPT קיימא עם גורם גדילה או רכב או באפידרמיס (EGF) במשך 15 דקות, לאחר חשיפתם למשך 30 דקות כדי מוסדות לא תאים, תאים אפופטוטיים, או תאי נימקים.
הערה: חשיפת תאים מתים עשויה גם לעורר או לעכב את רמת הפעילות של החייל אמריקאיven איתות מולקולה. גירוי מזוהה הטוב ביותר מעל בסיס נמוך (למשל, בהעדר EGF), ואילו עיכוב מזוהה הטוב ביותר מנקודת התחלה גבוהה (למשל, נוכחות של EGF). מאז את ההשפעה של גירויים עם תאים מתים שהוא מלכתחילה לא ידוע, מומלץ לבצע את כל המחקרים בשני בהעדר ואת הנוכחות של EGF.
גירוי 5. של תאים מגיבים עם אפופטוטיים תאי נקרוטי (פרוטוקול 4)
- לשאוב B הבינוני תרבות מן הכלים מראש שכותרתו של שקט (מורעב בסרום) BU.MPT תאים מגיבים (פרוטוקול 3).
הערה: לאחר תרבות הלילה בתנאים אוֹסְרָנִי, תאי BU.MPT צריכה להתנהג כמו תרבויות עיקריות של PTEC כליות עכבר. - לכל 100 צלחת מ"מ, להוסיף 2 מ"ל של אחת מהפעולות הבאות: B בינוני תרבות (לא התאים); ההשעיה תאים אפופטוטיים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מ"ל ב B בינוני תרבות (פרוטוקול 1); או השעית תא נימקים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל i מיליליטרn התרבות בינוני B (פרוטוקול 2).
- הפץ את ההשעיה מ"ל 2 של תאים מתים באופן שווה על פני צלחת 100 מ"מ, ולשמור את הזמן עבורם להתיישב עד למינימום. כדי להשיג זאת, להפיץ את ירידת השעית תא המתה אחר טיפה עם טפטפת קצה רחב על פני כל השטח של מנות התא המגיב. השתמש נפח של 2 מ"ל כפשרה בין מזעור זמן שיקוע הימנעות ובהצטברויות תאים מתים.
הערה: שימוש השעיה של תאים מתים כגירוי כרוך מספר שיקולים מיוחדים, אשר יתוארו להלן ביתר פירוט (טבלה 2 ודיון). - להשיג יחס תאים מתים אל המגיב של ~ 1: 1 על ידי הוספת 2 מ"ל של תאים מתים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מ"ל לצלחת מ"מ ומחוברות 100, המכיל ~ 10 x 10 6 תאים. לחלופין, על מנת לבסס את התלות במינון של אירועי איתות ציינו, לשנות את היחס בין מתי תאים המגיב באופן רציף על ידי דילול פרוגרסיבית כתB הבינוני יור של השעיות תאים המתות ערוכות פרוטוקולי 1 ו -2.
- הפץ את ההשעיה מ"ל 2 של תאים מתים באופן שווה על פני צלחת 100 מ"מ, ולשמור את הזמן עבורם להתיישב עד למינימום. כדי להשיג זאת, להפיץ את ירידת השעית תא המתה אחר טיפה עם טפטפת קצה רחב על פני כל השטח של מנות התא המגיב. השתמש נפח של 2 מ"ל כפשרה בין מזעור זמן שיקוע הימנעות ובהצטברויות תאים מתים.
- מערבולת בעדינות את הכלים, אז לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% humidified (v / v) CO 2 באטמוספרה.
- לאחר 30 דקות, לגרות את התאים המגיבים עם רכב משני או 50 EGF ננומטר, פי-התיוג מראש של מנת התרבות.
- דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה 2 5% humidified (v / v) CO.
- לשטוף את התאים המתים על ידי הוספת 5 מ"ל של DPBS 1x קר כקרח, מתערבל צלחת, ו aspirating נוזל הכביסה. חזור שלוש פעמים.
- מיד למקום את הכלים התא המגיב על הקרח לעיבוד נוסף.
- כן lysates תא
- הכן חיץ תמוגה התא המכיל את הפעולות הבאות: 1 × טריס שנאגרו מלוחים (TBS), 10 מ"מ pyrophosphate נתרן, 0.5% w / v deoxycholate, 0.1% w / v SDS, 10 גליצרול%, פלואוריד נתרן 25 מ"מ.
- בסמוך לפני התא תמוגה, להוסיף את הדברים הבאים לפי הסדר המדויק שניתנו בבית indריכוזים icated: מעכבי פרוטאז קוקטייל EDTA ללא מיני (1 טבליה לכל 10 מ"ל של חיץ תמוגה), 10% (v / v) טריטון X-100, 1 dithiothreitol מ"מ (DTT), 1 מ"מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF), ו -10 orthovanadate נתרן מ"מ.
- הוסף 700 μL של חיץ תמוגה תא קר כקרח ל -100 מ"מ צלחת של תאי מגיב מגורה טרי על קרח משלב 5.7. לגרד תאים עם מגרד תא, ולהעביר את lysate מראש צונן 1.5 microtubes מ"ל. שמור את הצינורות על קרח במשך 15 דקות.
- lysates Sonicate על קרח עם 10 פעימות של 20 הרץ, פחות כל שנייה אחת משך. הימנע יצירת קצף על ממשק גז / נוזל, כמו זה יכול לחמם יותר מדי את הדגימות. לגמרי לטבול את החללית sonicator לתוך microtubes המכילים lysates לפני ההפעלה החוזרת של sonicator על ולהפעיל את sonicator מעל לפני הסרת החללית מן lysates.
- צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C, להעביר את supernatants לתוך microtubes מראש צונן טריים, ולאחסן ב -70 ºC.
- בצע ג'ל אלקטרופורזה ו immunoblotting על supernatants של lysates, כפי שתואר לעיל 6,9,10,15.
- הכן חיץ תמוגה התא המכיל את הפעולות הבאות: 1 × טריס שנאגרו מלוחים (TBS), 10 מ"מ pyrophosphate נתרן, 0.5% w / v deoxycholate, 0.1% w / v SDS, 10 גליצרול%, פלואוריד נתרן 25 מ"מ.
6. מניעת מגע פיזי ישיר בין מטרות המגיבים באמצעות ממברנה פוליקרבונט Semipermeable (פרוטוקול 5)
- כן תאים מגיבים BU.MPT פי פרוטוקול 3, עם יוצא מן כלל אחד; לגדל תאים בתרבית רקמה פוליסטירן סטרילי מטופלים אשכולות 12 גם.
- בבארות שנבחרו, להציב מערכת תמיכה חדירה המכילה קרום פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר כדי למנוע אינטראקציה פיזית בין תאים מתים מגיבים. כלול בארות שליטה ללא קרום באותו ניסוי.
- לשאוב בינוני תרבות B מבארות ניסיוני של תאים המגיב BU.MPT מורעבים בסרום.
- עקוב פרוטוקול 4 לגירוי של תאים מגיבים עם תאים אפופטוטיים או נימקים, בשינויים הבאים:
- לכל טוב של 1אשכול 2-היטב, להוסיף 0.1 מ"ל של אחת מהפעולות הבאות: B בינוני תרבות (לא התאים); ההשעיה תאים אפופטוטיים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מ"ל ב B בינוני תרבות (פרוטוקול 1); או השעית תא נימקים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר ב B הבינוני תרבות (פרוטוקול 2).
הערה: כתוצאה היטב ומחוברות של אשכול 12 גם מכיל ~ 0.5 x 10 6 תאים, תוספת של 0.1 מ"ל של תאים מתים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר מניב יחס תאים מתים אל המגיב של ~ 1: 1. - כדי בארות המכילות את מערכת התמיכה החדירה, להוסיף את התאים המתים על גבי הממברנה פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר בתוך מערכת התמיכה החדירה, כך שאין אינטראקציה פיזית ישירה בין תאים מתים מגיבים.
- לכל טוב של 1אשכול 2-היטב, להוסיף 0.1 מ"ל של אחת מהפעולות הבאות: B בינוני תרבות (לא התאים); ההשעיה תאים אפופטוטיים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מ"ל ב B בינוני תרבות (פרוטוקול 1); או השעית תא נימקים ב ~ 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר ב B הבינוני תרבות (פרוטוקול 2).
7. עיכוב של Phagocytosis עם Cytochalasin D (פרוטוקול 6)
- כן תאים מגיבים BU.MPT פי פרוטוקול 3.
- הכן את D cytoskeletal מעכב cytochalasin ב dimethsulfoxide י.ל. (DMSO) בשעה 4 מ"ג / מ"ל (1,000 ×). הוסף מנות מראש שכותרתו של תאים המגיב BU.MPT או 10 μL של הרכב (DMSO) או 10 μL של D cytochalasin כדי להשיג ריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ"ל ב 10 מ"ל של מדיום תרבות B.
הערה: ריכוז זה של cytochalasin D, phagocytosis על ידי תאי BU.MPT וקו תא מקרופאג היה עצור על ידי ≥90% 9,10. - דגירה של 2 שעות ב 37 ºC באווירה 2 5% humidified (v / v) CO.
- עקוב פרוטוקול 4 לגירוי של תאים מגיבים עם תאים אפופטוטיים או נימקים.
- בהתאם לצורך, לאשר עיכוב של phagocytosis של תאים מתים על ידי cytometry זרימה באמצעות תכשיר נפרד של תאים מתים מגיבים (או תאים שמורים למטרה זו), כפי שתוארה לעיל 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באיור 1, אנו מספקים סכמטי המתאר את צעדי העיתוי קריטי מעורבים בהכנת תאים אפופטוטיים (פרוטוקול 1) ותאי נימקים (פרוטוקול 2) ואת הגירוי של תאים מגיבים עם השעיות של תאים אפופטוטיים, נימקים (פרוטוקול 4).
באיור 2, אנו מספקים תוצאות נציג מראה את ההשפעה של תאים אפופטוטיים על זירחון של שני isoforms של synthase גליקוגן קינאז סרין-תראונין קינאז-3 (GSK-3), GSK-3α ו- GSK-3β. יש GSK-3α / β תפקיד בולט הסדרת תרבות תאים והישרדות, כמו גם התפקיד החשוב שלה במטבוליזם הגלוקוז. זירחון של GSK-3α ב סרין-21 ו- GSK-3β ב סרין-9 מעכב פעילות קינאז, בתורו, מוביל לירידה זירחון מוגבר התייצבות-קטנין β. בטא-קטניןאז translocates לגרעין, שבו הוא מקדם את השעתוק של גנים ידועים לעורר התפשטות תאים ומעכבות אפופטוזיס. לכן, זירחון מוגבר של GSK-3α / β קשורה התפשטות מוגברת והישרדות, ואילו ירידה זירחון של GSK-3α / β בקורלציה עם התפשטות והישרדות ירד.
חשיפה של מגיבי BU.MPT שקטים כדי אפופטוטיים תאים למשך 30 דקות זירחון בסיס עכבות בחום של GSK-3α / β (איור 2 א). באופן דומה, חשיפה מוקדמת מטרות אפופטוטיים למשך 30 דקות בחום עכבות גורם גדילה באפידרמיס עוקב (EGF) זירחון -induced של (איור 2 א) GSK-3α / β. לעומת זאת, חשיפה של המגיבים BU.MPT לתאים נמקי לא הייתה השפעה גם על זירחון הבזליים או המושרה EGF של GSK-3α / β.
כדי המונעת וטיפולt אינטראקציה פיזית בין מגיבי BU.MPT ו תאים אפופטוטיים, המגיבה BU.MPT גדלה מערכת תמיכה חדירה ומופרדת מטרות אפופטוטיים ידי קרום פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר. מניעת אינטראקציה פיזית בין המגיבים BU.MPT ו תאים אפופטוטיים ביטל את היכולת של מטרות אפופטוטיים לעכב זירחון של GSK-3α / β (איור 2 ב). כדי להעריך את התפקיד של phagocytosis, השתמשנו D cytoskeletal מעכב cytochalasin למנוע ספיגת phagocytic של תאים מתים. עיכוב של זירחון של GSK-3α / β בתגובה תאים אפופטוטיים התרחשו בהעדר phagocytosis (איור 2 ג). בעבר הראינו כי D cytochalasin, בריכוז בשימוש, מעכב PTEC ו phagocytosis מקרופאג ידי ≥90% 9,10. יחדיו, התוצאות שלנו מראות כי עיכוב בתיווך תאים אפופטוטיים של זירחון של GSK3α / β דורש betwe אינטראקציה פיזית ישירה en מטרות תאים מגיבים, אבל היא עצמאית של phagocytosis.
איור 1. סכימה לזירוז של איתות תאיים אירועי תאים המגיבים קיימא על ידי אינטראקציה פיזית עם תאי שכנים שעברו מוות של תאים. גרפי הקו מתארים את אירועי העיתוי קריטי בהכנה (א) אפופטוטיים (Apo) תא (B) נימקים (נקר) השעיות תא של תאי BU.MPT, ובסופו של (C) גירוי של מגיב BU.MPT קיימא תאים עם השעיות של תאים אפופטוטיים או נימקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
איור 2. עיכוב של זירחון של GSK3α / β בתאי BU.MPT מגיב בעקבות חשיפת תאי אפופטוטיים דורש אינטראקצית Cell-Cell ישיר אך לא יהיה תלוי Phagocytosis. סרום מורעבים תאים המגיב BU.MPT טופלו קודם עבור 2 שעות עם (A, B) הרכב או (ג) cytochalasin D (4 מיקרוגרם / מ"ל), ולאחר מכן מגורה למשך 30 דקות ללא תאים (-), תאים אפופטוטיים (Apo ), או תאי נימקים (NEC) ב תא מת כדי המגיב יחס תא של 1: 1. התאים המגיבים נשטפו אז, וטופחו במשך 15 דקות נוספות, בהעדר או בנוכחות EGF (50 ננומטר), לפני הקטיף. מקור תאים אפופטוטיים היה תאים BU.MPT שטופלו staurosporine. מקור תאי נימקים היה תאי BU.MPT שטופל בחום. אינטראקציה בין תאים מתים המגיב BU.MPT הייתה או (A, C) הפרעה, מה שמאפשר ישירתא מגיב מת אינטראקציה פיזית, או (ב) עם הפרדת תאי מגיבים מת על ידי קרום פוליקרבונט 0.4 מיקרומטר מערכת תמיכה חדירה. תאים מתים ותאי מגיב לא חסידים הוסרו על ידי שטיפה, ו BU.MPT המגיב lysates התא נבדק עם נוגדנים נגד פוספורילציה GSK3α / β כמוצג. טעינת שוויון אושרה על ידי חיטוט עבור dehydrogenase glyceraldehyde-3-phosphate הכולל (GAPDH). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| השפעה על אירוע איתות בהנחת מנגנון זה | |||||||
| התערבות | מתווך מסיס | הכרת קולטן בתיווך | phagocytosis | ||||
| קיבוע של תאים אפופטוטיים * | חיסול | הַתמָדָה | הַתמָדָה | ||||
| הפרדה פיזית של תאים אפופטוטיים, מגיב † | הַתמָדָה | חיסול | חיסול | ||||
| בינוני מותנה Ultracentrifuged מתאי עוברים אפופטוזיס כמו stimulus¶ | הַתמָדָה | חיסול | חיסול | ||||
| תאי נימקים כגירוי | חיסול | ביעור או תגובה מכוונת הפוך (למשל, עיכוב לעומת גירוי) | הַתמָדָה | ||||
| חרוזים לטקס כגירוי | חיסול | חיסול | הַתמָדָה | ||||
| עיכוב תרופתי phagocytosis | הַתמָדָה | הַתמָדָה | חיסול | * חוזה תוצאות להניח קיבעון אינו משנה הקובעים משטח קריטי אחראי להכרה קולטן בתיווך ו / או phagocytosis. | |||
| † חוזה תוצאות כרוכות שתי הנחות: ראשית, כי המתווך המסיס הוא קטן מספיק כדי לעבור הדרך הנקבובית של הממברנה הפרדת אפופטוטיים ותגובת תאים, ושנית, כי כל שלפוחית סככה או microvesicles, לעתים קרובות כינו גופים אפופטוטיים, הם גדולים מדי כדי לעבור דרך הנקבוביות של הממברנה. תפקיד שלפוחית או microvesicles יהיה שהוצע על ידי חוסר הלימה באירועי האיתות ציינו עם הפרדה פיזית של תאים אפופטוטיים, המגיבים לעומת בינוני מותנית ultracentrifuged. | |||||||
| ¶ ultracentrifugation (20,000 g × למשך 30 דקות) יש צורך להסיר כל גופים אפופטוטיים או אחרים לשפוך חומר מסיס שעשויים לחקות את effeCTS של תאים אפופטוטיים ללא פגע. | |||||||
טבלה 1. זיהוי של המנגנון (ים) האחראי על איתות אירועי תאי קיימא בעקבות חשיפת תאים אפופטוטיים. כמה אסטרטגיות ניסיוני פשוטות ניתן להבחין בין מנגנון הפוטנציאל (ים) אחראי איתות אירועים נצפו בעקבות חשיפת תאים אפופטוטיים. מנגנונים אלה כוללים: אינטראקציה פיזית של תאים אפופטוטיים עם קולטן ספציפי על מגיב התא, שחרור מתווך מסיסים מתא אפופטוטיים, ומעורבות של מכונות phagocytic של מגיב התא.
| נושא ניסיוני | אסטרטגיות זמינות עבור מזעור ו / או עקיף |
| מספר מוגבלתאים אפופטוטיים של לכל תא להגיב (~ 1: 1 יחס). | 1. להגדיל את מספר תאים אפופטוטיים, אבל אפופטוטיים אל מגיב יחס התא צריך להיות כל זמן <2: 1. * |
| Need for שיקוע כובד תלוי של תאים אפופטוטיים. | 1. מזער נפח בינוני שבו תאים אפופטוטיים מושעים. |
| 2. צנטריפוגה צלחת או צלחת לנהוג תאים אפופטוטיים דרך המדיום השעיית יותר מהר. | |
| הפריסה המרחבית לא אחידה של תאים אפופטוטיים. | 1. בזהירות להפיץ את ירידת השעית תאי אפופטוטיים אחר טיפה עם טפטפת קצה רחב על פני כל השטח של מנות התא המגיב. |
| 2. תרבויות מנות הימנעו או בארות בקוטר <35 מ"מ, שבו תופעות של המניסקוס יכולות להוביל הפצות אחידות. | |
| ההטרוגניות של אוכלוסיית תאים אפופטוטיים. | 1. השתמש inducer חזקשל אפופטוזיס. |
| 2. לאחר אינדוקציה, לתקן את התאים אפופטוטיים עם paraformaldehyde, ולמיין לפי cytometry זרימה להשיג אוכלוסייה אחידה יותר. | |
| * בשעה אפופטוטיים אל המגיב יחסי התא> 2: 1, תאים אפופטוטיים יהוו השטיח ומחוברות תאים אפופטוטיים נוספים כבר לא ליצור קשר ישיר עם תאים המגיב | |
טבלה 2. סוגיות ניסיוני הקשורים לשימוש של השעיה סלולרית כגירוי של אירועי איתות התאית. כמה מכשולי ניסיוני הקשורים לשימוש של השעית תא כגירוי מפורטים, וכן אסטרטגיות הפתרון החלקי שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מספקים כאן פרוטוקול לאפיון אירועי האיתות התאי מושרים תאי קיימא לאחר חשיפתם לתאים העוברים אפופטוזיס, או צורות אחרות של מוות של תאים. הפרוטוקול מדגיש את מספר מנגנונים שבאמצעותם חשיפת תאי אפופטוטיים יכולה לווסת מסלולי איתות תאיים בתוך תאי המגיב קיימא. מנגנונים אלה כוללים: האינטראקציה (באמצעות גישור מולקולות או גורמי שטח על התאים המתים או שלפוחיות microvesicles הסככה שלו, לעתים קרובות כינו גופים אפופטוטיים) עם קולטן ספציפי על התא המגיב; השחרור מתווך מסיס (או אפילו דור תאיים שלהם 27); וההתקשרות של מכונות phagocytic. בנסיבות בהן phagocytosis משמעותית מתרחשת, מנגנון נוסף שיש לקחת בחשבון הוא משלוח של מתווכים, כגון מיקרו-רנ"א, מועשר בתוך תאים אפופטוטיים או שלפוחית שלה 21. המשמעות של הפרוטוקול שלנו, לעומת oמתודולוגיות יס, טמון דיסקציה זהירה שלה של מספר מנגנונים שבאמצעותם תאים אפופטוטיים יכול לווסת הולכת אותות בתוך התאים להגיב. יתרון עיקרי הוא כי רוב הטכניקות הדרושות לכך פשוטים תקן תרבית תאים.
בעוד הפרוטוקול ספציפי עבור תאי BU.MPT, קו PTEC כליות עכבר הנציח, כמקור של שני תאים המתים ותגובה, התאמת פרוטוקול שורות תאים אחרות או בתרביות תאים עיקריות היא פשוטה מיושם בקלות. יתר על כן, כפי בפרסומים הקודמים שלנו, המקור של תאים מתים ותגובה לא צריך בהכרח להיות זהה 9,10,19. בעוד אנו מתארים את השימוש של staurosporine וחום כמו מעוררים של אפופטוזיס ונמק, בהתאמה, במצב וטריגרים של מוות של תאים עשוי להשתנות גם. בעוד אירועי איתות מושרה המגיבים BU.MPT בעקבות חשיפת תאים אפופטוטיים הנם בלתי תלויים בעיקרם במצב של אינדוקצית אפופטוזיס, אנו חהve מקיימים כמה הבדלים 9,10. מסיבה זו, אנו ממליצים תוצאות מפתח מעתיקות עם גורמים שונים של מוות של תאים אפופטוטיים. לדוגמה, אם התאים phagocytic ביותר, כגון מקרופאגים, משמשים כמגיבים 4,6, או אם משך האינטראקציה בין המגיבים ותאים מתים זה מספיק זמן בשביל phagocytosis משמעותי להתרחש, אז אפשר לשקול inducer רעיל של אפופטוזיס, כגון ultraviolet- או גמא הקרנה 4,9,10, כדי לשלול משלוח phagocytic הפוטנציאל של הרעלן. שיטות חלופיות של אינדוקציה של נמק עשוי להיחשב גם. בעוד השגנו תוצאות זהות עם חימום ולהקפיא פשרה של תאים, ובהצטברויות התא הנרחבות ופסולת המתרחשות עם להקפיא הפשרה לעשות שימוש בעייתי.
כמה אסטרטגיות פשוטות יכולות לעזור להבהיר את המנגנון המסוים אחראי לכל אירועי איתות נצפה בעקבות חשיפת תאים אפופטוטיים (לוח 1 בטבלת 1, ההשפעה על אירוע האיתות שנצפה יכולה לאתר את המנגנון האחראי. לדוגמה, במקרה של הכרה קולטן בתיווך של תאים אפופטוטיים, במקרה איתות צריך להתמיד למרות קיבעון של תאים אפופטוטיים, וצריך להתבטל עם החלפת תאים אפופטוטיים ידי חרוזים בינוני או לטקס מותנה, כמו גם עם הפרדה פיזית של תאים מתים להגיב. בתגובת תאי נימקים, במקרה האיתות צריך לחסל או להיות מכוון הפוך (למשל, עיכוב לעומת גירוי).
ישנן מספר השלכות המעשה הוגבלה מת אל-המגיב יחס התא יכוללהוביל לירידה או טשטוש אירועי איתות. כדי אינטראקציה פיזית עם תא המגיב קיימא, תא אפופטוטיים ראשון חייב להתיישב דרך העמודה של השעיית בינונית. אפילו עם כרכים מינימאליים, הפעם עבור שיקוע של תאים יכולים להיות ניכר, כל עוד 10 עד 20 דקות. אירועים איתות תאיים ובכך יהיה תיאום בין התאים להגיב. לפיכך, הקשר הראשוני בין תאים המגיבים ומתים לא יכול להיות מתוזמן בדיוק, אלא נופל בטווח מעט רחב של פעמים. לאיתות האירועים המתרחשים על לוח זמנים קצר יותר מהנדרש ליישוב, זה חוסר סנכרון יכול להוביל טשטוש של אות כזה שזה כבר לא להבחין מהרקע. אפילו אותות של משך מורחב, אם לא בסדר גודל מספיק, יכולים להיות רגישים לנושא הזה.
בנוסף לבעיות הזמניות אלה, בתחום המרחב גם יכול להשפיע לרעה על תוצאותיה. השפעות של המניסקוס, במיוחד בבארות ומנות של היםקוטר קניון (למשל, בתרבית רקמת קלקר שטופל 96-היטב אשכולות), או זרמים נוזלים שנוצרו על ידי pipetting הכוחני מדי יכול להוביל חלוקה לא אחידה של תאים מתים, ובכך ליצור מצב של חג או רעב בין מגיב תאים. מאז האות הנמדד נובע שמכל התאים המגיבים בבאר יחידה או צלחת, וריאציה על לכידתו של תאים מתים עלולה לטשטש אותות חלשים.
סוגיה סופית מתייחסת ההטרוגניות של אוכלוסיית התאים אפופטוטיים. אפילו עם הדק חזק של אפופטוזיס, כגון staurosporine, כל הכנה של תאים מתים תכיל תאים בשלבים שונים של תהליך המוות. זה הופך רלוונטי, אם עוצמת תגובת תאי אפופטוטיים תלויה בשלב שלה בתוך 10,14 תהליך המוות. מאז בממוצע כל תא מגיב פוגש רק תא אחד אפופטוטיים, ההטרוגניות במקרה זה יכול להוביל להיחלשות של אירוע האיתות זוהה כולל. טבלה 2
ישנם מספר חששות ניסיוניים אחרים הקשורים באופן ייחודי עם השימוש של תאים מתים כגירוי. חשוב לציין, תנאי התרבות עשויים להשפיע לא רק את התאים להגיב, אלא גם את התאים המתים עצמם. לדוגמה, חלבונים בסרום, אם הוא קיים, יכול לצרף אל פני השטח של תאים מתים, ולשפר או לעכב את הכרתה ידי להגיב תאים. פתרון בעיות תוצאה לא עקבית או מכך שונה מזו מהמדווח בספרות, תשומת לב צריך להינתן בתנאי התרבויות הבאים (עבור השני מגיב ותאים מתים): מידת המפגש, מספר קטע, נוכחות של סרום, האיון חום של סרום , ו אופי ומשך קפאון. לבסוף, אחד צריך להיות מודע לכך מוות של תאים הוא היבט בלתי נמנע של כל תרבית התאים, ותאי מגיב ולכן הם חשופים ללא הרף לרמה נמוכה של מתיםתאים. חשיפה זו יכולה להשפיע על תגובת ניסיוני פוטנציאל בולוס של תאים מתים, מאז האותות מאוד נחקרים שמתבצעים מושרה רף. אפנון אות עשוי להתחולל דרך מסלולי משוב נורמלים, או אפילו דרך הבחירה של תת-אוכלוסייה של תאים מגיבים, במיוחד אם אירועי איתות מושרה לערב הישרדות או התפשטות.
לסיכום, תארנו פרוטוקול קביעת אירועי איתות תאיים מושרים תאי קיימא על ידי האינטראקציה הפיסית שלהם עם תאים מתים או גוססים סמוכים. למרות הדגש הוא בעיקר על איתות אירועים המושרה על ידי הכרת קולטן בתיווך של תאים מתים, הפרוטוקול גם מאפשר זיהוי של איתות אירועים המושרה על ידי ספיגת phagocytic או השחרור של מתווכים מסיסים מן התאים המתים. השימוש של תאים מתים כגירוי מציג מספר גורמים ייחודיים שיכול לעכב את הגילוי של אירועי איתות תאיים. מודעות אלה uגורמי nique, כמו גם את מספר המנגנונים שבאמצעותם תאים מתים לווסת איתות תאית, הוא קריטי בעיצוב הפרשנות של ניסויים בתוך תחום צומח זה של מחקר. הפרוטוקול המתואר כאן צריך סיוע בהבנת המנגנונים שבאמצעותם מתים או גוססים תאים להשפיע השכנים לחיות שלהם בשני בריאות ומחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
