Abstract
Клетки умирают путем апоптоза, также упоминается как регулируемом гибель клеток, приобретают несколько новых видов деятельности, которые позволяют им влиять на функцию смежных живых клеток. Жизнедеятельности, такие как выживание, пролиферации, роста и дифференцировки, являются одними из многих клеточных функций, модулированных апоптотических клеток. Способность распознавать и реагировать на апоптотических клеток, как представляется, является универсальным свойством всех клеток, независимо от происхождения или органа происхождения. Тем не менее, разнообразие и сложность ответа на апоптозе мандатов, которые большое внимание быть приняты в рассекает сигнальных событий и путей, ответственных за какой-либо конкретного результата. В частности, необходимо проводить различие между множеством механизмов, с помощью которых апоптотических клеток могут влиять на внутриклеточные сигнальные пути в пределах жизнеспособных иммунокомпетентных клеток, в том числе: признание рецептор-опосредованного апоптоза клетки, высвобождение растворимых медиаторов апоптоза клетки, и / или зацепление фагоcytic оборудование. Здесь мы приводим протокол для определения внутриклеточных событий сигнализации, которые индуцируются в жизнеспособных иммунокомпетентных клеток после их воздействия апоптотических клеток. Одним из основных преимуществ протокола заключается в том внимании, он платит рассечения механизма, с помощью которого апоптотических клеток модулировать сигнальных событий внутри отвечающих клеток. В то время как протокол является специфичным для условно увековеченную мыши почки проксимальной линии трубчатых элементов (BU.MPT клетки), он легко адаптируется к клеточных линий, которые не являются эпителиальные происхождения и / или полученный из материалов, отличных от почек органов. Использование мертвых клеток в качестве стимула вводит несколько уникальных факторов, которые могут препятствовать обнаружению внутриклеточных сигнальных событий. Эти проблемы, а также стратегии, чтобы максимально уменьшить или обойти их, обсуждаются в рамках протокола. Применение этого протокола должно помочь нашей расширяющейся знания широкого влияния, что мертвые или умирающие клетки оказывают на их живых соседей, как в здоровье и в diseaсе.
Introduction
Апоптоз, или регулируемая гибель клеток 1, способствует существенным образом на содержание и развитие тканей. Рассматриваемый наиболее просто, допускает апоптозом возрасте, поврежденные или лишние клетки должны быть устранены без вреда для окружающих тканей 2,3. Вклад апоптоза в гомеостазе ткани, однако, значительно более динамичным и разнообразным. Клетки умирают путем апоптоза приобретают несколько новых видов деятельности, как секретируется и связанную с клетками, которые позволяют им влиять на функцию смежных живых клеток 4-10. Более ранние исследования были сосредоточены на способности апоптотических клеток для подавления воспаления 11-16, но апоптотических клеток также модулировать широкий спектр клеточных функций, включая такие жизнедеятельности как выживание 4,9,10, пролиферации, дифференцировки 4,9,10 17, миграция 18, и рост 19. Более того, эти эффекты не ограничиваются профессиональными фагоцитами, как макрофагс, но распространяется на практически всех типов и линий клеток, в том числе традиционно не-фагоцитирующих клеток, таких как эпителиальные и эндотелиальные клетки 7,9,10,18-21.
Конкретный ответ соседних живых клеток после воздействия апоптотических клеток зависит от множества факторов, которые имеют отношение к обоим жизнеспособных клеток и реагирующих самих апоптотических клеток. Например, несмотря на то воздействие апоптотических клеток ингибирует пролиферацию обоих мышиных макрофагов и почечных проксимальных канальцев эпителиальных клеток (PTECs), эти два типа клеток резко отличаются по их реакции на выживание в апоптотических клеток 4,6,9,10. Апоптотических клеток способствуют выживанию макрофагов, но индуцирует апоптоз в PTECs 4,6,9,10. Следует отметить, что реакция на апоптотических клеток может отличаться даже среди отвечающих клеток к той же линии, в зависимости от органа , Отвечающий клетки происхождения 10 (например, почек PTECs против молочных желез эпителиальныеклетки) или состояние активации 22 (например, нейтрофилы). И наоборот, апоптотических клеток может вызывать различные реакции в той же самой клетке в зависимости от характера Апоптические стимула 10,23 или стадию апоптоза 10,14.
Учитывая несходство и сложность ответа на апоптотических клеток, большое внимание должно быть принято в рассекает сигнальных событий и путей, ответственных за какой-либо конкретного результата. Во- первых, ответы , требующие непосредственного физического взаимодействия между жизнеспособными и апоптотических клеток следует отличать от тех , вызываемое растворимых медиаторов выпущенных или генерируемых апоптического ячейкой 3,6-10. Если требуется физическое взаимодействие, то дальнейшая дифференциация должна быть выполнена. Сигнальных событий может зависеть от распознавания рецептора-опосредованного апоптоза клетки, независимо от последующего охвате, или на фагоцитарную поглощение, независимо от специфического рецептора, который связывает клеток путем апоптоза 3-7,9,10,19. В последнем случае, ответ не является специфическим для апоптотических клеток, и могут быть вызваны любым фагоцитарной материала 4,6.
Важность этих различий может быть вновь оценены контрастные реакции макрофагов и PTECs почек. Для обоих типов клеток, воздействие апоптотических клеток изменяет активность киназы про выживание Akt. Модуляция зависит от физического взаимодействия, так как разделение реагирования и апоптотических клеток путем поликарбонатную мембрану 0,4 мкм ликвидирует реакцию 4,9,10,19. Тем не менее, реакция PTECs является рецептор-опосредованного и не зависит от фагоцитоза, в то время как реакция макрофагов управляется фагоцитоза 4,9,10,19. Этот вывод подтверждается тем фактом , что воздействие латексных шариков, нейтральный фагоцитарной стимул, не оказывает никакого влияния на активность Akt в PTECs, но имитирует эффект апоптотических клеток в макрофагах 4,9.
"> Несмотря на то, менее хорошо изучены, клетки гибнут некроз, или случайной гибели клеток 1, также модулировать функцию рядом жизнеспособных клеток 3-10,19. Как и апоптотических клеток, некротические клетки проявляют свое действие с помощью различных механизмов, в частности, утечки внутриклеточного содержимого через их разрыва клеточной мембраны 3,5,6,9,24. Многие клетки, в том числе PTECs и макрофагами, обладают различными неконкурентных рецепторы клетки умирают некрозом 5,9. Взаимодействие этих рецепторов вызывает сигнальные события, часто противоположные тем , индуцированный зацепление рецепторов для апоптотических клеток 4-10,19. Например, в PTECs, некротические клетки увеличивают фосфорилирование Akt, в то время как апоптотических клеток уменьшают фосфорилирование 9,10,19. Здесь мы опишем протокол для идентификации внутриклеточных сигнальных событий, индуцированные в жизнеспособных PTECs почек через признание опосредованного рецепторами соседних апоптотических PTECs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
Примечание: В этом протоколе двух или более клеточных линий или первичных клеточных культур, независимо друг от друга получают в конкретных условиях. Эти препараты включают апоптозе (Протокол 1), некротических клеток (Протокол 2) и здоровых иммунокомпетентных клеток (протокол 3). После самостоятельной подготовки, в апоптозе или некротические клетки добавляются к иммунокомпетентных клеток и полученную в результате трансдукции сигнала отслеживается (Протоколы 4, 5 и 6).
- Подготовка питательных сред и реактивов
- Приготовьте 500 мл культуральной среды А (для использования при выращивании клеток в разрешающих условиях, см раздел 1.2) путем объединения следующих: 1x Дульбекко Модифицированный орла Средний (DMEM), содержащей 4,5 г / л глюкозы, 584 мг / л ʟ-глутамина, 110 мг / л пирувата натрия, 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина, 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 10 единиц / мл интерферона-гамма (IFN-gamma).
- Приготовьте 500 мл культуральной среды B (для использования КНан сыворотки голодающих клеток при непермиссивной условиях, смотрите раздел 1.2), исключив FBS и IFN-gamma из рецепта культуральной среды А. Для того, чтобы вырастить клетки под непермиссивной условиях (до сывороточного голодания), добавьте 10% об / V FBS в культуральной среде B.
- Готовят 0,4% (об / об) параформальдегида, рН 7,2, в фосфатном буферном растворе 1x Дульбекко (DPBS) с 4% акций параформальдегидом для фиксации мертвых клеток.
Примечание: параформальдегид является токсичным, а также соответствующие следует проявлять осторожность при его использовании.
- Культура BU.MPT клетки
- Оттепель из жидкого азота один флакон клеток BU.MPT.
Примечание: BU.MPT представляет собой проксимальный линия трубчатой эпителиальные клетки мыши почки (PTEC), полученный из трансгенной мыши, несущей чувствительный к температуре (Ts) мутации (tsA58) крупного опухолевого антигена SV40 (Тэг) под контролем мыши основной комплекс гистосовместимости (MHC) H-2K б класс I промоутер 25,26. - Пластина клеток на стерильном polystyrена вакуум-газ с плазменной обработкой культуры тканей блюда (~ 5 × 10 6 клеток на чашку диаметром 100 мм).
- Рост клеток в разрешающих условиях в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2.
Примечание: разрешающих условиях, которые определены в качестве культуры при 33 - 37 ° С в присутствии IFN-gamma, допускают устойчивое выражение tsA58-мутантным Тэг трансгена. В отличие от первичных культур мыши почек PTEC, которые не выживают более чем за один проход или два, BU.MPT культивируют в разрешающих услови х, могут быть пассировать до бесконечности.- Прохождение клетки по крайней мере три раза после оттаивания, прежде чем использовать их в эксперименте.
- Пропусканием клеток, прибавляют 1 мл 0,05% трипсина на 100 мм чашку, и инкубировать в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 при 37 ° С в течение 5 мин. Нейтрализовать трипсина путем добавления 10 мл среды A. аспирата обособленные клетки, и разделить 1: 3 до 1: 5 в новые 100 мм стерильную полистирол вакуум-газ с плазменной обработкой TISSУЭ блюда культуры. Добавьте носитель, чтобы довести объем до в общей сложности 10 мл на 100 мм блюдо.
- Прохождение клетки по крайней мере три раза после оттаивания, прежде чем использовать их в эксперименте.
- При подготовке к экспериментального использования в качестве отвечающих клеток, роста клеток до слияния в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 под непермиссивные условиях (т.е. при 39 ° С в отсутствие IFN-gamma [среда В , содержащей 10% об / об ФБС]).
Примечание: В непермиссивные условиях, экспрессия tsA58-мутантным Тэг трансгена подавляется> 95%, а BU.MPT клетки ведут себя как первичные культуры мыши почек PTEC.
- Оттепель из жидкого азота один флакон клеток BU.MPT.
2. Приготовление апоптотических BU.MPT клеток (Протокол 1)
Примечание: Этот протокол является специфическим для клеток BU.MPT в качестве источника апоптотических клеток, и стауроспорином как метод индукции апоптоза. В качестве альтернативы, другой клеточной линией, или первичной культуры клеток, может быть использован в качестве источника апоптотических клеток, с апоптозу, вызванному стандартизированной ProtocoLs для этого конкретного типа клеток и способ индукции апоптоза.
- После прохода на диаметром 100 мм , стерильный полистирол плазмы вакуумной газ обработанные чашки с культурой ткани, растут BU.MPT клетки до слияния в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 в разрешающих условиях (т.е. при температуре 37 ° С в культуральной среде А в 10 мл на 100 мм блюдо), как описано в разделе 1.2.3.
- Полоскание приверженец клеточный монослой трижды культуральной средой B, используя 10 мл на полоскание.
- Индуцируют апоптоз путем инкубации клеток в культуральной среде В , содержащей стауроспорин, неселективный ингибитор протеинкиназы, при 1 мкг / мл в течение 3 ч в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 при 37 ° С .
- Аспирируйте стауроспорином содержащих среду, содержащую "плавающим" апоптотических клеток, которые оторваны от монослоя. Центрифуга эту среду в течение 10 мин при 500g, отбросить супернатант, промойте Таблетку три раза культуральной средой B, идобавить осадок обратно в клетки, собранные на следующей стадии, 2.5.
- Отделить оставшиеся прилипшие клетки из шагов 2.3 и 2.4 добавлением 5 мМ (этилендиаминтетрауксусной кислоты) ЭДТА в 1X Ca 2 + - и Mg 2+ -бесплатно DPBS в количестве 1 мл на чашку в течение 5 минут. Аспирируйте ЭДТА содержащих среду, содержащую отдельные апоптотических клеток, а также объединить отдельные клетки с «плавающих» апоптотических клеток из стадии 2.4 в стерильной 15 мл центрифужные пробирки полистирола.
- Промыть апоптотических клеток в три раза путем центрифугирования в течение 10 мин при 500g и ресуспендирования в 10 мл 1x Ca + 2 - и Mg + 2 -свободных DPBS на промывку.
- После последней промывки, приостановить апоптотических клеток в свежей культуральной среде В на ~ 5 × 10 6 клеток на мл перед использованием , чтобы стимулировать иммунокомпетентные клетки. В качестве альтернативы, зафиксировать промытые апоптотических клеток в 0,4% (об / об) параформальдегида в 1X ДЗФР в течение 30 мин, а затем промывают три раза с культуройсреда Б, перед суспендированием в культуральной среде B.
- В зависимости от обстоятельств, подтверждают индукции апоптоза с помощью проточной цитометрии с использованием отдельного препарата апоптотических клеток (или путем резервирования несколько ячеек для этой цели), как описано ранее 6,9,10,15.
Примечание: Ранние апоптотических клетки имеют неповрежденные клеточные мембраны, и появляются в виде пропидийиодидом (PI) -отрицательные и аннексина V-положительные клетки уменьшение размеров клеток (относительно жизнеспособных клеток). Поздний апоптотических клетки имеют поврежденную клеточные мембраны, и появляются как PI-положительные и аннексина V-положительные клетки уменьшение размеров клеток. Использование текущего протокола, типичные препараты содержат ~~~HEAD=iobj 85% ранний апоптотических и ~ 15% поздних апоптотических клеток. - Добавить апоптотических клеток в BU.MPT иммунокомпетентных клеток (протокол 3) при апоптозе-к-ответчиком соотношении клеток 1: 1, либо непосредственно, либо после фиксации апоптотических клеток в течение 30 мин с 0,4% (об / об) параформальдегида в 1X ДЗФР ,
Примечание: фиксация клеток перед апоптотических стимуляции ответчиков должныне влияют на результаты, если Наблюдаемое сигнальных событий не обусловлены высвобождением растворимого медиатора (таблица 1).
3. Получение некротический BU.MPT клеток (Протокол 2)
Примечание: Этот протокол является специфическим для клеток BU.MPT в качестве источника некротических клеток и нагрева, как метод индукции некроза. В качестве альтернативы, другой клеточной линией, или первичной культуры клеток, может быть использован в качестве источника некротических клеток, с некрозом, индуцированной стандартизированными протоколами для этого конкретного типа клеток и методом индукции некроза.
- После прохода на диаметром 100 мм , стерильный полистирол плазмы вакуумной газ обработанные чашки с культурой ткани, растут BU.MPT клетки до слияния в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 в разрешающих условиях (т.е. при температуре 37 ° С в культуральной среде А в 10 мл на чашку), как описано в разделе 1.2.3.
- Полоскание приверженец клеточный монослой трижды культуральной средой B, используя10 мл на прополоскать.
- Открепления клеток путем добавления 5 мМ ЭДТА в 1X Ca + 2 - и Mg + 2 -свободных DPBS в количестве 1 мл на чашку в течение 5 минут. Аспирируйте ЭДТА содержащих среду, содержащую отдельные клетки, и добавить клеточной суспензии в стерильный 15 мл центрифужные пробирки полистирола.
- Промыть клетки три раза центрифугированием в течение 10 мин при 500g и ресуспендирования в 10 мл Ca + 2 - и Mg + 2 -свободных DPBS на промывку.
- После последней промывки, суспендирования клеток в свежей культуральной среде В на ~ 5 × 10 6 клеток на мл.
- Индуцируют некроз нагреванием клеток до 70 ° С в течение 45 мин на водяной бане, осторожно встряхивая клеточной суспензии через каждые 10 мин.
- Инкубируйте клетки в течение 2 ч в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 при 37 ° С. Аккуратно вихрь клеточной суспензии через каждые 15 мин.
- В зависимости от обстоятельств, подтверждают индукцию некроза с помощью проточной цитометрии с использованием отдельного препарата пеcrotic клетки (или путем резервирования несколько ячеек для этой цели), как описано ранее , 6,9,10,15.
Примечание: некротические клетки разрушают клеточные мембраны, и появляются как PI-положительных клеток увеличенного размера клеток (относительно жизнеспособных клеток). Использование текущего протокола, типичные препараты содержат ≥ 95% некротических клеток. В качестве альтернативы, индукция некроза и потере целостности мембраны может быть подтверждена с помощью окрашивания трипановым синим.
4. Получение BU.MPT иммунокомпетентных клеток (протокол 3)
Примечание: Этот протокол является специфическим для клеток BU.MPT в качестве источника иммунокомпетентных клеток. В качестве альтернативы, другой клеточной линией, или первичной культуры клеток, могут быть использованы в качестве иммунокомпетентных клеток. До начала экспериментального использования успокоенность может быть вызван в течение ночи с помощью стандартных протоколов в лаборатории.
- Рост клеток BU.MPT в стерильной 100 мм чашки для культивирования тканей в разрешающих условиях в культуральной среде А в 10 мл на чашку, пока они не достигнут ~85% Стечение.
- Отберите культуральной среды A, и Прополощите клетки трижды культуральной средой B со скоростью 10 мл в полоскании. Сыворотка истощени клеток в течение ночи в течение 18 до 24 ч в увлажненной 5% (об / об) атмосфере СО 2 под непермиссивные условиях (т.е. при 39 ° С в культуральной среде B со скоростью 10 мл на чашку), как описано в разделе 1.2 .4, для того, чтобы вызвать состояние покоя. В качестве альтернативы, роста клеток в культуральной среде B плюс 10% (об / об) FBS при 39 ° С в течение одного дня, прежде чем в сыворотке крови голодающих клеток в течение ночи в культуральной среде B без FBS.
- Добавьте описание отдельной тканевой культуры блюдо из сливающихся BU.MPT клеток для каждого экспериментального состояния.
- Включите следующие шесть условий: стимулирование жизнеспособных BU.MPT реагирующих с коэффициентом либо носителем или эпидермального роста (EGF) в течение 15 мин после их выдержки в течение 30 мин с использованием либо без каких-либо клеток, апоптотических клеток или некротических клеток.
Примечание: Воздействие мертвые клетки могут либо стимулировать или подавлять уровень активности ГИвэн сигнализации молекулу. Стимуляция лучше всего обнаруживается выше низкого исходного уровня (например, отсутствие EGF), в то время как ингибирование лучше всего обнаруживается с высоким исходным уровнем (например, наличие EGF). Так как эффект стимуляции с мертвыми клетками априори неизвестна, рекомендуется проводить все исследования как в отсутствие , так и при наличии EGF.
5. Стимулирование иммунокомпетентных клеток с апоптотических и некротических клеток (Протокол 4)
- Отберите культуральной среды B из предварительно меченных блюд в состоянии покоя (сывороточный голодали) BU.MPT иммунокомпетентных клеток (протокол 3).
Примечание: После ночной культуры при непермиссивной условиях, BU.MPT клетки должны вести себя как первичные культуры почек мыши PTEC. - За 100 мм чашку, добавляют 2 мл одного из следующих действий: В культуральной среды (без клеток); апоптическая суспензии клеток в ~ 5 × 10 6 клеток на мл в культуральной среде B (Протокол 1); или некротической клеточной суспензии при ~ 5 × 10 6 клеток на мл Iп культуральной среды B (Протокол 2).
- Распределить 2 мл суспензии мертвых клеток равномерно по 100 мм блюдо, и сохранить время для них, чтобы обосноваться к минимуму. Для достижения этой цели, распределить тайника клеточной суспензии по капле с широким наконечником пипетки по всей поверхности Ответчик клеточных блюд. Использование объема 2 мл в качестве компромисса между минимизации времени отстаивания и избежать образования комков мертвых клеток.
Примечание: использование суспензии мертвых клеток в качестве стимула влечет за собой ряд специальных соображений, которые описаны ниже более подробно (таблица 2 и обсуждение). - Достижения отношения мертвых-к-ответчику клеток ~ 1: 1 путем добавления 2 мл мертвых клеток при ~ 5 × 10 6 клеток на мл в мм чашку сливающийся 100, который содержит ~ 10 х 10 6 клеток. С другой стороны, для того, чтобы установить зависимость от дозы каких-либо наблюдаемых сигнальных событий, варьировать соотношение умерших к иммунокомпетентных клеток непрерывно прогрессирующим разведением в культеЮр среда В мертвых клеточных суспензий, приготовленных в Протоколами 1 и 2.
- Распределить 2 мл суспензии мертвых клеток равномерно по 100 мм блюдо, и сохранить время для них, чтобы обосноваться к минимуму. Для достижения этой цели, распределить тайника клеточной суспензии по капле с широким наконечником пипетки по всей поверхности Ответчик клеточных блюд. Использование объема 2 мл в качестве компромисса между минимизации времени отстаивания и избежать образования комков мертвых клеток.
- Аккуратно водоворот посуду, а затем инкубировать при температуре 37 ° С в увлажненной 5% (об / об) CO 2 атмосферы.
- Через 30 мин, стимулируют иммунокомпетентные клетки получены либо носителем или 50 нМ EGF, в соответствии с предварительной маркировки чашки для культивирования.
- Инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С в увлажненной 5% (об / об) CO 2 атмосферы.
- Смывают мертвые клетки путем добавления 5 мл охлажденного льдом 1x ДЗФР, закрученной блюдо, и аспирационного моющей жидкости. Повторите три раза.
- Сразу же место посуду Ответчик клетки на льду для дальнейшей обработки.
- Приготовьте лизаты клеток
- Подготовка буфера для лизиса клеток, содержащий следующее: 1 × Трис-солевой буферный раствор (TBS), 10 мМ пирофосфата натрия, 0,5% вес / об дезоксихолата, 0,1% вес / об SDS, 10% глицерина и 25 мМ фторида натрия.
- Непосредственно перед лизису клетки, добавить следующее в точном порядке, указанном в IndКонцентрации льные: мини-ЭДТА свободной коктейль ингибиторов протеаз (1 таблетка на 10 мл буфера для лизиса), 10% (об / об) Тритона X-100, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), и 10 мМ ортованадат натрия.
- Добавьте 700 мкл охлажденного льдом буфера для лизиса клеток на 100 мм чашку свежеприготовленного стимулированных иммунокомпетентных клеток на льду с шага 5.7. Наскребать клетки с клеточным скребком и передавать лизат предварительно охлажденный 1,5 мл микропробирки. Поддерживать трубки на льду в течение 15 мин.
- Соникатные лизатов на льду с 10 импульсов 20 Гц, менее чем за одну секунду каждый по продолжительности. Избегайте создания пены на границе раздела газ / жидкость, так как это может привести к перегреву образцы. Полностью погрузить ультразвуковом зонд в микропробирки, содержащие лизаты перед переключением на ультразвукового и включите ультразвукового перед извлечением зонда из лизатов.
- Центрифуга при 20000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С, передавать супернатанты на свежий предварительно охлажденный микропробирок, И хранить при температуре -70 ° С.
- Выполнение гель - электрофореза и иммуноблоттинга на супернатантах лизатов, как было описано ранее 6,9,10,15.
- Подготовка буфера для лизиса клеток, содержащий следующее: 1 × Трис-солевой буферный раствор (TBS), 10 мМ пирофосфата натрия, 0,5% вес / об дезоксихолата, 0,1% вес / об SDS, 10% глицерина и 25 мМ фторида натрия.
6. Предотвращение прямого физического контакта между целями и ответчики Использование полупроницаемую поликарбонатную мембрану (Протокол 5)
- Приготовьте иммунокомпетентных клеток BU.MPT в соответствии с Протоколом 3, за одним исключением; роста клеток в стерильной культуре ткани полистирола обрабатывают кластеры 12-а.
- В отдельных скважинах, поместите проницаемую систему поддержки, содержащую поликарбонатную мембрану 0,4 мкм, чтобы предотвратить физическое взаимодействие между мертвыми и иммунокомпетентных клеток. Включают контрольные лунки без мембраны в том же эксперименте.
- Отберите культуральной среды B из экспериментальных скважин BU.MPT иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови голодали.
- Следуйте Протокол 4 для стимуляции иммунокомпетентных клеток с апоптотических или некротических клеток, со следующими изменениями:
- На лунку 1Кластер 2-, добавьте 0,1 мл одного из следующих действий: В культуральной среды (без клеток); апоптическая суспензии клеток в ~ 5 × 10 6 клеток на мл в культуральной среде B (Протокол 1); или некротической клеточной суспензии при ~ 5 × 10 6 клеток на мл в культуральной среде B (Протокол 2).
Примечание: В качестве сливающийся лунку 12-луночного кластер содержит ~ 0,5 × 10 6 клеток, добавление 0,1 мл мертвых клеток при ~ 5 × 10 6 клеток на мл приводит к тупиковой к ответчику соотношение клеток ~ 1: 1. - Для скважин, содержащих систему проницаемой поддержки, добавить мертвые клетки в верхней части 0,4 мкм поликарбонатную мембрану в проницаемой системе поддержки, так что нет никакого прямого физического взаимодействия между мертвыми и иммунокомпетентных клеток.
- На лунку 1Кластер 2-, добавьте 0,1 мл одного из следующих действий: В культуральной среды (без клеток); апоптическая суспензии клеток в ~ 5 × 10 6 клеток на мл в культуральной среде B (Протокол 1); или некротической клеточной суспензии при ~ 5 × 10 6 клеток на мл в культуральной среде B (Протокол 2).
7. Ингибирование фагоцитоза с Цитохалазин D (Протокол № 6)
- Приготовьте иммунокомпетентных клеток BU.MPT в соответствии с Протоколом 3.
- Подготовьте цитоскелета ингибитор цитохалазин D в dimethил сульфоксид (ДМСО) в дозе 4 мг / мл (1000 ×). Добавить в предварительно меченных блюда из иммунокомпетентных клеток BU.MPT либо 10 мкл носителя (ДМСО) или 10 мкл цитохалазином D для достижения конечной концентрации 4 мкг / мл в 10 мл культуральной среды B.
Примечание: При такой концентрации цитохалазином D, фагоцитоз клетками BU.MPT и макрофагальной клеточной линии ингибируется ≥90% 9,10. - Инкубировать в течение 2 ч при 37 ° С в увлажненной 5% (об / об) CO 2 атмосферы.
- Следуйте Протокол 4 для стимуляции иммунокомпетентных клеток с апоптотических или некротических клеток.
- В зависимости от обстоятельств, подтверждают ингибирование фагоцитоза мертвых клеток с помощью проточной цитометрии с использованием отдельного препарата мертвых и иммунокомпетентных клеток (или ячеек , зарезервированных для этой цели), как описано выше 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1, мы предлагаем схему , изображающую сроки и важные шаги , связанные с подготовкой апоптотических клеток (Протокол 1) и некротических клеток (Протокол 2) и стимуляцию иммунокомпетентных клеток с суспензиями апоптотических и некротических клеток (Протокол 4).
На рисунке 2, мы обеспечиваем репрезентативные результаты , показывающие эффект апоптотических клеток на фосфорилирование двух изоформ серин-треонин киназа гликоген - синтазы - киназы-3 (GSK-3), GSK-3 & alpha; и GSK-3 & beta;. ГСК-3α / β играет ведущую роль в регуляции клеточной пролиферации и выживания, а также играть важную роль в метаболизме глюкозы. Фосфорилирование GSK-3 & alpha; на серин-21 и GSK-3 & beta на серин-9 ингибирует активность киназы и, в свою очередь, приводит к снижению фосфорилирования и увеличение стабилизации -катенина. -катенинзатем транслоцируется в ядро, где он способствует транскрипцию генов, как известно, стимулирует пролиферацию клеток и ингибировать апоптоз. Поэтому, увеличение фосфорилирования GSK-3 & alpha; / & beta связано с увеличением пролиферации и выживания, в то время как снижает уровень фосфорилирования GSK-3 & alpha; / & beta коррелирует со снижением пролиферации и выживания.
Воздействие покоящихся BU.MPT ответчиков к апоптотических клеток в течение 30 мин сильно тормозил базальной фосфорилирования GSK-3 & alpha; / р (рис 2А). Точно так же перед воздействием апоптотических мишеней в течение 30 мин сильно тормозил последующий эпидермальный фактор роста (EGF) -индуцированное фосфорилирование GSK-3α / В (фиг.2А). В отличие от этого, экспозиция BU.MPT реагирующих на некротических клеток не было никакого влияния ни на базальной или EGF-индуцированного фосфорилирования GSK-3 & alpha; / р.
Для предупреждет физическое взаимодействие между BU.MPT респондеров и апоптотических клеток, BU.MPT ответчики выращивали в проницаемой системе поддержки и отделена от апоптотических мишеней поликарбонатную мембрану 0,4 мкм. Предотвращение физического взаимодействия между BU.MPT респондеров и апоптозе отменила способность апоптотических мишеней ингибировать фосфорилирование GSK-3 & alpha; / & beta (рис 2B). Для того, чтобы оценить роль фагоцитоза, мы использовали цитоскелета ингибитор цитохалазин D, чтобы предотвратить фагоцитарной поглощение мертвых клеток. Ингибирование фосфорилирования GSK-3 & alpha; / & beta в ответ на апоптотических клеток происходит в отсутствие фагоцитоза (фиг.2с). Ранее мы показали , что цитохалазин D, при используемой концентрации, ингибирует PTEC и макрофагального фагоцитоза ≥90% 9,10. Взятые вместе, наши результаты показывают, что апоптическая клеточно-опосредованная ингибирование фосфорилирования GSK3α / р требует непосредственного физического взаимодействия betwe ан целей и иммунокомпетентных клеток, но не зависит от фагоцитоза.
Рисунок 1. Схема для индукции внутриклеточных сигнальных событий жизнеспособными иммунокомпетентных клеток путем физического взаимодействия с соседними клетками , проходящих гибель клеток. На графиках линии изображают сроки и критические события в подготовке (А) апоптическая (APO) клеток и (В) некротических (Necro) клеточных суспензий клеток BU.MPT, и в (С) стимулирование жизнеспособных BU.MPT ответчиком клетки с суспензиями апоптотических или некротических клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Ингибирование фосфорилирования GSK3α / р в BU.MPT иммунокомпетентных клеток после воздействия апоптотических клеток требует прямого межклеточные взаимодействия , но не зависит от фагоцитоза. Недостатком сыворотки иммунокомпетентные клетки BU.MPT предварительно обрабатывают в течение 2 ч с (A, B) транспортного средства или (C) цитохалазином D (4 мкг / мл), а затем стимулировали в течение 30 мин, без клеток (-) апоптотических клеток (APO ), или некротические клетки (НЭК) в мертвой клетке , чтобы RespondeR соотношение клеток 1: 1. Иммунокомпетентные клетки затем промывали и инкубировали еще в течение 15 мин в отсутствие или в присутствии EGF (50 нМ), до сбора урожая. Источником апоптотических клеток был стауроспорина обработанных BU.MPT клетки. Источником некротических клеток подвергали термообработке BU.MPT клетки. Взаимодействие между мертвыми клетками и BU.MPT ответчиков был либо (A, C) беспрепятственное, что позволяет прямойМертвая клетка-Ответчик физическое взаимодействие, или (B) , с разделением мертвых клеток и ответчиков по поликарбонатную мембрану 0,4 мкм в проницаемой системе поддержки. Мертвые клетки и неадгезивные иммунокомпетентные клетки удаляли путем промывки, и BU.MPT Ответчик клеточные лизаты зондируют анти-фосфорилированных GSK3α / бета антител, как показано на рисунке. Равный нагрузка была подтверждена путем зондирования для полного глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Влияние на сигнализации события предполагая этот механизм | |||||||
| вмешательство | Растворимый посредник | Распознавание рецептор-опосредованного | Фагоцитоз | ||||
| Фиксация апоптотических клеток * | элиминация | Упорство | Упорство | ||||
| Физическое разделение апоптотических и иммунокомпетентных клеток † | Упорство | элиминация | элиминация | ||||
| Ультрацентрифуге среду из клеток, подвергающихся апоптозу stimulus¶ кондиционером | Упорство | элиминация | элиминация | ||||
| Некротические клетки в качестве стимула | элиминация | Устранение или направлены в противоположные стороны ответа (например, ингибирование в сравнении стимуляции) | Упорство | ||||
| Латексные шарики в качестве стимула | элиминация | элиминация | Упорство | ||||
| Фармакологическая ингибирование фагоцитоза | Упорство | Упорство | элиминация | * Прогнозируемые результаты предполагают , что фиксация не изменяет критические детерминанты поверхности , ответственные за распознавание и / или фагоцитоза опосредованного рецептором. | |||
| † Прогнозируемые результаты влекут за собой два предположения: во- первых, что растворимый посредник достаточно мал , чтобы пройти через поры мембраны , отделяющей апоптотических и реагирующих клеток, и второй, что любые сарай везикулы или микропузырьки, которые часто называют апоптотических тел, слишком велики , чтобы проходят через поры мембраны. Роль для везикул или микропузырьков будет предложено отсутствие согласованности в сигнализации событий, наблюдаемых при физическом разделении апоптотических и иммунокомпетентных клеток в сравнении с ультрацентрифуге кондиционированной среды. | |||||||
| ¶ Ультрацентрифугирование (20000 × г в течение 30 мин) необходимо удалить апоптотических тел или других пролил нерастворимого материала , который может имитировать EffeЦТС неповрежденную апоптотической клетки. | |||||||
Таблица 1. Определение механизма (ов) , ответственных за сигнальных событий в жизнеспособные клетки после воздействия апоптотических клеток. Несколько прямолинейные экспериментальные стратегии предусмотрены различать потенциального механизма (ов), ответственного за сигнальных событий, наблюдаемых после воздействия апоптотических клеток. Эти механизмы включают в себя: физическое взаимодействие апоптотической клетки со специфическими рецепторами на клетке, респондеров высвобождение растворимых медиаторов из клеток путем апоптоза, а также взаимодействие фагоцитарной машин Ответчик клетки.
| Экспериментальный выпуск | Доступные стратегии для минимизации и / или обхода |
| Ограниченное числоапоптотических клеток на ячейку (отвечающей ~ 1: 1 соотношение). | 1. Увеличение числа апоптотических клеток, но соотношение клеток апоптическая к ответчику должно быть сведено <2: 1. * |
| Потребность в гравитационно-зависимой оседания апоптотических клеток. | 1. минимизировать объем среды, в которой апоптотических клеток приостановлены. |
| 2. Центрифуга блюдо или тарелка для более быстрого приведения в действие апоптотических клеток через суспендирующей среды. | |
| Неравномерное пространственное распределение апоптотических клеток. | 1. Осторожно распределить апоптический падение клеточной суспензии по капле с широким наконечником пипетки по всей поверхности Ответчик клеточных блюд. |
| 2. Избегайте культуры блюда или скважины с диаметром <35 мм, в котором мениска эффекты могут привести к неравномерному распределений. | |
| Гетерогенность популяции клеток путем апоптоза. | 1. Используйте сильный индукторапоптоза. |
| 2. После индукции фиксируют апоптотических клеток с параформальдегидом и сортировать по проточной цитометрии, чтобы получить более однородную популяцию. | |
| Коэффициенты клеток * В-апоптоза к-ответчиком> 2: 1, Апоптические клетки образуют сливающийся ковер и дополнительные апоптотических клеток больше не будет прямой контакт с иммунокомпетентных клеток | |
Таблица 2. Экспериментальные вопросы , связанные с использованием клеточной суспензии в качестве стимула внутриклеточных сигнальных событий. Несколько экспериментальных препятствий, связанных с использованием суспензии клеток, в качестве стимула, перечислены, а также стратегии их частичное средство.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы предлагаем здесь протокол для определения характеристик внутриклеточных сигнальных событий, индуцированные в жизнеспособных клеток после их воздействия клеток, подвергающихся апоптозу, или другие формы клеточной гибели. Протокол подчеркивает несколько механизмов, с помощью которых воздействие апоптотических клеток могут модулировать внутриклеточные сигнальные пути в пределах жизнеспособных иммунокомпетентных клеток. Эти механизмы включают в себя: взаимодействие (через мостиковые молекулы или поверхностные детерминанты на мертвые клетки или ее сарая везикулы и микропузырьков, которые часто называют апоптозных тел) со специфическими рецепторами на респондеров клетки; высвобождение растворимых медиаторов (или даже их внеклеточной поколения 27); и участие фагоцитарной машин. В условиях , в которых происходит существенная фагоцитоз, дополнительный механизм будет рассмотрен вопрос доставки посредников, таких как микроРНК, обогащенных в апоптотической клетке или ее пузырьках 21. Значимость нашего протокола, по сравнению с Oугие методологии, заключается в его тщательной рассечения многочисленных механизмов, с помощью которых апоптотических клеток могут модулировать передачу сигнала в пределах отвечающих клеток. Главным преимуществом является то, что большинство методов, необходимых просты и стандарт клеточной культуре.
Хотя протокол является специфическим для клеток BU.MPT, иммортализованной мыши почки PTEC линии, как источник обоих мертвых и реагирующих клеток, адаптация протокола к других клеточных линий или первичных клеточных культур проста и легко реализуется. К тому же , как и в наших предыдущих публикациях, источник мертвых и отвечающих клеток не обязательно должны быть одинаковыми 9,10,19. В то время как мы описали использование стауроспорином и тепла в качестве индукторов апоптоза и некроза, соответственно, режим и триггерами гибели клеток, могут также различаться. В то время как сигнальные события, вызванные в BU.MPT ответчиков после воздействия апоптотических клеток в значительной степени зависит от способа индукции апоптоза, мы гаве наблюдали некоторые различия 9,10. По этой причине мы рекомендуем тиражирование ключевые результаты с несколькими различными триггеров апоптотической гибели клеток. Например, если сильно фагоциты, такие как макрофаги, используются в качестве ответчиков 4,6, или если длительность взаимодействия респондеров и мертвых клеток достаточно долго для существенного фагоцитоз произойти, то можно было бы считать нетоксичный индуктор апоптоз, такие как ultraviolet- или гамма-облучение 4,9,10, чтобы исключить потенциальную фагоцитарную доставку токсина. Могут быть рассмотрены также альтернативные способы индукции некроза. В то время как мы получили одинаковые результаты с отоплением и замораживания-оттаивания клеток, обширная слипания клеток и мусора происходит с замораживания-оттаивания делает его использование проблематичным.
Несколько простых стратегий может помочь выяснить конкретный механизм , ответственный за любые сигнализации событий , наблюдаемых после воздействия апоптотических клеток (Таблица 1 таблице 1, влияние на наблюдаемую сигнализации события может определить ответственного механизма. Например, в случае распознавания рецептора-опосредованного апоптоза клетки, событие сигнализации должен сохраняться, несмотря на фиксацию клеток путем апоптоза, и должна быть устранена с заменой апоптотических клеток условными средними или латексными шариками, а также с физическим разделением мертвых и реагирующих клеток. В ответ на некротических клеток, событие сигнализации должны быть устранены или становятся противоположно направленными (например, торможение по сравнению с стимуляции).
Есть несколько последствий этого ограниченного мертвую к ответчику соотношение клеток, который можетприводят к снижению или перекрыванием сигнализации событий. Для того, чтобы физически взаимодействовать с жизнеспособного респондеров клетки, апоптический клетка сначала необходимо урегулировать через колонку суспендирующей среды. Даже при минимальных объемах, время для оседания клеток может быть значительным, до тех пор, как от 10 до 20 мин. Внутриклеточной сигнализации событий таким образом, будет несогласованных среди отвечающих клеток. Следовательно, первоначальный контакт между иммунным ответом и мертвые клетки не могут быть точно синхронизированный, а скорее попадает в несколько широком диапазоне времен. Для сигнальных событий, которые происходят на шкале времени короче, чем это требуется для урегулирования, это отсутствие синхронизации может привести к затемнению сигнала таким образом, что она больше не отличима от фона. Даже сигналы расширенной продолжительности, если не достаточной величины, могут быть восприимчивы к этому вопросу.
В дополнение к этим временным проблемам, пространственные вопросы также могут негативно повлиять на результаты. Мениска эффекты, особенно в скважинах и блюда сДиаметр центр (например, культура пенополистирол ткани обрабатывают 96-луночного кластеры), или жидкости , токи , генерируемые слишком пипеткой силового может привести к неравномерному распределению мертвых клеток, тем самым создавая состояние Сальденов среди иммунокомпетентных клеток. Так как измеренный сигнал исходит от всех иммунокомпетентных клеток в одной скважине или пластины, изменение в захвате мертвых клеток может скрывать слабые сигналы.
Последний вопрос относится к гетерогенности популяции апоптотических клеток. Даже при сильном триггером апоптоза, таких как стауроспорином, любой препарат мертвых клеток будет содержать клетки на нескольких этапах процесса смерти. Это становится актуальным, если сила реакции на клетки зависит апоптотических от его стадии в процессе смерти 10,14. Так как в среднем каждый реагирует клетка встречается только один апоптический клетку, гетерогенность в этом случае может привести к ослаблению общей обнаруженной сигнализации события. Таблица 2
Есть несколько других экспериментальных проблем однозначно связаны с использованием мертвых клеток в качестве стимула. Важно отметить, что условия культивирования могут влиять не только Отвечающий клетки, но и сами мертвые клетки. Например, белки сыворотки, если он присутствует, можно прикрепить к поверхности мертвые клетки, и повышать или снижать активность его признания отвечающих клеток. В устранении противоречивый результат, или результат, отличный от того, в литературе, внимание следует уделить следующим условиям культивирования (для обоих ответчику и мертвых клеток): степень слияния, номер канала, наличие сыворотки, термоинактивации сыворотки , а также характер и продолжительность неподвижности. Наконец, нужно иметь в виду, что гибель клеток неумолимая аспект всей клеточной культуры, и иммунокомпетентные клетки, таким образом, непрерывно контактируют с низким уровнем мертвыхклетки. Это воздействие может потенциально повлиять на экспериментальную реакцию на болюс мертвых клеток, так как сами сигналы, изучаемые в настоящее время постоянно индуцируется. модуляция сигнала может происходить через обычные пути обратной связи, или даже путем выбора субпопуляции иммунокомпетентных клеток, особенно, если индуцированные сигнальных событий связаны выживание или пролиферацию.
Таким образом, мы описали протокол для определения внутриклеточных событий сигнализации, индуцированных в жизнеспособных клеток путем их физического взаимодействия с соседними мертвых или умирающих клеток. Хотя основное внимание в основном на сигнальных событий, индуцированные признания опосредованного рецептором мертвых клеток, протокол также позволяет идентифицировать сигнальных событий, вызванных фагоцитарной поглощения или высвобождения растворимых медиаторов из мертвых клеток. Использование мертвых клеток в качестве стимула вводит несколько уникальных факторов, которые могут препятствовать обнаружению внутриклеточных сигнальных событий. Понимание этих UNique факторы, а также многочисленные механизмы, с помощью которых мертвые клетки модулировать внутриклеточную передачу сигнала, имеет решающее значение для проектирования и интерпретации экспериментов в этой растущей области исследования. Протокол, описанный здесь, должно помочь в понимании механизмов, с помощью которых мертвые или умирающие клетки влияют на их живых соседей как в здоровье и болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
