Summary
帕金森病（PD），黑质（SNC）多巴胺能神经元退化，导致运动功能障碍。此处我们报告从表达eGFP的小鼠通过酪氨酸羟化酶（TH）的启动子序列驱动的培养腹侧中脑神经元，从培养收获个别荧光神经元，并使用RNA-SEQ测量它们转录的协议。
Abstract
在帕金森氏病（PD）有贯穿了在黑质致密多巴胺能神经元的显着退化脑中广泛的神经元丧失，导致运动徐缓，强直和震颤。在初级腹侧中脑（VM）的培养活多巴胺能神经元的使用荧光标记的识别提供了一种替代的方法来研究这些神经元的选择性脆弱而不依靠固定的细胞的免疫染色。在这里，我们分离，解离，并培养小鼠VM神经3周。然后，我们确定在使用的eGFP的荧光（由酪氨酸羟化酶（TH）启动子驱动）的培养物的多巴胺能神经元。单个神经元被收集到用玻璃微离心管。接下来，我们裂解收获的细胞，并进行cDNA合成和转座子介导的“tagmentation”，以产生单细胞RNA测序文库1，2，屁股=“外部参照”> 3，4，5。传递一个质量控制检查后，单细胞库进行测序和随后的分析进行测量的基因表达。我们报告个人多巴胺和中脑培养物中分离GABA能神经元转录组的结果。我们报告，收获和测序，该活的TH-eGFP的细胞的100％的多巴胺能神经元。这些技术将在神经科学和分子生物学广泛的应用。
Introduction
帕金森氏病（PD）是一种不可治愈的，年龄相关的神经变性疾病。此相对常见病症的起因仍然知之甚少。有广泛的神经元损失整个大脑，用在黑质（SNC）多巴胺能神经元的显着的神经元变性，导致运动徐缓，强直，震颤的诊断的临床特征。
含黑质多巴胺能神经元主要混合培养是帕金森氏病尤为重要。腹侧被盖区（VTA）多巴胺能神经元有牵连的奖励和上瘾。腹侧（VM）的主要混合胚胎培养同时包含黑质致密部和腹侧被盖区多巴胺（DA）神经元和GABA能神经元。 VM初级培养物可以是用于神经保护测定法有用并阐明多巴胺能神经元的选择性脆弱性。有识别基于形态学的培养多巴胺能细胞没有可靠的方法。他再我们开发技术来识别和收获单多巴胺能神经元，并构建单细胞，高产出的RNA测序文库。
我们报告单多巴胺和中脑培养物中分离GABA能神经元代表RNA转录组数据。该协议可以用于神经保护，神经变性，和药理学试验来研究在DA / GABA转录各种处理的影响。由于多巴胺能神经元代表主虚拟机的文化表达的神经元的一小部分，可靠地识别活的文化这些神经元的能力将实现单细胞研究的增强范围。这些新颖的技术将有助于理解发生在细胞水平上的机制的进展，并且可以具有应用在神经科学和分子生物学领域的其它地方。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：所有实验均按照护理和使用美国国立卫生研究院和协议提供动物的指导方针进行了机构动物护理和使用委员会在加州技术研究所的批准。
1.从小鼠胚胎脑多巴胺能细胞培养的推导
- 解决方案和培养基
- 抗坏血酸储备溶液的制备
- 称出352毫克的抗坏血酸。添加无菌H 2 O操作20 mL的最终总体积。在37℃水浴地方溶解。通过0.2微米的注射器尖端和储存在-20°C 500微升等分过滤。
- 木瓜蛋白酶原液制备
- 稀释木瓜蛋白酶〜15单位/ mL在1×Hanks'平衡盐溶液（HBSS）。移液器上下5次调匀。准备在夹层的一天。
- DNA酶原液制备
- 称取20毫克DNA酶。添加无菌H 2 O操作20毫升的总终体积。无菌过滤器具有0.2微米的注射器过滤嘴。商店在1毫升等分-20℃。
- 终止液的制备
- 稀释5毫升供体马马血清至10％在45毫升1×HBSS。无菌过滤器具有0.2微米的针筒式过滤器尖端。保存在4℃。
- 的4％牛血清白蛋白（BSA）储备溶液制备
- 称取2克的BSA，并添加1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），以45毫升的总终体积。过滤消毒用0.2微米的注射器过滤嘴。保存在4℃。
- 电镀培养基的制备
- 入494毫升介质中，添加1.25含有L-丙氨酰L-谷氨酰胺（L-谷氨酰胺的稳定化源）和5mL施主马血清毫升培养基。过滤消毒用0.2微米的注射器FIL之三尖。保存在4℃。
- 细胞培养介质的制备
- 到196毫升电镀液，加入4毫升B27和200μL抗坏血酸。过滤消毒用0.2微米的过滤器。在4℃下储存溶液并在一个星期内使用。
- 4％多聚甲醛（PFA）溶液的制备
注意：是使用多聚甲醛一般注意事项如下：使用通风橱，避免皮肤和眼睛接触，避免吸入蒸气，远离热源或明火保持距离。穿戴合适的个人防护服。 PFA可引起过敏和皮炎，因此洗手操作后彻底。- 加入10 mL 16％PFA〜30毫升1X PBS，pH值7.4。
- 0.1％的Triton X-100的制备
- 吸管1毫升的Triton X-100到9毫升1×PBS中，使10％的溶液。吸管慢慢允许粘稠溶液以填充枪头。在温暖的37℃水浴DIS解决。在4℃下保存10％的股份。
- 稀释10％的库存到0.01％（ 例如 ，通过执行2个串行1:10稀释：稀释10 1毫升％溶液到9毫升1×PBS中，使1％溶液; 1毫升1％的溶液加入到9毫升1×PBS中，使0.1％的溶液）。
- 的10％，制备1％驴血清
- 添加1毫升驴血清的9mL的1×PBS中的为10％的溶液。添加0.5mL的驴血清，以49.5毫升1×PBS中，pH值7.4的为1％的溶液。
- 1X PBS的制备
- 稀释10倍的PBS加入50毫升到450毫升的H 2 O调节用pH计的溶液至pH 7.4的pH值至1x。
- 抗坏血酸储备溶液的制备
- 涂层培养皿
- 聚-L-鸟氨酸涂层
- 涂层仅10毫米直径的玻璃底中的所有35毫米培养皿使用无菌技术的中心与120μL的聚-L-鸟氨酸。在37℃下孵育1小时。使用真空吸引器吸出多罗rnithine。用无菌H 2 O冲洗两次菜
- 层粘连蛋白涂层（储备浓度为1毫克/毫升）
- 稀释20μL层粘连蛋白与2毫升无菌H 2 O（终浓度为0.01毫克/毫升）的。
- 涂层仅10毫米直径的玻璃底中的所有的菜用层粘连蛋白稀释至0.01毫克的120微升的中心/毫升使用无菌技术，并且在使用前孵育1小时或O / N在37℃。
- 聚-L-鸟氨酸涂层
- 鼠标解剖
注意：在此夹层的方法被设计为细胞最小暴露，因为它们是从胚胎囊转移到培养箱中。细胞的生存力通过用于中脑的解剖仅除去大脑的一部分保留下来。更快速的脑所得隔离而不需要解剖全脑访问的区域。见材料的表在此研究中使用的小鼠品系。 - 喷安乐死鼠标用70％的乙醇的腹部。掌握使用镊子用2×3的齿的下腹部皮肤并打开使用钝叶片手术剪腹腔。让两个切口每侧横向和近端移动。使用镊子暴露腹腔折叠腹壁。
注：子宫现在暴露出来。暴露胸膜腔和气胸的创建也确保了动物不恢复。 - 切子宫角的两端向子宫分离。置于在无菌罩培养皿。
- 每手使用直尖镊子打开胚囊并取出胚胎。通过使用镊子颈部捏头了快速斩首。与用力蹬在口鼻部，使背面是可访问的镊子稳定的头部。
- 在使用其他哈举行的镊子第二，就在脑脊前捏皮肤和头骨的层。剥开皮肤和尾端沿中线的头骨。将镊子周围山脊皮层和脑和其他在小脑之间的一个提示。
- 捏住并取出整个脑，留在喙侧和小脑的尾侧前脑后面。在解剖显微镜下培养皿用冷HBSS放置。
- 重复上述步骤为剩余的胚胎。
- 根据解剖显微镜，翻转大脑段，使腹侧现在访问。现在有4个象限中可见。轻轻抓脑膜和拉动从大脑向上走删除所有脑膜和血管。
- 使用镊子而分离脑来稳定大脑段。放置镊子的一个夹钳进入心室大约在段的中心。使第一次捏背，指着我n要的菜，然后向内每侧。通过双方的横向切割以较低的两个象限。
注：感兴趣的组织是在腹侧低劣部，从而出现密集。这个区域包含了VTA和致密。 - 修剪和丢弃不太致密的组织：包括上，下丘。放置在培养皿的不同区域同时包含VTA和致密在新鲜HBSS的解剖组织。
注：在此阶段小鼠大脑发育（E14），在腹侧中脑感兴趣的区域是由从所述未定带和其他丘脑细胞团的心室分离。显影胚胎鼠脑的多个细长结构允许这些区域，其位于更靠近一起在成年小鼠大脑之间的区别。 - 重复所有剩余的大脑部分。
- 所有的大脑部分已被解剖后，使用镊子和一个11号手术刀季度EA通道中脑部分成近似相等大小的块。
- 细胞的酶处理
- 使用大口径的P1000的枪头占用的HBSS所有四分的脑段，将它们放入一个15 mL锥形管。让段沉降到试管底部并删除已经采取了与四分块的HBSS。
- 加入500微升的木瓜蛋白酶溶液到管并放入37℃水浴15分钟。悬浮细胞通过手指后7.5分钟轻弹管。
- 使用宽孔P1000尖，吸管只中脑段成的脱氧核糖核酸酶I（DNA酶）溶液1毫升等分试样。允许多个节段沉降到管底部。
- 使用大口径的P1000尖，只传输中脑段含1毫升冷一站式解决方案的冲洗15毫升管。让段沉降到试管底部并重复该漂洗上CE更多。
- 细胞悬浮机械研磨
- 用1毫升新鲜的一站式解决方案和吸管上，可以替代在最后一次漂洗和向下7X与P1000枪头磨碎细胞。避免过度研磨，以尽量减少细胞裂解。
- 通过缓慢移液的4％BSA溶液200微升到管的底部延伸到的细胞悬浮液。仔细撤回枪头，以避免破坏细胞悬浮层。在280×g离心6分钟离心后，吸用P1000上清液和重悬细胞在1mL电镀培养基。
- 使用血球进行细胞计数。稀释细胞悬浮液，以1000个/μL，与电镀液。
- 使用真空吸引器，从包被的培养皿吸出层粘连蛋白，在最多三个菜批次。板120微升（1.2×10 5个细胞/皿（78.5 平方毫米
- 1小时后，小心地加入3毫升培养基的培养皿的非种子面积最小化的细胞的破坏。
- 在3天的时间间隔执行一个半到细胞培养皿充满培养基改变为3周。
对于RNA测序2.收获培养，多巴胺能神经元
注：细胞收获和单细胞RNA的序列协议的概述在图1中给出。
- 步骤进行实验的前一天
- 通过在蒸馏水2 O 15分钟100％的乙醇超声处理15分钟，然后再清洁硼硅玻璃毛细管。排出管中，在200℃的烘箱中烘烤过夜以失活RNA酶。
- 使用刚刚打开无RNase的枪头通过从离心管的RNA酶抑制剂溶液1μL（20μL总体积）的测序试剂盒混合10倍的裂解缓冲液的19微升制备的10倍反应缓冲液的原液。降速混合物短暂使用微离心机，并保持在冰上。
- 添加2微升的10×反应缓冲液到每个单独的0.2mL的PCR管（用于收集所收获的神经元）的。标记与鉴定神经元适当的标记，以收获和储存在4℃下冷冻管。
- 步骤来执行对实验当天
- 在收获移液器的制备。
- 使用微电极拉出器和一个microforge的玻璃包加热灯丝焙烤毛细管 - （8微米2）拉大顶端直径微量。设置拉出器，以形成具有一个长锥形微量。使用配有校准的目镜刻度和高功率的ob一个microforge主观打破微量的前端到所需的笔尖尺寸（10 - 20微米）。
- 扣紧微量进microforge吸管支架和支架安装到所述microforge。使用microforge和开关上的电流的机械手向灯丝加热它使微量的前端聚焦的玻璃包加热灯丝的上方。触摸枪头灯丝加热。当枪头已经熔化至适当直径切断电流。
注意。关断电流将使灯丝突然向下移动并从移液管尖端分离，产生一个大的，开放的嘴吸管具有所需的直径。 - 直到需要存放完成微量在一个封闭的盒子。
- 收获的神经元。
注意。培养的神经元收获以下以前发表的协议6的修改版本。- 彻底CLEAN所有与使用液体消毒剂和水，接着用水漂洗培养菜肴和收集管接触的细胞收获室的所有表面。擦拭用80％乙醇消毒后表面，然后核糖核酸酶抑制剂，注入擦拭。
- 装满冰块两根绝缘的容器，一是定期（水）冰和另一个用干冰。广场上的常规冰2微升10X反应缓冲液以前填充的0.2毫升的PCR收集管。
- 除去含有从培养箱神经元的培养皿中，从盘排出培养基，用2mL无RNase的Dulbecco PBS（DPBS）中冲洗，并用1毫升DPBS的收割替换。
- 确定荧光，TH阳性在初级脑培养物用装有40X相目标，一个Hg灯，和GFP的滤波器集合的倒，落射荧光显微镜神经元。
- 使用电动或手动MI在胞体吸管的位置cromanipulator。吸出神经元成使用通过连接于微量保持器的侧端口的塑料管经口施加轻柔抽吸玻璃微量。立即删除含浴液细胞微量。
- 放置一个0.2毫升的PCR管收集含有反应缓冲液内的移液管尖，并打破尖端靠在管的一侧，在底部附近。通过将无菌21g的注射器针头在微量的背面并施加向外的压力，从破碎的尖端微量的 - （1.5微升0.5）排出剩余的液体。
- 离心收集管用于使用台式微量离心机5秒，并在干冰冻结它。存储包含单个电池在-80℃的收集管。通常情况下，5细胞每个培养皿上在环境温度下1小时内收获。
- 在收获移液器的制备。
3.单细胞RNA测序库代
- <LI>第一链cDNA的代
- 把冰下面的试剂在PCR柜。制备第一链主混合物加10％通过在PCR室中在室温下将以下试剂组合：2微升5×第一链缓冲液，0.25微升的DTT（100毫米），1微升dNTP混合物（10毫摩尔），1微升的寡核苷酸（ 12μM），0.25微升RNA酶抑制剂，和1微升逆转录酶（100单位）。这是在逆转录主混合物（每反应5.5微升总体积）。
- 以干冰从-80℃的样品，带到PCR内阁。以下内容添加到单细胞样本：1微升3'引物1和1μL定量RNA峰值。携带样品冷却器块到一个热盖热循环仪预先设置在72℃。
- 孵育在热循环3分钟的管在72℃，然后把样品上的PCR冷却器机架。加入预混（从步骤3.1.1）的5.5微升到每个反应管中，轻轻吹打混合。旋0.2微升试管5秒钟，并在热循环仪孵育如下：42℃90分钟，70℃10分钟。保持在4℃。
- 放大的第一链cDNA的净化。
注：将PCR扩增的cDNA是由固定于磁珠纯化。使用磁分离设备为0.2 mL管。- 分装磁珠成1.5毫升管中。每次使用前，将珠等分至室温至少30分钟，搅拌均匀分散。涡磁珠，直到混合均匀。
- 添加的磁珠25μL到各样品中。吹打整个音量上下至少10倍到调匀混合。孵育在室温下8分钟，以让该cDNA结合到珠子上。
- PCR预混液的制备
- 准备DS-cDNA的扩增PCR预混对于具有ADDIT所有反应通过混合5微升10X PCR缓冲液，2微升dNTP混合物（10毫米），2μLPCR引物2（12μM），2微升50X 2聚合酶混合物，和39μL无核酸酶的水有理的10％（50微升总体积/反应）。
- 第一链的扩增
- 放置样品和磁珠上的磁分离装置≥5分钟，直至液体出现完全清楚，并没有留在上清液珠。
- 保持在分离装置上的样品中，吸取上清液并丢弃。旋转样品5秒从管的一侧收集液体。放置磁分离装置上的样品30秒，然后除去所有剩余的上清液用P10移液器。
- 添加PCR主混合物的50μL的从以前的步骤与珠结合各含有管的DNA。放置管预热的热循环仪（95℃）用加热的盖子。使用下列编程的，是开始热循环L：95℃1分钟，26个循环的95℃15秒，65℃30秒，68℃6分钟。然后，72℃10分钟。保持在4℃。
注：了解更多详情，请咨询测序用户手册和以优化采样设置。
- 扩增双链cDNA的净化
- 添加90微升磁珠向每个样品。吹打整个音量上下至少10倍到调匀混合。孵育在室温下8分钟，以让该cDNA结合到珠子上。放置磁分离装置在样品上加上珠≥5分钟，直至液体出现完全清楚，并没有留在上清液珠。
- 而样品磁分离装置上，除去上清液并丢弃。保持磁分离装置上的样品。添加新鲜的85％的乙醇，以每个样品的140微升，而不会干扰珠。等待30秒。移液器关闭上清液。基因仍将绑定到BEA在洗涤过程中的DS。
- 重复乙醇洗一次。
- 旋转简要样本以从管的一侧收集液体。放置磁分离装置上的样品30秒，然后除去所有剩余的乙醇用吸管。放置在室温下的样品2 - 2.5分钟，直到沉淀干燥并不再有光泽（出现裂纹，即前）。
注：干燥沉淀只有等到它只是干燥。小球看起来无光泽，没有光泽。如果沉淀不干燥，乙醇会停留在样品孔，这将降低扩增的cDNA的回收率和产率。如果颗粒被过度干燥，将有在沉淀中的裂纹。这将需要更长的时间超过2分钟补充水分，并可能降低扩增的cDNA复苏和产量。 - 一旦珠是干，加洗脱缓冲液22.5微升，以覆盖珠粒料。从磁分离设备中取出样品调匀重悬珠。在cubate在RT 10分钟以再水合。
- 旋转样品5秒从管的一侧收集液体。放置样品背面的磁分离装置上≥1分钟，直到溶液是完全清楚。
注：孵化过程中珠小群体未必对沉淀的磁铁。吸取这些非颗粒化珠粒上下上清液重悬，然后吸取他们朝向哪里珠的其余已沉淀的磁铁（无破坏现有的沉淀）。 - 继续培养，直到没有珠粒留在上清液中。从每管转移含有纯化的cDNA澄清上清液到无核酸酶，低粘性管。每个标签管样品信息并储存在-20℃。该样品可以在-20℃无限期储存。
- DNA浓度和片段大小的测量
- 通过量化1μL人进行质量控制检查上的荧光cDNA的iquot。评估的ds-cDNA的1微升（3纳克）用电泳系统（如在1）中描述。
- DNA断裂
注：使用DNA样品制备试剂盒。- 添加的cDNA的20微升（35纳克计）到管中。添加Tagment的DNA 25微升（TD）的缓冲液至含cDNA的管。
- 添加5μL的TDE1（Tagment脱氧核糖核酸酶）到管中。移液器上下10倍混合。选用一个新鲜提示为每个样本。离心机在20℃280×g离心1分钟。
- 放置在样品中与加热盖的热循环仪，并在运行：55℃，5.5分钟。迅速加入50微升QG溶液（凝胶提取试剂盒）。移液器上下10倍混合。直接继续到下一个步骤。
- DNA碎片的纯化
- 加入170μL珠，吸管向上和向下10倍混合。让它坐了10分钟。放管上的磁铁。让管坐于磁体10分钟。而样品磁分离装置上，吸取上清液并丢弃。
- 留在磁体的管中，加入85％的乙醇200微升。让我们坐30秒，然后除去乙醇。重复乙醇洗。在旋转RT管1000 XG。
- 把管放回磁铁。移液器关闭任何残留的乙醇。让样品在室温下干燥15分钟。
- 从凝胶提取试剂盒添加洗脱缓冲液21微升。让管坐客磁铁，吸管向上和向下10倍混合。让管坐在RT 15分钟。
- 返回管到磁体5分钟。吸移管20微升的溶液（纯化的DNA）到一个新的试管中。
- 零散的DNA标记和PCR扩增
注：在这一步骤中纯化的DNA通过有限个循环的PCR程序进行扩增。 PCR步骤还增加了指数1（I7）和索引2（I5）以及共同适配器（P5和P7）（对于簇生成和测序必需的）。指该DNA小号充足的准备指南了解更多详情。- 在一个新的试管中加入指数2引物5μL（白帽）。使用新的枪头，加5μL指数1底漆（橙色帽）的。添加PCR扩增预混15微升至每管。
- 添加5μl的PCR引物鸡尾酒到每个管中。添加纯化的DNA的20微升到管。轻轻移液器上下3 - 5倍。
- 3分钟30秒，10秒，63℃30秒，72℃3分钟5个循环的98℃72℃，98℃：使用上的热循环以下程序进行PCR。保持在10℃。立即进行的PCR清理或在4℃下将样品储存长达2天。
- 扩增的DNA片段纯化
- 使小珠至室温。准备新鲜的85％乙醇。取样品PCR检测出机器后短暂离心。
- 添加珠粒30微升到管。轻轻吸管混合向上和向下10倍。让该管在室温下放置5分钟。地方BACK于磁体5分钟。用在磁铁的管使用一个移液管弃去上清液。
- 添加85％乙醇200微升至每个管。吸取后30秒乙醇边。重复85％乙醇洗。吸取后30秒乙醇边。
- 用在磁铁管静止和帽打开时，允许珠粒空气干燥15分钟。从磁体取出管。
- 添加洗脱缓冲液32.5微升。吸管轻轻向上和向下10倍。孵育关闭10磁铁 - 15分钟。
- 返回管到磁体2分钟，或直至上清液已经清除。小心地将上清液30微升转移至新管中。
- DNA浓度和片段大小的测量
- 通过量化cDNA的1微升的DNA浓度对荧光计进行质量控制检查。确定由电泳该DNA的片段的大小。评估的ds-cDNA的1微升（3纳克）。
- 测序
- 带来的单细胞RNA测序库来测序设施。在生成继先前公布的协议4的音序器100个基点测序读数。
注：每个测序文库生成> 20000000唯一映射读取。
- 带来的单细胞RNA测序库来测序设施。在生成继先前公布的协议4的音序器100个基点测序读数。
注意：对于下面的步骤使用的试剂从商业测序试剂盒。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
此处我们报告来自小鼠表达EGFP由酪氨酸羟化酶启动子序列驱动的培养腹侧中脑神经元，从培养收获个别荧光神经元，并使用RNA-SEQ（ 图1）测量它们的RNA转录的协议。该数据表明，收获和测序的TH-eGFP的阳性细胞100％为多巴胺能神经元，是根据以下三个DA相关基因的转录物的存在下，TH，多巴脱羧酶（DDC）和多巴胺转运DAT （SLC6A3）。所有TH-EGFP阳性细胞通过RNA-SEQ的评估表达这三个基因。在每一个单细胞RNA测序文库6,000 -检测8000蛋白质编码基因（ 图2）。的多巴胺能神经元鲁棒表达除了多巴胺相关的转录到几个烟碱乙酰胆碱受体（nAChR的）亚基（ 表1）。我们观察到，没有•全部为阴性为TH是GABA能细胞;因此，我们定义的基础上，GAD1成绩单的存在细胞的GABA能由RNA-SEQ的评估。我们定义为GABA能神经元不表达多巴胺相关的转录但如前所述确实表达对GABA合成，GAD1的主要基因细胞。单细胞库还透露长的非编码RNA，以及编码通道，受体，核蛋白质，组蛋白，细胞器的蛋白质，和转录因子的转录。
图1. RNA测序在单个神经元，在我们的初级TH-EGFP鼠标中脑培养实验演出。 （1）培养的TH-eGFP的小鼠腹侧神经3周。 （2）通过使用汞光源和FITC / GFP滤波器激动人心的GFP识别荧光单神经元。 （3）无线网络TH下阶段光学相同40X的目标，可视化单个神经元，并正确地放置吸管。 （4 - 5）吸出单个细胞放入玻璃微。图像显示收获后的细胞：（4）40X阶段; （5）eGFP的荧光。 （6）溶解细胞在72℃用寡-dT引物裂解缓冲液。 （7）cDNA合成; 26周期的放大。 （8）转座子介导的cDNA的“tagmentation”。 （9）的cDNA质量控制检查和多路复用测序。采用高顶礼帽，袖扣和Cuffdiff 7（10）后续计算分析。基因表达的相对丰度每百万映射成绩单千碱基片段为单位测量读取（FPKM）。的RNA-SEQ的目标是提供在细胞和它们的相对丰度表达的基因的列表。图（2 - 4）是从当前窝K，（6 - 10）从先前的一份报告1修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2。 在从TH-eGFP的阳性细胞系生成的单多巴胺RNA测序库检测蛋白质编码基因的数目。在单细胞库进行检测8000个基因的蛋白质 - 6000。 FPKM：每百万映射成绩单千碱基片段阅读（FPKM）。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 基因 | DA单细胞N = 10 | GABA能的单细胞N = 7 |
| FPKM（平均值±SEM）的 | ||
| TH | 4714±764 | 1.2±0.14 |
| DDC | 779±167 | 0.8±0.1 |
| SLC6A3 / DAT | 506±144 | 0.5±0.04 |
| DRD2 | 14±8 | 0.1±0.004 |
| chrna6（α6） | 174±57 | 0.0 |
| CHRNA4（α4） | 17±5 | 26.4±2.3 |
| CHRNB2（β2） | 9±3 | 17.3±1.2 |
| chrnb3（β3） | 38±13 | 0.0 |
| GAD1 | 0.0 | 959.0±70.0 |
| Htr3a | 0.0 | 0.6±0.01 |
| Htr3b | 0.0 | 0.0 |
表1.多巴胺相关的21天中VentrMidbrain文化与乙酰胆碱受体基因转录本多巴胺和GABA能神经元。对TH-eGFP的阳性和阴性的神经元RNA测序数据被示出。单细胞收集在培养第21天RNA测序数据表明，TH-eGFP的阳性神经元有高水平的DA相关基因的转录，包括酪氨酸羟化酶（TH），多巴脱羧酶（DDC），多巴胺转运DAT（SLC6A3）和烟碱型乙酰胆碱受体（胆碱受体）亚单位包括α6，α4，β2和β3。但是，这些细胞具有GABA能标记基因谷氨酸脱羧酶1（GAD1）和血清素5-HT 3受体A和B亚基（Htr3A和Htr3B）的低的水平。 GABA能神经元具有较低的无水平DA相关基因转录，chrna6，chrnb3和Htr3A / B，但有高水平的GAD1。 RNA-SEQ（Cuffdiff）数据显示多巴胺有关，GABA能，烟碱受体，血清素和成绩单。 FPKM：每百万映射成绩单千碱基片段阅读（FPKM）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里，我们分离使用荧光标记，然后研究以单细胞的RNA-SEQ每个小区由一个异质群体单细胞。我们报告，我们收获并测序活的TH-eGFP的细胞100％的确多巴胺能神经元，是根据以下三个DA相关基因的转录，TH，DDC和SLC6A3的存在。所有TH-EGFP阳性细胞通过RNA-SEQ的评估表达这三个基因。这是一致的与电生理研究显示，每TH-EGFP细胞也呈现出与多巴胺能神经元8,9相关的离子通道的剧目。在这个协议中，我们采用的GENSAT酪氨酸羟化酶-EGFP小鼠品系10作为现场多巴胺能神经元的可靠标志。在WT文化有现查明根据其形态活多巴胺能神经元没有可靠的方法。尽管我们在iDEN网络的丰富经验tifying和多巴胺能神经元记录，在野生型文化中只有三个了收获怀疑多巴胺能细胞的十是多巴胺能神经元。此外，我们观察到，不是所有的为阴性TH的细胞是GABA能。我们定义了基于所述GAD1转录物的存在和不存在对DA相关的转录物的细胞作为GABA能通过RNA-SEQ评定。
由于多巴胺能神经元代表主虚拟机的文化表达的神经元的一小部分，在活的文化可靠地识别这些神经元的能力将提升现有单细胞研究的范围。该协议可以用于神经保护，神经变性，和药理学试验以研究对多巴胺能转录的各种治疗方法的效果。此外，一个可以使用此协议为免疫组织化学，电，生物光子11，并且在原则上，蛋白质组分析。该本身测定是对于帕金森氏病和成瘾研究特别有用。但当然类似协议，上GENSAT小鼠或类似标记的小鼠中，可用于其它疾病状态或用于那些稀有细胞。此外，该协议使异质性的神经元给予亚型中一个新兴的观点。
在以前的研究中，收获了单细胞后，我们把它直接进入PBS;然而，现在我们直接放置在收获单细胞到反应缓冲液。这将导致更高质量的RNA序列库，在每个库检测基因的数量来评估。一个该技术的主要限制是，荧光标记的细胞是必需的。如前所述，不存在在基于形态学的混合培养，以确定一个特定的细胞类型真正可靠的方法。大范围的小区固有荧光或Cre的表达小鼠线现在提供适当标记的细胞在许多情况下。然而，护理笑选择一个合适的荧光鼠标线时，ULD的，因为它们的转基因小鼠品系进行了广泛的研究发现，TH-Cre重组酶基因敲除小鼠表现出线条明显的nondopaminergic小区12转基因表达。
此外，可能需要在以后的实验中被优化的另一个步骤是微量的所需末端的尺寸。如果未来的实验包括使用比多巴胺能神经元的其它细胞类型的，微量移液器尖端大小，可能需要为感兴趣的细胞进行优化。
RNA深度测序比芯片更强大的技术。 RNA测序提供良好的运行可以运行的重复性。检测到的动态范围相当于细胞内的实际转录物丰度。人们可以发现选择性剪接的形式和新的亚型。样品未经参照基因从头分析是可能的;如果一个新的参考基因被发现的数据可以被重新分析了特异性基因（多个），而无需再次13运行湿式工作试验。
总之，我们报告，收获和测序，该活的TH-eGFP的细胞的100％的多巴胺能神经元。该技术扩展了鉴定急性从GENSAT小鼠，第14，15和技术将在神经科学和分子生物学的广泛应用解离或长期培养的多巴胺能神经元的其他报告。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x stock solution, 1x final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20 °C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37 °C Water bath | |||
| 37 °C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps - 2x3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50x 2 polymerase mix | 50x Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10x PCR buffer | 10x Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
