Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Pålidelig Identifikation af Living dopaminerge neuroner i midthjernen Cultures Brug RNA Sequencing og TH-promotor-drevet eGFP Expression

Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/54981
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Summary

Ved Parkinsons sygdom (PD), sorte substans (SNC) dopaminerge neuroner degenerere, hvilket fører til motorisk dysfunktion. Her rapporterer vi en protokol til dyrkning ventrale midthjernen neuroner fra en mus, der udtrykker eGFP drevet af en tyrosinhydroxylase (TH) promotorsekvens, høst individuelle fluorescerende neuroner fra kulturerne, og måling af deres transkriptom anvendelse af RNA-seq.

Abstract

Ved Parkinsons sygdom (PD) der er udbredt neurontab hele hjernen med udtalt degeneration af dopaminerge neuroner i SNC, hvilket fører til bradykinesi, rigiditet og tremor. Identifikationen af ​​levende dopaminerge neuroner i ubearbejdet ventrale mesencephaliske (VM) kulturer ved hjælp af en fluorescerende markør giver en alternativ måde at studere den selektive sårbarhed disse neuroner uden at henvise til immunfarvning af faste celler. Her, vi isolerer, dissocierer, og kultur muse VM neuroner i 3 uger. Vi derefter identificere dopaminerge neuroner i kulturer under anvendelse eGFP fluorescens (drevet af en tyrosinhydroxylase (TH) promoter). Individuelle neuroner høstes i mikrocentrifugerør ved anvendelse af glas mikropipetter. Dernæst vi lysere høstede celler og udføre cDNA-syntese og transposon-medieret "tagmentation" til at producere enkeltcelle-RNA-Seq biblioteker 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Efter at have passeret en kvalitetskontrol check, er encellede biblioteker sekventeret og efterfølgende analyse udføres for at måle genekspression. Vi rapporterer transkriptom resultater for individuel dopaminerge og GABAerge neuroner isoleret fra midthjernen kulturer. Vi rapporterer, at 100% af de levende TH-eGFP-celler, der blev høstet og sekventeret var dopaminerge neuroner. Disse teknikker vil have udbredt anvendelse i neurovidenskab og molekylærbiologi.

Introduction

Parkinsons sygdom (PD) er en uhelbredelig, aldersrelateret neurodegenerativ lidelse. Årsagen til denne relativt almindelig lidelse forbliver dårligt forstået. Der er udbredt neurontab hele hjernen, med udtalt neuronal degeneration af dopaminerge neuroner i substantia nigra (SNC), hvilket fører til diagnostiske kliniske træk ved bradykinesi, stivhed og tremor.

Primære blandede kulturer indeholdende SNC dopaminerge neuroner er især relevante for Parkinsons sygdom. Ventrale tegmentalområde (VTA) dopaminerge neuroner har været impliceret i belønning og afhængighed. Ventrale mesencephaliske (VM) primære blandede embryonale kulturer indeholder både SNC og VTA dopaminerge (DA) neuroner og GABAerge neuroner. VM primære kulturer kan være nyttigt for neurobeskyttelse assays og til at belyse den selektive sårbarhed af dopaminerge neuroner. Der er ikke nogen pålidelig måde at identificere dopaminerge celler i kultur baseret på morfologi. Hanre vi udvikler teknikker til at identificere og høste enkelt dopaminerge neuroner, og konstruere encellede, højt forrentede RNA sekventering biblioteker.

Vi rapporterer repræsentative RNA transkriptom data for enkelt dopaminerge og GABAerge neuroner isoleret fra midthjernen kulturer. Denne protokol kan anvendes til neurobeskyttelse, neurodegeneration, og farmakologiske assays til at undersøge virkningerne af forskellige behandlinger på DA / GABA transkriptom. Fordi dopaminerge neuroner udgør et lille mindretal af de neuroner, der er udtrykt i primære VM kulturer, vil evnen til pålideligt identificere disse neuroner i levende kulturer muliggøre en forbedret vifte af encellede undersøgelser. Disse hidtil ukendte teknikker vil lette fremskridt i forståelsen af ​​mekanismerne, der finder sted på celleniveau og kan have anvendelser andetsteds inden for neurovidenskab og molekylærbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pasning og anvendelse af dyr, der leveres af National Institutes of Health, og protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på California Institute of Technology.

1. Udledning af Primary Dopaminerge Cell Cultures fra embryonale Mouse Brain

  1. Løsninger og Kultur Medium
    1. Fremstilling af ascorbinsyre Stamopløsning
      1. Afvejes 352 mg ascorbinsyre. Tilføj sterilt H2O til et endeligt samlet volumen på 20 ml. Sted i 37 ° C vandbad for at opløse. Filtreres gennem 0,2 um sprøjtens spids og butik i 500 pi prøver ved -20 ° C.
    2. Fremstilling af papain Stamopløsning
      1. Fortynd papain til 15 enheder / ml i 1 x Hanks'-balanceret saltopløsning (HBSS). Pipette op og ned 5 gange for at blande grundigt. Forbered på dagen for dissektion.
    3. Fremstilling af DNase Stamopløsning
      1. Afvejes 20 mg DNase. Tilføj sterilt H2O til et samlet slutvolumen på 20 ml. Sterilt filter med 0,2 um sprøjtefilter spids. Opbevares ved -20 ° C i 1 ml prøver.
    4. Fremstilling stopopløsning
      1. Fortynd 5 ml donorhesteinfluenzavirusset hesteserum til 10% i 45 ml 1x HBSS. Sterilt filter med en 0,2 um sprøjtefilter spids. Opbevares ved 4 ° C.
    5. Fremstilling af 4% bovint serumalbumin (BSA) stamopløsning
      1. Afvej 2 g BSA og tilføj 1x phosphatpufret saltvand (PBS) til et samlet slutvolumen på 45 ml. Filtersteriliser med 0,2 um sprøjtefilter spids. Opbevares ved 4 ° C.
    6. Fremstilling af udpladningsmedium
      1. I 494 ml medium, tilsættes 1,25 ml kulturmedier, der indeholder L-alanyl-L-glutamin (et stabiliseret kilde til L-glutamin) og 5 ml donor hesteserum. Filtersteriliser med 0,2 um sprøjte filter tip. Opbevares ved 4 ° C.
    7. Fremstilling af cellekultur-medium
      1. I 196 ml udpladningsmedium, tilsættes 4 ml B27 og 200 pi ascorbinsyre. Filtersteriliser med 0,2 um filter. løsningen Opbevar ved 4 ° C og brug inden for en uge.
    8. Fremstilling af 4% paraformaldehyd (PFA) Løsning
      Forsigtig: Generelle forholdsregler ved brug af paraformaldehyd er som følger: Brug et stinkskab, undgå kontakt med hud og øjne, undgå indånding af dampe, holde sig væk fra varme eller åben ild. Bær passende personlig beskyttelsesdragt. PFA kan forårsage sensibilisering og dermatitis, derfor vaske hænder grundigt efter brug.
      1. Der tilsættes 10 ml 16% PFA til 30 ml 1x PBS, pH 7,4.
    9. Fremstilling af 0,1% Triton X-100
      1. Pipette 1 ml Triton X-100 i 9 ml 1x PBS til at gøre en 10% opløsning. Pipette langsomt at tillade viskøs opløsning til at fylde pipettespids. Varm i 37 ° C vandbad til disløse. Opbevar 10% lager ved 4 ° C.
      2. Fortynd 10% lager til 0,01% (fx ved at udføre 2 serielle 1:10 fortyndinger: fortynd 1 ml 10% opløsning i 9 ml 1x PBS til at gøre 1% opløsning; 1 ml 1% opløsning i 9 ml 1x PBS til at gøre 0,1% opløsning).
    10. Fremstilling af 10% og 1% donkey serum
      1. Tilsæt 1 ml æsel serum til 9 ml 1x PBS til en 10% opløsning. Tilsæt 0,5 ml af æsel serum til 49,5 ml 1 x PBS, pH 7,4 i en 1% opløsning.
    11. Fremstilling af 1x PBS
      1. Fortynd 10x PBS til 1x ved tilsætning af 50 ml til 450 ml H 2 O. Indstil pH af opløsningen til pH 7,4 ved anvendelse af et pH-meter.
  2. Coating dyrkningsskålene
    1. Poly-L-ornithin Coating
      1. Coat kun 10 mm glas diameter bund i midten af ​​alle mm skåle 35 med 120 pi poly-L-ornithin anvendelse af sterilt teknik. Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Brug et vakuum sug til aspirere poly-Lornithine. Skyl retter to gange med sterilt H 2 O.
    2. Laminin Coating (stock koncentration på 1 mg / ml)
      1. Fortynd 20 pi laminin med 2 ml sterilt H2O (slutkoncentration 0,01 mg / ml).
      2. Coat kun 10 mm glas diameter bund i midten af ​​alle retter med 120 pi laminin fortyndet til 0,01 mg / ml under anvendelse af sterilt teknik, og inkuber i 1 time eller O / N ved 37 ° C før brug.
  3. mus Dissektion
    BEMÆRK: Fremgangsmåderne i denne dissektion er designet til minimal udsættelse af celler, som de overføres fra embryonale sække til kulturen inkubator. Levedygtigheden af ​​cellerne bevares ved fjernelse kun en del af hjernen for dissektion af midthjernen. Isolering af midthjernen udbytte hurtigere uden behov for at dissekere hele hjernen at få adgang til regionen. Se tabel of Materials for muse-stamme anvendt i denne undersøgelse. Aflive en tidsindstillet gravid mus på gestationel dag 14 under anvendelse af CO 2.
  4. Spray bug aflives mus med 70% ethanol. Tag fat i huden af ​​underlivet ved anvendelse af pincetter med 2 x 3 tænder og åbne bughulen ved stump klinge kirurgiske sakse. Lav to snit bevæger sideværts og proksimalt på hver side. Fold over bugvæggen med pincet for at eksponere den abdominale kavitet.
    BEMÆRK: Livmoderen er nu udsat. Eksponering af pleurahulen og skabelse af pneumothorax sikrer også, at dyret ikke komme sig.
  5. Skær begge ender af uterine horn at adskille livmoderen. Placer i en petriskål i en steril hætte.
  6. Brug straight-tip pincet i hver hånd åbne embryo sac og fjern embryo. Hurtigt halshugge ved at klemme hovedet af ved halsen med pincet. Stabiliser hovedet med tangen fast placeret på snuden, så den dorsale overflade er tilgængelig.
  7. Brug af pincet afholdt i den anden hand, klemmes det lag af huden og kraniet lige før højderyggen af ​​mesencephalon. Skrælle huden og kraniet kaudalt langs midterlinjen. Placer pincet omkring højderyg med en spids mellem cortex og mesencephalon og den anden over cerebellum.
  8. Knib og fjerne hele midthjernen, efterlod forhjernen på rostralt side og lillehjernen på caudale side. Sted i en petriskål med koldt HBSS under et dissektionsmikroskop.
  9. Gentag proceduren for de resterende embryoner.
  10. Under dissektionsmikroskop, flip over hjernen segment, så den ventrale side er nu tilgængelig. Der er nu 4 kvadranter synlige. Fjern alle meninges og kar ved forsigtigt fat hjernehinden og trække opad væk fra hjernen.
  11. Brug pincet til at stabilisere hjernen segment, mens adskillelse af midthjernen. Placer en tang af pincet ind i ventriklen omtrent i midten af ​​segmentet. Gøre den første knivspids dorsalt, peger into fadet, så medialt på hver side. Tag de nederste to kvadranter ved at gøre laterale snit på begge sider.
    BEMÆRK: væv af interesse er i den ventrale ringere sektion, som synes tæt. Denne region indeholder både VTA og SNC.
  12. Trim og kassér det væv, der er mindre tæt: dette omfatter den overlegne og underlegne colliculi. Placer dissekerede væv, der indeholder både VTA og SNC i frisk HBSS på et separat område af petriskålen.
    BEMÆRK: På dette stadium i musehjerne udvikling (E14), er regionen af ​​interesse i den ventrale midthjernen adskilt af en ventrikel fra zona incerta og andre hypothalamus cellegrupper. Jo mere aflang struktur udvikle embryonale muse hjerne tillader skelnen mellem disse områder, som er placeret tættere på hinanden i den voksne musehjerne.
  13. Gentag for alle de resterende hjernen segmenter.
  14. Efter alle de hjernen segmenter er blevet dissekeret, bruge pincet og en nr 11 skalpel til kvart each midthjernen sektion i stykker af ens størrelse.
  • Tidsforskyder cellerne
    1. Enzymatisk Behandling af celler
      1. Brug en bred boring P1000 pipette tip til at tage alle de indkvarteret midthjernen segmenter i HBSS og placere dem i en 15 ml konisk rør. Lad segmenterne sedimentere til bunden af ​​røret og fjern HBSS, der er blevet taget op med de kvarte stykker.
      2. Tilsæt 500 pi papain opløsning til røret og anbringes i et 37 ° C vandbad i 15 min. Resuspender celler ved finger zappe røret efter 7,5 min.
      3. Ved hjælp af en bred boring P1000 tip, pipette kun de midthjernen segmenter i en 1 ml prøve af deoxyribonuclease I (DNase) løsning. Tillad segmenterne at sedimentere til bunden af ​​røret.
      4. Ved hjælp af en stor indvendig diameter P1000 tip, overføre kun de midthjernen segmenter til en 15 ml rør indeholdende 1 ml kold stopopløsning til skylning. Lad segmenterne sedimentere til bunden af ​​røret og gentag skylningen påce mere.
    2. Mekanisk Triturering cellesuspension
      1. Udskift sidste skylning med 1 ml frisk stop-løsning og pipette op og ned 7x med en P1000 pipettespids til udriv celler. Undgå overdreven findeling at minimere cellelyse.
      2. Lå til grund cellesuspensionen ved langsomt at pipettere 200 pi 4% BSA-opløsning i bunden af ​​røret. trække forsigtigt pipettespidsen for at undgå at forstyrre celle suspension lag. Efter centrifugering ved 280 xg i 6 min, aspireres supernatanten med P1000 og cellerne resuspenderes i 1 ml udpladningsmedium.
  • Optælling og Plating cellerne
    1. Udfør celletallet ved anvendelse af et hæmocytometer. Fortynd cellesuspensionen til 1.000 celler / pi, med udpladningsmedium.
    2. Ved hjælp af et vakuum aspirator, aspireres laminin fra de belagte retter, i partier på højst tre retter. Plade 120 pi (1,2 x 10 5 celler / skål (78,5 mm 2
    3. Efter 1 time tilsættes forsigtigt 3 ml dyrkningsmedium til et ikke podet område af dyrkningsskålen for at minimere desintegration af celler.
    4. Udfør en halv til fuld medium ændring på celle dyrkningsskåle ved 3 d intervaller i 3 uger.

    • 2. Høst Dyrkede-dopaminerge neuroner til RNA-sekventering

    BEMÆRK: En oversigt over protokol cellen høst og single-celle-RNA-sekventering er givet i figur 1.

    1. Trin for at udføre før dagen af ​​forsøget
      1. Ren borosilikatglas kapillarrør ved lydbehandling i 100% ethanol i 15 minutter og derefter igen i destilleret H2O i 15 minutter. Dræn slangen og bages natten over i en ovn ved 200 ° C for at inaktivere RNase.
      2. Brug nyåbnetRNase-fri pipettespidser til fremstilling af en stamopløsning på 10x reaktionsbuffer ved blanding 19 eliter 10X lyseringspuffer fra sekventeringskittet med 1 pi RNase inhibitor-opløsning (20 pi totalvolumen) i et mikrocentrifugerør. Spin ned blandingen kortvarigt under anvendelse af en mikro-centrifuge og holde på is.
      3. Tilsæt 2 pi af 10x reaktionsbuffer til hver af de individuelle 0,2 ml PCR-rør (der anvendes til indsamling de høstede neuroner). Mærk rørene med passende tags identificerer neuroner til at blive høstet og opbevares nedfrosset ved 4 ° C.
    2. Trin for at udføre på Day of the Experiment
      1. Fabrikation af Høst pipetter.
        1. Træk diameter mikropipetter stor-tip (ved 2 - 8 pm) fra den bagte kapillarrør ved hjælp af en mikroelektrode aftrækker og glas-belagte filamenter af en microforge opvarmning. Indstil aftrækker til at danne mikropipetter med lang konus. Brug en microforge udstyret med et kalibreret okular stregglasset og en høj effekt obsubjektive at bryde spidsen af ​​mikropipetten til den ønskede dysestørrelse (10 - 20 um).
        2. Fastgør mikropipetten i pipette holderen microforge og montere holderen på microforge. Bringe spidsen af ​​mikropipette i fokus over glas-coatet filament opvarmning ved hjælp af den mekaniske manipulator af microforge og kontakten på strøm til glødetråden for at varme det. Berør pipettespidsen til den opvarmede filament. Sluk for strømmen, når pipettespidsen er smeltet til den passende diameter.
          BEMÆRK. Afbrydelse af strøm vil forårsage glødetråden til at bevæge sig pludseligt nedad og løsnes fra pipettespidsen, der producerer en stor, åben pipette med den ønskede diameter.
        3. Opbevar de færdige mikropipetter i en lukket kasse indtil brug.
      2. Høst af neuroner.
        BEMÆRK. Dyrkede neuroner blev høstet efter en modificeret version af en tidligere offentliggjort protokol 6.
        1. grundigt clEAN alle overflader af cellen høst rum, der kommer i kontakt med kulturer retter og opsamlingsrør anvender flydende desinfektionsmiddel og vand efterfulgt af skylning med vand. Tør den desinficerede overflader med 80% ethanol og derefter en RNase-inhibitor-infunderes serviet.
        2. Fyld to isolerede beholdere med is, et med regelmæssige (vand) is og en anden med tøris. Placer 0,2 ml PCR indsamling rør tidligere fyldt med 2 eliter 10X reaktion buffer på den almindelige is.
        3. Fjern dyrkningsskålen indeholdende neuronerne fra inkubatoren, dræne dyrkningsmediet fra skålen, skylles med 2 ml RNase-fri Dulbeccos PBS (DPBS) og erstat med 1 ml DPBS til høst.
        4. Identificere fluorescerende, TH-positive neuroner i de primære midthjernen kulturer under anvendelse af et omvendt, epifluorescensmikroskop udstyret med en 40X fase objektiv, en Hg-lampe og et GFP filtersæt.
        5. Anbring pipetten over cellen soma anvendelse af en motoriseret eller manuel micromanipulator. Aspirer neuron i glasset mikropipette under forsigtig sugning påføres gennem munden gennem plastrøret fastgjort til sideporten af ​​holderen mikropipetten. Fjern omgående mikropipetten indeholdende cellen fra badopløsningen.
        6. Anbring pipettespidsen i et 0,2 ml PCR-rør samling indeholdende reaktionsbuffer, og bryde spidsen mod siden af ​​røret, nær bunden. Uddrive resterende væske (0,5 - 1.5 pi) fra den brudte spidsen af ​​mikropipette ved at placere en steril 21 G sprøjtenål ​​i bagsiden af ​​mikropipetten og påføring udadgående tryk.
        7. Centrifugeres opsamlingsrøret i 5 s ved anvendelse af en stationær mikro-centrifuge og fryse det i tøris. Opbevar opsamlingsrør indeholdende de enkelte celler ved -80 ° C. Typisk 5-celler høstes pr fad over en periode på 1 time ved omgivelsernes temperatur.

    3. Single-celle-RNA-Seq Bibliotek Generation

      <li> Generering af første streng cDNA
      BEMÆRK: For de følgende trin bruger reagenser fra den kommercielle sekventering kit.
      1. Bring nedenstående reagenser på is til PCR-kabinettet. Forbered en første streng mastermix plus 10% ved at kombinere følgende reagenser ved stuetemperatur i en PCR kabinet: 2 pi 5x første streng buffer, 0,25 pi DTT (100 mM), 1 pi dNTP-blanding (10 mM), 1 pi oligonukleotid ( 12 uM), 0,25 pi RNase inhibitor og 1 pi revers transkriptase (100 enheder). Dette er den omvendte transkriptase mastermix (5,5 pi totalvolumen per reaktion).
      2. Tag prøver fra -80 C på tøris og bringe til PCR kabinet. Tilføj følgende til den enkelt celle prøve: 1 pi 3 'primer 1 og 1 pi kvantificeret RNA spikes. Bring prøver på en chiller blok til en hot-låg thermocycler forudindstillet ved 72 ° C.
      3. Inkubér rørene i thermocycler i 3 min ved 72 ° C, og derefter sætte prøverne på en PCR køligere rack.Tilføj 5,5 uL af master mix (fra trin 3.1.1) til hvert reagensglas og bland ved pipettering forsigtigt. Dreje 0,2 pi rørene i 5 s og inkuber i et thermocycler som følger: 42 ° C i 90 minutter, 70 ° C i 10 minutter. Hold ved 4 ° C.
    1. Oprensning af Amplified First Strand cDNA.
      BEMÆRK: Det PCR-amplificerede cDNA renses ved immobilisering på magnetiske perler. Brug en magnetisk separationsindretning i 0,2 ml glas.
      1. Alikvot de magnetiske perler i 1,5 ml rør. Før hver brug, bringe perle portioner til stuetemperatur i mindst 30 min og bland godt at sprede. Vortex magnetiske perler indtil blandet jævnt.
      2. 25 pi af magnetiske perler til hver prøve. Bland ved pipettering hele volumen op og ned mindst 10x for at blande grundigt. Inkuber ved stuetemperatur i 8 min for at lade cDNA binder til perlerne.
    2. Fremstilling af PCR Master Mix
      1. Forbered ds-cDNA forstærkning PCR Master mix for alle reaktioner med en additional 10% ved blanding af 5 pi 10x PCR-buffer, 2 pi dNTP-blanding (10 mM), 2 pi PCR-primer 2 (12 pM), 2 pi 50x 2 polymerase mix, og 39 pi nuclease frit vand (50 pi totalvolumen / reaktion).
    3. Amplifikation af First Strand
      1. Placer prøverne og magnetiske perler på den magnetiske separation enhed ≥5 min, indtil al væsken er fuldstændig klar, og der er ingen perler tilbage i supernatanten.
      2. Holde prøverne på skilleindretningen, pipettere supernatanten og kasseres. Spin prøverne i 5 s til opsamling af væsken fra den side af røret. Placer prøverne på den magnetiske separation enhed i 30 s, derefter fjerne al resterende supernatant med en P10 pipette.
      3. Der tilsættes 50 pi af PCR-mastermix til hvert rør indeholdende DNA bundet til perlerne fra det foregående trin. Glasset anbringes i en forvarmet termisk cycler (95 ° C) med en opvarmet låg. Påbegynde termisk cykling ved hjælp af følgende program: 95 ° C i 1 min, 26 cykler ved 95 ° C i 15 s, 65 ° C i 30 s, 68 ° C i 6 min. Så 72 ° C 10 min. Hold ved 4 ° C.
        BEMÆRK: Kontakt sekventering brugsanvisning for flere detaljer og til at optimere indstillingerne prøven.
    4. Oprensning af Amplified dobbeltstrengede cDNA
      1. Tilføj 90 pi perler til hver prøve. Bland ved pipettering hele volumen op og ned mindst 10x for at blande grundigt. Inkuber ved stuetemperatur i 8 min for at lade cDNA binder til perlerne. Placer prøverne plus perler på magnetisk separation indretning til ≥5 min, indtil al væsken er fuldstændig klar, og der er ingen perler tilbage i supernatanten.
      2. Mens prøverne er på den magnetiske separation enhed, supernatanten fjernes og kasseres. Hold prøverne på den magnetiske separation enhed. Tilføj 140 pi af frisk gjort 85% ethanol til hver prøve, uden at forstyrre perlerne. Vent i 30 sekunder. Pipette off supernatanten. cDNA vil fortsat være bundet til beads under vaskeprocessen.
      3. Gentag ethanolvask gang mere.
      4. Kort fortalt spinde prøverne til opsamling af væske fra siden af ​​røret. Placer prøverne på den magnetiske separation enhed i 30 s, derefter fjerne al resterende ethanol med en pipette. Placer prøverne ved stuetemperatur til 2 - 2,5 min, indtil pelleten er tørt og ikke længere skinnende (dvs. før en revne vises).
        BEMÆRK: Tør pellet kun indtil det er bare tørt. Pelleten vil se mat uden glans. Hvis pelleten ikke er tør, vil ethanol forblive i prøvebrøndene, hvilket vil reducere det amplificerede cDNA recovery rate og udbyttet. Hvis pelleten er over-tør, vil der være revner i pelleten. Det vil tage længere tid end 2 min at rehydrere og kan reducere forstærket cDNA nyttiggørelse og udbytte.
      5. Når perlerne er tørre, tilsættes 22,5 pi elueringsbuffer til dækning perlen pellet. Fjern prøverne fra den magnetiske separation enhed og bland grundigt at resuspendere perlerne. Icubate ved stuetemperatur i 10 min for at rehydrere.
      6. Spin prøverne i 5 s til opsamling af væsken fra den side af røret. Placer prøverne tilbage på den magnetiske separation indretning til ≥1 min, indtil opløsningen er fuldstændig klar.
        Bemærk: En lille population af perler kan ikke pelletere mod magneten under inkubation. Pipettere disse unpelleted perler op og ned for at resuspendere dem med supernatanten, og derefter pipetteres dem mod magneten hvor resten af ​​perlerne allerede har pelleteret (uden påvirkning af det nuværende pellet).
      7. Fortsæt inkubation indtil der ikke perler forbliver i supernatanten. Overfør klare supernatant indeholdende oprensede cDNA fra hvert rør til en nuklease-fri, lav friktionskoefficient rør. Mærk hvert rør med oplysningerne om prøverne og opbevares ved -20 ° C. Prøverne kan opbevares ved -20 ° C uendeligt.
    5. Måling af DNA-koncentrationen og fragment størrelse
      1. Gennemføre en kvalitetskontrol ved at kvantificere en 1 pi aliquot af cDNA'et på et fluorometer. Vurdere 1 pi (3 ng) af ds-cDNA under anvendelse af et elektroforese-system (som beskrevet i 1).
    6. Opsplitning af DNA
      BEMÆRK: Brug en DNA prøve forberedelse kit.
      1. Der tilsættes 20 pi af cDNA (35 ng i alt) til et rør. Tilsæt 25 pi Tagment DNA (TD) buffer til røret indeholdende cDNA.
      2. Tilsæt 5 uL af TDE1 (Tagment DNA Enzyme) til røret. Pipette op og ned 10x at blande. Brug en ny spids til hver prøve. Der centrifugeres ved 280 xg ved 20 ° C i 1 min.
      3. Placer prøverne i en thermocycler med et opvarmet låg og køre det på: 55 ° C, 5,5 min. Hurtigt tilføje 50 uL QG løsning (gelekstraheringskit). Pipette op og ned 10x at blande. Fortsæt direkte til det næste trin.
    7. Oprensning af fragmenteret DNA
      1. Tilføj 170 pi perler, pipette op og ned 10x at blande. Lad det sidde i 10 min. Sæt rør på magneten. Lad rørene sidde på magneten i 10 min.Mens prøverne er på den magnetiske separation enhed, pipette supernatanten og kassér.
      2. Efterlad røret på magneten og tilsættes 200 pi af 85% ethanol. Lad sidde i 30 s, derefter fjerne ethanol. Gentag ethanol vask. Spin røret 1.000 xg ved stuetemperatur.
      3. Sætte røret tilbage på magneten. Pipette off enhver resterende ethanol. Lad prøverne tørre ved stuetemperatur i 15 minutter.
      4. Tilføj 21 pi elueringsbuffer fra gelekstraktionskittet. Lad slangen sidde magnetenheden, pipette op og ned 10x at blande. Lad røret sidde ved stuetemperatur i 15 minutter.
      5. Retur røret til magneten i 5 min. Pipetter 20 pi opløsning (oprenset DNA) ind i et nyt rør.
    8. Mærkning og PCR-amplifikation af det fragmenterede DNA
      BEMÆRK: I dette trin det rensede DNA forstærkes via en begrænset cyklus PCR-programmet. PCR trin tilføjer også indeks 1 (i7) og indeks 2 (i5) samt fælles adaptere (P5 og P7) (påkrævet for klynge generation og sekventering). Se DNA srigelig forberedelse guide for flere detaljer.
      1. I et nyt rør tilsættes 5 pi indeks 2 primere (hvid cap). Ved hjælp af en ny pipettespids tilsættes 5 pi indeks 1 primer (orange hætte). Tilføj 15 pi PCR Master mix til hvert rør.
      2. Tilsæt 5 pi PCR-primer cocktail til hvert rør. Der tilsættes 20 ul af oprensede DNA til røret. Pipettér forsigtigt op og ned 3 - 5 gange.
      3. Udfør PCR under anvendelse af følgende program på en thermocycler: 72 ° C i 3 minutter, 98 ° C i 30 s, 5 cyklusser af 98 ° C i 10 s, 63 ° C i 30 s, 72 ° C i 3 min. Fastholdelse ved 10 ° C. Fortsæt straks til PCR oprydning eller opbevare prøven ved 4 ° C i op til 2 d.
    9. Oprensning af amplificerede DNA-fragmenter
      1. Bringe perlerne til RT. Forbered frisk 85% ethanol. Tag prøver ud af PCR maskine og spin ned kortvarigt.
      2. Tilsæt 30 pi perler til røret. Forsigtigt pipette blande op og ned 10x. Lad røret stå ved stuetemperatur i 5 min. Place bacK på magneten i 5 min. Med røret på magneten brug en pipette til at skille supernatanten.
      3. Tilsæt 200 pi af 85% ethanol til hvert rør. Pipette ethanol efter 30 s. Gentag ethanolvask den 85%. Pipette ethanol efter 30 s.
      4. Med rørene stadig på magneten og hætter åben, give perlerne lufttørre i 15 min. Fjern rørene fra magneten.
      5. Tilføj 32,5 pi elueringsbuffer. Forsigtigt pipette op og ned 10x. Inkuber off magnet for 10 - 15 min.
      6. Retur rørene til magneten i 2 minutter, eller indtil supernatanten er blokerede. overføre omhyggeligt 30 pi af supernatanten til et nyt rør.
    10. Måling af DNA-koncentrationen og fragmentstørrelse
      1. Foretage en kvalitetskontrol ved kvantificering af DNA-koncentration på 1 pi af cDNA på et fluorometer. Bestem fragmentstørrelse af DNA'et ved elektroforese. Vurdere 1 pi (3 ng) af ds-cDNA.
    11. Sekventering
      1. Bring enkelt celle RNA-Seq biblioteker til en sekventering facilitet. Generer 100 bp sekventering læser på en sequencer efter en tidligere offentliggjort protokol 4.
        BEMÆRK: Hver sekventering bibliotek genererer> 20 millioner entydigt kortlægning læser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Her rapporterer vi en protokol til dyrkning ventrale midthjernen neuroner fra en mus, der udtrykker eGFP drevet af en tyrosinhydroxylase promotorsekvens, høst individuelle fluorescerende neuroner fra kulturerne, og måling af deres RNA transkriptom anvendelse af RNA-seq (figur 1). Dataene viste, at 100% af TH-eGFP-positive celler, der blev høstet og sekventeret var dopaminerge neuroner, baseret på tilstedeværelsen af ​​følgende tre DA-relaterede gentranskripter, TH, dopa-decarboxylase (DDC), og dopamin-transporteren DAT (slc6a3). Alle de TH-eGFP-positive celler udtrykte disse tre gener som bedømt ved RNA-Seq. I hver enkelt celle-RNA-Seq bibliotek 6.000 - blev påvist 8.000 proteinkodende gener (figur 2). De dopaminerge neuroner robust ekspres dopamin-relaterede transkripter foruden adskillige nicotinacetylcholinreceptor (nAChR) underenheder (tabel 1). Vi observerede, at ingent alle de celler, der var negative for TH var GABAerge; derfor vi definerede celler som GABAerge baseret på tilstedeværelsen af ​​Gad1 transkriptet som vurderet ved RNA-seq. De celler, som vi defineret som GABAerge neuroner ikke udtrykker dopamin-relaterede transkripter men som nævnt do udtrykke en større gen for GABA-syntese, Gad1. De encellede biblioteker afslørede også lange ikke-kodende RNA, samt transkripter koder kanaler, receptorer, kerneproteiner, histoner, organellar proteiner og transkriptionsfaktorer.

    figur 1
    Figur 1. RNA-Seq i individuelle neuroner, som udføres i vore forsøg på primær TH-eGFP Mouse midthjernen kulturer. (1) Kultur TH-eGFP mus ventrale neuroner i 3 uger. (2) identificere fluorescerende enkelt neuroner ved at excitere GFP under anvendelse af en Hg lyskilde og FITC / GFP-filter. (3) With samme 40X målet under fase optik, visualisere enkelte neuroner og korrekt placere pipetten. (4. - 5.) Aspirer enkelt celle i glasset mikropipetten. Billeder viser en celle efter høst: (4) Fase 40X; (5) eGFP fluorescens. (6) Lyser celler med lysepuffer med oligo-dT-primer ved 72 ° C. (7) cDNA-syntese; 26 cyklusser amplifikation. (8) Transposon-medieret "tagmentation" af cDNA. (9) cDNA kvalitetskontrol og multiplex sekventering. (10) Efter beregningsmæssige analyse ved hjælp Tophat, manchetknapper og Cuffdiff 7. Relative forekomst af udtrykte gener blev målt i enheder af fragmenter pr kilobase af transkript pr million kortlagt læser (FPKM). Målet med RNA-seq er at tilvejebringe en liste af gener udtrykt i en celle og deres relative forekomst. Billeder (2 - 4) er fra den aktuelle work, (6-10) er modificeret fra en tidligere rapport 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Figur 2
    Figur 2. The Number af Protein Coding Gener påvist i Single Dopaminerg RNA-Seq biblioteker Genereret fra TH-eGFP-positive celler. 6.000 - 8.000 protein gener blev detekteret i de enkelte celle biblioteker. FPKM: Fragmenter pr kilobase af udskrift per million kortlagt læser (FPKM). Klik her for at se en større version af dette tal.

    Gener DA enkelte celler n = 10 GABAerge enkelte celler n = 7
    FPKM (gennemsnit ± SEM)
    TH 4714 ± 764 1,2 ± 0,14
    DDC 779 ± 167 0,8 ± 0,1
    slc6a3 / DAT 506 ± 144 0,5 ± 0,04
    Drd2 14 ± 8 0,1 ± 0,004
    chrna6 (α6) 174 ± 57 0,0
    chrna4 (α4) 17 ± 5 26,4 ± 2,3
    chrnb2 (β2) 9 ± 3 17,3 ± 1,2
    chrnb3 (β3) 38 ± 13 0,0
    Gad1 0,0 959,0 ± 70,0
    Htr3a 0,0 0,6 ± 0,01
    Htr3b 0,0 0,0

    Tabel 1. Dopamin-relaterede og nAChR Gene Udskrifter i dopaminerge og GABAerge neuroner på dag 21 i VentrMidbrain Cultures. RNA-Seq data for TH-eGFP positive og negative neuroner er vist. Enkelte celler blev høstet på kultur dag 21. RNA-Seq data viser, at TH-eGFP positive neuroner havde høje niveauer af DA-relaterede gen udskrifter, herunder tyrosinhydroxylase (TH), dopa decarboxylase (DDC), dopamin-transporteren DAT (slc6a3) og nicotinacetylcholinreceptor (nAChR) underenheder herunder α6, α4, β2 og β3. Men disse celler havde lave niveauer af GABAerge markørgenet glutaminsyredecarboxylase 1 (Gad1) og serotonin 5-HT3 receptor A og B-underenheder (Htr3A og Htr3B). GABAerge neuroner har lav eller ingen niveaueraf DA-relaterede gen udskrifter, chrna6, chrnb3 og Htr3A / B, men har høje niveauer af Gad1. RNA-Seq (Cuffdiff) data er vist for dopamin-relaterede, GABAerge, nikotinsyre receptor, og serotonin udskrifter. FPKM: Fragmenter pr kilobase af udskrift per million kortlagt læser (FPKM).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her isolere vi enkeltceller fra en heterogen population ved anvendelse af et fluorescerende mærke, derefter studere hver celle med enkelt-celle-RNA-seq. Vi rapporterer, at 100% af de levende TH-eGFP celler, som vi høstet og sekventeret var faktisk dopaminerge neuroner, baseret på tilstedeværelsen af ​​følgende tre DA-relaterede gentranskripter, TH, DDC og slc6a3. Alle de TH-eGFP-positive celler udtrykte disse tre gener som bedømt ved RNA-Seq. Dette var overensstemmende med elektrofysiologiske undersøgelser, der viste, at hver TH-eGFP celle vises også et repertoire af ionkanaler forbundet med dopaminerge neuroner 8, 9. I denne protokol udnyttet vi GENSAT tyrosinhydroxylase-eGFP musestamme 10 som en pålidelig markør for levende dopaminerge neuroner. I WT kulturer er der i øjeblikket ingen pålidelig måde at identificere levende dopaminerge neuroner baseret på deres morfologi. Trods vores omfattende erfaring inden idenficere og optagelse fra dopaminerge neuroner, i vildtype kulturer kun tre ud af ti af de formodede dopaminerge celler høstet var dopaminerge neuroner. Derudover observerede vi, at ikke alle de celler, der var negative for TH var GABAerge. Vi definerede celler som GABAerge baseret på tilstedeværelsen af ​​Gad1 transkriptet og fraværet af det DA-relaterede transkripter som bedømt ved RNA-seq.

    Fordi dopaminerge neuroner udgør et lille mindretal af de neuroner, der er udtrykt i primære VM kulturer, vil evnen til pålideligt identificere disse neuroner i levende kulturer forøge omfanget af tilgængelige encellede undersøgelser. Denne protokol kan anvendes til neurobeskyttelse, neurodegeneration, og farmakologiske assays til at undersøge virkningerne af forskellige behandlinger på dopaminerge transkriptomet. Derudover kan man bruge denne protokol til immunhistokemisk, elektrofysiologisk, BioPhotonic 11, og i princippet proteom analyser. DetSE assays er specielt nyttigt for Parkinsons sygdom og afhængighed forskning. Men naturligvis analoge protokoller, på GENSAT mus eller tilsvarende mærkede mus, kan anvendes til andre sygdomstilstande eller for celler, der er sjældne. Desuden er denne protokol giver en spirende baggrund af den uensartede inden for en given neuronal undertype.

    I tidligere undersøgelser, efter høst af enkelt celle placeret vi det direkte i PBS; men nu placere vi den høstede enkelt celle direkte i reaktionspuffer. Dette resulterer i bedre kvalitet RNA-Seq biblioteker som vurderet ved antal gener opdaget i hvert bibliotek. En af de største begrænsninger teknik er, at der må fluorescerende mærkede celler. Som nævnt tidligere, er der ingen virkelig pålidelig måde at identificere en specifik celletype i en blandet kultur baseret på morfologi. Det store udvalg af celle-specifikke fluorescerende eller Cre-udtrykkende muse linjer nu giver passende markeret celler i mange tilfælde. Men pleje should skal træffes, når der vælges en egnet fluorescerende mus linje, som en omfattende undersøgelse af transgene mus linjer fandt, at TH-Cre knock-in mus linjer udviser udtalt transgen ekspression i nondopaminergic celler 12.

    Derudover blev en skridt, der muligvis skal optimeres i fremtidige eksperimenter er den ønskede spids størrelse mikropipetten. Hvis fremtidige eksperimenter omfatter anvendelsen af ​​andre end dopaminerge neuroner celletyper, kan mikropipettespidsen størrelse skal optimeres for cellen af ​​interesse.

    RNA dyb sekventering er en mere kraftfuld teknik end microarrays. RNA-Seq giver godt løb-til-run reproducerbarhed. Det dynamiske område detekteres, er sammenlignelig med den faktiske transkript overflod i celler. Man kan detektere alternative splejsede former og nye isoformer. De novo-analyse af prøver uden reference gen er muligt; og hvis en ny henvisning gen opdaget data kan genbruges analyseres forspecifikt gen (er) uden at skulle køre den våde-arbejde eksperiment igen 13.

    For at opsummere, rapporterer vi, at 100% af de levende TH-eGFP-celler, der blev høstet og sekventeret var dopaminerge neuroner. Denne teknik forlænger andre rapporter, der identificerer akut dissocierede eller langsigtede dyrkede dopaminerge neuroner fra GENSAT mus, 14, 15 og teknikken vil have udbredt applikationer i neurovidenskab og molekylærbiologi.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
    Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x Gibco  14175-095
    Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
    Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
    Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
    L-Ascorbic acid Sigma  A7506
    B27 Gibco  17504-044 50x stock solution, 1x final concentration.
    35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
    Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
    Laminin Sigma  L2020 Stored at -20 °C in 20 µL aliquots
    Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
    Blue pipette tips P1000 Sorenson Bioscience  Inc. 10130
    10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
    37 °C Water bath
    37 °C, 5% humidity incubator
    16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
    Triton X-100 Sigma  X100-500ML
    Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
    Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
    Forceps - 2x3 teeth Fine Science Tools 11022-14
    Forceps - Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
    Forceps - Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
    10x PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
    Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x Gibco 14190-144 500 mL
    21 G needle BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
    Micropipette puller Sutter Instrument model P-87
    Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
    Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit
    oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
    Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
    Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
    Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
    50x 2 polymerase mix 50x Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
    10x PCR buffer 10x Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
    RNA Spikes ThermoFisher 4456740
    PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack
    DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
    PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
    PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
    Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
    HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110 rxns
    Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
    Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5 mL
    RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
    Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
    Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
    Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.)
    Microforge Narishige (or equivalent) 
    Sequencer Illumina HiSeq instrument
    GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
    2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
    3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
    4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
    5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
    6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
    7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
    8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
    9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
    10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
    11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
    12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
    13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
    14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
    15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

    Tags

    Neuroscience encellede RNA-sekventering cellehøst midthjernen kulturer dopaminerge neuroner Parkinsons sygdom
    Pålidelig Identifikation af Living dopaminerge neuroner i midthjernen Cultures Brug RNA Sequencing og TH-promotor-drevet eGFP Expression
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. … More

    Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter