Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحديد موثوق المعيشة الدوبامين الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الثقافات عن طريق RNA تسلسل وTH يحركها المروج EGFP التعبير

Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/54981
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Summary

في مرض باركنسون (PD)، المادة السوداء (SNC) الخلايا العصبية الدوبامين تتحول، مما يؤدي إلى خلل وظيفي السيارات. نحن هنا نورد بروتوكول لزراعة الخلايا العصبية الدماغ المتوسط ​​بطني من ماوس معربا عن EGFP يقودها تسلسل المروج هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، حصاد الخلايا العصبية الفلورسنت الفردية من الثقافات، وقياس Transcriptome على الخاصة بهم باستخدام الحمض النووي الريبي يليها.

Abstract

في مرض باركنسون (PD) هناك فقدان الخلايا العصبية على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ مع انحطاط وضوحا من الخلايا العصبية الدوبامين في المجلس الوطني السوري، مما يؤدي إلى بطء الحركة، وصلابة، والزلزال. تحديد يعيشون الخلايا العصبية الدوبامين في الثقافات الأولية بطني الدماغ المتوسط ​​(VM) باستخدام علامة فلوري يوفر وسيلة بديلة لدراسة الضعف الانتقائي لهذه الخلايا العصبية دون الاعتماد على المناعية للخلايا ثابتة. هنا، نحن عزل، فصل، والثقافة الماوس VM الخلايا العصبية لمدة 3 أسابيع. ثم نحدد الخلايا العصبية الدوبامين في الثقافات باستخدام EGFP مضان (يقودها المروج هيدروكسيلاز التيروزين (TH)). ويتم حصاد الخلايا العصبية الفردية في أنابيب microcentrifuge باستخدام بال micropipettes الزجاج. المقبل، ونحن ليز الخلايا تحصد، وإجراء توليف [كدنا وبوساطة ينقول "tagmentation" لإنتاج خلية واحدة-RNA يليها مكتبات 1، 2،الحمار = "XREF"> 3، 4، 5. بعد اجتياز فحص لمراقبة الجودة، والتسلسل المكتبات وحيدة الخلية ويتم تحليلها لاحقا إلى قياس التعبير الجيني. نفيدكم النتائج Transcriptome على لالدوبامين الفردية والخلايا العصبية GABAergic معزولة عن الثقافات الدماغ المتوسط. نفيدكم أن 100٪ من خلايا TH-EGFP الحية التي تم حصادها والتسلسل كانت الخلايا العصبية الدوبامين. وهذه التقنيات لها تطبيقات واسعة في علم الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئي.

Introduction

مرض باركنسون (PD) هو، اضطراب الاعصاب عضال المرتبطة بالعمر. سبب هذا الاضطراب شائع نسبيا لا تزال غير مفهومة. هناك خسارة واسعة النطاق العصبية في جميع أنحاء الدماغ، مع انحطاط الخلايا العصبية وضوحا من الخلايا العصبية الدوبامين في المادة السوداء (SNC)، مما يؤدي إلى مظاهر سريرية التشخيص من بطء الحركة والجمود والهزة.

الثقافات المختلطة الابتدائية التي تحتوي على SNC الخلايا العصبية الدوبامين هي ذات الصلة وخاصة لمرض الشلل الرعاش. قد تورطت بطني السقيفية المنطقة (VTA) الخلايا العصبية الدوبامين في الثواب والإدمان. بطني الدماغ المتوسط ​​(VM) الابتدائية الثقافات الجنينية مختلطة تحتوي على كل SNC وVTA الدوبامين (DA) الخلايا العصبية والخلايا العصبية GABAergic. يمكن VM الثقافات الأولية أن تكون مفيدة لفحوصات العصبية ولإلقاء الضوء على ضعف انتقائي من الخلايا العصبية الدوبامين. لا توجد وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد الخلايا الدوبامين في ثقافة تقوم على التشكل. هوإعادة نطور تقنيات لتحديد وحصاد الخلايا العصبية الدوبامين واحدة، وبناء وحيدة الخلية، وارتفاع العائد المكتبات RNA التسلسل.

نحن إبلاغ بيانات الحمض النووي الريبي Transcriptome على تمثيلية للالدوبامين واحد والخلايا العصبية GABAergic معزولة عن الثقافات الدماغ المتوسط. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لالعصبية، التنكس العصبي، والمقايسات الدوائية لدراسة آثار العلاجات المختلفة على Transcriptome على DA / GABA. لأن الخلايا العصبية الدوبامين تمثل أقلية صغيرة من الخلايا العصبية التي أعرب عنها في الثقافات VM الأولية، فإن القدرة على تحديد موثوق هذه الخلايا العصبية في الثقافات التي تعيش تمكين مجموعة محسنة من الدراسات وحيدة الخلية. وهذه التقنيات الجديدة تسهيل التقدم في فهم الآليات التي تجري على المستوى الخلوي، ويمكن أن تكون لها تطبيقات في أماكن أخرى في مجالات علم الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية واستخدام الحيوانات التي تقدمها المعاهد الوطنية للصحة، وبروتوكولات تمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا.

1. اشتقاق الثقافات الخلية الأولية الدوبامين من المخ الجنينية الماوس

  1. حلول والثقافة المتوسطة
    1. إعداد حمض الأسكوربيك محلول المخزون
      1. تزن من 352 ملغ من حامض الاسكوربيك. إضافة H 2 O معقمة إلى الحجم الكلي النهائي من 20 مل. مكان في 37 ° C حمام الماء لإذابة. من خلال تصفية 0.2 ميكرون طرف الحقنة وتخزينها في 500 مكل في -20 درجة مئوية.
    2. إعداد غراء محلول المخزون
      1. تمييع غراء إلى 15 وحدة / مل في 1X حل الملح Hanks' متوازن (HBSS). ماصة صعودا وهبوطا 5 مرات لتخلط جيدا. إعداد يوم تشريح.
    3. إعداد الدناز محلول المخزون
      1. تزن من 20 ملغ من الدناز. إضافة H 2 O معقمة إلى الحجم النهائي الكلي من 20 مل. تصفية العقيمة مع 0.2 ميكرون فلتر حقنة طرف. مخزن في -20 درجة مئوية في 1 مليلتر مأخوذة.
    4. إعداد وقف الحل
      1. تمييع 5 مل المانحة مصل الحصان الخيول إلى 10٪ في 45 مل 1X HBSS. تصفية العقيمة مع 0.2 ميكرون فلتر حقنة طرف. تخزينها في 4 درجات مئوية.
    5. إعداد 4٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) حل سهم
      1. تزن من 2 غرام من جيش صرب البوسنة وإضافة مخزنة الفوسفات 1X المالحة (PBS) إلى الحجم النهائي ما مجموعه 45 مل. فلتر تعقيم مع 0.2 ميكرون فلتر حقنة طرف. تخزينها في 4 درجات مئوية.
    6. إعداد تصفيح المتوسطة
      1. في 494 مل المتوسطة، إضافة 1.25 مل سائل الإعلام والثقافة الذي يحتوي L-ألانيل-L-الجلوتامين (مصدر استقرت من L-الجلوتامين) و 5 مل من الجهات المانحة مصل الخيول. فلتر تعقيم مع 0.2 ميكرون حقنة سن الفيلثالثا طرف. تخزينها في 4 درجات مئوية.
    7. إعداد خلية ثقافة المتوسط
      1. في 196 مل طلاء المتوسطة، إضافة 4 مل B27 و 200 ميكرولتر حمض الاسكوربيك. فلتر تعقيم مع 0.2 ميكرون فلتر. تخزين الحل في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون اسبوع.
    8. إعداد 4٪ لامتصاص العرق (PFA) الحل
      تحذير: الاحتياطات العامة لاستخدام امتصاص العرق هي كما يلي: استخدام غطاء الدخان، وتجنب الجلد والعين الاتصال، وتجنب استنشاق البخار، والابتعاد عن الحرارة أو اللهب المكشوف. ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة. PFA يمكن أن تسبب حساسية والتهاب الجلد، وبالتالي غسل اليدين جيدا بعد التعامل مع.
      1. إضافة 10 مل من 16٪ PFA إلى 30 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4.
    9. إعداد 0.1٪ تريتون X-100
      1. ماصة 1 مل تريتون X-100 إلى 9 مل برنامج تلفزيوني 1X لجعل حل 10٪. ماصة ببطء للسماح حل لزجة لملء ماصة. دافئة في 37 ° C حمام الماء لديسحل. تخزين المخزون بنسبة 10٪ في 4 درجات مئوية.
      2. تمييع الأسهم 10٪ إلى 0.01٪ (على سبيل المثال، عن طريق أداء 2 مسلسل 1:10 التخفيفات: تمييع 1 مل من 10٪ الحل في 9 مل برنامج تلفزيوني 1X لجعل الحل 1٪، 1 مل من محلول 1٪ إلى 9 مل برنامج تلفزيوني 1X لجعل حل 0.1٪).
    10. إعداد 10٪ و 1٪ المصل حمار
      1. إضافة 1 مل من مصل حمار إلى 9 مل من برنامج تلفزيوني 1X لحل 10٪. إضافة 0.5 مل من مصل حمار إلى 49.5 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4 لمحلول 1٪.
    11. إعداد برنامج تلفزيوني 1X
      1. تمييع 10X برنامج تلفزيوني ل1x أخرى بإضافة 50 مل إلى 450 مل من H 2 O. ضبط درجة الحموضة من الحل لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام مقياس درجة الحموضة.
  2. طلاء أطباق الثقافة
    1. بولي-L-الأورنيثين طلاء
      1. معطف فقط 10 مم أسفل القطر الزجاج في مركز كل الأطباق مم ال 35 مع 120 ميكرولتر بولي-L-الأورنيثين باستخدام تقنية معقمة. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدام الشافطة فراغ لنضح بولي لوrnithine. شطف الأطباق مرتين مع H 2 O. معقم
    2. Laminin طلاء (تركيز الأسهم من 1 ملغ / مل)
      1. تمييع 20 ميكرولتر laminin مع 2 مل من H 2 O معقمة (نهائي تركيز 0.01 ملغ / مل).
      2. معطف فقط 10 مم أسفل القطر الزجاج في مركز كل الأطباق مع 120 ميكرولتر من laminin المخفف إلى 0.01 ملغ / مل باستخدام تقنية معقمة، واحتضان لمدة 1 ساعة أو O / N عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. الماوس تشريح
    ملاحظة: تم تصميم الطرق في هذه تشريح للتعرض الحد الأدنى من الخلايا، حيث يتم نقلهم من الحويصلات الجنينية إلى حاضنة الثقافة. هو الحفاظ على بقاء الخلايا عن طريق إزالة جزء فقط من الدماغ لتشريح الدماغ المتوسط. العزلة من عائدات المخ الأوسط بسرعة أكبر دون الحاجة لتشريح الدماغ بأكمله للوصول إلى المنطقة. انظر جدول المواد للسلالة الماوس المستخدمة في هذه الدراسة. الموت ببطء ماوس حاملا توقيتها على الحمل 14 يوما باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2.
  4. رش البطن من الماوس الموت الرحيم مع 70٪ من الإيثانول. فهم جلد البطن باستخدام ملقط مع 2 × 3 الأسنان وفتح تجويف البطن باستخدام مقص جراحي شفرة حادة. جعل اثنين من التخفيضات تتحرك أفقيا وقريب من كل جانب. أضعاف خلال جدار البطن باستخدام ملقط لفضح تجويف البطن.
    ملاحظة: يتم الآن تتعرض الرحم. كشف التجويف الجنبي وإنشاء استرواح الصدر يضمن أيضا أن هذا الحيوان لا تسترد.
  5. قطع طرفي قرن الرحم لفصل الرحم. ضع في طبق بيتري في غطاء العقيمة.
  6. باستخدام ملقط مستقيم الحافة في كل يد فتح كيس الجنين وإزالة الجنين. قطع رأس بسرعة عن طريق معسر قبالة رأس في الرقبة مع ملقط. استقرار الرأس مع ملقط صبت على خطم بحيث السطح الظهري يمكن الوصول إليه.
  7. باستخدام ملقط الذي عقد في هكتار أخرىالثانية، قرصة طبقة من الجلد والجمجمة قبل التلال من الدماغ المتوسط. قشر العودة الجلد والجمجمة caudally على طول خط الوسط. وضع ملقط حول التلال مع طرف واحد بين اللحاء والدماغ المتوسط ​​والآخر على المخيخ.
  8. قرصة وإزالة المخ الأوسط بأكمله، تاركا وراءه الدماغ الأمامي على الجانب منقاري والمخيخ على الجانب الذيلية. ضع في طبق بيتري مع HBSS الباردة تحت المجهر تشريح.
  9. كرر الإجراء الأجنة المتبقية.
  10. تحت المجهر تشريح، والوجه على جزء الدماغ بحيث الجانب البطني يمكن الوصول إليه الآن. هناك الآن 4 الأرباع مرئية. إزالة كافة السحايا والأوعية الدموية عن طريق الامساك بلطف السحايا وسحب صعودا بعيدا عن الدماغ.
  11. استخدام ملقط لتحقيق الاستقرار في هذا الجزء في الدماغ بينما كانت تفصل بين الدماغ المتوسط. وضع تونغ واحد من ملقط في البطين تقريبا في وسط القطاع. جعل أول ظهريا قرصة، لافتا طn لالطبق، ثم إعلامي على كل جانب. خذ السفليين الأرباع بجعل التخفيضات الجانبية على كلا الجانبين.
    ملاحظة: الأنسجة من الاهتمام في المقطع أدنى بطني، والذي يظهر كثيفة. وتحتوي هذه المنطقة على حد سواء VTA والمجلس الوطني السوري.
  12. تقليم والتخلص من الأنسجة التي هي أقل كثافة: وهذا يشمل أكيمات الأعلى والأدنى. ضع تشريح الأنسجة التي تحتوي على كل من VTA وSNC في HBSS جديدة على منطقة منفصلة للطبق بيتري.
    ملاحظة: في هذه المرحلة من تطور مخ الفأر (E14)، يتم فصل المنطقة من اهتمام في الدماغ المتوسط ​​بطني من البطين من incerta زونا وغيرها من الجماعات خلية المهاد. هيكل أكثر ممدود من تطوير دماغ الفأر الجنينية يسمح للتمييز بين هذه المناطق، والتي تقع أقرب معا في دماغ الفأر الكبار.
  13. أكرر لجميع شرائح الدماغ المتبقية.
  14. بعد أن تم تشريح جميع شرائح الدماغ، واستخدام الملقط ومشرط رقم 11 لعصام الربعقسم الدماغ المتوسط ​​CH رأي إلى قطع متساوية الحجم تقريبا.
  • عدم الربط بين الخلايا
    1. الأنزيمية علاج الخلايا
      1. استخدام على نطاق تتحمل P1000 ماصة للسيطرة على كل شرائح الدماغ المتوسط ​​إيواؤهم في HBSS ووضعها في أنبوب مخروطي 15 مل. السماح للشرائح تترسب في قاع الأنبوب وإزالة HBSS التي تم تناولها مع القطع إيواؤهم.
      2. إضافة 500 ميكرولتر من محلول غراء للأنبوب والمكان الى 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 15 دقيقة. Resuspend الخلايا بواسطة الإصبع عبها الأنبوب بعد 7.5 دقيقة.
      3. استخدام على نطاق تتحمل P1000 طرف، ماصة فقط شرائح الدماغ المتوسط ​​إلى قسامة 1 مل من ديوكسي ريبونيوكلياز الأول (الدناز) حل. السماح للشرائح لتستقر في قاع الأنبوب.
      4. استخدام على نطاق تتحمل P1000 طرف، ونقل فقط شرائح المخ الأوسط إلى أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من محلول توقف البارد لشطف. السماح للشرائح تترسب في قاع الأنبوب، وتكرار شطف علىم أكثر من ذلك.
    2. سحن الميكانيكية تعليق خلية
      1. استبدال شطف الماضي مع 1 مل من محلول توقف الطازجة وماصة صعودا وهبوطا 7X مع طرف P1000 ماصة لليسحن الخلايا. تجنب الإفراط في سحن لتقليل تحلل الخلية.
      2. الأساس الذي تقوم عليه تعليق الخلية بواسطة pipetting ببطء 200 ميكرولتر من 4٪ حل جيش صرب البوسنة في الجزء السفلي من الأنبوب. سحب بعناية غيض ماصة لتجنب تعطيل طبقة تعليق خلية. بعد الطرد المركزي في 280 x ج لمدة 6 دقائق، ونضح طاف مع P1000 و resuspend الخلايا في 1 مل من الطلاء المتوسطة.
  • العد وطلاء الخلايا
    1. أداء عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تمييع تعليق خلية إلى 1000 خلية / ميكرولتر، مع طلاء المتوسطة.
    2. باستخدام الشافطة فراغ، نضح laminin من الأطباق المغلفة، على دفعات على الأكثر ثلاثة أطباق. لوحة 120 ميكرولتر (1.2 × 10 5 خلية / طبق (78.5 مم 2
    3. بعد 1 ساعة، إضافة بعناية 3 مل من مستنبت إلى منطقة غير المصنف من الطبق الثقافة للحد من تعطيل الخلايا.
    4. أداء نصف إلى تغيير المتوسطة كاملة على أطباق زراعة الخلايا في 3 فترات د لمدة 3 أسابيع.

    • الخلايا العصبية 2. حصاد مثقف-الدوبامين لتسلسل الحمض النووي الريبي

    يتم إعطاء لمحة عامة عن بروتوكول حصاد الخلايا وحيدة الخلية الحمض النووي الريبي التسلسل في الشكل رقم 1: ملاحظة.

    1. خطوات إلى تنفيذ قبل يوم من التجربة
      1. نظيف البورسليكات الزجاج الأنابيب الشعرية التي كتبها sonicating في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة، ثم مرة أخرى في H المقطر 2 O لمدة 15 دقيقة. استنزاف الأنابيب والخبز بين عشية وضحاها في الفرن على حرارة 200 درجة مئوية لتعطيل ريبونوكلياز.
      2. استخدام افتتح حديثانصائح ماصة ريبونوكلياز خالية لإعداد محلول المخزون من 10X العازلة رد فعل عن طريق خلط 19 ميكرولتر من 10X العازلة تحلل من عدة التسلسل مع 1 ميكرولتر من حل ريبونوكلياز المانع (20 ميكرولتر اجمالى حجم) في أنبوب microcentrifuge. تدور باستمرار الخليط باستخدام جهاز للطرد المركزي لفترة وجيزة الصغيرة والحفاظ على الجليد.
      3. إضافة 2 ميكرولتر من العازلة 10X رد فعل على كل من الفرد 0.2 مل أنابيب PCR (التي تستخدم لجمع الخلايا العصبية التي تحصد). تسمية أنابيب مع به مناسبة تحديد الخلايا العصبية للحصاد وتخزين جمدت في 4 درجات مئوية.
    2. خطوات إلى تنفيذ يوم للتجربة
      1. تلفيق الماصات حصاد.
        1. سحب بال micropipettes قطرها غيض كبير (2-8 ميكرون) من أنابيب الشعرية خبز باستخدام مجتذب مسرى مكروي والمغلفة الزجاج التدفئة خيوط من microforge. تعيين مجتذب لتشكيل بال micropipettes مع تفتق طويل. استخدام microforge مجهزة graticule العدسة معايرة والمكشوف عالية الطاقةjective لكسر غيض من micropipette إلى حجم غيض المطلوب (10-20 ميكرون).
        2. ربط micropipette في حامل ماصة microforge وجبل حامل على microforge. جلب غيض من micropipette في التركيز فوق التدفئة خيوط الزجاج المطلي باستخدام مناور الميكانيكية للmicroforge والتبديل على النظام الحالي إلى خيوط لتسخين ذلك. لمس طرف ماصة للخيوط ساخنة. إيقاف التيار عند طرف ماصة قد ذاب إلى القطر المناسب.
          ملحوظة. سوف بقطع التيار تسبب خيوط للتحرك فجأة الهبوط وفصل من طرف ماصة، مما ينتج عنه، ماصة كبيرة مفتوحة ذات الرؤوس مع القطر المطلوب.
        3. تخزين بال micropipettes الانتهاء منها في صندوق مغلق لحين الحاجة إليها.
      2. حصاد الخلايا العصبية.
        ملحوظة. وكان حصاد الخلايا العصبية مثقف التالية نسخة معدلة من بروتوكول نشرت سابقا 6.
        1. البنود بدقةEAN جميع الأسطح من الغرفة خلية الحاصدات التي تتلامس مع الأطباق الثقافات وأنابيب جمع باستخدام مطهر السائل والماء تليها شطف المياه. مسح أسفل الأسطح تطهيرها مع الايثانول 80٪ وبعد ذلك ريبونوكلياز المانع التي غرست مسح.
        2. ملء حاويتين معزول مع الثلج، واحدة مع (الماء) الجليد العادي وآخر مع الثلج الجاف. ضع 0.2 أنابيب جمع مل PCR شغل سابقا مع 2 ميكرولتر من 10X العازلة رد فعل على الجليد منتظم.
        3. إزالة الطبق الثقافة التي تحتوي على الخلايا العصبية من الحاضنة، واستنزاف مستنبت من الطبق، وشطف مع 2 مل من برنامج تلفزيوني ريبونوكلياز خالية Dulbecco و(DPBS) واستبدالها مع 1 مل من DPBS للحصاد.
        4. تحديد الفلورسنت، والخلايا العصبية TH-إيجابية في ثقافات الدماغ المتوسط ​​الأولية باستخدام مقلوب، epifluorescence المجهر مجهزة الهدف 40X المرحلة، مصباح الزئبق، ومجموعة مرشح GFP.
        5. ضع ماصة على سوما الخلية باستخدام ميل الآلية أو اليدويةcromanipulator. نضح الخلايا العصبية في micropipette الزجاج باستخدام الشفط لطيف تطبيقها عن طريق الفم من خلال أنابيب بلاستيكية تعلق على ميناء جانب صاحب micropipette. على الفور إزالة micropipette يحتوي على الخلية من حل الاستحمام.
        6. مكان غيض ماصة داخل تحتوي على رد فعل العازلة 0.2 مل PCR جمع أنبوب، وكسر طرف ضد الجانب من الأنبوب، بالقرب من القاع. طرد السوائل المتبقية (0،5-1،5 ميكرولتر) من طرف مكسور من micropipette من خلال وضع العقيمة 21 G إبرة حقنة في الظهر من micropipette وتطبيق الخارج الضغط.
        7. أجهزة الطرد المركزي أنبوب جمع لمدة 5 ق باستخدام سطح المكتب الصغيرة الطرد المركزي وتجميده في الثلج الجاف. تخزين أنابيب جمع تحتوي على الخلايا وحيدة في -80 درجة مئوية. عادة، يتم حصاد 5 خلايا في طبق على مدى الفترة من 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة.

    3. وحيد الخلية RNA تسلسل الجيل المكتبة

      <لى> الجيل من [كدنا حبلا الأول
      ملاحظة: للحصول على الخطوات التالية تستخدم الكواشف من عدة التسلسل التجارية.
      1. جلب الكواشف التالية على الجليد لمجلس الوزراء PCR. إعداد أول مزيج حبلا رئيسية بالإضافة إلى 10٪ من خلال الجمع بين الكواشف التالية في درجة حرارة الغرفة في خزانة PCR: 2 ميكرولتر 5X عازلة الأول حبلا، 0.25 ميكرولتر DTT (100 ملم)، مزيج 1 ميكرولتر dNTP (10 ملم)، 1 ميكرولتر النوكليوتيد ( 12 ميكرومتر)، 0.25 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، و 1 ميكرولتر عكس الناسخ (100 وحدة). هذا هو عكس مزيج الناسخ الرئيسي (5.5 ميكرولتر اجمالى حجم في رد الفعل).
      2. أخذ عينات من -80 C على الثلج الجاف وتقديمهم إلى مجلس الوزراء PCR. إضافة ما يلي إلى عينة خلية واحدة: 1 ميكرولتر 3 'التمهيدي 1 و 1 ميكرولتر كميا طفرات الحمض النووي الريبي. جلب عينات على كتلة مبرد لالساخنة غطاء thermocycler مسبقا عند 72 درجة مئوية.
      3. احتضان الأنابيب في thermocycler لمدة 3 دقائق في 72 درجة مئوية، ومن ثم وضع العينات على PCR رف برودة.إضافة 5.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي (من الخطوة 3.1.1) إلى كل أنبوب تفاعل ومزيج من قبل pipetting بلطف. تدور 0.2 أنابيب ميكرولتر لمدة 5 ق واحتضان في thermocycler على النحو التالي: 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، و 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية.
    1. تنقية أسهب ستراند الأولى كدنا].
      ملاحظة: يتم تنقيته وكدنا] تضخيم PCR عن طريق تجميد على حبات مغناطيسية. استخدام جهاز الفصل المغناطيسي 0.2 مل أنابيب.
      1. قسامة حبات مغناطيسية إلى 1.5 مل أنابيب. قبل كل استعمال، وجلب قسامات حبة لدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل وتخلط جيدا لتفريق. حبات مغناطيسية دوامة حتى تمتزج بشكل متساو.
      2. إضافة 25 ميكرولتر من حبات مغناطيسية لكل عينة. مزيج من قبل pipetting كامل حجم صعودا وهبوطا 10X على الأقل لتخلط جيدا. في احتضان RT لمدة 8 دقائق للسماح للربط كدنا] إلى الخرز.
    2. إعداد PCR ميكس ماستر
      1. تحضير مزيج الرئيسي DS-كدنا] تضخيم PCR لجميع التفاعلات مع المضافاتIONAL 10٪ عن طريق خلط عازلة 5 ميكرولتر 10X PCR، مزيج dNTP 2 ميكرولتر (10 ملم)، 2 ميكرولتر PCR التمهيدي 2 (12 ميكرومتر)، 2 ميكرولتر 50X مزيج 2 البلمرة، و 39 ميكرولتر المياه nuclease خالية من (50 ميكرولتر اجمالى حجم / رد فعل).
    3. التضخيم من ستراند الأولى
      1. وضع العينات وحبات مغناطيسية على الفصل المغناطيسي جهاز ≥5 دقيقة، حتى يظهر سائل واضحة تماما، وليس هناك أي الخرز تركت في طاف.
      2. حفظ العينات على الجهاز الانفصال، ماصة طاف وتجاهل. تدور العينات لمدة 5 ثوان لجمع السائل من جانب الأنبوب. وضع العينات في جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 30 ثانية، ثم قم بإزالة كافة طاف المتبقية مع pipettor P10.
      3. إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الرئيسي PCR إلى كل DNA الأنبوب الذي يحتوي منضمة إلى حبات من الخطوة السابقة. وضع أنبوب في cycler الحرارية محمى (95 درجة مئوية) مع غطاء ساخنة. بدء الدراجات الحرارية باستخدام البرامج التالية:م: 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 26 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 68 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. ثم 72 درجة مئوية مدة 10 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: راجع دليل المستخدم التسلسل لمزيد من التفاصيل وتحسين إعدادات العينة.
    4. تنقية كدنا] الذين تقطعت بهم السبل انقر نقرا مزدوجا أسهب
      1. إضافة 90 ميكرولتر من الخرز على كل عينة. مزيج من قبل pipetting كامل حجم صعودا وهبوطا 10X على الأقل لتخلط جيدا. في احتضان RT لمدة 8 دقائق للسماح للربط كدنا] إلى الخرز. وضع العينات بالإضافة إلى الخرز على جهاز الفصل المغناطيسي لل≥5 دقيقة، حتى يظهر سائل واضحة تماما، وليس هناك أي الخرز تركت في طاف.
      2. في حين أن العينات على جهاز الفصل المغناطيسي، وإزالة طاف وتجاهل. الحفاظ على عينات على جهاز الفصل المغناطيسي. إضافة 140 ميكرولتر من تقدم طازجة 85٪ من الإيثانول لكل عينة من دون إزعاج الخرز. انتظر لمدة 30 ثانية. ماصة قبالة طاف. ستبقى كدنا] ملزمة لمكتب التحقيقات الفرنسىس أثناء عملية الغسيل.
      3. تكرار غسل الإيثانول مرة أخرى.
      4. باختصار تدور العينات لجمع السائل من جانب الأنبوب. وضع العينات في جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 30 ثانية، ثم قم بإزالة كافة الإيثانول المتبقية مع ماصة. وضع العينات في درجة حرارة الغرفة ل2-2،5 دقيقة حتى بيليه هو جاف ولم يعد لامعة (أي قبل ظهور صدع).
        ملاحظة: تجفيف بيليه فقط حتى انها مجرد الجاف. سوف بيليه تبدو غير لامع مع عدم وجود أشعة الشمس. إذا كان بيليه ليست جافة، ستبقى الإيثانول في الآبار عينة، والتي سوف تقلل من معدل الاسترداد كدنا] تضخيم والعائد. إذا كان بيليه هو أكثر الجافة، سيكون هناك تصدعات في بيليه. وسوف يستغرق وقتا أطول من 2 دقيقة لترطيب وقد يقلل من الانتعاش كدنا] تضخيم والعائد.
      5. مرة واحدة حبات جافة، إضافة 22.5 ميكرولتر من شطف العازلة لتغطية بيليه حبة. إزالة عينات من الجهاز الفصل المغناطيسي وتخلط جيدا ل resuspend الخرز. فيcubate في RT لمدة 10 دقيقة لترطيب.
      6. تدور العينات لمدة 5 ثوان لجمع السائل من جانب الأنبوب. وضع العينات مرة أخرى على جهاز الفصل المغناطيسي لل≥1 دقيقة، حتى حل واضح تماما.
        ملاحظة: هناك عدد صغير من الخرز قد لا بيليه ضد المغناطيس أثناء الحضانة. ماصة هذه الخرز unpelleted صعودا وهبوطا ل resuspend لهم طاف، ثم ماصة منهم نحو المغناطيس حيث بقية من الخرز ومكعبات بالفعل (دون الإخلال بيليه القائمة).
      7. تستمر الحضانة حتى لا تظل حبات في طاف. نقل طاف واضحة تحتوي على كدنا] المنقى من كل أنبوب إلى أنبوب nuclease خالية المنخفض التصاق. تسمية كل أنبوب مع معلومات العينة وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. قد يتم تخزين العينات في -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
    5. قياس تركيز الحمض النووي وحجم قطعة
      1. إجراء اختبار مراقبة الجودة عن طريق قياس 1 ميكرولتر اللهiquot من [كدنا على التألق. تقييم 1 ميكرولتر (3 نانوغرام) من DS-كدنا] باستخدام نظام الكهربائي (كما هو موضح في 1).
    6. تفتيت الحمض النووي
      ملاحظة: استخدم إعداد ملف الحمض النووي عينة.
      1. إضافة 20 ميكرولتر من [كدنا (35 نانوغرام مجموع) لأنبوب. إضافة 25 ميكرولتر من Tagment الحمض النووي (TD) العازلة إلى الأنبوب الذي يحتوي على كدنا].
      2. إضافة 5 ميكرولتر من TDE1 (Tagment الحمض النووي أنزيم) إلى أنبوب. ماصة صعودا وهبوطا 10X إلى المزيج. استخدام معلومات سرية جديدة عن كل عينة. أجهزة الطرد المركزي في 280 x ج عند 20 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      3. وضع العينات في thermocycler بغطاء ساخنة وتشغيله في: 55 ° C، 5.5 دقيقة. بسرعة إضافة 50 ميكرولتر حل QG (هلام عدة الاستخراج). ماصة صعودا وهبوطا 10X إلى المزيج. متابعة مباشرة إلى الخطوة التالية.
    7. تنقية الحمض النووي مجزأ
      1. إضافة 170 ميكرولتر من الخرز، ماصة صعودا وهبوطا 10X إلى المزيج. السماح لها الجلوس لمدة 10 دقيقة. وضع أنابيب على المغناطيس. السماح للأنابيب الجلوس على مغناطيس لمدة 10 دقيقة.في حين أن العينات على جهاز الفصل المغناطيسي، ماصة طاف وتجاهل.
      2. ترك أنبوب على المغناطيس وإضافة 200 ميكرولتر من 85٪ من الإيثانول. اتركيه لمدة 30 ثانية، ثم إزالة الإيثانول. تكرار غسل الإيثانول. تدور x ج أنبوب 1000 في RT.
      3. وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس. ماصة من أي الإيثانول المتبقية. السماح للعينات الجافة في RT لمدة 15 دقيقة.
      4. إضافة 21 ميكرولتر من شطف العازلة من عدة استخراج الهلام. السماح للأنبوب الجلوس قبالة المغناطيس، ماصة صعودا وهبوطا 10X إلى المزيج. السماح للأنبوب الجلوس على RT لمدة 15 دقيقة.
      5. إعادة أنبوب إلى المغناطيس لمدة 5 دقائق. ماصة 20 ميكرولتر من محلول (DNA تنقية) في أنبوب جديد.
    8. علامات وPCR التضخيم من الحمض النووي مجزأ
      ملاحظة: في هذه الخطوة يتم تضخيمه الحمض النووي تنقيته من خلال برنامج PCR محدودة دورة. ويضيف أيضا خطوة PCR مؤشر 1 (i7 و) والمؤشر 2 (i5 و) وكذلك محولات المشتركة (P5 وP7) (مطلوب لتوليد العنقودية والتسلسل). الرجوع إلى الحمض النووي الصورةوافرة دليل إعداد لمزيد من التفاصيل.
      1. في أنبوب جديد إضافة 5 ميكرولتر من المؤشر 2 الاشعال (قبعة بيضاء). باستخدام طرف ماصة جديدة إضافة 5 ميكرولتر من مؤشر 1 التمهيدي (غطاء البرتقال). إضافة 15 ميكرولتر من مزيج الرئيسي PCR إلى كل أنبوب.
      2. إضافة 5 ميكرولتر من PCR التمهيدي كوكتيل لكل أنبوب. إضافة 20 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى إلى الأنبوب. ماصة بلطف صعودا وهبوطا 3-5 مرات.
      3. أداء PCR باستخدام البرنامج التالي على thermocycler: 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 5 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. عقد في 10 درجة مئوية. الشروع فورا في PCR تنظيف أو تخزين العينة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 د.
    9. تنقية أسهب الحمض النووي شظايا
      1. جعل الخرز لRT. إعداد الطازجة 85٪ من الإيثانول. أخذ عينات من الجهاز PCR وتدور باستمرار لفترة وجيزة.
      2. إضافة 30 ميكرولتر من الخرز للأنبوب. بلطف ماصة مزيج صعودا وهبوطا 10X. السماح للأنبوب الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. مكان البكالورياك على مغناطيس لمدة 5 دقائق. مع أنبوب على المغناطيس استخدام ماصة لتجاهل طاف.
      3. إضافة 200 ميكرولتر من 85٪ من الإيثانول إلى كل أنبوب. ماصة الإيثانول من بعد 30 ثانية. كرر 85٪ من الإيثانول غسل. ماصة الإيثانول من بعد 30 ثانية.
      4. مع الأنابيب لا تزال على المغناطيس وقبعات مفتوحة، والسماح للالخرز للهواء الجاف لمدة 15 دقيقة. إزالة الأنابيب من المغناطيس.
      5. إضافة 32.5 ميكرولتر من شطف العازلة. ماصة بلطف صعودا ونزولا 10X. احتضان قبالة جذب لل10-15 دقيقة.
      6. العودة الأنابيب إلى المغناطيس لمدة 2 دقيقة، أو حتى مسح طاف. نقل بعناية 30 ميكرولتر من طاف لأنبوب جديد.
    10. قياس تركيز الحمض النووي وجزء الحجم
      1. إجراء اختبار مراقبة الجودة عن طريق قياس تركيز الحمض النووي من 1 ميكرولتر من [كدنا على التألق. تحديد حجم جزء من الحمض النووي من قبل الكهربائي. تقييم 1 ميكرولتر (3 نانوغرام) من DS-كدنا].
    11. التسلسل
      1. جعل مكتبات RNA يليها خلية واحدة إلى مرفق التسلسل. توليد 100 تسلسل بي بي يقرأ على التسلسل التالي بروتوكول نشرت سابقا 4.
        ملاحظة: كل مكتبة التسلسل يولد> 20 مليون فريد رسم الخرائط يقرأ.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    نحن هنا نورد بروتوكول لزراعة الخلايا العصبية الدماغ المتوسط بطني من ماوس معربا عن EGFP يقودها تسلسل المروج هيدروكسيلاز التيروزين، حصاد الخلايا العصبية الفلورسنت الفردية من الثقافات، وقياس Transcriptome على RNA وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي يليها (الشكل 1). وأظهرت البيانات أن 100٪ من خلايا TH-EGFP إيجابية التي تم حصادها والتسلسل كانت الخلايا العصبية الدوبامين، على أساس وجود ثلاث نسخ الجين التالية المتعلقة DA، TH، دوبا كربوكسيل (DDC)، ونقل الدوبامين DAT (slc6a3). كافة الخلايا إيجابية TH-EGFP التعبير عن هذه الجينات الثلاثة وفقا لتقييم RNA تسلسل. في كل مكتبة RNA يليها وحيدة الخلية 6000 - تم الكشف عن 8000 الجينات ترميز البروتين (الشكل 2). الخلايا العصبية الدوبامين تعبر بقوة النصوص ذات الصلة الدوبامين بالإضافة إلى العديد من النيكوتين مستقبلات الأستيل كولين (nAChR) مفارز (الجدول 1). لاحظنا أنه لا يوجدر كل من الخلايا التي كانت سلبية للTH كانت GABAergic. لذا حددنا الخلايا كما GABAergic على أساس وجود نص Gad1 وفقا لتقييم RNA وما يليها. الخلايا التي حددنا باسم الخلايا العصبية GABAergic لا تعبر عن النصوص المتعلقة الدوبامين ولكن كما ذكرت تأليف التعبير عن جين رئيسي لتخليق GABA، Gad1. كشف المكتبات وحيدة الخلية أيضا طويل غير الترميز الحمض النووي الريبي، بالإضافة إلى النصوص ترميز القنوات، والمستقبلات، البروتينات النووية، الهستونات والبروتينات organellar، وعوامل النسخ.

    شكل 1
    الشكل 1. RNA تسلسل في الخلايا العصبية الفردية، كما يؤديها في تجاربنا على الثقافات TH-EGFP ماوس الدماغ المتوسط الأولية. (1) الثقافة TH-EGFP الماوس الخلايا العصبية بطني لمدة 3 أسابيع. (2) تحديد الخلايا العصبية واحدة الفلورسنت التي كتبها GFP مثيرة باستخدام مصدر ضوء زئبق وFITC مرشح / GFP. (3) وايث الهدف 40X نفسه تحت البصريات المرحلة، تصور الخلايا العصبية واحدة وموقف ماصة بشكل صحيح. (4-5) نضح في خلية واحدة في micropipette الزجاج. الصور تظهر الخلية بعد الحصاد: (4) المرحلة 40X. (5) مضان EGFP. (6) خلايا ليز مع تحلل العازلة مع بنسبة ضئيلة من DT التمهيدي عند 72 درجة مئوية. (7) التوليف [كدنا]. 26 دورات التضخيم. (8) بوساطة ينقول "tagmentation" من كدنا]. (9) اختبار مراقبة الجودة كدنا] والتسلسل المضاعفة. (10) التحليل الحسابي لاحقة باستخدام Tophat، أزرار أكمام وCuffdiff 7. وقد تم قياس الوفرة النسبية من الجينات التي أعرب عنها في وحدات من شظايا في كيلو قاعدة من نسخة لكل مليون معين يقرأ (FPKM). الهدف من الحمض النووي الريبي وما يليها هو توفير قائمة من الجينات التي أعرب عنها في زنزانة ووفرة النسبية. الصور (2-4) هم من الع الحالييتم تعديلها من التقرير السابق 1 - ك، (10 6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الرقم 2. عدد من الجينات البروتين الترميز الكشف في المكتبات واحدة الدوبامين RNA تسلسل المولدة من خلايا TH-EGFP إيجابية. تم الكشف عن 8000 الجينات البروتين في المكتبات خلية واحدة - 6000. FPKM: شظايا في كيلو قاعدة من نسخة لكل مليون معين يقرأ (FPKM). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الجينات الخلايا وحيدة دا ن = 10 خلايا GABAergic واحدة ن = 7
    FPKM (يعني ± SEM)
    TH 4714 ± 764 1.2 ± 0.14
    DDC 779 ± 167 0.8 ± 0.1
    slc6a3 / DAT 506 ± 144 0.5 ± 0.04
    DRD2 14 ± 8 0.1 ± 0.004
    chrna6 (α6) 174 ± 57 0.0
    chrna4 (α4) 17 ± 5 26.4 ± 2.3
    chrnb2 (β2) 9 ± 3 17.3 ± 1.2
    chrnb3 (β3) 38 ± 13 0.0
    Gad1 0.0 959.0 ± 70.0
    Htr3a 0.0 0.6 ± 0.01
    Htr3b 0.0 0.0

    الجدول 1. وnAChR جين النصوص في الدوبامين وGABAergic الخلايا العصبية في يوم 21 في الثقافات VentrMidbrain المتعلقة الدوبامين. وأظهرت بيانات الحمض النووي الريبي يليها لTH-EGFP الخلايا العصبية الإيجابية والسلبية. وكان حصاد الخلايا واحد في يوم والثقافة وتبين 21. بيانات الحمض النووي الريبي بعدها أن TH-EGFP الخلايا العصبية الإيجابية لديهم مستويات عالية من النصوص الجينات المرتبطة DA، بما في ذلك هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، دوبا كربوكسيل (DDC)، وناقلات الدوبامين DAT (slc6a3) والنيكوتينيك مستقبلات الأستيل كولين (nAChR) مفارز بما في ذلك α6، α4، β2 وβ3. ومع ذلك، كانت هذه الخلايا مستويات منخفضة من كربوكسيل GABAergic علامة الجينات حمض الجلوتاميك 1 (Gad1) والسيروتونين 5-HT3 المستقبلة ألف ومفارز ب (Htr3A وHtr3B). الخلايا العصبية GABAergic لها منخفضة دون المستوياتالنصوص المتعلقة DA-جين، chrna6، chrnb3، وHtr3A / B، ولكن لديهم مستويات عالية من Gad1. وتظهر RNA تسلسل (Cuffdiff) بيانات عن النصوص المتعلقة الدوبامين، GABAergic، مستقبلات النيكوتين، والسيروتونين. FPKM: شظايا في كيلو قاعدة من نسخة لكل مليون معين يقرأ (FPKM).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    نحن هنا عزل الخلايا واحد من السكان غير متجانسة باستخدام علامة فلوري، ثم دراسة كل خلية مع وحيدة الخلية RNA وما يليها. نفيدكم أن 100٪ من خلايا TH-EGFP حية أننا حصادها والتسلسل كانت الخلايا العصبية الدوبامين في الواقع، على أساس وجود ثلاث نسخ الجينات المرتبطة DA التالية، TH، DDC وslc6a3. كافة الخلايا إيجابية TH-EGFP التعبير عن هذه الجينات الثلاثة وفقا لتقييم RNA تسلسل. وكان هذا متوافقا مع الدراسات الكهربية التي أظهرت أن كل خلية TH-EGFP عرض أيضا ذخيرة من القنوات الأيونية المرتبطة الخلايا العصبية الدوبامين 8 و 9. في هذا البروتوكول والاستفادة من GENSAT هيدروكسيلاز التيروزين-EGFP الماوس سلالة 10 كعلامة موثوقة لالخلايا العصبية الدوبامين الحية. في الثقافات WT الوقت الحاضر لا توجد وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد الخلايا العصبية الدوبامين الحية على أساس التشكل. وعلى الرغم من خبرتنا الواسعة في الاتساعtifying وتسجيل من الخلايا العصبية الدوبامين، في الثقافات wildtype ثلاثة فقط من أصل عشرة من خلايا الدوبامين يشتبه تحصد كانت الخلايا العصبية الدوبامين. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن ليس كل من الخلايا التي كانت سلبية للTH كانت GABAergic. حددنا الخلايا كما GABAergic على أساس وجود نص Gad1 وغياب النصوص المتعلقة DA-وفقا لتقييم RNA وما يليها.

    لأن الخلايا العصبية الدوبامين تمثل أقلية صغيرة من الخلايا العصبية التي أعرب عنها في الثقافات VM الأولية، فإن القدرة على تحديد موثوق هذه الخلايا العصبية في الثقافات التي تعيش تعزيز مجموعة من الدراسات وحيدة الخلية المتاحة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لالعصبية، التنكس العصبي، والمقايسات الدوائية لدراسة آثار العلاجات المختلفة على Transcriptome على الدوبامين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن استخدام هذا البروتوكول لالمناعى، الكهربية، بيوفوتونيك 11، ومن حيث المبدأ، المقايسات البروتين. الالمقايسات حد ذاتها هي مفيدة بشكل خاص للبحوث الأمراض وإدمان باركنسون. ولكن بطبيعة الحال بروتوكولات مماثلة، على الفئران GENSAT أو الفئران المسمى بالمثل، يمكن استخدامها في الحالات المرضية الأخرى أو للخلايا التي هي نادرة. بالإضافة إلى ذلك، يعطي هذا البروتوكول وجهة نظر الناشئة من عدم التجانس داخل سلالة الخلايا العصبية معينة.

    في دراسات سابقة، بعد حصاد خلية واحدة نحن وضعها مباشرة في برنامج تلفزيوني. ولكن الآن نضع خلية واحدة حصادها مباشرة في المخزن المؤقت رد فعل. وهذا يؤدي إلى مكتبات RNA يليها نوعية أفضل وفقا لتقييم عدد الجينات المكتشفة في كل مكتبة. هو أن يطلب من أحد القيود الرئيسية للتقنية الخلايا الموسومة fluorescently. وكما ذكرنا سابقا، لا توجد وسيلة يمكن الاعتماد عليها حقا لتحديد نوع خلية معينة في ثقافة مختلطة على أساس التشكل. مجموعة كبيرة من الفلورسنت خلايا محددة أو لجنة المساواة العرقية، معربا عن خطوط الماوس يوفر الآن وضع علامة على النحو المناسب الخلايا في كثير من الحالات. ومع ذلك، شو الرعايةيونيتبول أن تؤخذ عند اختيار خط الماوس الفلورسنت مناسب، كما وجدت دراسة موسعة لخطوط الماوس المعدلة وراثيا التي TH-لجنة المساواة العرقية الضربة القاضية في خطوط الماوس المعرض وضوحا التعبير التحوير في خلايا nondopaminergic 12.

    بالإضافة إلى ذلك، خطوة أخرى قد تحتاج إلى تحسين في التجارب المستقبلية هي حجم غيض المطلوب من micropipette. إذا وتشمل التجارب المستقبلية استخدام أنواع أخرى من الخلايا من الخلايا العصبية الدوبامين، قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل للخلية من مصلحة حجم غيض micropipette.

    RNA تسلسل عميق هو أسلوب أقوى من القطع الصغيرة. RNA تسلسل يعطي جيد استنساخ المدى للتشغيل. النطاق الديناميكي الكشف عن يماثل إلى وفرة نسخة الفعلية داخل الخلايا. يمكن للمرء اكتشاف أشكال لصق البديلة والإسوية جديدة. دي تحليل نوفو العينات دون جين إشارة غير ممكن؛ وإذا تم اكتشاف الجين المرجعية الجديدة للبيانات يمكن إعادة تحليل-لجين معين (ق) من دون الحاجة إلى تشغيل التجربة الرطب العمل مرة أخرى 13.

    لتلخيص، ونحن التقرير أن 100٪ من خلايا TH-EGFP الحية التي تم حصادها والتسلسل كانت الخلايا العصبية الدوبامين. هذه التقنية تمتد تقارير أخرى بأن تحدد فصلها تماما أو الخلايا العصبية الدوبامين مثقف على المدى الطويل من الفئران GENSAT و 14 و 15 و التقنية سوف تكون لها تطبيقات واسعة في علم الأعصاب وعلم الأحياء الجزيئي.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
    Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x Gibco  14175-095
    Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
    Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
    Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
    L-Ascorbic acid Sigma  A7506
    B27 Gibco  17504-044 50x stock solution, 1x final concentration.
    35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
    Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
    Laminin Sigma  L2020 Stored at -20 °C in 20 µL aliquots
    Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
    Blue pipette tips P1000 Sorenson Bioscience  Inc. 10130
    10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
    37 °C Water bath
    37 °C, 5% humidity incubator
    16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
    Triton X-100 Sigma  X100-500ML
    Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
    Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
    Forceps - 2x3 teeth Fine Science Tools 11022-14
    Forceps - Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
    Forceps - Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
    10x PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
    Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x Gibco 14190-144 500 mL
    21 G needle BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
    Micropipette puller Sutter Instrument model P-87
    Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
    Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit
    oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
    Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
    Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
    Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
    50x 2 polymerase mix 50x Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
    10x PCR buffer 10x Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
    RNA Spikes ThermoFisher 4456740
    PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack
    DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
    PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
    PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
    Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
    HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110 rxns
    Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
    Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5 mL
    RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
    Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
    Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
    Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.)
    Microforge Narishige (or equivalent) 
    Sequencer Illumina HiSeq instrument
    GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
    2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
    3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
    4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
    5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
    6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
    7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
    8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
    9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
    10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
    11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
    12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
    13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
    14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
    15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

    Tags

    علم الأعصاب، العدد 120، وحيدة الخلية، RNA التسلسل، حصاد الخلايا والثقافات الدماغ المتوسط، الخلايا العصبية الدوبامين، ومرض باركنسون
    تحديد موثوق المعيشة الدوبامين الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الثقافات عن طريق RNA تسلسل وTH يحركها المروج EGFP التعبير
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. … More

    Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter