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Neuroscience

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/54981
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Summary

Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.

Abstract

Nella malattia di Parkinson (PD) non vi è perdita neuronale diffusa in tutto il cervello con degenerazione dei neuroni dopaminergici pronunciata nel snc, che porta a bradicinesia, rigidità, e tremore. L'identificazione dei neuroni dopaminergici che vivono in colture primarie ventrale mesencefalica (VM) utilizzando un marcatore fluorescente fornisce un modo alternativo per studiare la vulnerabilità selettiva di questi neuroni senza fare affidamento sul immunocolorazione delle cellule fissate. Qui, isolare, dissociamo, e la cultura di topo neuroni VM per 3 settimane. Abbiamo poi identifichiamo neuroni dopaminergici nella coltura usando eGFP fluorescenza (guidata da un promotore tirosina idrossilasi (TH)). neuroni individuali sono raccolte in provette da microcentrifuga utilizzando micropipette di vetro. Successivamente, abbiamo la lisi delle cellule raccolte, e condurre la sintesi del DNA e trasposoni-mediata "tagmentation" per produrre librerie di RNA-Seq singola cella 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Dopo aver superato un controllo di qualità-controllo, librerie unicellulari sono in sequenza e la successiva analisi viene effettuata per misurare l'espressione genica. Riportiamo i risultati trascrittoma per dopaminergici individuale e neuroni GABAergici isolati da colture mesencefalo. Si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che sono stati raccolti e sequenziati erano neuroni dopaminergici. Queste tecniche avranno applicazioni diffuse nel campo delle neuroscienze e della biologia molecolare.

Introduction

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa incurabile, legate all'età. La causa di questo disturbo relativamente comune rimane poco compresa. Vi è diffusa perdita neuronale in tutto il cervello, con marcata degenerazione neuronale dei neuroni dopaminergici nella sostanza nera (SNC), che porta a caratteristiche cliniche diagnostiche di bradicinesia, rigidità e tremori.

colture miste primarie contenenti neuroni dopaminergici SNC sono particolarmente rilevanti per la malattia di Parkinson. Ventrale tegmentale Area (VTA) neuroni dopaminergici sono stati implicati nella ricompensa e la dipendenza. Ventrale mesencefalico (VM) colture primarie embrionali miste contengono sia i neuroni SnC e VTA dopaminergici (DA) e neuroni GABAergici. VM colture primarie possono essere utili per saggi neuroprotezione e per chiarire la vulnerabilità selettiva dei neuroni dopaminergici. Non vi è alcun modo affidabile per identificare le cellule dopaminergiche in coltura basati sulla morfologia. luire sviluppiamo tecniche per identificare e raccogliere i neuroni dopaminergici singoli, e costruire unicellulari, ad alto rendimento librerie RNA di sequenziamento.

Riportiamo i dati rappresentativi RNA trascrittoma per singola dopaminergici e neuroni GABAergici isolati da colture mesencefalo. Questo protocollo può essere utilizzato per la neuroprotezione, neurodegenerazione, e saggi farmacologici per studiare gli effetti dei vari trattamenti sul trascrittoma DA / GABA. Perché neuroni dopaminergici rappresentano una piccola minoranza dei neuroni espresse in colture primarie VM, la capacità di identificare in modo affidabile questi neuroni in culture che vivono consentirà una maggiore gamma di studi unicellulari. Queste nuove tecniche faciliteranno progressi nella comprensione dei meccanismi che si svolgono a livello cellulare e possono avere applicazioni altrove nel campo delle neuroscienze e della biologia molecolare.

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Protocol

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali forniti dal National Institutes of Health, e protocolli sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso il California Institute of Technology.

1. Derivazione di primaria dopaminergici colture cellulari da Brain embrionali di topo

  1. Soluzioni e terreno di coltura
    1. Preparazione di Acido Ascorbico della Soluzione
      1. Pesare 352 mg di acido ascorbico. Aggiungere sterile H 2 O per un volume totale finale di 20 mL. Posto nel 37 ° C bagnomaria per sciogliere. Filtrare 0,2 micron punta della siringa e conservare in 500 microlitri aliquote a -20 ° C.
    2. Preparazione di papaina della Soluzione
      1. Diluire papaina a 15 unità / ml in soluzione Salt Hanks' equilibrata 1x (HBSS). Pipetta su e giù per 5 volte per mescolare accuratamente. Preparare il giorno della dissezione.
    3. Preparazione di DNasi della Soluzione
      1. Pesare 20 mg di DNasi. Aggiungere sterile H 2 O per un volume finale di 20 ml. filtro sterile con 0,2 micron punta filtro siringa. Conservare a -20 ° C in 1 aliquote mL.
    4. Preparazione della soluzione di stop
      1. Diluire 5 ml donatori siero di cavallo equina al 10% in 45 ml 1x HBSS. filtro sterile con una punta di 0,2 micron filtro siringa. Conservare a 4 ° C.
    5. Preparazione del 4% soluzione madre (BSA) albumina sierica bovina
      1. Pesare 2 g di BSA e aggiungere 1x con tampone fosfato salino (PBS) ad un volume finale di 45 ml. Filtro sterilizzare con 0,2 micron punta filtro per siringa. Conservare a 4 ° C.
    6. Preparazione di placcatura Media
      1. In 494 ml di mezzo, aggiungere 1,25 mL terreni di coltura che contiene L-alanil-L-glutammina (fonte stabilizzata di L-glutammina) e 5 ml di siero donatore equina. Filtro sterilizzare con 0,2 micron siringa filpunta ter. Conservare a 4 ° C.
    7. Preparazione del mezzo di coltura cellulare
      1. In 196 ml di media placcatura, aggiungere 4 ml B27 e acido ascorbico 200 ml. Filtro sterilizzare con 0,2 micron filtro. Conservare la soluzione a 4 ° C ed utilizzare entro una settimana.
    8. Preparazione di 4% paraformaldeide (PFA) Soluzione
      Attenzione: le precauzioni generali per l'utilizzo di paraformaldeide sono i seguenti: utilizzare una cappa aspirante, evitare la pelle e con gli occhi, evitare l'inalazione dei vapori, tenere lontano da fonti di calore o fiamme libere. Indossare indumenti di protezione personale. PFA può causare sensibilizzazione e dermatite, quindi lavare accuratamente le mani dopo aver maneggiato.
      1. Aggiungere 10 ml di 16% PFA per 30 ml di 1x PBS, pH 7,4.
    9. Preparazione del 0,1% Triton X-100
      1. Pipettare 1 mL Triton X-100 in 9 mL PBS 1x per ottenere una soluzione al 10%. Pipetta lentamente per permettere una soluzione viscosa di riempire punta della pipetta. Caldo in 37 ° C bagnomaria a disrisolvere. Conservare 10% stock a 4 ° C.
      2. Diluire il 10% dello stock da 0,01% (ad esempio, eseguendo 2 seriali 1:10 diluizioni: diluire 1 mL di soluzione 10% in 9 ml di PBS 1x per rendere soluzione all'1%; 1 ml di soluzione di 1% in 9 ml di PBS 1x per fare soluzione allo 0,1%).
    10. Preparazione del 10% e l'1% di siero asino
      1. Aggiungere 1 ml di siero asino 9 mL di PBS 1x per una soluzione al 10%. Aggiungere 0,5 ml di siero asino al 49,5 mL di PBS 1x, pH 7,4 per una soluzione 1%.
    11. Preparazione di PBS 1x
      1. Diluire 10x PBS a 1x aggiungendo 50 ml in 450 ml di H 2 O. Regolare il pH della soluzione a pH 7,4 utilizzando un pHmetro.
  2. Rivestimento i piatti della cultura
    1. Poly-L-ornitina Coating
      1. Coat soltanto i 10 mm Inferiore vetro del diametro al centro di tutti i piatti 35 mm con 120 microlitri di poli-L-ornitina con tecnica sterile. Incubare per 1 ora a 37 ° C. Utilizzare un aspiratore per aspirare il poli-Lornithine. Lavare i piatti due volte con H 2 O. sterili
    2. Laminina Coating (magazzino concentrazione di 1 mg / ml)
      1. Diluire 20 ml laminina con 2 ml di H 2 O sterile (concentrazione finale 0,01 mg / ml).
      2. Coat solo il fondo di vetro diametro di 10 mm al centro di tutte le stoviglie con 120 ml di laminina diluito a 0,01 mg / mL con tecnica sterile, e incubare per 1 ora o O / N a 37 ° C prima dell'uso.
  3. mouse Dissection
    NOTA: I metodi in questo dissezione sono progettati per ridurre al minimo l'esposizione di cellule, come vengono trasferiti da sacchi embrionali per la cultura incubatore. La vitalità delle cellule è conservata rimuovendo solo una parte del cervello per dissezione del mesencefalo. Isolamento del ricavato mesencefalo più rapidamente senza la necessità di sezionare l'intero cervello per accedere alla regione. Vedere la Tabella dei Materiali per il ceppo del mouse utilizzato in questo studio. Euthanize un mouse incinta cronometrato il gestazionale giorno 14 con CO 2.
  4. Spruzzare l'addome del mouse eutanasia con il 70% di etanolo. Afferrare la pelle del basso addome con pinze a 2 x 3 denti e aprire la cavità addominale con lama smussata forbici chirurgiche. Fare due tagli spostano lateralmente e prossimalmente su ogni lato. Ripiegare la parete addominale con pinze per esporre la cavità addominale.
    NOTA: L'utero è ora esposta. L'esposizione del cavità pleurica e la creazione di pneumotorace assicura anche che l'animale non recuperare.
  5. Tagliare entrambe le estremità del corno uterino per separare l'utero. Mettere in una capsula di Petri in una cappa sterile.
  6. Utilizzando pinze dritto-punta in ogni mano aprire il sacco embrionale e rimuovere l'embrione. decapitate rapidamente pizzicando la testa fuori al collo con le pinze. Stabilizzare la testa con le pinze saldamente collocati sul muso modo che la superficie dorsale è accessibile.
  7. Utilizzando le pinze detenute in altri ettariND, pizzicare la strato di pelle e il cranio poco prima della cresta del mesencefalo. Sbucciare indietro la pelle e il cranio caudale lungo la linea mediana. Posizionare una pinza intorno al crinale con una punta tra la corteccia e il mesencefalo e l'altra sopra il cervelletto.
  8. Pinch e rimuovere l'intero mesencefalo, lasciando dietro di sé il prosencefalo sul lato rostrale del cervelletto e sul lato caudale. Mettere in una capsula di Petri con HBSS freddo sotto un microscopio da dissezione.
  9. Ripetere la procedura per i restanti embrioni.
  10. Al microscopio da dissezione, capovolgere il segmento cervello in modo che il lato ventrale è ora accessibile. Ora ci sono 4 quadranti visibile. Rimuovere tutti i meningi e vascolarizzazione afferrando delicatamente le meningi e tirando verso l'alto lontano dal cervello.
  11. Utilizzare pinze per stabilizzare il segmento cervello mentre separa il mesencefalo. Mettere una pinza di pinze nel ventricolo approssimativamente al centro del segmento. Effettuare la prima dorsale pizzico, indicando into il piatto, poi medialmente su ogni lato. Prendete i due quadranti inferiori facendo tagli laterali su entrambi i lati.
    NOTA: Il tessuto di interesse è nella parte inferiore ventrale, che appare densa. Questa regione contiene sia il VTA e SNc.
  12. Tagliare ed eliminare il tessuto che è meno densa: questo include il collicoli superiore ed inferiore. Posizionare il tessuto sezionato contenente sia il VTA e SNC nella fresca HBSS in una zona separata della scatola di Petri.
    NOTA: In questa fase di sviluppo del cervello di topo (E14), la regione di interesse nel mesencefalo ventrale è separato da un ventricolo dal incerta zona e altri gruppi di cellule ipotalamiche. La struttura più allungata del sviluppo del cervello embrionali di topo permette la distinzione tra queste aree, che si trovano più vicini nel cervello di topo adulto.
  13. Ripetere l'operazione per tutti i segmenti del cervello rimanenti.
  14. Dopo che tutti i segmenti del cervello sono stati sezionati, usare una pinza e un bisturi n ° 11 a quarto bissezione mesencefalo ch in pezzi di approssimativamente uguale dimensione.
  • Dissociare le cellule
    1. Trattamento enzimatico delle cellule
      1. Utilizzare un ampio tunnel punta della pipetta P1000 a prendere tutti i segmenti del mesencefalo squartati in HBSS e metterli in un tubo da 15 ml. Che i segmenti depositano sul fondo della provetta e rimuovere HBSS che è stato ripreso con i pezzi in quarti.
      2. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di papaina al tubo e posto in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min. Risospendere le cellule di un dito muovendo il tubo dopo 7.5 min.
      3. Utilizzando una punta P1000 ampio tunnel, pipette solo i segmenti mesencefalo in una aliquota 1 ml di soluzione deossiribonucleasi I (DNasi). Lasciare i segmenti di depositarsi sul fondo della provetta.
      4. Utilizzando una punta P1000 ampio tunnel, trasferire solo i segmenti mesencefalo in una provetta da 15 ml contenente 1 ml di soluzione di arresto a freddo per sciacquare. Che i segmenti depositano sul fondo della provetta e ripetere il risciacquo sullace di più.
    2. La triturazione meccanica di Cell Suspension
      1. Sostituire l'ultimo risciacquo con 1 ml di soluzione di arresto fresco e pipetta su e giù 7x con una punta P1000 pipetta per triturare le cellule. Evitare di triturazione per ridurre al minimo la lisi cellulare.
      2. UNDERLAY la sospensione cellulare pipettando lentamente 200 ml di soluzione di BSA 4% sul fondo della provetta. ritirare con cura la punta della pipetta per evitare di interrompere lo strato di sospensione cellulare. Dopo centrifugazione a 280 xg per 6 minuti, aspirare il surnatante con P1000 e risospendere le cellule in 1 ml di placcatura medie.
  • Contare e placcatura le cellule
    1. Eseguire la conta delle cellule utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare a 1.000 cellule / ml, con placcatura media.
    2. Utilizzando un aspiratore, aspirare il laminina dai piatti rivestiti, in lotti di al massimo tre piatti. Piastra 120 ml (1,2 x 10 5 cellule / piatto (78,5 millimetri 2
    3. Dopo 1 h, aggiungere accuratamente 3 mL di terreno di coltura ad una zona unseeded del piatto cultura per minimizzare la rottura delle cellule.
    4. Eseguire un mezzo a pieno cambiamento medio sui piatti di coltura cellulare ad intervalli di 3 d per 3 settimane.

    • I neuroni 2. raccolta coltivate-dopaminergici per RNA Sequencing

    NOTA: Una panoramica del protocollo cellula-raccolta e cella singola RNA-Sequencing è dato in Figura 1.

    1. I passaggi da eseguire prima del giorno dell'esperimento
      1. Capillare di vetro borosilicato Clean tubi mediante sonicazione in 100% di etanolo per 15 min e poi di nuovo in H 2 O distillata O per 15 min. Scolare il tubo e cuocere notte in un forno a 200 ° C per inattivare RNasi.
      2. Utilizzare appena apertopunte di pipette RNasi-free per preparare una soluzione stock di 10x tampone di reazione mescolando 19 ml di 10x tampone di lisi dal kit di sequenziamento con 1 ml di soluzione di inibitore RNasi (20 microlitri di volume totale) in una provetta. Spin giù la miscela per breve tempo con un micro-centrifuga e tenere in ghiaccio.
      3. Aggiungere 2 microlitri di tampone 10x reazione a ciascuno dei singoli tubi 0,2 mL per PCR (utilizzati per raccogliere i neuroni raccolti). Etichettare le provette con tag appropriati identificativi neuroni di essere raccolte e conservare congelati a 4 ° C.
    2. I passaggi per eseguire sul giorno dell'esperimento
      1. Realizzazione delle pipette di raccolta.
        1. Tirare micropipette di grande diametro-Tip (2-8 micron) dal tubo capillare al forno con un estrattore microelettrodo e il riscaldamento del filamento di vetro rivestita di un microforge. Impostare l'estrattore per formare micropipette con un lungo cono. Utilizzare un microforge dotato di un reticolo oculare calibrato ed un OB ad alta potenzaproiettiva per rompere la punta della micropipetta per la dimensione punta desiderata (10-20 micron).
        2. Fissare la micropipetta nel supporto pipetta microforge e montare il supporto sul microforge. Portare la punta della micropipetta a fuoco sopra del filamento di riscaldamento di vetro rivestite con il manipolatore meccanico del microforge ed accendere la corrente al filamento per riscaldarla. Toccare la punta della pipetta al filamento riscaldato. Spegnere la corrente quando la punta della pipetta si è sciolto al diametro appropriato.
          NOTA. Escludere la corrente farà sì che il filamento di muoversi improvvisamente verso il basso e staccare dalla punta della pipetta, producendo una grande, pipetta aperto a punta con il diametro desiderato.
        3. Conservare le micropipette completati in una scatola chiusa fino a quando necessario.
      2. La raccolta dei neuroni.
        NOTA. Neuroni in coltura sono state raccolte a seguito di una versione modificata di un protocollo precedentemente pubblicato 6.
        1. completamente clean tutte le superfici della sala celle-raccolta che entrano in contatto con i piatti culture e tubi di raccolta utilizzando liquido disinfettante e acqua seguita da un risciacquo con acqua. Pulire le superfici disinfettate con l'80% di etanolo e poi un RNase-inibitore infuso wipe.
        2. Riempire due contenitori isolati con ghiaccio, uno con regolare ghiaccio (acqua) e un altro con ghiaccio secco. Mettere le provette per il prelievo di 0,2 ml per PCR riempite in precedenza con 2 ml di tampone di reazione 10x sul ghiaccio regolare.
        3. Rimuovere il piatto di coltura contenente i neuroni dal termostato, drenare il terreno di coltura dal piatto, sciacquare con 2 ml di RNasi-free Dulbecco PBS (DPBS) e sostituirlo con 1 ml di DPBS per la raccolta.
        4. Identificare fluorescenti, i neuroni TH-positivi nelle colture primarie mesencefalo utilizzando un invertito, epifluorescenza microscopio dotato di un obiettivo 40X di fase, una lampada Hg, e un set di filtri GFP.
        5. Posizionare la pipetta sul soma cellulare mediante un mi motorizzato o manualecromanipulator. Aspirare il neurone nel micropipetta di vetro con aspirazione delicata applicato dalla bocca attraverso il tubo di plastica collegato alla porta laterale del titolare micropipetta. Rimuovere immediatamente la micropipetta contenente la cella dalla soluzione balneazione.
        6. Posizionare la punta della pipetta in un tampone di reazione contenente 0,2 ml PCR raccolta tubo, e rompere la punta contro il lato del tubo, vicino al fondo. Espellere il fluido rimasto (0,5 - 1.5 mL) dalla punta rotta della micropipetta mettendo una sterile 21 G ago della siringa nella parte posteriore della micropipetta e applicando pressione verso l'esterno.
        7. Centrifugare il tubo di raccolta per 5 s utilizzando un desktop micro-centrifuga e congelarlo in ghiaccio secco. Conservare le provette per il prelievo contenenti le singole celle a -80 ° C. Tipicamente, 5 cellule sono raccolte a piatto nell'arco di 1 ora a temperatura ambiente.

    3. Single-cell RNA-Seq Biblioteca Generation

      <li> Generazione del primo filamento di cDNA
      NOTA: Per le seguenti operazioni utilizzano reagenti dal kit di sequenziamento commerciale.
      1. Portare i reagenti sotto sul ghiaccio al mobile PCR. Preparare un primo master mix filone più il 10% combinando i seguenti reagenti a temperatura ambiente in un armadio PCR: 2 microlitri 5X Buffer primo filone, 0,25 ml DTT (100 mm), dNTP mix 1 ml (10 mm), 1 ml di oligonucleotidi ( 12 micron), 0,25 ml RNase Inhibitor, e 1 ml trascrittasi inversa (100 unità). Questo è il master mix trascrittasi inversa (5,5 microlitri di volume totale per reazione).
      2. Prendere i campioni dal -80 C in ghiaccio secco e portare al mobile PCR. Aggiungere il seguente al campione singola cella: 1 ml 3 'primer 1 e 1 ml quantificato picchi di RNA. Portare i campioni su un blocco refrigeratore ad un termociclatore preset hot-lid a 72 ° C.
      3. Incubare le provette nel termociclatore per 3 minuti a 72 ° C, e poi mettere i campioni su una PCR cremagliera raffreddamento.Aggiungere 5,5 microlitri della master mix (dal punto 3.1.1) per ciascun tubo di reazione e mescolare pipettando delicatamente. Spin tubi 0,2 microlitri per 5 s ed incubare in un termociclatore come segue: 42 ° C per 90 min, 70 ° C per 10 min. Tenere a 4 ° C.
    1. Purificazione di Amplified First Strand cDNA.
      NOTA: Il cDNA PCR-amplificato viene purificato per l'immobilizzazione su sfere magnetiche. Utilizzare un dispositivo di separazione magnetica per 0,2 mL.
      1. Aliquota le sfere magnetiche in provette da 1,5 ml. Prima di ogni utilizzo, portare aliquote perline a temperatura ambiente per almeno 30 minuti e mescolare bene per disperdere. sfere magnetiche Vortex fino mescolata in modo omogeneo.
      2. Aggiungere 25 ml di sfere magnetiche per ogni campione. Mescolare pipettando l'intero volume su e giù per almeno 10 volte per mescolare completamente. Incubare a temperatura ambiente per 8 minuti per consentire la legano cDNA ai talloni.
    2. Preparazione di PCR Master Mix
      1. Preparare la master mix ds-cDNA PCR per tutte le reazioni con un additionale 10% mescolando buffer di 5 ml 10x PCR, dNTP mix 2 ml (10 mm), 2 microlitri PCR Primer 2 (12 micron), 2 microlitri 50x 2 polimerasi mix, e 39 microlitri di acqua priva di nucleasi (50 microlitri volume totale / reazione).
    3. Amplificazione di First Strand
      1. Porre i campioni e perline magnetiche sulla separazione magnetica dispositivo ≥5 min, fino a quando il liquido non appare completamente chiaro, e non vi sono perline rimaste nel surnatante.
      2. Mantenere i campioni sul dispositivo di separazione, pipetta il surnatante e scartare. Spin i campioni per 5 s per raccogliere il liquido dal lato del tubo. Posizionare i campioni sul dispositivo di separazione magnetica per 30 s, quindi rimuovere tutto il surnatante rimanente con una pipetta P10.
      3. Aggiungere 50 microlitri della master mix PCR in ogni provetta contenente il DNA legato alle perle del passaggio precedente. Posizionare il tubo in un termociclatore preriscaldato (95 ° C) con un coperchio riscaldato. Iniziare il ciclo termico utilizzando la seguente program: 95 ° C per 1 minuto, 26 cicli di 95 ° C per 15 s, 65 ° C per 30 s, 68 ° C per 6 min. Poi 72 ° C 10 min. Tenere a 4 ° C.
        NOTA: consultare utente di sequenza manuale per maggiori dettagli e per ottimizzare le impostazioni di esempio.
    4. Purificazione di cDNA amplificato a doppia elica
      1. Aggiungere 90 ml di perline per ogni campione. Mescolare pipettando l'intero volume su e giù per almeno 10 volte per mescolare completamente. Incubare a temperatura ambiente per 8 minuti per consentire la legano cDNA ai talloni. Posizionare i campioni più perline sul dispositivo di separazione magnetica per ≥5 minuti, fino a quando il liquido non appare del tutto chiaro, e non ci sono perle di sinistra nel surnatante.
      2. Mentre i campioni sono sul dispositivo di separazione magnetica, rimuovere il surnatante e scartare. Mantenere i campioni sul dispositivo di separazione magnetica. Aggiungere 140 ml di appena fatto 85% di etanolo per ogni campione senza disturbare le perline. Attendere 30 s. Pipetta il sopranatante. cDNA rimarrà legato al beads durante il processo di lavaggio.
      3. Ripetere il lavaggio etanolo ancora una volta.
      4. Brevemente girare i campioni per raccogliere il liquido dal lato del tubo. Porre i campioni sul dispositivo di separazione magnetica per 30 s, quindi rimuovere tutta l'etanolo residuo con una pipetta. Porre i campioni a temperatura ambiente per 2 - 2,5 min finché il pellet è secco e non lucido (cioè prima che appaia una crepa).
        NOTA: Asciugare il pellet solo fino a quando si tratta solo di asciutto. Il pellet sarà opaco, senza brillare. Se il pellet non è asciutta, l'etanolo rimarrà nei pozzetti del campione, che ridurrà il tasso di recupero cDNA amplificato e la resa. Se il pellet è troppo secca, ci saranno crepe nel pellet. Ci vorrà più di 2 minuti per reidratare e può ridurre il recupero cDNA amplificato e la resa.
      5. Una volta che le perle sono secchi, aggiungere 22,5 ml di tampone di eluizione per coprire il pellet tallone. Rimuovere i campioni dal dispositivo di separazione magnetica e mescolare bene per risospendere le sfere. Incubate a temperatura ambiente per 10 minuti per reidratare.
      6. Spin i campioni per 5 s per raccogliere il liquido dal lato del tubo. Posizionare i campioni di nuovo sul dispositivo di separazione magnetica per ≥1 minuti, fino a quando la soluzione è del tutto chiaro.
        NOTA: una piccola popolazione di perle non può sedimentare contro il magnete durante l'incubazione. Pipettare queste perle unpelleted su e giù per risospendere loro con il supernatante, e poi li pipetta verso il magnete dove il resto delle perle hanno già pellettato (senza interrompere il pellet esistente).
      7. Continuare l'incubazione fino a quando non perline rimangono nel surnatante. Trasferire il surnatante trasparente contenente cDNA purificato da ogni tubo di un tubo priva di nucleasi a bassa aderenza. Etichettare ogni provetta con le informazioni del campione e conservare a -20 ° C. I campioni possono essere conservati a -20 ° C a tempo indeterminato.
    5. Misurazione della concentrazione del DNA e la dimensione del frammento
      1. Eseguire un controllo di qualità da quantificare un 1 ml alIQUOT del cDNA su un fluorimetro. Valutare 1 ml (3 ng) di ds-cDNA usando un sistema di elettroforesi (come descritto in 1).
    6. La frammentazione del DNA
      NOTA: utilizzare un kit di preparazione del campione di DNA.
      1. Aggiungere 20 ml di cDNA (35 ng totali) in una provetta. Aggiungere 25 ml di Tagment DNA (TD) tampone per il tubo contenente il cDNA.
      2. Aggiungere 5 ml di TDE1 (Tagment DNA Enzyme) al tubo. Pipetta su e giù per 10 volte per mescolare. Utilizzare una punta fresca per ogni campione. Centrifugare a 280 xg a 20 ° C per 1 min.
      3. Mettere i campioni in un termociclatore con un coperchio riscaldato ed eseguirlo a: 55 ° C, 5.5 min. Aggiungere rapidamente 50 ml soluzione QG (kit di estrazione gel). Pipetta su e giù per 10 volte per mescolare. Continuare direttamente alla fase successiva.
    7. Purificazione di DNA frammentato
      1. Aggiungere 170 ml di perline, pipetta su e giù per 10 volte per mescolare. Lasciare riposare per 10 minuti. Mettere tubi sul magnete. Lasciate che i tubi si siedono sul magnete per 10 min.Mentre i campioni sono sul dispositivo di separazione magnetica, pipetta il surnatante e scartare.
      2. Lasciare il tubo sul magnete e aggiungere 200 ml di 85% di etanolo. Lasciate riposare per 30 s, quindi rimuovere l'etanolo. Ripetere il lavaggio etanolo. Spin XG tubo 1.000 a temperatura ambiente.
      3. Mettere il tubo di nuovo sul magnete. Pipetta fuori qualsiasi etanolo residua. Lasciate che i campioni asciugare a temperatura ambiente per 15 min.
      4. Aggiungere 21 ml di tampone di eluizione dal kit di estrazione del gel. Lasciate che il tubo di sedersi fuori il magnete, pipetta su e giù per 10 volte per mescolare. Lasciate che il tubo di riposare a temperatura ambiente per 15 min.
      5. Ritorna il tubo al magnete per 5 min. Pipettare 20 ml di soluzione (DNA purificato) in una nuova provetta.
    8. Tagging e PCR amplificazione del DNA frammentato
      NOTA: In questa fase il DNA purificato viene amplificato tramite un programma PCR limitata ciclo. Il passo PCR aggiunge anche indice 1 (i7) e indice 2 (i5) nonché adattatori comuni (P5 e P7) (necessaria per la generazione di cluster e sequenziamento). Fare riferimento al DNA sampia guida di preparazione per ulteriori dettagli.
      1. In un nuovo tubo aggiungere 5 ml di indice 2 primer (tappo bianco). Utilizzando un nuovo puntale aggiungere 5 ml di indice 1 Primer (coperchio arancione). Aggiungere 15 ml di PCR Master Mix per ogni provetta.
      2. Aggiungere 5 ml di PCR Primer cocktail ad ogni provetta. Aggiungere 20 ml di DNA purificato al tubo. Delicatamente pipetta su e giù per 3 - 5 volte.
      3. Eseguire la PCR utilizzando il seguente programma su un termociclatore: 72 ° C per 3 min, 98 ° C per 30 s, 5 cicli di 98 ° C per 10 s, 63 ° C per 30 s, 72 ° C per 3 min. Tenere a 10 ° C. Procedere immediatamente alla PCR clean-up o conservare il campione a 4 ° C per un massimo di 2 d.
    9. Purificazione di DNA amplificato di frammenti
      1. Portare le perline per RT. Preparare fresco 85% di etanolo. Prelevare campioni di macchina PCR e spin down brevemente.
      2. Aggiungere 30 ml di perline al tubo. Delicatamente pipetta mescolare su e giù per 10 volte. Lasciate che il tubo di riposare a temperatura ambiente per 5 min. luogo back sul magnete per 5 min. Con il tubo sul magnete utilizzare una pipetta di scartare il surnatante.
      3. Aggiungere 200 ml di 85% di etanolo per ogni provetta. Pipetta etanolo dopo 30 s. Ripetere il lavaggio etanolo 85%. Pipetta etanolo dopo 30 s.
      4. Con i tubi ancora sul magnete e le calotte aperte, permettono le perline di aria secca per 15 min. Rimuovere le provette dal magnete.
      5. Aggiungere 32,5 ml di tampone di eluizione. Delicatamente pipetta su e giù per 10 volte. Incubare fuori il magnete per 10 - 15 minuti.
      6. Riportare i tubi per il magnete per 2 minuti, o fino a quando il surnatante ha eliminato. Trasferire accuratamente 30 ml del surnatante in una nuova provetta.
    10. Misurazione della concentrazione del DNA e frammento Size
      1. Eseguire un controllo di qualità attraverso la quantificazione della concentrazione di DNA di 1 ml di cDNA su un fluorimetro. Determinare la dimensione del frammento del DNA mediante elettroforesi. Valutare 1 ml (3 ng) di ds-cDNA.
    11. sequencing
      1. Portare le librerie di RNA-Seq singola cella di un impianto di sequenziamento. Genera 100 bp sequenza si legge su un sequencer seguendo un protocollo precedentemente pubblicato 4.
        NOTA: Ogni libreria sequenziamento genera> 20 milioni univocamente mappatura legge.

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    Representative Results

    Qui riportiamo un protocollo per la coltura neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotrice tirosina idrossilasi, raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando la loro trascrittoma RNA utilizzando RNA-seq (Figura 1). I dati mostrano che il 100% delle cellule TH-eGFP-positivi che sono stati raccolti e sequenziati erano neuroni dopaminergici, basata sulla presenza delle seguenti tre trascritti genici DA-correlati, TH, dopa decarbossilasi (DDC), e il trasportatore della dopamina DAT (slc6a3). Tutte le cellule positive TH-eGFP espresso questi tre geni come valutato dal RNA-Seq. In ogni libreria RNA-Seq monocellulari 6.000 - 8.000 geni codificanti proteine sono state rilevate (Figura 2). I neuroni dopaminergici robusto esprimono trascrizioni dopamina legati, oltre a diverse subunità recettore nicotinico (nAChR) (Tabella 1). Abbiamo osservato che nessunt tutte le cellule che erano negativi per TH erano GABAergico; Pertanto abbiamo definito cellule come GABAergica base alla presenza del trascritto GAD1 valutata mediante RNA-seq. Le cellule che abbiamo definito come neuroni GABAergici non esprimono trascrizioni dopamina legati ma come detto esprimono un importante gene per la sintesi del GABA, GAD1. Le librerie monocellulari anche rivelato RNA non codificanti lunghi, nonché trascritti codificante canali, recettori, proteine ​​nucleari, istoni, proteine ​​organellari, e fattori di trascrizione.

    Figura 1
    Figura 1. RNA-Seq nei neuroni individuali, come Eseguita nei nostri esperimenti su colture TH-eGFP mouse Midbrain primarie. (1) La cultura TH-eGFP topo neuroni ventrali per 3 settimane. (2) Identificare fluorescenti singoli neuroni da GFP eccitante utilizzando una sorgente di luce Hg e filtro / GFP FITC. (3) With lo stesso obiettivo 40X sotto l'ottica di fase, visualizzare singoli neuroni e posizionare correttamente la pipetta. (4 - 5) Aspirare il singola cella nel micropipetta di vetro. Le immagini mostrano una cella dopo la raccolta: (4) Fase 40X; (5) eGFP fluorescenza. (6) cellule Lisare con tampone di lisi con oligo-dT iniettore a 72 ° C. (7) sintesi del cDNA; 26 cicli di amplificazione. (8) Transposon-mediata "tagmentation" di cDNA. (9) controllo di qualità del cDNA e sequenziamento multiplex. (10) analisi computazionale successiva utilizzando Tophat, gemelli e Cuffdiff 7. relativa abbondanza di geni espressi stata misurata in unità di frammenti per kilobase di trascrizione per milione mappato legge (FPKM). L'obiettivo di RNA-seq è di fornire un elenco di geni espressi in una cella e la loro relativa abbondanza. Immagini (2 - 4) provengono dal wor correntek, (6 - 10) sono modificate da una precedente relazione 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2. Il numero di geni codificanti proteine rilevati nelle biblioteche singolo dopaminergici RNA-Seq generata da celle a TH-eGFP-positivi. 6.000 - 8.000 geni delle proteine ​​sono stati rilevati nelle librerie di celle singole. FPKM: Frammenti per kilobase di trascrizione per milione mappato legge (FPKM). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    geni Singole cellule DA n = 10 GABAergici singole cellule n = 7
    FPKM (media ± SEM)
    TH 4714 ± 764 1.2 ± 0.14
    DDC 779 ± 167 0,8 ± 0,1
    slc6a3 / DAT 506 ± 144 0.5 ± 0.04
    DRD2 14 ± 8 0.1 ± 0.004
    chrna6 (α6) 174 ± 57 0.0
    CHRNA4 (α4) 17 ± 5 26.4 ± 2.3
    CHRNB2 (β2) 9 ± 3 17,3 ± 1,2
    chrnb3 (β3) 38 ± 13 0.0
    GAD1 0.0 959,0 ± 70,0
    Htr3a 0.0 0,6 ± 0,01
    Htr3b 0.0 0.0

    Tabella 1. dopamina legati e nAChR Gene trascrizioni in dopaminergici e GABAergici neuroni al giorno 21 in Culture VentrMidbrain. sono riportati i dati di RNA-Seq per TH-eGFP neuroni positivi e negativi. Singole cellule sono state raccolte il giorno di cultura 21. sequenze di Rna-Seq dimostrare che TH-eGFP neuroni positivi avevano alti livelli di trascritti genici DA-correlati, tra cui la tirosina idrossilasi (TH), dopa decarbossilasi (DDC), il trasportatore della dopamina DAT (slc6a3) e recettore nicotinico (nAChR) subunità tra cui α6, α4, β2 e β3. Tuttavia, queste cellule hanno bassi livelli di decarbossilasi GABAergica gene marcatore acido glutammico 1 (GAD1) ​​e la serotonina 5-HT3 A e subunità B (Htr3A e Htr3B). neuroni GABAergici hanno un basso o nessun livellidi trascrizioni DA-correlate gene, chrna6, chrnb3, e Htr3A / B, ma hanno alti livelli di GAD1. dati RNA-Seq (Cuffdiff) sono indicati per le trascrizioni dopamina legati, GABAergici, del recettore nicotinico, e serotonina. FPKM: Frammenti per kilobase di trascrizione per milione mappato legge (FPKM).

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    Discussion

    Qui si isolare le cellule singole da una popolazione eterogenea con un tag fluorescenti, quindi studiare ogni cella con cella singola RNA-Seq. Si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che abbiamo raccolto e sequenziati erano neuroni dopaminergici infatti, basata sulla presenza delle seguenti tre trascritti genici DA-correlati, TH, DDC e slc6a3. Tutte le cellule positive TH-eGFP espresso questi tre geni come valutato dal RNA-Seq. Questo è stato concorde con gli studi elettrofisiologici che hanno dimostrato che ogni cella TH-eGFP visualizzato anche un repertorio di canali ionici associati con i neuroni dopaminergici 8, 9. In questo protocollo abbiamo utilizzato la GENSAT tirosina idrossilasi-eGFP del mouse ceppo 10 come marker affidabile per i neuroni dopaminergici dal vivo. Nelle culture WT non vi è attualmente alcun modo affidabile per identificare i neuroni dopaminergici in tempo reale in base alla loro morfologia. Nonostante la nostra vasta esperienza nella identificare e la registrazione da neuroni dopaminergici, nelle culture di tipo selvatico solo tre su dieci delle cellule dopaminergiche sospetti raccolte erano neuroni dopaminergici. Inoltre, abbiamo osservato che non tutte le cellule che erano negativi per TH erano GABAergico. Abbiamo definito cellule come GABAergica base alla presenza della trascrizione GAD1 e l'assenza dei trascritti DA-correlati valutata mediante RNA-seq.

    Perché neuroni dopaminergici rappresentano una piccola minoranza dei neuroni espresse in colture primarie VM, la capacità di identificare in modo affidabile questi neuroni in culture che vivono aumenterà la gamma di studi unicellulari disponibili. Questo protocollo può essere utilizzato per la neuroprotezione, neurodegenerazione, e saggi farmacologici per studiare gli effetti dei vari trattamenti sul trascrittoma dopaminergica. Inoltre, si può utilizzare questo protocollo per immunoistochimica, elettrofisiologiche, BioPhotonic 11, e in linea di principio, saggi proteomica. Ilsaggi SE sono particolarmente utili per la malattia e la dipendenza di ricerca di Parkinson. Ma naturalmente protocolli analoghi, sui topi GENSAT o topi simile etichettati, potrebbero essere utilizzati per altri stati di malattia o per le cellule che sono rare. Inoltre, questo protocollo dà una visione emergente della eterogeneità all'interno di un dato sottotipo neuronale.

    In studi precedenti, dopo la raccolta della singola cella abbiamo messo direttamente in PBS; tuttavia ora abbiamo posto la singola cella raccolto direttamente nel tampone di reazione. Ciò si traduce in librerie di RNA-Seq di migliore qualità, come valutato dal numero di geni individuati in ogni libreria. Uno dei principali limiti di questa tecnica è che sono tenuti cellule fluorescente tag. Come affermato in precedenza, non c'è modo veramente affidabile per identificare un tipo di cellula specifico in una coltura mista basata su morfologia. L'ampia gamma di fluorescenti specifiche cellule o Cre-esprimono linee del mouse offre ora opportunamente segnalato cellule in molti casi. Tuttavia, sho curaULD da prendere quando si seleziona una linea di topi adatto fluorescente, come un ampio studio di linee di topo transgenico scoperto che TH-Cre knock-in linee del mouse esporre pronunciato l'espressione del transgene nelle cellule nondopaminergic 12.

    Inoltre, un altro passo che può avere bisogno di essere ottimizzato in esperimenti futuri è la dimensione punta desiderata della micropipetta. Se i futuri esperimenti includono l'uso di tipi cellulari diversi neuroni dopaminergici, la dimensione punta micropipetta può avere bisogno di essere ottimizzato per la cella di interesse.

    RNA sequenziamento profondo è una tecnica più potente di microarray. RNA-Seq dà buona riproducibilità run-to-run. La gamma dinamica rilevato è paragonabile all'abbondanza trascrizione effettiva all'interno delle cellule. Si può rilevare forme di splicing alternativi e nuovi isoforme. De analisi novo di campioni senza un gene di riferimento è possibile; e se un nuovo gene di riferimento viene scoperto i dati possono essere nuovamente analizzati per lagene specifico (s) senza dover eseguire nuovamente l'esperimento 13 wet-lavoro.

    Riassumendo, si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che sono stati raccolti e sequenziati erano neuroni dopaminergici. Questa tecnica si estende altri rapporti che identificano acutamente dissociate o colture di neuroni dopaminergici a lungo termine da topi GENSAT, 14, 15 e la tecnica avrà applicazioni diffuse nel campo delle neuroscienze e della biologia molecolare.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
    Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x Gibco  14175-095
    Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
    Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
    Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
    L-Ascorbic acid Sigma  A7506
    B27 Gibco  17504-044 50x stock solution, 1x final concentration.
    35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
    Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
    Laminin Sigma  L2020 Stored at -20 °C in 20 µL aliquots
    Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
    Blue pipette tips P1000 Sorenson Bioscience  Inc. 10130
    10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
    37 °C Water bath
    37 °C, 5% humidity incubator
    16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
    Triton X-100 Sigma  X100-500ML
    Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
    Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
    Forceps - 2x3 teeth Fine Science Tools 11022-14
    Forceps - Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
    Forceps - Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
    10x PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
    Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x Gibco 14190-144 500 mL
    21 G needle BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
    Micropipette puller Sutter Instrument model P-87
    Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
    Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit
    oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
    Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
    Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
    Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
    50x 2 polymerase mix 50x Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
    10x PCR buffer 10x Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
    RNA Spikes ThermoFisher 4456740
    PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack
    DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
    PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
    PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
    Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
    HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110 rxns
    Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
    Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5 mL
    RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
    Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
    Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
    Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.)
    Microforge Narishige (or equivalent) 
    Sequencer Illumina HiSeq instrument
    GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

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    References

    1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
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    3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
    4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
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    Neuroscienze Numero 120 cella singola RNA-sequenziamento raccolta di cellule culture mesencefalo neuroni dopaminergici il morbo di Parkinson
    Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression
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    Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

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