Abstract
apoptoz ile ölen hücreler, aynı zamanda komşu canlı hücrelerin fonksiyonunu etkileyen sağlayacak birçok yeni faaliyetler kazanmak gibi düzenlenmiş hücre ölümü anılacaktır. Böyle hayatta kalma, proliferasyon, büyüme ve farklılaşma gibi hayati faaliyetler, apoptotik hücreler tarafından modüle birçok hücresel fonksiyonları arasında yer almaktadır. apoptotik hücrelere tanıyıp tepki yeteneği bağımsız olarak soy veya bağlantı organının, tüm hücrelerin evrensel özellik olarak görünmektedir. Ancak, çeşitlilik ve büyük bir dikkatle herhangi bir sonuç için sorumlu sinyal olaylarını ve yollar diseksiyon alınması apoptotik hücreler görev tepki karmaşıklığı. Özelde, bir apoptotik hücreler de dahil olmak üzere, uygun bir cevap hücreleri içinde hücre içi sinyal yollarını etkileyebilir olan çoklu mekanizmalar arasında ayrım yapılmalıdır: reseptör aracılı apoptotik hücre tanınması, apoptotik hücre tarafından çözülebilen aracıların salınmasını ve / veya etkileşim phagocytic makine. Burada, apoptotik hücrelere maruz kaldıkları aşağıdaki canlı yanıt veren hücrelerde uyarılan hücre içi sinyal olayları tanımlamak için bir protokol sağlar. protokolün önemli bir avantajı apoptotik hücrelerin yanıt hücreleri içinde sinyal olaylarını modüle hangi mekanizmanın diseksiyonu için ödediği dikkat yatıyor. Protokol bir şartlı immortalize fare böbreği proksimal tübüler hücre hattı (BU.MPT hücreleri) için spesifik iken, kolayca kaynaklı olmayan epitel ve / veya böbrek dışında organ türetilmiş olan hücre hatlarına uyarlanmıştır. Bir uyarıcı olarak ölü hücrelerin kullanımı hücre içi sinyal olayları algılama engelleyebilir birçok benzersiz faktörler tanıtır. Bu sorunlar, hem de bunları en aza indirmek veya aşmak için stratejiler, protokolde içinde tartışılır. Bu protokolün uygulanması sağlığında ve Disea hem de ölü veya ölmekte hücreler canlı komşuları üzerinde uygulamayın geniş etki genişleyen bilgi yardımcı olmalıdırse.
Introduction
Apoptozis veya regüle hücre ölümü 1, dokuların bakımı ve geliştirilmesi için önemli bir şekilde katkıda bulunur. En basit inceledi, apoptoz izinleri, yaş hasarlı veya aşırı hücre çevredeki dokulara 2,3 zarar vermeden bertaraf edilmesi için. doku homeostazında için apoptoz katkısı, önemli ölçüde daha dinamik ve çeşitlidir. Apoptoz ile ölmemiştir hücreler birden fazla yeni aktiviteler elde hem salgılanan hem hücre-bağlantılı bitişik canlı hücreler 4-10 çalışmasına etki sağlayacak. Inflamasyonu 11-16 bastırmak için apoptotik hücrelerin yeteneği odaklanmış önceki çalışmalar, ancak apoptotik hücreler de, hayatta kalma 4,9,10, çoğalması 4,9,10, farklılaşma 17 gibi hayati faaliyetler de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonları, geniş bir modüle göç 18 ve büyüme 19. Ayrıca, bu etkiler makrofaj gibi -profesyonel fagositlerin sınırlı değildirs, ancak epitelyal ve endotelyal hücreleri 7,9,10,18-21 gibi geleneksel fagositik olmayan hücreler de dahil olmak üzere, hemen hemen tüm hücre tipleri ve soy, kadar uzanır.
apoptotik hücrelere maruz kaldıktan sonra, bitişik canlı hücre spesifik yanıt uygulanabilir, hücrelerin ve apoptotik hücrelerin kendileri, hem ilgili çok sayıda faktöre bağlıdır. Apoptotik hücrelere maruz kalmanın sıçangil makrofaj ve böbrek proksimal tübüler epitelyel hücrelerin (PTECs) proliferasyonunu inhibe olmasına rağmen, örneğin, bu iki hücre tipi apoptotik hücrelerin 4,6,9,10 onların yaşam yanıt olarak büyük ölçüde farklılık gösterir. Apoptotik hücreler, makrofajlar yaşamasını uzattığı ancak PTECs 4,6,9,10 apoptotik ölümüne neden olur. Özellikle, apoptotik hücrelere yanıt aynı soydan gelen hücrelerin yanıt kökeni 10 (meme epitel karşı, örneğin böbrek PTECs nedeniyle yanıt hücrenin organa bağlı arasında bile farklılık gösterebilirhücreleri) ya da aktivasyon durumu 22 (örneğin, nötrofiller). Bunun aksine, apoptotik hücrelerin apoptotik doğasına bağlı olarak aynı hücre içinde farklı tepkiler 10,23 veya apoptoz 10,14 aşamasına uyaran tetikleyebilir.
Apoptotik hücre yanıtı diverseness ve karmaşıklığı göz önüne alındığında, büyük bir dikkatle herhangi bir sonuç sorumlu sinyal olaylarını ve yolların kesme alınmalıdır. İlk olarak, canlı ve apoptotik hücreleri arasındaki doğrudan fiziksel etkileşim gerektiren yanıtları apoptotik hücrenin 3,6-10 tarafından yayımlanan veya oluşturulan çözünür arabulucular tarafından ortaya çıkarılan olanlardan ayırt edilmelidir. Fiziksel etkileşim gerekli ise, o zaman, bir başka farklılaşma yapılmalıdır. Sinyal olayları apoptotik hücre bağlanan özel bir reseptör bağımsız sonra yutulma bağımsız veya fagositik alımına apoptotik hücre, reseptör aracılı tanıma bağlıdır 3-7,9,10,19. İkinci durumda, tepki apoptotik hücrelere özgü değildir ve herhangi bir fagositik malzeme 4,6 ile tetiklenebilir.
Bu ayrımlar önemi tekrar makrofajlar ve böbrek PTECs tepkileri zıt tarafından takdir edilebilir. Her iki hücre türü için, apoptotik hücrelerine maruz ön-sağkalım kinaz Akt'nin aktivitesini değiştirir. Modülasyon, bir 0.4 um polikarbonat membran ile yanıt ayrılması ve apoptotik hücre yana yanıt 4,9,10,19 ortadan kaldırır, fiziksel etkileşime bağlıdır. Makrofajlar tepki fagositozu 4,9,10,19 tarafından tahrik edilmektedir, oysa Ancak PTECs tepkisi, reseptör aracılı fagositoz bağımsızdır. Bu sonuç, lateks boncuklar, nötr fagositik uyarana, maruz kalınması hiçbir PTECs içinde Akt aktivitesi üzerine etkisi, ancak taklit makrofajlar 4,9 apoptotik hücrelerin etkisi vardır gerçeği ile takviye edilmiştir.
"Daha az araştırılmıştır> de, nekroz ya da kaza sonucu hücre ölümü 1 ile boyama hücreleri apoptotik hücre gibi, nekrotik hücre çeşitli mekanizmalar, özellikle sızıntı yoluyla etki gösterirler. 3-10,19 Yakınlarda canlı hücrelerin fonksiyonunu modüle onların yırtılmış hücre zarından 3,5,6,9,24 aracılığıyla hücre içi içeriğinin. PTECs ve makrofajlar dahil olmak üzere birçok hücreler, hücreler nekroz 5,9 ile ölen için farklı olmayan rakip reseptörlerini sahiptirler. bu reseptörlerin Nişan olan sinyal olaylarını neden olur apoptotik hücreler, fosforilasyon 9,10,19 azaltılması ise genellikle apoptotik hücrelerin 4-10,19 reseptörlerinin katılım neden kişilerce karşısında yer alır. Örneğin, PTECs olarak, nekrotik hücre, Akt fosforilasyonunun artar. Burada, komşu apoptotik PTECs reseptör aracılı tanınması yoluyla uygulanabilir böbrek PTECs indüklenen hücre içi sinyal olaylarını belirlemek için bir protokol açıklar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlıklar
Not: Bu protokol, iki ya da daha fazla hücre hattında ya da birincil hücre kültürleri içinde, bağımsız bir şekilde, belirli koşullar altında hazırlanır. Bu preparatlar, apoptotik hücrelerin (Protokol 1), nekrotik hücre (Protokol 2) ve sağlıklı bir cevap veren hücreler (Protokol 3) içerir. bağımsız olarak hazırlanması sonra apoptotik ya da nekrotik hücre cevap hücrelere ilave edilir ve sonuçta elde edilen sinyal transdüksiyon (Protokoller 4, 5, ve 6) kontrol edilmektedir.
- Kültür ortamı ve reaktifler hazırlayın
- , 110 1x Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) 4.5 g / L glikoz, 584 mg / L ʟ-glutamin (permisif koşullar altında büyüyen hücreleri zaman, kullanıcı için bölüm 1.2), 500 ml kültür ortamı bir hazırlama şu birleştirerek mg / L sodyum piruvat, 100 birim / ml penisilin-streptomisin,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve 10 birim / interferon-γ (IFN-y) çözeltisi.
- kullanım wh için kültür ortamı B 500 mL (hazırlayınnon-permisif koşullar altında serum açlıktan hücreleri tr, önceki serum açlık non-permisif koşullar altında (hücreleri büyümek için kültür ortamı A.) bir tarifi FBS ve IFN-y atlayarak bölüm 1.2) bakın,% 10 v ekleyin kültür ortamı B. / h FBS
- Ölü hücrelerin tespit için% 4 paraformaldehid hazır gelen 1x Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) içinde,% 0.4 (h / h) paraformaldehit, pH 7.2 hazırlanır.
Not: Paraformaldehyde toksik ve uygun uyarı kullanımı konusunda dikkatli olunmalıdır.
- Kültür BU.MPT hücreleri
- Sıvı nitrojenden BU.MPT hücrelerin bir şişe çözülme.
Not: BU.MPT büyük fare kontrolü altında SV40 büyük tümör antijeni (TAg) 'in bir sıcaklığa duyarlı (ts) mutasyon (tsA58) taşıyan bir transgenik fare türetilmiş bir fare böbreği proksimal tübül epitel hücre (PTEC) çizgi doku uygunluk kompleksi (MHC) H-2K b class I 25,26 promotör. - Steril polystyr plaka hücreleriene vakum gaz plazma tedavi doku kültürü yemekleri (~ 5 x 10 6 hücre 100 mm çaplı tabak başına).
- Nemlendirilmiş bir% 5 (h / h) CO2 atmosfer izin veren koşullar altında hücrelerin büyütün.
Not: 33, kültür olarak tanımlanır izin veren koşullar, - IFN-y varlığında, 37 ° C, tsA58 mutasyonlu TAg transgenin stabil ifadesini sağlar. hoşgörülü koşullar süresiz pasajlanır edilebilir altında tek bir geçit ya da iki daha fazla hayatta olmayan fare böbrek PTEC primer kültürlerinde, aksine, BU.MPT kültüre.- Bir deneyde kullanmadan önce çözdürme sonrası Passage hücreleri en az üç kez.
- Geçiş hücreleri için, 5 dakika için 37 ° C 'de (h / h) CO2 atmosferi nemlendirilmiş% 5, 100 mm tabak başına% 0.05 tripsin 1 ml ve inkübe edilir. 10 ml orta A. aspire müstakil hücreler ekleyerek tripsin nötralize ve 1 bölmek: Yeni 100 mm steril polistiren vakum gaz plazma tedavi Tiss içine 5: 1 3ue kültür yemekleri. Her 100 mm tabak için 10 mL toplam hacim getirmek için ortam bir ekleyin.
- Bir deneyde kullanmadan önce çözdürme sonrası Passage hücreleri en az üç kez.
- Hücrelerin yanıt deney kullanım için hazırlık olarak, non-permisif koşullar altında nemlendirilmiş bir% 5 birbirine karışacak şekilde hücrelerin (h / h) CO2 atmosferi büyür (yani, IFN-y ve yokluğunda 39 ° C 'de [ortam B,% 10 v ihtiva eden / hac FBS]).
Not: non-permisif koşullar altında, tsA58 mutasyonlu TAg transgenin ekspresyonu>% 95 oranında inhibe edilir ve BU.MPT hücreleri, fare böbreği PTEC primer kültürlerinde gibi davranırlar.
- Sıvı nitrojenden BU.MPT hücrelerin bir şişe çözülme.
Apopitotik BU.MPT Hücreler 2. Hazırlık (Protokol 1)
Not: Bu protokol, apoptoz indüksiyonu yöntemi olarak apoptotik hücrelerin kaynağı ve staurosporin olarak BU.MPT hücreleri için özeldir. Seçenek olarak ise, bir başka hücre hattı veya birincil hücre kültürü, standart Protoco neden olduğu apoptozi ile apoptotik hücre kaynağı olarak kullanılabilmektedirapoptoz indüksiyonu, belirli bir hücre tipi ve yönteme mi.
- 100 mm çapında, steril polistiren vakum gaz plazma muamele edilmiş doku kültürü çanakları üzerine geçtikten sonra, BU.MPT Hücreler, nemli% 5 bir toplak izin veren koşullar altında (h / h) CO2 atmosferi büyümeye (yani kültür ortamı A 37 ° C'de bölüm 1.2.3'de tarif edildiği gibi, 100 mm tabak için 10 mL).
- yapışık hücre tek tabaka durulama için 10 mL kullanılarak kültür ortamı B ile üç kez yıkayın.
- 37 ° C 'de (h / h) CO, nemlendirilmiş% 5, 3 saat boyunca 1 ug / ml, 2 atmosfer staurosporin, seçici olmayan bir protein kinaz inhibitörü ihtiva eden kültür ortamı B hücreleri inkübe edilerek apoptosis.
- tek tabaka müstakil "yüzen" apoptotik hücreler içeren staurosporin içeren orta aspire. Santrifüj 500 xg'de 10 dakika boyunca, bu ortam, süpernatantı atmak pelet kültür ortamı B ile üç kez yıkanır, veBir sonraki adımda, 2,5 toplanan hücrelere geri pelet ekleyin.
- 5 mM (etilendiamintetraasetik asit) 1 x Ca EDTA ilave edilerek adım 2.3 ve 2.4 arasında kalan yapışkan hücreleri ayırmak 2 + - ve Mg, 5 dakika süreyle etiketlenir 1 mL, 2 + içermeyen DPBS. müstakil apoptotik hücreler içeren EDTA içeren ortam aspire ve steril bir 15 ml santrifüj tüpüne polistiren adım 2.4 "yüzen" apoptotik hücreler müstakil hücreleri havuz.
- Ve Mg + 2 yıkama başına içermeyen DPBS - 10 ml 1x Ca + 2 10 500 xg'de dk ve tabanda için apoptotik hücreleri santrifüj yoluyla üç kez yıkayın.
- Son yıkamadan sonra, cevap veren hücreler uyarmak için kullanımdan önce mL başına yaklaşık 5 x 10 6 hücre taze kültür ortamı B apoptotik hücrelerin süspansiyonu. Seçenek olarak ise, 30 dakika boyunca 1 x DPBS% 0.4 (h / h) paraformaldehid yıkandı apoptotik hücrelerin tespit ve kültür ile üç kez yıkamakKültür ortamı B içinde askıya alınmadan önce ortam B,
- Uygun olarak, apoptotik hücrelerin ayrı hazırlanmasını kullanarak sitometrisi (ya da bu amaç için bazı hücreler ayırarak), daha önce tarif edildiği gibi 6,9,10,15, akış apoptosis teyit etmektedir.
Not: erken apoptotik hücre sağlam hücre zarları, ve propidyum iyodür (PI) gibi görünür artı ve anneksin V-pozitif hücreler (canlı hücrelere göre) hücre boyutuna azalmıştır. Mesai apoptotik hücre dışı sağlam hücre zarları, ve PI-pozitif ve anneksin V-pozitif hücreler, hücre boyutu azalmıştır olarak görünür. Geçerli protokolünü kullanarak tipik hazırlıkları ~ 85% erken apoptotik ve ~% 15 geç apoptotik hücreler içerir. - ya doğrudan ya da% 0.4 1x DPBS (h / h) paraformaldehid ile, 30 dakika boyunca apoptotik hücrelerin tespit sonra 1: 1 arasında bir apoptotik-to-yanıtlayıcı hücre oranında, cevap veren hücreler (Protokol 3) BU.MPT apoptotik hücrelerin ekleme .
Not: Apoptotik hücre tespit önceki yanıt uyarılmasına gerekirgözlenen sinyal olayları çözülebilir bir arabulucu (Tablo 1) salınmasına bağlı olmadıkça değil, sonuçları etkileyebilir.
Nekrotik BU.MPT Hücreler 3. Hazırlama (Protokol 2)
Not: Bu protokol, nekroz indüksiyon yöntemi olarak nekrotik hücre kaynağı, ve ısıtma gibi BU.MPT hücreleri için özeldir. Seçenek olarak ise, bir başka hücre hattı veya birincil hücre kültürü, nekroz indüksiyonunun bu özel hücre tipine ve yönteme standart protokollerle neden olduğu nekrozu ile nekrotik hücre kaynağı olarak kullanılabilir.
- 100 mm çapında, steril polistiren vakum gaz plazma muamele edilmiş doku kültürü çanakları üzerine geçtikten sonra, BU.MPT Hücreler, nemli% 5 bir toplak izin veren koşullar altında (h / h) CO2 atmosferi büyümeye (yani kültür ortamı A 37 ° C'de bölüm 1.2.3'de tarif edildiği gibi kap başına 10 mL).
- , Yapışık hücre tek tabaka kültür ortamı B ile üç kez yıkayın kullanarakdurulama için 10 mL.
- Ve Mg + 2, 5 dakika süreyle etiketlenir 1 mL içermeyen DPBS - 1x Ca + 2 5 mM EDTA ilave edilerek hücreler ayırın. Ayrılan hücreler içeren EDTA içeren ortam aspire ve steril bir 15 ml santrifüj tüpüne polistiren hücre süspansiyonu ekleyin.
- Ve Mg + 2, yıkama başına içermeyen DPBS - Ca + 2 10 mL, 10 500 x g'de dakika ve yeniden süspansiyon için hücreler santrifüj ile üç kez yıkayın.
- Son yıkamadan sonra, mL başına yaklaşık 5 x 10 6 hücre taze kültür ortamı B hücreleri askıya.
- yavaşça hücre süspansiyonu her 10 dakika süre ile girdap, bir su banyosu içinde 45 dakika boyunca 70 ° C 'hücreleri ısıtılarak nekroza neden.
- 37 ° C'de (h / h) CO2 atmosferi nemlendirilmiş% 5, 2 saat boyunca inkübe hücreleri. Yavaşça hücre süspansiyonu, her 15 dakikada bir vorteks.
- Uygun olarak, KD ayrı bir hazırlık kullanarak flow sitometri ile nekroz indüksiyon onaylamakcrotic hücreleri (veya bu amaçla bazı hücrelerin ayırarak), daha önce 6,9,10,15 nitelendirdi.
Nekrotik hücreler, hücre zarlar açılmış ve (canlı hücrelere göre) hücre boyut artışı PI-pozitif hücreler olarak görünür: edin. Geçerli protokolünü kullanarak tipik hazırlıkları ≥% 95 nekrotik hücreler içerir. Seçenek olarak ise, nekroz ve membran bütünlüğü kaybı indüksiyonu Tripan mavi boyanması yolu ile teyit edilebilir.
BU.MPT tepki veren hücre 4. hazırlanması (Protokol 3)
Not: Bu protokol, cevap veren hücreler kaynağı olarak BU.MPT hücreleri için özeldir. Seçenek olarak ise, bir başka hücre hattı veya birincil hücre kültürü, cevap veren hücreler olarak da kullanılabilir. Deneysel kullanmadan önce, sessizlik laboratuvar içinde standardize protokoller tarafından bir gecede uyarılan edilebilir.
- bu elde edene kadar ~ çanak başına 10 mL kültür ortamı A izin veren koşullar altında steril 100 mm doku kültürü çanakları içinde BU.MPT hücreleri büyümek% 85 izdiham.
- Aspire kültür ortamı A ve durulama başına 10 mL hücreleri kültür ortamı B ile üç kez yıkayın. Nemli bir% 5 18 ila 24 saat boyunca bir gece boyunca non-permisif koşullar altında (h / h) CO2 atmosferi hücreler serum açlıktan (örneğin çanak başına 10 mL 39 ° C kültürü ortamı b) Bölüm 1.2'de tarif edildiği gibi, 0,4, sırayla sessizliğini ikna etmek. Seçenek olarak ise, FBS'siz gece boyunca kültür ortamı B serum açlık hücreler bir gün önce 39 ° C 'de kültür ortamı B ve% 10 (h / h) FBS hücreleri büyür.
- Her bir deney koşulu için konfluent BU.MPT hücreleri ayrı bir doku kültürü çanağı etiketleyin.
- Resim hücreler, apoptotik hücrelerin ya da nekrotik hücrelerden 30 dakika boyunca kendi maruz kaldıktan sonra, 15 dakika boyunca, ya araç ya da epidermal büyüme faktörü (EGF) ile uygun bir BU.MPT yanıt uyarılmasını, aşağıdaki altı koşulları içerir.
Not: ölü hücrelerin maruz uyarmak veya bir GI aktivite seviyesini önleyen, yaven molekülünü sinyalizasyon. Uyarım en düşük taban üzerinde tespit edilir (örneğin, EGF yokluğu), inhibisyon en yüksek başlangıçtan itibaren tespit edilir ise (örneğin, EGF varlığı). Ölü hücreleri ile uyarma etkisi a priori bilinmeyen olduğu için, ve yokluğunda, EGF varlığında hem de tüm çalışmalar yapılması önerilmektedir.
Apoptotik ve nekrotik hücreler (Protokolün 4) ile Cevapçi hücrelerinin 5. Stimülasyon
- durgun önceden etiketlenmiş yemekler aspire kültür ortamı B (serum hasret) BU.MPT yanıtlayıcı hücreleri (Protokolü 3).
Not: non-permisif koşullar altında gecede kültür, BU.MPT hücreleri, fare böbrek PTEC primer kültürlerinde gibi davranması gerektiğini sonra. - 100 mm tabak başına, aşağıdakilerden biri 2 mL ekleyin: kültür ortamı B (hücre yok); Kültür ortamı B mL başına yaklaşık 5 x 10 6 hücre (Protokol 1) en apoptotik hücre süspansiyonu; ml i başına ya da nekrotik hücre süspansiyonu ~ 5 x 10 6 hücren kültür ortamı B (Protokol 2).
- eşit 100 mm tabak üzerinde ölü hücrelerden 2 ml süspansiyon dağıtmak ve onları minimuma yerleşmek için zaman tutun. Bunu başarmak için, cevaplayıcı hücre yemekleri tüm yüzey üzerinde geniş bir uç pipet ile damla ölü hücre süspansiyonu damla dağıtın. yerleşme zamanı en aza indirilmesi ve ölü hücrelerin topaklanma kaçınarak arasında bir uzlaşma olarak 2 mL hacmi kullanın.
Not: ölü hücre süspansiyonunun kullanımı bir uyarıcı daha ayrıntılı (Tablo 2 ve Tartışma) aşağıda açıklanan özel durumlar, bir dizi gerektirir gibi. - ~ 10 x 10 6 hücre içeren bir birleşik 100 mm tabak e mL başına yaklaşık 5 x 10 6 hücre ölü hücrelerin 2 mL eklenerek 1: ~ 1 bir ölü için yanıtlayıcı hücre oranı elde edin. Seçenek olarak ise, gözlenen herhangi bir sinyal olayını doza bağlılığı tespit etmek için, kült ilerleyici seyreltme ile sürekli cevap veren hücreler ölü oranı değişebilirProtokoller 1 ve 2'de hazırlanan ölü hücre süspansiyonları ure ortam B.
- eşit 100 mm tabak üzerinde ölü hücrelerden 2 ml süspansiyon dağıtmak ve onları minimuma yerleşmek için zaman tutun. Bunu başarmak için, cevaplayıcı hücre yemekleri tüm yüzey üzerinde geniş bir uç pipet ile damla ölü hücre süspansiyonu damla dağıtın. yerleşme zamanı en aza indirilmesi ve ölü hücrelerin topaklanma kaçınarak arasında bir uzlaşma olarak 2 mL hacmi kullanın.
- Yavaşça, nemlendirilmiş% 5 (h / h) CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe yemekler girdap.
- 30 dakika sonra, kültür çanağı ön etiketleme, uygun, araç veya 50 nM EGF ile ya cevap veren hücreler uyarır.
- Nemlendirilmiş bir% 5 (h / h) CO2 atmosferinde 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- , Buz gibi soğuk 1x DPBS 5 ml ekleyerek çanak dönen ve yıkama sıvısı aspire ölü hücreleri yıkayacak. üç kez tekrarlayın.
- Hemen daha sonraki işlemler için buz üzerinde cevaplayıcı hücre yemekleri yerleştirin.
- Hücre lizatları hazırlanması
- Aşağıdakileri içeren hücre liziz tamponu: 1 × Tris tuz (TBS), 10 mM sodyum pirofosfat,% 0.5 w / v deoksikolat / h SDS,% 10 gliserol, ve 25 mM sodyum fluorür% 0.1 tamponlu.
- , Lizis hücre ind verilen kesin sırayla aşağıdaki eklemek hemen öncegili konsantrasyonları: Mini EDTA'sız proteaz inhibitör kokteyli (1 tablet 10 liziz tamponunda mL başına),% 10 (h / h) Triton X-100, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), ve 10 mM sodyum ortovanadat.
- Adım 5.7 buz üzerinde taze uyarılmış cevap veren hücreler 100 mm tabak başına buz gibi soğuk hücre lizis tamponu 700 mcL ekleyin. Bir hücre kazıyıcı ile hücreler Pençe ve 1.5 mL mikrotüpler pre-soğuk lizat aktarın. 15 dakika boyunca buz üzerinde tüpler koruyun.
- 20 Hz, süresi bir saniyeden daha kısa her biri 10 darbeleri ile buz üzerinde sonikasyon lizatları. Bu örnekleri aşırı ısınmasına gibi, gaz / sıvı arayüzünde köpük oluşturma kaçının. Tamamen üzerinde sonikatör açmadan önce lizatları içeren mikrotüpler içine sonikatör probu batırmak ve lizatları probu çıkarmadan önce sonikatör kapatın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj, taze, önceden soğutulmuş mikrotüpler içine süpernatantlar aktarınVe mağaza -70 ° C'de ºC.
- Daha önce tarif edildiği gibi 6,9,10,15, lizatlarının yüzen üzerinde jel elektroforezi ve immunoblotting gerçekleştirin.
- Aşağıdakileri içeren hücre liziz tamponu: 1 × Tris tuz (TBS), 10 mM sodyum pirofosfat,% 0.5 w / v deoksikolat / h SDS,% 10 gliserol, ve 25 mM sodyum fluorür% 0.1 tamponlu.
6. Yarı geçirgen polikarbonat membran kullanılarak Hedefler ve Müdahale arasında doğrudan fiziksel temas önleme (Protokol 5)
- bir istisna dışında, Protokole 3'e göre BU.MPT yanıtlayıcı hücrelerin hazırlayın; steril polistiren doku kültürü içindeki hücreler büyümeye 12 oyuklu küme işlemden geçirildi.
- Seçilen kuyularda, ölü ve cevap veren hücreler arasındaki fiziksel etkileşimi önlemek için 0.4 mikron polikarbonat membran içeren bir geçirgen destek sistemi yerleştirin. Aynı deneyde, bir membran olmayan kontrol kuyuları içerir.
- Serum hasret BU.MPT cevap veren hücreler deneysel kuyulardan aspire kültür ortamı B.
- şu değişiklikler ya apoptotik ya da nekrotik hücre ile tepki veren hücre uyarılması için Protokol 4 uygulayın:
- Oyuk başına 12-oyuklu küme aşağıdakilerden biri 0.1 mL ekleyin: kültür ortamı B (hücre yok); Kültür ortamı B mL başına yaklaşık 5 x 10 6 hücre (Protokol 1) en apoptotik hücre süspansiyonu; ya da nekrotik hücre süspansiyonu kültür ortamı B mL başına yaklaşık 5 x 10 6 hücre (Protokol 2), en.
Not: 12 oyuklu küme konfluent de içerdiğinden ± 0.5 x 10 6 hücre, ~ ölü hücrelerin 0.1 mL ilave ML başına 5 x 10 6 hücre bir ölü için yanıtlayıcı hücre oranı ~ verir 1: 1. - geçirgen destek sistemi içeren kuyulara, geçirgen destek sistemi içinde 0.4 mikron polikarbonat membran üstüne ölü hücreleri eklemek, böylece ölü ve cevap veren hücreler arasında doğrudan bir fiziksel etkileşim vardır.
- Oyuk başına 12-oyuklu küme aşağıdakilerden biri 0.1 mL ekleyin: kültür ortamı B (hücre yok); Kültür ortamı B mL başına yaklaşık 5 x 10 6 hücre (Protokol 1) en apoptotik hücre süspansiyonu; ya da nekrotik hücre süspansiyonu kültür ortamı B mL başına yaklaşık 5 x 10 6 hücre (Protokol 2), en.
Sitokalasin D Fagositoz 7. Önleme (Protokol 6)
- Protokol 3'e göre BU.MPT cevap veren hücreler hazırlayın.
- dimetilpropil olarak iskelet inhibitörü cytochalasin D hazırlayınil sülfoksit 4 mg / mL (1.000 x) (DMSO). BU.MPT tepki veren hücre için önceden işaretlenmiş bulaşık ilave ya da aracın 10 uL (DMSO) veya sitokalasin D 10 uL kültür ortamı B 10 mL 4 ug / mL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için
Not: BU.MPT hücre ve makrofaj hücre hattı ile sitokalasin D, fagositoz Bu konsantrasyonda ≥90% 9,10 ile inhibe edilmiştir. - Nemlendirilmiş bir% 5 (h / h) CO2 atmosferinde 37 ° C 'de 2 saat süre ile inkübe edilir.
- apoptotik ya da nekrotik hücreler ile cevap veren hücreler uyarılması için Protokol 4 izleyin.
- Daha önce tarif edildiği gibi, 9,10, uygun olarak, (bu amaç için ayrılmıştır veya hücre) ve ölü cevap veren hücreler, ayrı bir preparasyonu kullanılarak akış sitometrisi ile ölü hücrelerin fagositozu inhibisyonunu teyit etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de, zamanlama ve kritik apoptotik hücre hazırlanmasında yer alan adımları (Protokol 1) ve nekrotik hücre (Protokol 2) ve apoptotik ve nekrotik hücre süspansiyonları cevap hücrelerinin uyarılmasını (Protokol 4) tasvir eden bir şemadır sağlar.
Şekil 2'de, serin-treonin kinaz glikojen sentaz kinaz-3 (GSK-3), GSK-3α ve GSK-3β, iki izoform fosforilasyonu üzerindeki apoptotik hücrelerin etkisini gösteren temsili sonuçlar sağlar. GSK-3α / β hücresel proliferasyon ve canlılık düzenlenmesinde önemli bir rol, hem de glikoz metabolizmasında çok önemli bir rolü vardır. serin-9 serine-21 ve GSK-3p de GSK-3a fosforilasyonu da, fosforilasyon azalmış ve β-katenin stabilizasyonu sebep olur, kinaz aktivitesini inhibe eder ve. ß-katenindaha sonra, hücre çoğalmasını teşvik etmek ve apoptozu inhibe ettiği bilinen genlerin transkripsiyonunu teşvik çekirdeği, yer değiştirir. GSK-3α / p fosforilasyonunu azalma proliferasyonu ve hayatta kalma ile ilişkilidir azaldı Bu nedenle, GSK-3α / p artan fosforilasyon, artan proliferasyon ve canlılık ile ilişkilidir.
Durgun BU.MPT cevap verenlerin Pozlama GSK-3α / p (Şekil 2A) 30 dakika kuvvetle inhibe bazal fosforilasyonu için hücrelerin apoptotik için. Benzer bir şekilde, 30 dakika süre ile apoptotik hedeflere maruz kalmadan önce güçlü bir sonraki epidermal büyüme faktörü (EGF), GSK-3α / β (Şekil 2A) ile indüklenen fosforilasyonunu inhibe etti. Bunun aksine, nekrotik hücre BU.MPT yanıt maruz GSK-3α / p bazal ya da EGF-indüklediği fosforilasyon ya da üzerinde bir etkisi olmamıştır.
PREVEN içinBU.MPT yanıt veren ve apoptotik hücreler arasında T fiziksel etkileşimi, BU.MPT yanıt geçirgen bir destek sistemi büyütüldü ve 0.4 um polikarbonat membran ile apoptotik hedeflerden ayrıldı. BU.MPT yanıt ve apoptotik hücre arasındaki fiziksel etkileşime önlenmesi GSK-3α / p (Şekil 2B) fosforilasyonunu inhibe etme apoptotik hedeflerin yeteneğini ortadan kaldırmıştır. fagositoz rolünü değerlendirmek için, biz ölü hücrelerden fagositik alımını önlemek için hücre iskeleti inhibitörü cytochalasin D kullanılır. Apoptotik hücre yanıt olarak GSK-3a / p fosforilasyonu inhibisyonu fagositoz yokluğunda (Şekil 2C) oluştu. Biz daha önce kullanılan konsantrasyonda, ≥90% 9,10 ile PTEC ve makrofaj fagositozu inhibe bu cytochalasin D göstermiştir. Birlikte ele alındığında, sonuçlar GSK3α / p fosforilasyonu apoptotik hücre-aracılı inhibisyonu direkt fiziksel etkileşim betwe gerektirdiğini göstermekte hedefler ve cevap veren hücreler, ancak en fagositoz bağımsızdır.
Şekil 1. Hücre Ölümü geçiren Komşu Hücreleri ile Fiziksel Etkileşim tarafından Canlı Yanıtlayıcı Hücreleri İndüksiyon hücre içi Sinyal ve olayları için şema. Çizgi grafikleridir (A) apoptotik (Apo), hücre ve (B) nekrotik (Necro) BU.MPT hücrelerinin hücre süspansiyonları hazırlanmasında zamanlaması ve kritik olaylar tasvir ve canlı BU.MPT yanıtlayıcı (c) 'de uyarım ya apoptotik ya da nekrotik hücre süspansiyonları hücreleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
Şekil 2. Apoptotik Hücreler Maruz ardından BU.MPT Yanıtlayıcı Hücreler GSK3α / ß Fosforilasyonunun engellenmesi Doğrudan Hücre-Hücre Etkileşimi gerektirir ama Fagositoz bağımsız mı. (-), Apoptotik hücrelerin (Apo Serumdan yoksun bırakılmış BU.MPT cevap hücreleri, hücreleri (A, B) araç ya da (C), sitokalasin D (4 ug / ml) ile 2 saat boyunca önceden muamele edilmiş ve daha sonra 30 dakika boyunca uyarıldı ), ölü hücre ya da nekrotik hücre (NEC) 1 hücre oranı müdahaleyi: 1 arasındadır. cevap hücreleri daha sonra hasat öncesi, EGF (50 nM) varlığında ya da yokluğunda bir 15 dakika daha yıkanmış ve kuluçkalanmıştır. Apoptotik hücre kaynağı staurosporin tedavi edilen BU.MPT hücre idi. nekrotik hücre kaynağı ısı ile muamele edilmiş BU.MPT hücre idi. Ölü hücreler ve BU.MPT yanıt arasındaki etkileşim doğrudan sağlayan ya (A, C) engelsiz olduÖlü hücre yanıtlayıcı fiziksel etkileşimi ya da geçirgen bir destek sistemi, bir 0.4 um polikarbonat membran ile ölü hücreleri ve yanıt ayrılması (B). Ölü hücreleri ve yapışmayan karşılık veren hücreler yıkanarak uzaklaştırılmış ve gösterildiği gibi BU.MPT hücre lizatlan anti-phosphorylate GSK3α / β antikorlar ile problanmıştır cevap. Eşit yükleme toplam gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) için problama ile teyit edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Bu mekanizmayı varsayarak olayı sinyal üzerindeki etkisi | |||||||
| müdahale | çözünür arabulucu | Reseptör aracılı tanıma | fagositoz | ||||
| apoptotik hücrelerin tespiti * | Eliminasyon | sebat | sebat | ||||
| apoptotik ve tepki veren hücre fiziksel olarak ayrılması † | sebat | Eliminasyon | Eliminasyon | ||||
| stimulus¶ olarak apoptoza hücrelerinden santrifüje koşullandırılmış ortam | sebat | Eliminasyon | Eliminasyon | ||||
| uyarıcı olarak Nekrotik hücreler | Eliminasyon | Eliminasyon veya zıt yönlü tepki (örneğin, stimülasyon karşı inhibisyon) | sebat | ||||
| uyarıcı olarak lateks boncuk | Eliminasyon | Eliminasyon | sebat | ||||
| fagositoz Farmakolojik engellenmesi | sebat | sebat | Eliminasyon | * Beklenen sonuçlar tespit reseptör aracılı tanıma ve / veya fagositozun sorumlu kritik yüzey belirleyicilerini değiştirmez varsayalım. | |||
| † Öngörülen sonuçlar iki varsayım gerektirecektir: Birincisi, çözünebilir arabulucu herhangi bir kulübe veziküller veya microvesicles, sık olarak adlandırdığı apoptotik cisimler, çok büyük olduğunu, membran gözenekleri apoptotik ayrılması ve hücrelerin yanıt ve ikinci geçmesine kadar küçük olduğunu zarının gözenekleri geçer. veziküller veya microvesicles için bir rol ultra santrifüje klimalı ortamda karşı apoptotik ve cevap veren hücreler fiziksel ayırma ile gözlenen sinyal olaylarda uyum eksikliği önerdiği olacaktır. | |||||||
| ¶, ultra santrifüje (30 dakika boyunca 20,000 x g) bir apoptotik cisimleri çıkarmak veya diğer effe taklit eden çözünmeyen malzemenin tutacak gerekli olanbozulmamış apoptotik hücre cts. | |||||||
Tablo 1. Apoptotik Hücreler Maruz ardından Canlı Hücrelerde Sinyal Olaylar Sorumlu Mekanizması (ler) in tanımlanması. Birkaç basit deneysel stratejiler apoptotik hücrelere maruz kaldıktan sonra olaylar sinyalizasyon sorumlu potansiyel mekanizma (lar) arasında ayrım yapmak gözlenen sağlanır. Bu mekanizmalar, şunları içerir: Fiziksel cevap hücre üzerinde özel reseptörlerin apoptotik hücre etkileşimi, apoptotik hücre çözünür aracıların salınmasını ve cevap hücrenin fagositik makine etkileşimi.
| deneysel konu | Minimizasyonu ve / veya atlatma için kullanılabilir stratejiler |
| Kısıtlı sayıdayanıt hücre başına apoptotik hücrelerin (~ 1: 1 oran). | *: 1. 1. apoptotik hücrelerin sayısını artırın, ancak apoptotik-to-cevaplayıcı hücre oranı <2 tutulmalıdır |
| apoptotik hücrelerin yerçekimi bağımlı çökmesi gerekir. | 1. apoptotik hücreler asılı olduğu ortamın hacmini en aza indirin. |
| 2. Santrifüj çanak veya plaka daha hızlı askıya aracılığıyla apoptotik hücreleri sürücü. | |
| apoptotik hücrelerin eşitsiz mekansal dağılımı. | 1. dikkatlice yanıtlayıcı hücre yemekleri tüm yüzey üzerinde geniş bir uç pipet ile damla apoptotik hücre süspansiyonu damla dağıtın. |
| menisküs etkileri düzensiz dağıtımlar yol açabilir bir çapa <35 mm, 2. kaçının kültür yemekleri veya kuyular. | |
| apoptotik hücre popülasyonunun heterojen. | 1. Güçlü bir indükleyici kullanınapoptosis. |
| 2. indüksiyon sonra, daha homojen bir nüfus elde etmek için akım sitometri sıralama paraformaldehite ile apoptotik hücreleri düzeltmek ve. | |
| * At apoptotik-to-cevaplayıcı hücre oranları> 2: 1, apoptotik hücreler konfluent halı oluşturacak ve ek apoptotik hücreler artık cevap veren hücreler ile doğrudan temas yapacak | |
Tablo 2. Hücre içi sinyal Olaylar bir Stimulus olarak bir hücresel Askıya Kullanımı ile Deneysel sorunlar İlişkili. uyarıcı gibi bir hücre süspansiyonunun kullanımı ile ilişkili çeşitli deneysel engeller listelenmiş yanı sıra kısmen çare stratejilerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada apoptoz veya hücre ölümünün diğer formları uygulanan hücrelere maruz kalma sonra yaşayabilir hücrelerin indüklenen hücre içi sinyal olayları için bir protokol sağlar. protokol apoptotik hücrelere maruz canlı cevap veren hücreler içinde hücre içi sinyal yollarını modüle hangi birden fazla mekanizmalar vurgulamaktadır. Bu mekanizmalar, şunları içerir: bir etkileşim (ölü hücre ya da atkı aralığı veziküller ve microvesicles ilgili moleküller veya yüzey belirleyicilerini köprü ile, genellikle apoptotik organları olarak adlandırılır) yanıtlayıcı hücre özel reseptörlerin; (hatta bunların hücre dışı nesil 27) çözünür mediatörlerin salınması; ve fagositik makine nişan. Önemli fagositoz ortaya çıktığı durumlarda, dikkate alınması gereken ek bir mekanizma apoptotik hücre veya kendi kesecikler 21 içinde zenginleştirilmiş gibi microRNA olarak arabulucuların, teslim olduğunu. o karşılaştırıldığında bizim protokolün önemi,ther metodolojiler, apoptotik hücreler yanıt hücrelerin içinde sinyal iletimini modüle hangi çoklu mekanizmaların onun dikkatli diseksiyon yatıyor. Önemli bir avantajı ise, gerektirdiği tekniklerin en basit ve hücre kültürü standart olmasıdır.
Protokol de öldü ve, hücrelerin kaynağı olarak BU.MPT hücreleri, bir ölümsüzleştirilmiş fare böbreği PTEC hattı, özel olmakla birlikte, diğer hücre hatları veya primer hücre kültürlerine protokol adaptasyonu basit ve kolay uygulanabilir bir. Ayrıca, daha önceki yayınlarda olduğu gibi, ölü, hücrelerin kaynağı mutlaka aynı 9,10,19 olmak zorunda değildir. Bu apoptoz ve nekroz indükleyicileri olarak staurosporin ve ısı kullanımını tarif ederken, sırasıyla modu ve hücre ölümü tetikleyiciler de değişebilir. Apoptotik hücreler maruz kaldıktan sonra BU.MPT yanıt indüklenen sinyal olayları apoptosisin şekli büyük ölçüde bağımsız olarak birlikte, habazı farklılıklar 9,10 gözlenen ettik. Bu nedenle, apoptotik hücre ölümünün çeşitli tetikleyicilerle replike önemli sonuçlar önerilir. Makrofajlar gibi çok fagositik hücreler, yanıt 4,6 olarak kullanılmaktadır, örneğin, yanıt ve ölü hücreleri arasındaki etkileşim süresi önemli fagositoz meydana gelmesi için, daha sonra bir bir toksik-olmayan indükleyici düşünebiliriz yeterince uzun olup olmadığını veya ultraviolet ya da gama ışınlama 4,9,10, toksin potansiyel fagositik teslim ekarte etmek gibi apoptoz. nekroz indüksiyon Alternatif yöntemler de düşünülebilir. Biz ısıtma ve hücrelerin dondurularak çözülme ile aynı sonuçları elde ederken, donma-çözülme ile meydana gelen geniş hücre topaklanma ve enkaz kullanımı sorunlu olun.
Birkaç basit stratejileri apoptotik hücrelerin (Tablo 1 maruz kaldıktan sonra gözlenen herhangi sinyal olaylardan sorumlu belirli mekanizmasını aydınlatmak için yardımcı olabilir Tablo 1'de ayrıntılı olarak, gözlenen sinyal olay üzerindeki etkisi sorumlu mekanizma belirlemekte. Örneğin, apoptotik hücre reseptör aracılı tanınması durumunda, sinyal olayının apoptotik hücre tespit rağmen devam etmelidir, ve koşullu ortam veya lateks boncuk, hem de fiziksel ayırma ile olduğu gibi göre apoptotik hücre değiştirme ile bertaraf edilmelidir ölü ve cevap hücreleri. Nekrotik hücre yanıt olarak, sinyal olayının ortadan kaldırılması gereken ya da ters yönde haline (örneğin, stimülasyon karşı inhibisyon).
can ölü için yanıtlayıcı hücre oranı sınırlı bu birkaç sonuçları vardırbir azalma ya da sinyal olayların örtücü yol açar. uygulanabilir bir yanıtlayıcı hücre ile fiziksel etkileşim için, bir apoptotik hücre ilk orta askıya alınması sütun aracılığıyla yerleşmek gerekir. Hatta az hacimli, hücrelerin çökmesi için zaman sürece 10 ila 20 dakika, kayda değer olabilir. Hücre içi sinyal olaylar böylece yanıt hücreler arasındaki koordinasyonsuzluk edilecektir. Bu nedenle, cevap ve ölü hücreler arasındaki ilk temas hassas biçimde zamanlanmış edilemez, aksine kez biraz geniş bir aralık içinde kalmaktadır. yerleşim için gerekli olandan daha kısa bir zaman ölçeği üzerinde meydana gelen sinyal olaylarının için, senkronizasyon bu eksikliği artık arka ayırt olduğu şekilde sinyalinin bir örtücü yol açabilir. genişletilmiş süre bile sinyalleri değil yeterli büyüklükte ise, bu konuda duyarlı olabilir.
Bu zamansal sorunlara ek olarak, uzamsal hususlar da olumsuz sonuçları etkileyebilir. Menisküs özellikle kuyularda etkileri ve s yemeklerialışveriş merkezi çapı ve böylece hücreler cevaplayıcı arasında bayram veya kıtlık bir devlet oluşturma, veya ölü hücrelerin homojen olmayan bir dağılım yol açabilir çok güçlü pipetleme tarafından üretilen sıvı akımları (örneğin, polistiren doku kültürü 96-kuyusu kümeleri tedavi). ölçülen sinyal, tek bir oyuk ya da plaka tüm cevap hücrelerinkinden elde için, ölü hücreleri yakalama değişim zayıf sinyalleri gizleyebilir.
Son bir konu apoptotik hücre popülasyonunun heterojen ilgilidir. Hatta böyle staurosporine olarak apoptoz güçlü bir tetikleyici ile, ölü hücrelerden herhangi hazırlık ölüm sürecinin çeşitli aşamaları hücreleri içerir. Apoptotik hücre tepkisinin gücü ölüm süreci 10,14 içindeki sahnede bağlıdır Bu, ilgili olur. Ortalama olarak, her yanıt hücresi sadece bir apoptotik hücre karşılaştığında için, bu durumda heterojenlik genel algılanan sinyal olayının zayıflamasına yol açabilir. Tablo 2
benzersiz bir uyarıcı olarak ölü hücrelerin kullanımı ile ilgili birçok deney endişeler bulunmaktadır. Önemli bir şekilde, kültür koşulları, hücrelerin, aynı zamanda ölü hücrelerin kendileri, sadece etkileyebilir. Örneğin, serum proteinleri, mevcut olduğu takdirde, ölü hücre yüzeyine bağlanır ve geliştirmek veya hücreleri yanıt tarafından tanınmasını önleyebilir. tutarsız sonuçlar giderme ya da bir sonuç literatürde bildirilen anlamlı şekilde farklı olarak, dikkat (yanıtlayıcı ve ölü hücreleri için) aşağıdaki kültür koşulları verilmelidir: izdiham, kanal adedi, serum mevcudiyetinde serum ısı inaktivasyonu derecesini ve doğa ve sükunet süresi. Son olarak, bir hücre ölümü tüm hücre kültürünün bir amansız bir yönü olduğunu farkında olması gerekir ve yanıtlayan hücreleri bu nedenle sürekli olarak ölü bir düşük seviyede maruzHücreler. Çalışmanın altında çok sinyaller sürekli uyarılan ediliyor çünkü bu poz potansiyel ölü hücrelerden bolus deneysel cevabı etkileyebilir. Sinyal modülasyonu kaynaklı sinyalizasyon olaylar hayatta kalma ya da çoğalmasını içeren, özellikle normal bir geribildirim yollar aracılığıyla, hatta cevap veren hücreler bir alt popülasyonun seçim yoluyla ortaya çıkabilir.
Özet olarak, bitişik ölü veya ölmekte olan hücre fiziksel etkileşimi ile canlı hücrelerde uyarılan hücre içi sinyal olaylarının tayini için bir protokol tanımlanmıştır. Odak Ölü hücrelerin reseptör-aracılı tanınması ile indüklenen sinyal olaylarını ağırlıklı olmasına rağmen, protokol, fagositik alımı veya ölü hücrelerden çözünür aracıların serbest bırakılması ile oluşturulan sinyal olaylarının tanımlanmasına izin verir. Bir uyarıcı olarak ölü hücrelerin kullanımı hücre içi sinyal olayları algılama engelleyebilir birçok benzersiz faktörler tanıtır. Bu u Farkındalıknique faktörler yanı sıra, ölü hücreler, hücre içi sinyallemesini modüle olan çoklu mekanizmalar, çalışmanın bu artan alanında deneylerin tasarımı ve yorumlanması için çok önemlidir. Burada açıklanan protokol ölü veya ölmekte hücreler sağlık ve hastalık hem de onların canlı komşularını etkileyen hangi mekanizma ile anlamada yardımcı olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
