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Neuroscience

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/54981
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

Summary

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

Abstract

Na doença de Parkinson (DP) não há perda neuronal generalizada em todo o cérebro com a degeneração dos neurónios dopaminérgicos pronunciada no Snc, levando a bradicinesia, rigidez e tremores. A identificação dos que vivem neurônios dopaminérgicos em culturas primárias Ventral mesencefálico (VM) usando um marcador fluorescente fornece uma forma alternativa para estudar a vulnerabilidade seletiva desses neurônios sem depender da imunocoloração das células fixas. Aqui, isolamos, dissociar e cultura rato neurônios VM para 3 semanas. Em seguida, identificar os neurónios dopaminérgicos em culturas usando eGFP fluorescência (conduzido por um promotor Tirosina Hidroxilase (TH)). neurónios individuais são colhidas em tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidro. A seguir, lisar as células colhidas, e realizar a síntese de cDNA e "tagmentation" mediada por transposão para produzir bibliotecas de ARN-Seq monocelulares 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Depois de passar uma verificação de controlo de qualidade, as bibliotecas de uma única célula são sequenciados e subsequente análise é realizada para medir a expressão do gene. Nós relatamos resultados transcriptoma para dopaminérgico individual e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que foram colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos. Essas técnicas terão vastas aplicações em neurociência e biologia molecular.

Introduction

Doença de Parkinson (DP) é, uma doença neurodegenerativa incurável relacionada com a idade. A causa desta doença relativamente comum permanece mal compreendido. Há uma perda generalizada neuronal em todo o cérebro, com a degeneração neuronal acentuada de neurónios dopaminérgicos da substância negra (SNC), levando a características clínicas de diagnóstico de bradicinesia, rigidez e tremor.

culturas mistas primárias contendo neurônios dopaminérgicos SNc são especialmente relevantes para a doença de Parkinson. Ventral tegmental Área (VTA) neurônios dopaminérgicos têm sido implicados na recompensa e vício. Ventral mesencefálico (VM) culturas embrionárias mistos primários contêm ambos os neurônios SNC ou a VTA dopaminérgico (DA) e neurônios GABAérgicos. VM culturas primárias podem ser úteis para ensaios de neuroproteção e para elucidar a vulnerabilidade selectiva dos neurónios dopaminérgicos. Não há nenhuma maneira confiável para identificar células dopaminérgicas na cultura com base na morfologia. Elere desenvolvemos técnicas para identificar e colher neurónios dopaminérgicos individuais e construir uma única célula, de alto rendimento bibliotecas RNA sequenciamento.

Relatamos dados RNA transcriptoma representativos para única dopaminérgica e neurônios GABAérgicos isolados a partir de culturas do mesencéfalo. Este protocolo pode ser utilizado para a neuroprotecção, a neurodegeneração, e os ensaios farmacológicos para estudar os efeitos de vários tratamentos no transcriptoma DA / GABA. Porque neurônios dopaminérgicos representam uma pequena minoria dos neurônios expressas em culturas primárias de VM, a capacidade de identificar com segurança esses neurônios em culturas que vivem permitirá uma gama avançada de estudos de uma única célula. Essas técnicas inovadoras facilitar avanços na compreensão dos mecanismos que ocorrem no nível celular e pode ter aplicações em outros lugares nos campos da biologia molecular e neuroscience.

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Protocol

NOTA: Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e uso de animais fornecidos pelos Institutos Nacionais de Saúde e protocolos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal no Instituto de Tecnologia da Califórnia.

1. Derivação da Primária dopaminérgicos culturas celulares embrionárias mouse Cérebro

  1. Soluções e Meio de Cultura
    1. Preparação de Ácido Ascórbico da Solução
      1. Pesar 352 mg de ácido ascórbico. Adicionar estéril H 2 O para um volume total final de 20 mL. Lugar no 37 ° C banho de água para dissolver. Filtrar com ponta de seringa de 0,2 mm e armazenar em 500 mL alíquotas a -20 ° C.
    2. Preparação da solução de papaína
      1. Dilui-se papaína de 15 unidades / mL em 1x solução de sal Hanks'-equilibrada (HBSS). Pipeta cima e para baixo 5 vezes para misturar bem. Prepare no dia da dissecção.
    3. Preparação de Solução Stock de ADNase
      1. Pesar 20 mg de DNase. Adicionar estéril H 2 O para um volume final total de 20 mL. Filtrar em condições estéreis com 0,2 um filtro de seringa de ponta. Armazenar a -20 ° C em alíquotas de 1 mL.
    4. Preparação de solução de paragem
      1. Dilui-se 5 ml de soro de cavalo dador equino a 10% em 45 mL de HBSS 1x. Filtrar em condições estéreis com um filtro de ponta de seringa de 0,2 | im. Armazenar a 4 ° C.
    5. Preparação de albumina de soro bovino (BSA) a solução stock de 4%
      1. Pesar 2 g de BSA e adicionar 1x com fosfato salino tamponado (PBS) para um volume final total de 45 mL. Filtrar esterilizar com 0,2 um filtro de seringa de ponta. Armazenar a 4 ° C.
    6. Preparação de chapeamento Médio
      1. Em 494 ml de meio, adicionar 1,25 mL de meios de cultura que contém L-alanil-L-glutamina (uma fonte estabilizada de L-glutamina) e 5 mL de soro de dador dos equídeos. Filtrar esterilizar com 0,2 um fil seringatip ter. Armazenar a 4 ° C.
    7. Preparação do meio de cultura celular
      1. Em 196 mL meio de plaqueamento, adicione 4 mL B27 e 200 mL de ácido ascórbico. Filtrar esterilizar com filtro de 0,2 um. Guardar a solução a 4 ° C e utilizar no prazo de uma semana.
    8. Preparação de paraformaldeído solução a 4% (PFA)
      Cuidado: precauções gerais para usando paraformaldeído são as seguintes: Use um exaustor, evite pele e dos olhos contato, evitar a inalação do vapor, manter afastado do calor ou chamas. Usar vestuário de protecção individual adequado. PFA pode causar sensibilização e dermatite, portanto, lave bem as mãos após o manuseio.
      1. Adicionam-se 10 ml de 16% de PFA a 30 mL de 1x PBS, pH 7,4.
    9. Preparação de 0,1% de Triton X-100
      1. Pipete 1 mL de Triton X-100 em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução a 10%. Pipeta lentamente para permitir solução viscosa para preencher ponta da pipeta. Quente no 37 ° C banho de água a disresolver. Armazenar estoque 10% a 4 ° C.
      2. Diluir estoque de 10% para 0,01% (por exemplo, através da realização de 2 diluições em série 1:10: diluir 1 mL de solução a 10% em 9 mL de 1x PBS para fazer uma solução%; 1 mL de uma solução 1%, a 9 ml de PBS 1x fazer solução a 0,1%).
    10. Preparação de 10% e 1% de soro de burro
      1. Adicionar 1 ml de soro de burro a 9 mL de 1x PBS para uma solução a 10%. Adicionar 0,5 ml de soro de burro a 49,5 mL de 1x PBS, pH 7,4 para uma solução a 1%.
    11. Preparação de 1x PBS
      1. Dilui-se PBS 10X para 1x pela adição de 50 mL em 450 mL de H 2 O. Ajustar o pH da solução a pH 7,4 usando um medidor de pH.
  2. O revestimento das placas de cultura
    1. A poli-L-ornitina Revestimento
      1. Revestimento apenas o fundo de vidro 10 mm de diâmetro no centro de todos os pratos de 35 mm com 120 mL de poli-L-ornitina utilizando uma técnica estéril. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Use um aspirador a vácuo para aspirar o poli-Lornithine. Lavar os pratos duas vezes com H 2 O. estéril
    2. Laminina revestimento (concentração estoque de 1 mg / ml)
      1. Diluir 20 uL com laminina 2 ml de H 2 O esterilizada (concentração final de 0,01 mg / mL).
      2. Revestimento somente a 10 milímetros com fundo de vidro de diâmetro no centro de todos os pratos com 120 mL de laminina diluída para 0,01 mg / ml utilizando uma técnica estéril, e incubar durante 1 h ou O / N a 37 ° C antes da utilização.
  3. rato Dissection
    NOTA: Os métodos desta dissecção são concebidos para uma exposição mínima de células, à medida que são transferidas a partir de sacos embrionárias para a incubadora de cultura. A viabilidade das células é preservada através da remoção de apenas uma parte do cérebro para dissecação do mesencéfalo. O isolamento do produto do mesencéfalo mais rapidamente sem a necessidade de dissecar todo o cérebro para aceder à região. Ver tabela de materiais para a estirpe de ratinho utilizada neste estudo. Euthanize um rato grávida cronometrado em gestacional dia 14 utilizando CO 2.
  4. Pulverizar o abdómen do rato sacrificados com 70% de etanol. Segure a pele do abdome inferior usando uma pinça com 2 x 3 dentes e abrir a cavidade abdominal através de lâmina sem corte tesoura cirúrgica. Faça dois cortes em movimento lateral e proximal de cada lado. Fold através da parede abdominal usando fórceps para expor a cavidade abdominal.
    NOTA: O útero está agora exposta. Expondo a cavidade pleural e criação de pneumotórax também garante que o animal não se recuperar.
  5. Cortar ambas as extremidades da trompa uterina para separar o útero. Coloque em um prato de Petri em uma capa estéril.
  6. Utilizando uma pinça reta de ponta em cada mão abrir o saco embrionário e remover o embrião. decapitar rapidamente por beliscar cabeça no pescoço com a pinça. Estabilizar a cabeça com a pinça firmemente colocado no focinho de modo que a superfície dorsal é acessível.
  7. Usando a pinça realizados no outro hand, aperte a camada de pele eo crânio, pouco antes do cume do mesencéfalo. Retire a pele eo crânio caudalmente ao longo da linha média. Coloque uma pinça em torno do cume com uma ponta entre o córtex e mesencéfalo eo outro sobre o cerebelo.
  8. Comprima e remover todo o mesencéfalo, deixando para trás o prosencéfalo no lado rostral e cerebelo no lado caudal. Colocar num prato de Petri com HBSS frio sob um microscópio de dissecação.
  9. Repita o procedimento para os embriões restantes.
  10. Sob o microscópio de dissecação, virar o segmento cérebro de modo que o lado ventral está agora acessível. Existem agora 4 quadrantes visível. Remover todas as meninges e vasculatura agarrando suavemente as meninges e puxando para cima para longe do cérebro.
  11. Utilize uma pinça para estabilizar o segmento de cérebro enquanto separa o mesencéfalo. Coloque um Tong de fórceps para o ventrículo aproximadamente no centro do segmento. Faça a primeira dorsal pitada, apontando inpara o prato, em seguida, medialmente em cada lado. Tome os dois quadrantes inferiores, fazendo cortes laterais em ambos os lados.
    NOTA: O tecido de interesse está na seção inferior ventral, que aparece densa. Esta região contém tanto o VTA e SNc.
  12. Apare e descartar o tecido que é menos denso: isso inclui o colículos superior e inferior. Colocar o tecido dissecado contendo tanto o VTA e SNc em HBSS fresca sobre uma área separada da placa de Petri.
    NOTA: Nesta fase do desenvolvimento do cérebro do rato (E14), a região de interesse no mesencéfalo ventral é separado por um ventrículo do zona incerta e outros grupos célula hipotalâmica. A estrutura mais alongada do cérebro do rato em desenvolvimento embrionário permite a distinção entre estas zonas, que estão localizados mais perto em conjunto no cérebro do rato adulto.
  13. Repita o procedimento para todos os segmentos do cérebro restantes.
  14. Depois de todos os segmentos cerebrais foram dissecados, utilize uma pinça e um bisturi No. 11 a EA trimestreseção mesencéfalo ch em pedaços de tamanho aproximadamente igual.
  • Dissociar as células
    1. O tratamento de células enzimática
      1. Use uma ampla calibre ponta P1000 pipeta para ocupar todos os segmentos do mesencéfalo esquartejado no HBSS e colocá-los em um tubo cônico de 15 mL. Deixe os segmentos depositar-se no fundo do tubo e remover a HBSS que foi retomado com as peças esquartejado.
      2. Adicionar 500 uL de solução de papaína para o tubo e colocar num banho de água a 37 ° C durante 15 min. Ressuspender as células por dedo sacudindo o tubo após 7,5 min.
      3. Usando uma ponta P1000 wide-bore, pipetas apenas os segmentos do mesencéfalo em uma alíquota de 1 mL de desoxirribonuclease I solução (DNase). Permitir que os segmentos para assentar no fundo do tubo.
      4. Utilizando uma ponta de P1000 grande calibre, transferir apenas os segmentos do mesencéfalo para um tubo de 15 ml contendo 1 ml de solução de paragem frio para enxaguar. Deixe os segmentos depositar-se no fundo do tubo e repetir o enxaguamento sobrece mais.
    2. A trituração mecânica da suspensão de células
      1. Substituir a última lavagem com 1 mL de solução de paragem fresco e pipeta cima e para baixo 7x com uma ponta P1000 pipeta para triturar as células. Evitar trituração excessiva para minimizar a lise celular.
      2. Subjacente à suspensão de células pipetando lentamente 200 ul de solução de BSA a 4% para o fundo do tubo. Cuidadosamente retire a ponta da pipeta para evitar prejudicar a camada de suspensão de células. Após centrifugação a 280 xg durante 6 minutos, aspirar o sobrenadante com P1000 e ressuspender as células em 1 ml de meio de plaqueamento.
  • A contagem e plaqueamento das células
    1. Efectuar a contagem de células utilizando um hemocitómetro. Dilui-se a suspensão de células a 1000 células / mL, com meio de plaqueamento.
    2. Usando um aspirador a vácuo, a laminina de aspirar as placas revestidas, em lotes de, no máximo, três pratos. Placa 120 mL (1,2 x 10 5 células / prato (78,5 mm2
    3. Após 1 h, adicionar cuidadosamente 3 mL de meio de cultura para uma área não semeada da placa de cultura para minimizar a ruptura das células.
    4. Executar uma metade de mudança de meio completo em placas de cultura de células em intervalos de 3 semanas, durante 3 d.

    • Neurônios 2. A colheita cultivado-dopaminérgicos para Sequencing RNA

    NOTA: Uma visão geral do protocolo de células-colheita e de uma única célula RNA-Sequencing é dado na Figura 1.

    1. Etapas a realizar antes do dia do Experimento
      1. Limpa tubos capilares de vidro de borosilicato submetendo a ultrassons em 100% de etanol durante 15 minutos e, em seguida, de novo em H2O destilada durante 15 min. Drenar o tubo e cozer durante a noite num forno a 200 ° C para inactivar a RNase.
      2. Use recém-inauguradopontas de pipeta isentas de RNase para preparar uma solução de reserva de 10x tampão de reacção por mistura de 19 ul de 10 x tampão de lise a partir do kit de sequenciação com 1 uL da solução de inibidor de RNase (20 mL de volume total) num tubo de microcentrífuga. Spin down a mistura usando brevemente um micro-centrífuga e manter em gelo.
      3. Adicionar 2 mL de tampão 10x a reacção para cada um dos tubos de 0,2 mL de PCR individuais (utilizados para recolher os neurónios colhidas). Rotular os tubos com etiquetas apropriadas para identificar os neurónios a ser colhida e armazenar congelada a 4 ° C.
    2. Passos a executar no dia do experimento
      1. Fabricação das pipetas colheita.
        1. Puxe micropipetas de grande diâmetro de ponta (2-8 um) do tubo capilar cozido usando um extrator de microeletrodos eo filamento de aquecimento revestido de vidro de um microforge. Defina o extrator para formar micropipetas com um longo cone. Use um microforge equipado com uma retícula ocular calibrado e um ob de alta potênciajectivo para quebrar a ponta da micropipeta para o tamanho desejado ponta (10 - 20 um).
        2. Aperte micropipeta no suporte da pipeta a microforge e montar titular para o microforge. Traga a ponta da micropipeta em foco acima do filamento de aquecimento de vidro revestido utilizando o manipulador mecânico do interruptor microforge e em que a corrente do filamento para aquecê-lo. Toque a ponta da pipeta para o filamento aquecido. Desligue a corrente quando a ponta da pipeta derreteu com o diâmetro adequado.
          NOTA. Desligando a corrente fará com que o filamento para mover-se repentinamente para baixo e separar da ponta da pipeta, produzindo uma grande pipeta, aberta de ponta com o diâmetro desejado.
        3. Armazenar as micropipetas concluídos em uma caixa fechada até ser necessário.
      2. Colhendo os neurônios.
        NOTA. Neurónios em cultura foram colhidas depois de uma versão modificada de um protocolo previamente publicado a 6.
        1. completamente clean todas as superfícies da sala de-colheita de células que entram em contacto com os pratos culturas e tubos de coleta usando desinfetante líquido e água, seguida por uma lavagem com água. Limpe as superfícies desinfectados com 80% de etanol e, em seguida, uma RNase inibidor infundido limpe.
        2. Encha dois recipientes isolados com gelo, um com (água) regular de gelo e outro com gelo seco. Coloque os tubos de 0,2 mL de coleta de PCR preenchidos previamente com 2 mL de 10x tampão de reação sobre o gelo regular.
        3. Remova a placa de cultura contendo os neurónios da incubadora, drenar o meio de cultura a partir do prato, lavar com 2 ml de PBS livre de RNase de Dulbecco (DPBS) e substitua com 1 ml de DPBS para a colheita.
        4. Identificar, neurônios TH-positivos fluorescentes nas culturas do mesencéfalo primárias utilizando um invertido, microscópio de epifluorescência equipado com uma objetiva de 40X fase, uma lâmpada de Hg, e um conjunto de filtro GFP.
        5. Posicionar a pipeta através da soma de células usando a mi motorizado ou manualcromanipulator. Aspirar o neurônio na micropipeta de vidro usando sucção suave aplicado por via oral, através do tubo de plástico ligado à porta lateral do suporte da micropipeta. Imediatamente remover a micropipeta, contendo a célula a partir da solução do banho.
        6. Colocar a ponta da pipeta no interior de um tampão de reacção contendo 0,2 mL de PCR tubo de recolha, e quebrar a ponta contra o lado do tubo, perto da parte inferior. Expelir o fluido restante (0,5-1,5 mL) a partir da ponta da micropipeta quebrado pela colocação de uma agulha 21 G seringa estéril no fundo da micropipeta e aplicando pressão para fora.
        7. Centrifugar o tubo de recolha durante 5 s usando um desktop micro-centrífuga e congelá-lo em gelo seco. Armazenar os tubos de colheita contendo as células individuais a -80 ° C. Tipicamente, 5 as células são colhidas por prato ao longo de um período de 1 h à temperatura ambiente.

    3. célula única de RNA-Seq Biblioteca Generation

      <li> Geração do cDNA da primeira cadeia
      NOTA: Para os passos seguintes utilizam reagentes do kit de sequenciação comercial.
      1. Trazer os reagentes abaixo no gelo para o gabinete PCR. Prepara-se uma primeira mistura principal cadeia mais de 10% por combinação dos seguintes reagentes à temperatura ambiente num armário de PCR: 2 ul de 5x tampão de primeira cadeia, 0,25 ul de DTT (100 mM), 1 uL de mistura de dNTP (10 mM), 1 ul de oligonucleótido ( 12 uM), 0,25 uL de RNase Inhibitor, e 1 uL de transcriptase (100 unidades) inverter. Isto é o inverso de transcriptase master mix (5,5 mL de volume total por reacção).
      2. Leve as amostras do -80 C em gelo seco e trazer para o gabinete de PCR. Adicione o seguinte para a amostra de célula única: 1 mL iniciador 3 '1 e 1 mL quantificados picos de ARN. Traga amostras em um bloco refrigerador para um termociclador predefinido de tampa quente a 72 ° C.
      3. Incubar os tubos no termociclador durante 3 min a 72 ° C, e, em seguida, colocar as amostras sobre uma cremalheira de PCR mais frio.Adicionar 5,5 mL da mistura principal (a partir do passo 3.1.1) a cada tubo de reacção e agitar suavemente por pipetagem. Girar os tubos de 0,2 uL durante 5 s e incubar num termociclador como se segue: 42 ° C durante 90 min, 70 ° C durante 10 min. Manter a 4 ° C.
    1. A purificação da primeira cadeia de ADNc amplificado.
      NOTA: O cDNA amplificado por PCR foi purificado por imobilização com contas magnéticas. Usar um dispositivo de separação magnética para tubos de 0,2 mL.
      1. Alíquota as esferas magnéticas em tubos de 1,5 mL. Antes de cada utilização, trazer alíquotas grânulo até à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min e misturar para dispersar bem. Vortex esferas magnéticas até uniformemente misturado.
      2. Adicionar 25 ul de contas magnéticas para cada amostra. Misture pipetando todo o volume para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 8 min para permitir a ligação de ADNc para os grânulos.
    2. Preparação de PCR Master Mix
      1. Preparar a mistura de mestre ds-cDNA amplificação por PCR para todas as reações com um additional 10% por mistura de tampão 5 uL de PCR a 10X, 2 ul de mistura de dNTP (10 mM), 2 uL de PCR o iniciador 2 (12 mM), 2 uL de 50x 2 polimerase mix, e 39 uL de nuclease isenta de água (50 mL volume total / reação).
    3. A amplificação de First Strand
      1. Coloque as amostras e as esferas magnéticas sobre o dispositivo de separação magnética ≥5 min, até o líquido ter um aspecto completamente clara, e não existem pérolas deixadas no sobrenadante.
      2. Manter as amostras no aparelho de separação, pipeta-se o sobrenadante e descartar. Rodar as amostras durante 5 segundos para recolher o líquido a partir do lado do tubo. Coloque as amostras no aparelho de separação magnética, durante 30 s, em seguida, remover todo o sobrenadante remanescente com um pipetador de P10.
      3. Adicionam-se 50 ul da mistura principal de PCR a cada tubo contendo ADN ligada às pérolas da etapa anterior. Colocar o tubo em um termociclador pré-aquecido (95 ° C) com uma tampa aquecida. Iniciar a ciclos térmicos com a seguinte program: 95 ° C durante 1 min, 26 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 6 min. Em seguida, 72 ° C 10 min. Manter a 4 ° C.
        NOTA: Consulte o manual do usuário sequenciamento para mais detalhes e para otimizar as configurações de exemplo.
    4. Purificação de cDNA amplificado Dobro-Encalhada
      1. Adicionar 90 ul de contas para cada amostra. Misture pipetando todo o volume para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 8 min para permitir a ligação de ADNc para os grânulos. Coloque as amostras mais esferas no dispositivo de separação magnética para ≥5 min, até o líquido ter um aspecto completamente clara, e não existem pérolas deixadas no sobrenadante.
      2. Enquanto as amostras no aparelho de separação magnética, remover o sobrenadante e descartar. Manter as amostras no aparelho de separação magnética. Adicionar 140 uL de acabado de fazer 85% de etanol para cada amostra sem perturbar as esferas. Aguarde 30 s. Pipeta fora o sobrenadante. cDNA permanecerá ligado ao beaDS durante o processo de lavagem.
      3. Repetir a lavagem de etanol mais uma vez.
      4. Resumidamente girar as amostras para recolher o líquido a partir do lado do tubo. Coloque as amostras no aparelho de separação magnética, durante 30 s, em seguida, remover todo o etanol remanescente com uma pipeta. Coloque as amostras à temperatura ambiente durante 2-2,5 min, até que o sedimento é seco e não mais brilhante (isto é, antes de uma fenda aparece).
        NOTA: Secar o pellet somente até que seja apenas seco. O pellet vai olhar fosco sem brilho. Se a pastilha não é seco, etanol permanecerá nos poços de amostra, o que reduzirá a taxa de recuperação de ADNc amplificado e o rendimento. Se o sedimento é sobre-seco, haverá fissuras no sedimento. Vai demorar mais do que 2 minutos para hidratar e pode reduzir a recuperação de cDNA amplificado e rendimento.
      5. Uma vez que os grânulos são secos, adicionar 22,5 mL de tampão de eluição para cobrir o sedimento grânulo. Retirar amostras a partir do dispositivo de separação magnética e misturar completamente para ressuspender as esferas. DentroCubate à TA durante 10 minutos para re-hidratar.
      6. Rodar as amostras durante 5 segundos para recolher o líquido a partir do lado do tubo. Coloque as amostras em volta do dispositivo de separação magnética para ≥1 min, até que a solução está completamente clara.
        NOTA: Uma pequena população de contas pode não agregar contra o íman durante a incubação. Pipetar estes grânulos unpelleted cima e para baixo para ressuspender as com o sobrenadante, e depois pipeta-los para o magneto, onde o resto dos grânulos já sedimentadas (sem perturbar o sedimento existente).
      7. Continuar a incubação até que não os grânulos permanecem no sobrenadante. Transferir o sobrenadante límpido contendo ADNc purificado a partir de cada tubo para um tubo livre de nuclease, de baixa aderência. Rotular cada tubo com informações da amostra e armazenar a -20 ° C. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C indefinidamente.
    5. Medição da concentração de DNA e o tamanho do fragmento
      1. Realizar uma verificação de controle de qualidade por meio da quantificação de 1 mL alIQUOT do ADNc num fluorómetro. Avaliar 1 ul (3 ng) de ADNc-cd, utilizando um sistema de electroforese (como descrito em 1).
    6. A fragmentação de ADN
      NOTA: Use um kit de preparação de ADN da amostra.
      1. Adicionar 20 ul de cDNA (35 ng total) para um tubo. Adicionar 25 uL de ADN Tagment (TD) de tampão ao tubo contendo o ADNc de.
      2. Adicionar 5 uL de TDE1 (Tagment ADN enzima) para o tubo. Pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Utilizar uma ponteira nova para cada amostra. Centrifuga-se a 280 xg a 20 ° C durante 1 min.
      3. Coloque as amostras num termociclador com uma tampa aquecida e executá-lo em: 55 ° C, 5,5 min. adicionar rapidamente 50 mL solução QG (kit de extracção de gel). Pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Continuar directamente para o passo seguinte.
    7. A purificação do ADN fragmentado
      1. Adicionar 170 mL de contas, pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Deixe-a descansar por 10 min. Coloque tubos sobre o ímã. Deixe os tubos de sentar-se no ímã para 10 min.Enquanto as amostras no aparelho de separação magnética, pipeta-se o sobrenadante e descartar.
      2. Deixar o tubo no ímã e adicionar 200 mL de 85% de etanol. Deixe descansar por 30 s, em seguida, remover o etanol. Repetir a lavagem de etanol. Gire a xg tubo de 1.000 em temperatura ambiente.
      3. Coloque o tubo de volta no ímã. Pipeta fora de todo o etanol residual. Deixe as amostras secas à temperatura ambiente durante 15 min.
      4. Adicionar 21 ul de tampão de eluição a partir do kit de extracção de gel. Deixe o tubo de se sentar fora do ímã, pipeta cima e para baixo 10 vezes para misturar. Deixe o tubo de sentar-se à TA durante 15 min.
      5. Retorno do tubo para o ímã para 5 min. Pipetar 20 ul de solução (ADN purificado) para um novo tubo.
    8. Tagging e PCR A amplificação do DNA fragmentado
      NOTA: Nesta etapa, o ADN purificado é amplificado através de um programa de PCR-ciclo limitada. A etapa de PCR também adiciona índice 1 (i7) e índice 2 (i5), bem como adaptadores comuns (P5 e P7) (necessário para a geração de cluster e sequenciamento). Referem-se ao ADN sum amplo guia de preparação para mais detalhes.
      1. Em um novo tubo de adicionar 5 mL de índice de 2 iniciadores (tampa branca). Utilizando uma nova ponta de pipeta adicionar 5 mL de índice 1 Primer (tampa cor de laranja). Adicionar 15 ul de PCR Master Mix para cada tubo.
      2. Adicionar 5 mL de coquetel de PCR de iniciadores a cada tubo. Adicionar 20 ul de ADN purificado para o tubo. Pipeta suavemente para cima e para baixo 3 - 5 vezes.
      3. Executar PCR utilizando o seguinte programa no termociclador: 72 ° C durante 3 min, 98 ° C durante 30 s, 5 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 63 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 3 min. Manter a 10 ° C. Prosseguir imediatamente para a PCR clean-up ou armazenar a amostra a 4 ° C durante até 2 d.
    9. Purificação de fragmentos de DNA amplificado
      1. Traga as contas a RT. Preparar uma solução fresca de etanol 85%. Colher amostras para fora da máquina PCR e girar rapidamente.
      2. Adicionar 30 ul de esferas para o tubo. Suavemente pipeta misturar cima e para baixo 10 vezes. Deixe que o tubo esteja à temperatura ambiente durante 5 min. lugar back on o íman durante 5 min. Com o tubo sobre o íman usar uma pipeta para desprezar o sobrenadante.
      3. Adicionar 200 ul de etanol a 85% a cada tubo. Pipeta de etanol após 30 s. Repetir a lavagem com etanol a 85%. Pipeta de etanol após 30 s.
      4. Com os tubos ainda no ímã e as tampas abertas, permitem que as contas para secar ao ar durante 15 min. Retirar os tubos do ímã.
      5. Adicionar 32.5 ul de tampão de eluição. Pipeta suavemente para cima e para baixo 10 vezes. Incubar fora do ímã para 10 - 15 min.
      6. Retornar os tubos para o ímã por 2 minutos ou até que o sobrenadante foi eliminada. transferir cuidadosamente 30 mL do sobrenadante para um novo tubo.
    10. Medição da concentração de DNA e o fragmento de tamanho
      1. Realizar uma verificação de controlo de qualidade pela quantificação da concentração de ADN de 1 uL do ADNc num fluorómetro. Determinar o tamanho do fragmento de DNA por electroforese. Avaliar 1 mL (3 ng) de ds-cDNA.
    11. Sequencing
      1. Traga as bibliotecas de RNA-Seq célula única a um serviço de sequenciação. Gerar 100 pb sequenciamento lê num sequenciador seguindo um protocolo publicado anteriormente 4.
        NOTA: Cada biblioteca sequenciação gera> 20 milhões exclusivamente mapeamento lê.

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    Representative Results

    Aqui relatamos um protocolo para a cultura de neurónios do mesencéfalo ventral de um ratinho que expressam eGFP accionado por uma sequência de promotor de tirosina-hidroxilase, colhendo neurónios fluorescentes individuais a partir das culturas, e medindo a sua transcriptoma de ARN utilizando ARN-SEQ (Figura 1). Os dados mostraram que 100% das células TH-eGFP-positivos que foram colhidas e sequenciados eram neurónios dopaminérgicos, com base na presença dos três transcritos de genes relacionados com DA seguintes, TH, dopa descarboxilase (DDC), e o transportador de dopamina DAT (SLC6A3). Todas as células positivas TH-EGFP expressa estes três genes como avaliado pela RNA-Seq. Em cada uma biblioteca de ARN-SEQ de uma única célula 6,000 - 8,000 genes codificadores de proteínas foram detectadas (Figura 2). Os neurónios dopaminérgicos robustamente expressar transcrições relacionadas com a dopamina, além de várias subunidades do receptor de acetilcolina nicotínico (nAChR) (Tabela 1). Observou-se que nãot todas as células que foram negativos para TH foram gabaérgico; Por conseguinte, definiu-se como células GABAérgica com base na presença do transcrito GAD1 como avaliado pela RNA-seq. As células que definimos como neurónios GABAérgicos não expressam transcrições relacionadas com a dopamina, mas como mencionado expressam um gene principal para a síntese de GABA, GAD1. As bibliotecas de uma única célula também revelou ARN não codificante de comprimento, bem como transcritos codificando canais, receptores, proteínas nucleares, histonas, proteínas organelares, e factores de transcrição.

    figura 1
    Figura 1. RNA-Seq em neurônios individuais, também foi realizado no Experimentos em culturas TH-eGFP mouse mesencéfalo primários. (1) Cultura TH-eGFP rato neurónios ventrais durante 3 semanas. (2) Identificar únicos neurônios fluorescentes por GFP emocionante usando uma fonte de luz Hg e FITC filtro / GFP. (3) With o mesmo objetivo 40X sob a ótica de fase, visualizar os neurônios individuais e posicionar corretamente a pipeta. (4-5) Aspirar a única célula na micropipeta de vidro. Imagens mostram uma célula após a colheita: (4) Fase 40X; (5) a fluorescência EGFP. (6) Lisar as células com tampão de lise com oligo-dT a 72 ° C. (7) síntese de ADNc; 26 ciclos de amplificação. (8) mediada por Transposon "tagmentation" de cDNA. (9) controlo de qualidade cDNA e sequenciamento multiplexado. (10) análise computacional subsequente usando Tophat, abotoaduras e Cuffdiff 7. A abundância relativa de genes expressos foi medida em unidades de fragmentos por quilobase de transcrição mapeado por milhão lê (FPKM). O objectivo da ARN-SEQ é o de proporcionar uma lista de genes expressos em uma célula e a sua abundância relativa. Imagens (2-4) estão a partir da corrente work, (6-10) são modificadas a partir de um relatório anterior 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 2
    Figura 2. O número de genes codificantes de proteína detectadas nas Bibliotecas único dopaminérgica ARN-seq gerado a partir de células TH-eGFP-positivos. 6.000 - 8.000 genes de proteínas foram detectadas nas bibliotecas de células individuais. FPKM: Fragmentos por quilobases de transcrição por milhão mapeados lê (FPKM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    genes Células individuais DA n = 10 Células individuais GABAérgicos n = 7
    FPKM (média ± SEM)
    º 4714 ± 764 1,2 ± 0,14
    DDC 779 ± 167 0,8 ± 0,1
    SLC6A3 / DAT 506 ± 144 0,5 ± 0,04
    DRD2 14 ± 8 0,1 ± 0,004
    chrna6 (α6) 174 ± 57 0.0
    Chrna4 (α4) 17 ± 5 26,4 ± 2,3
    chrnb2 (β2) 9 ± 3 17,3 ± 1,2
    chrnb3 (β3) 38 ± 13 0.0
    GAD1 0.0 959,0 ± 70,0
    Htr3a 0.0 0,6 ± 0,01
    Htr3b 0.0 0.0

    Tabela 1. nAChR Gene Transcrições em dopaminérgica e GABAérgica Neurônios e no dia 21 em culturas VentrMidbrain relacionados dopamina. dados de RNA-Seq para neurónios TH-eGFP positivas e negativas são mostradas. células individuais foram colhidas no dia da cultura 21. Os dados de RNA-Seq mostrar que os neurônios TH-eGFP positivas tinham altos níveis de transcritos do gene relacionados-DA, incluindo tirosina hidroxilase (TH), dopa descarboxilase (DDC), o transportador de dopamina DAT (SLC6A3) e receptor nicotínico (nAChR), incluindo as subunidades α6, α4, β2 e β3. No entanto, estas células tinham baixos níveis da descarboxilase gene marcador GABAérgica um ácido glutâmico (GAD1) ​​e a serotonina 5-HT3 A e B (subunidades Htr3A e Htr3B). neurônios GABAérgicos têm baixa ou nenhuma níveisde transcritos relacionados-DA genes, chrna6, chrnb3 e Htr3A / B, mas têm altos níveis de GAD1. dados de ARN-SEQ (Cuffdiff) são mostradas para transcrições relacionadas com a dopamina, gabaérgicos, receptores nicotínicos, e serotonina. FPKM: Fragmentos por quilobases de transcrição por milhão mapeados lê (FPKM).

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    Discussion

    Aqui nós isolar células individuais de uma população heterogênea, utilizando uma etiqueta fluorescente, em seguida, estudar cada célula com uma única célula de RNA-seq. Relata-se que 100% das células vivas TH-eGFP que colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos, de facto, com base na presença dos três transcritos de genes relacionados com DA seguintes, TH, DDC e SLC6A3. Todas as células positivas TH-EGFP expressa estes três genes como avaliado pela RNA-Seq. Este foi concordante com os estudos eletrofisiológicos que mostraram que cada célula TH-eGFP também exibiu um repertório de canais iônicos associados com neurónios dopaminérgicos 8, 9. Neste protocolo utilizamos o GENSAT tirosina hidroxilase-eGFP estirpe de ratinhos 10 como um marcador confiável para neurónios dopaminérgicos ao vivo. Em culturas WT não existe actualmente nenhuma maneira confiável para identificar neurónios dopaminérgicos ao vivo com base na sua morfologia. Apesar da nossa vasta experiência em identificando e gravar a partir de neurónios dopaminérgicos, nas culturas de tipo selvagem apenas três dos dez das células dopaminérgicas suspeitos colhidas foram neurónios dopaminérgicos. Além disso, observou-se que nem todas as células que foram negativos para TH foram GABAérgica. Definiu-se como células GABAérgica com base na presença do transcrito GAD1 e a ausência das transcrições relacionadas com a DA como avaliado pela RNA-seq.

    Porque neurônios dopaminérgicos representam uma pequena minoria dos neurônios expressas em culturas primárias de VM, a capacidade de identificar com segurança esses neurônios em culturas que vivem irá aumentar a gama de estudos de célula única disponíveis. Este protocolo pode ser utilizado para a neuroprotecção, a neurodegeneração, e os ensaios farmacológicos para estudar os efeitos de vários tratamentos no transcriptoma dopaminérgica. Além disso, pode-se utilizar este protocolo para imuno-histoquímica, eletrofisiológico, biofotônica 11, e, em princípio, ensaios de proteômica. oensaios de si são especialmente úteis para a pesquisa da doença e dependência de Parkinson. Mas é claro protocolos análogos, em ratos ou ratinhos GENSAT designação semelhante, pode ser utilizado para outros estados de doença ou para as células que são raras. Além disso, este protocolo dá uma visão emergente da heterogeneidade dentro de um determinado subtipo neuronal.

    Em estudos anteriores, depois de colher a única célula que colocou diretamente em PBS; mas agora colocamos a única célula colhida diretamente no tampão de reacção. Isto resulta em melhores bibliotecas de ARN-SEQ de qualidade tal como avaliado por números de genes detectados em cada biblioteca. Uma das principais limitações da técnica é que as células marcadas por fluorescência são necessários. Como afirmado anteriormente, não há nenhuma maneira realmente fiável para identificar um tipo específico de célula de uma cultura mista com base na morfologia. A grande variedade de fluorescente específica da célula ou expressam Cre linhas de ratinhos proporciona agora apropriadamente células marcadas em muitos casos. No entanto, sho cuidadosuld ser tomados ao selecionar uma linha do rato fluorescente adequado, como um extenso estudo de linhas de camundongos transgênicos descobriu que TH-Cre knock-in mouse linhas exibem pronunciada expressão do transgene em células nondopaminergic 12.

    Além disso, um outro passo que pode necessitar de ser optimizada em experiências futuras é o tamanho da ponta da micropipeta desejado. Se experiências futuras incluem a utilização de tipos de células diferentes de neurónios dopaminérgicos, o tamanho da ponta da micropipeta pode necessitar de ser optimizado para a célula de interesse.

    RNA sequenciação profunda é uma técnica mais poderosa do que microarrays. RNA-Seq dá boa reprodutibilidade run-to-run. A gama dinâmica é detectado comparável à abundância transcrição real dentro de células. Pode-se detectar formas de splicing alternativos e novas isoformas. De análise de amostras novo sem um gene de referência é possível; e se um novo gene de referência é descoberto que os dados podem ser re-analisadas para agene específico (s), sem ter que executar o experimento de trabalho molhado novamente 13.

    Para resumir, que relatam que 100% das células vivas TH-eGFP que foram colhidas e foram sequenciados os neurónios dopaminérgicos. Essa técnica estende outros relatórios que identificam agudamente dissociadas ou neurônios dopaminérgicos cultivadas a longo prazo de ratos GENSAT, 14, 15 e a técnica terão vastas aplicações em neurociência e biologia molecular.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Papain Worthington Biochemical Corporation  LS003126
    Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x Gibco  14175-095
    Donor Equine Serum Thermo Scientific  SH30074.03
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A7030-50G
    Medium: Neurobasal medium Gibco  21103-049
    Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX Gibco  35050-061 0.5 mM final concentration.
    L-Ascorbic acid Sigma  A7506
    B27 Gibco  17504-044 50x stock solution, 1x final concentration.
    35 mm glass bottom dishes MatTek   P35GC-1.5-10-C
    Poly-L-Ornithine Sigma  P4957
    Laminin Sigma  L2020 Stored at -20 °C in 20 µL aliquots
    Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma  DN25
    Blue pipette tips P1000 Sorenson Bioscience  Inc. 10130
    10 mm shallow Petri dish VWR  25384-324
    37 °C Water bath
    37 °C, 5% humidity incubator
    16% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
    Triton X-100 Sigma  X100-500ML
    Donkey serum Equitech  SD-0100HI 100% stock solution, 1% final concentration.
    Standard Pattern surgical scissors Fine Science Tools 14000-14
    Forceps - 2x3 teeth Fine Science Tools 11022-14
    Forceps - Dumont #55 Fine Science Tools 11295-51
    Forceps - Dumont #5 Fine Science Tools 11252-23
    10x PBS, pH 7.4 Gibco  70011-044
    Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x Gibco 14190-144 500 mL
    21 G needle BD PrecisionGlide Needle 305167 100 needles
    Micropipette puller Sutter Instrument model P-87
    Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-285
    Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing Clontech 634936 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit
    oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) From the SMARTer Kit 
    Reverse transcriptase (100 units) SMARTcribe reverse transcriptase From the SMARTer Kit 
    Primer 1 3’ CDSIIa primer  From the SMARTer Kit
    Primer 2 IS PCR primer From the SMARTer Kit
    50x 2 polymerase mix 50x Advantage 2 polymerase mix From the SMARTer Kit
    10x PCR buffer 10x Advantage 2 PCR buffer From the SMARTer Kit
    RNA Spikes ThermoFisher 4456740
    PCR cooler rack IsoFreeze PCR cooler rack
    DNA Sample Preparation Kit  (Illumina/Nextera) Nexter FC-121-1030 24 Samples
    PCR master mix Nextera PCR master mix (NPM) From the Nextera Kit 
    PCR primer cocktail (PPC)  Nextera PCR primer cocktail (PPC)  From the Nextera Kit
    Fluorometer The Qubit ThermoFisher Q33216
    HS DNA BioAnalyzer kit Agilent 5067-4626 110 rxns
    Electrophoresis system  Agilent 2100 Bioanalyzer. G2938C
    Magnetic beads: Agencourt AMPure  Beckman Coulter A63880 5 mL
    RNAse wipe: RNAse Zap wipes Ambion AM9786 Size 100 Sheets
    Qubit ds HS Assay Kit Molecular probes  Q32854 500 assays
    Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit Qiagen  28704
    Glass capillary tubing (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.)
    Microforge Narishige (or equivalent) 
    Sequencer Illumina HiSeq instrument
    GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain  MMRRC stock number: 000292-UNC Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center

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    References

    1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
    2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
    3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
    4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
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    6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
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    Neurociência Edição 120 de uma única célula o RNA-sequenciação colheita de células as culturas do mesencéfalo os neurônios dopaminérgicos doença de Parkinson
    A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression
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    Henley, B. M., Cohen, B. N., Kim, C. H., Gold, H. D., Srinivasan, R., McKinney, S., Deshpande, P., Lester, H. A. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. J. Vis. Exp. (120), e54981, doi:10.3791/54981 (2017).

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