Summary
Wij ontwikkelden twee traceren combinaties Rosa26 tdtomato (alomtegenwoordig tot expressie in alle cellen) / Cre (specifiek tot expressie in chondrocyten) muizen: één met 2.3Col1a1-GFP (specifiek voor osteoblasten) en een met immunofluorescentie (specifiek voor botcellen). De gegevens tonen de directe omzetting van chondrocyten in botcellen.
Abstract
De cel lineage tracing systeem is voornamelijk gebruikt in ontwikkelingsbiologie studies. Het gebruik van Cre recombinase maakt de activering van de reporter in een specifieke cellijn en al het nageslacht. Hier hebben we gebruik gemaakt van de cel lineage tracing techniek aan te tonen dat chondrocyten direct in osteoblasten en osteocyten transformeren tijdens lange botten en kaakkopje ontwikkeling met behulp van twee soorten Cre, Col10a1-Cre en aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), gekruist met Rosa26 tdTomato. Zowel Col10 en aggrecan zijn goed herkend markers voor chondrocyten.
Op basis hiervan hebben we een nieuwe methode-cellijn tracing in combinatie met fluorescerende immunohistochemie te definiëren lot van de cel door het analyseren van de expressie van specifieke celmarkers. Runx2 (een marker voor een vroeg stadium osteogene cellen) en Dentin matrix protein1 (DMP1, een marker voor een laat stadium osteogene cellen) warengebruikt om chondrocyte afgeleide botcellen en hun differentiatie status identificeren. Deze combinatie verbreedt niet alleen de toepassing van cellijn tracing, maar vereenvoudigt ook de vorming van verbinding muizen. Belangrijker is het aantal, de locatie en differentiatie status van oudercel nageslacht gelijktijdig worden weergegeven, die meer informatie dan alleen cellijn tracing. Kortom, de co-toepassing van cellijn tracing technieken en immunofluorescentie is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van celbiologie in vivo.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling endochondrale botvorming goed voor meer dan 80% van het skelet volume. Het wordt algemeen aangenomen dat het begint met de apoptose van hypertrofische chondrocyten. Vervolgens worden de cellen van het onderliggende beenmerg invasie en angiogenese initiëren, gevolgd door afzetting van nieuw bot beenmerg en periosteum-afgeleide cellen 1,2. Het lot van de cel van hypertrofische chondrocyten (HC), echter, is een kwestie van debat voor decennia 3. Aanvankelijk werden HC's als het einde van de chondrocyte differentiatieomzettingsweg zijn en apoptose werd algemeen aangenomen dat het uiteindelijke lot van HC zijn. Nu sommige onderzoekers suggereren dat ten minste enkele HCs kunnen overleven en bijdragen aan botvorming. Hoewel ze de groei voorgestelde plaat chondrocyten had de mogelijkheid om transdifferentiëren in osteoblasten basis van ultrastructuur, immunohistochemische kleuring en in vitro studies 46, geen van deze werkwijzen were definitief bij het aantonen van chondrocyte bijdrage aan de osteoblast lineage.
De cel lineage tracing techniek zorgt voor een meer rigoureuze manier om lot van de cel te bestuderen. Kort gesproken, een recombinase enzym dat alleen in een bepaald type cel tot expressie wordt gebracht, stimuleert de expressie van het reportergen. Zo worden dergelijke cellen en hun nakomelingen permanente etikettering 7. De Cre-loxP systeem wordt vaak gebruikt in lineage tracing. Cre (de recombinase enzym) zal de STOP sequentie tussen de twee loxP plaatsen accijnzen en activeer de verslaggever in een bepaalde cellijn (Figuur 1A). In sommige gevallen kan de onderzoeker kiezen een gunstig tijdstip te Cre activeren met een geneesmiddel, zoals tamoxifen, waardoor Cre te fuseren met een gewijzigde vorm van de oestrogeenreceptor (Cre ERT2) 8. TL-reporters hebben de standaard in lineage tracing experimenten omdat ze drastisch de complexiteit te verminderen gewordenen het verbeteren van de nauwkeurigheid en efficiëntie van de cel lot traceren 8,9. tdTomato is steeds de beste keuze onder de tl-reporters omdat het de helderste fluorescerend eiwit en de sterkste epifluorescentie, waardoor het gemakkelijk gevisualiseerd 7 (Figuur 1A).
Via de Rosa26 tdTomato lineage tracing, onze fractie en andere onderzoekers hebben aangetoond dat HC fenotype in botcellen tijdens de ontwikkeling 10-14 kunnen veranderen. Om dit te bereiken, hebben wij twee traceren combinaties met Rosa26 tdtomato (alomtegenwoordige expressie in alle cellen) / Cre (specifiek voor chondrocyten) muizen: 2.3Col1a1-GFP (specifiek voor osteoblasten) en immunofluorescentie (specifiek voor botcellen). De gegevens tonen dat beide methoden levensvatbaar manieren lot van de cel te bestuderen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Texas A & M University College of Dentistry goedgekeurd.
1. Animal Breeding
- Met drie diermodellen in deze studie. Om het lot van de embryonale chondrocyten in condyl formatie te onderzoeken, het eerste gebruik Col10a1-Cre 15 muizen en kruis ze met Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J) muizen Col10a1- verkrijgen Cre en Rosa26 tdTomato muizen. Vervolgens steekt deze muizen met 2.3Col1a1-GFP muizen 16. Gebruik Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP muizen om de cellijn tracing experimenten (Figuur 1B) voeren.
- Om het lot van de postnatale chondrocyten te bestuderen, volgt u dezelfde procedure als in stap 1.1, maar gebruik maken van de aggrecan-cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) 17,18 lijn en houd de Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP muizen om de cellijn tracing experimenten (figuur 1C) voeren. Injecteer tamoxifen op postnatale dag 14.
- Om de cel lineage tracing techniek immunofluorescentie combineren, steek Agg-Cre ERT2 muizen en Rosa26 tdTomato muizen. Gebruik muizen die beide genen dragen in het experiment en injecteer de tamoxifen op postnatale dag 3 (figuur 1D).
2. Materiaal Voorbereiding
- Los het tamoxifen poeder in 10% ethanol en 90% maïsolie in een concentratie van 10 mg / ml. De dosering voor injectie is 75 mg / kg.
- Los het paraformaldehyde (PFA) poeder in PBS tot een concentratie van 4%, middels 2 M natrium-hydraat de pH tot 7,4 aan te passen. Gebruik 4% PFA oplossing voor het weefsel (de kaakkop en achterbeen worden hier gebruikt) na het offer te lossen. Omwille van zijntoxiciteit, handvat PFA in de kap met handschoenen en een gezichtsmasker.
- Los het EDTA poeder in gedestilleerd water tot een concentratie van 10%, onder toepassing van 2 M natrium-hydraat de pH tot 7,4 aan te passen. Gebruik 10% EDTA aan de kaakkop en achterbeen ontkalken.
- Lossen poeder sucrose in PBS bij concentraties van 15% en 30%. Gebruik de sucrose oplossing om het weefsel te dehydrateren na ontkalking.
- Los het poeder hyaluronidase in PBS bij een concentratie van 2 mg / ml, pH 5,0. Deze oplossing is voor immunofluorescentie antigen herstel.
- Gebruik een 1,5 ml-buis een blokkeeroplossing die 3% runderserumalbumine (BSA) en 20% geit serum in PBS bevat Runx2 of DMP1 immunofluorescentiekleuring bereiden.
- Gebruik een 1,5 ml-buis van een primaire antilichaamoplossing die 2% geit serum in PBS bevat Runx2 of DMP1 immunofluorescentiekleuring bereiden. De concentratie van het primaire antilichaam 1: 400 voor Runx2 en 1: 100 voor DMP1.
- Gebruik een 1,5 ml buis voor te bereidenhet konijn IgG als controlemiddel voor immunofluorescentie kleuring om vals positieve resultaten te vermijden. De oplossing bevat 2% geit serum in PBS. De concentratie van het konijn IgG voor Runx2 controle 1: 400; voor DMP1, 1: 100. Voer het experiment en de controle kleuring tegelijkertijd.
- Gebruik een 1,5 ml buis met een secundair antilichaam oplossing die 2% geit serum in PBS bevat Runx2 of DMP1 immunofluorescentiekleuring bereiden. Gebruik het secundaire antilichaam bij een verdunning van 1: 500.
3. Schuif Voorbereiding voor confocale microscopie (Cell Lineage Alleen Tracing, Geen Combinatie met Immunofluorescentie)
- Injecteren tamoxifen in de Agg-cre ERT2 muizen op een gunstig tijdstip.
- Verwijder eerst een muis uit zijn kooi. Gebruik vervolgens de linker duim en wijsvinger om de huid op de rug van de muis te grijpen en draai het om, waardoor de buik. Gebruik de rechterhand om de spuit te houden. Het optimale ingangspunt voor injectie op de left of rechterkant van de onderbuik, het vermijden van de lever en de blaas.
- De spuit evenwijdig aan de achterpoten van de muizen en injecteer intraperitoneaal. De dosering voor injectie is 75 mg / kg. De gewichten van de muizen op de leeftijd van 2 weken, 3 weken en 4 weken oud zijn ongeveer 7-9 g 11-13 g en 16-18 g, respectievelijk.
- Verdoven de muizen met een Xylazine / Ketaset combinatie.
- De werkoplossing te maken, eerst verdunnen xylazine en Ketaset met gedestilleerd water tot een concentratie van 1 mg / ml en 5 mg / ml. Vervolgens meng de xylazine en Ketaset in een 1: 2 verhouding. De dosering voor injectie 30 pl / g.
- Injecteren in stap 3,1. Bevestig de verdoving door knijpen de enkel van de muis. De muis bewusteloos als het geen reactie.
- Perfuseren de muizen met 4% PFA na verdoving.
- Na de muis bewustzijn verliest, bevestig de vier poten van de muis op een bord te entirely bloot de buik.
- Verzadigen de buik met 70% ethanol en maak een uitsnede van de onderbuik aan de hals langs de middellijn. Knijpen en tegelijkertijd trek de huid aan de zijkanten van de peritoneale membraan te onthullen. Gebruik dissectie schaar om een longitudinale uitsnijding te maken.
- Knip en verwijder de voorste ribben naar het hart bloot te leggen. Prik het hart van de linker hartkamer met een 22 G spuit, houdt u de spuit, en tegelijkertijd snijd een gleuf in de rechter oorschelp.
- Injecteer langzaam de 4% PFA, die wordt doorbloed langs het cardiovasculair systeem, terwijl het bloed spoelt van de snede van rechts oorschelp. Het volume van de PFA perfusie is 1 ml / gram. Voer deze stap in een klasse I bioveiligheid kast die is hard-afvoer naar het gebouw uitlaatsysteem.
- Afpellen huid van de muis en plaats het gehele lichaam in een 50-ml polypropyleen centrifugebuis die 40 ml 4% PFA bevat overnacht vast bij 4 ° C.
- Gebruik dissectie schaar en # 3 en # 5 tang om de onderkaak achterbeen verwijder uit het lichaam en de spieren en pezen aan het oppervlak te verwijderen. Voer deze stap in een klasse I bioveiligheid kast die is hard-afvoer naar het gebouw uitlaatsysteem.
- Snijd de onderkaak in twee fragmenten op het distale gebied van de derde molaar. Op dezelfde manier, snijd het bovenbeen en onderbeen in de ellepijp naar het beenmerg holte bloot om ontkalking te versnellen. Zet het deel dat de condylus en condylaire proces omvat en langs de achterpoot in 40 ml 10% EDTA ontkalken bij 4 ° C gedurende 2-4 dagen in een 50-ml polypropyleen centrifugebuis.
- Gebruik 50 ml van 15% sucrose om de condylus en achterpoot overnacht drogen bij 4 ° C in een 50-ml polypropyleen centrifugebuis.
- Gebruik 30% sucrose om de condylus en achterpoot dehydrateren overnacht bij 4 ° C in een 50-ml polypropyleen centrifugebuis.
- Langs de sagittale vlak, insluiten van het monster metOktober op het scherpst plaat in de cryosectie machine.
- Horizontaal lag de condylus of het achterbeen in de montage mal. Dompel het weefsel in oktober en laat het in de cryosectie machine tot de oktober bevriest.
- Monteer de oktober blok op de snijplaat. Wacht ongeveer 15 minuten voor het snijden zodat de LGO volledig bevroren.
- Snijd de condylus en achterpoot in 10-um secties. Verzamel de secties op dia's en bewaar bij -20 ° C.
- Incubeer de dia in een 37 ° C kamer om het water te verwijderen voordat kleuring.
- Was de glaasjes tweemaal met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
- Veeg het water rond elke sectie. Gebruik een hydrofobe barrière pen om de onderdelen te omcirkelen en drop DAPI of niet-fluorescerende anti-fade montage oplossing in de cirkel. leg voorzichtig het deksel slip.
4. Immunohistochemische kleuring voor Runx2 en DMP1
LET OP: De IgG control noodzakelijk zijn voor immunohistochemische kleuring om vals-positieve signalen voorkomen. De kleuring van de experimentele en controlegroepen moet gelijktijdig worden uitgevoerd.
- Incubeer de glaasjes in een 37 ° C kamer naar het water te verwijderen voordat kleuring.
- Was de dia's twee keer met gedestilleerd water.
- Gebruik de hydrofobe barrière pen om alle afdelingen cirkel op de dia. Van deze stap, voeg alle bereide oplossing in de kring om de delen volledig bedekken.
- Behandel de secties met hyaluronidase in een vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Het volume van de oplossing (in stappen 4,5-4,8) afhankelijk van de grootte van de sectie. Gebruik 50 gl oplossing van de condylus en 100 gl van de lange botten. Wassen met PBST (PBS dat 0,1% Tween 20 bevat) driemaal.
- Bereiden en toepassen blokkerende oplossing voor elke sectie en incubeer ze in een vochtige kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Incubeer de secties met primaireoplossing antilichaam (konijn anti-muis Runx2, of konijn anti-muis DMP1) bij 4 ° C overnacht. Wassen met PBS driemaal.
- Incubeer de secties met secundaire antilichaamoplossing (geit anti-konijn Alexa Fluor 488) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Wassen met PBS driemaal.
- Veeg het water rond de sectie en drop DAPI in de cirkel naar de sectie op de dia te dekken. leg voorzichtig het deksel slip.
5. confocale microscopie
- Capture fluorescerende celbeelden met een confocale microscoop bij een golflengte variërend van 488 um (groen) tot 561 urn (rood). Neem meerdere gestapelde beelden bij 200 Hz (afmetingen van 1024 × 1024) 19 met behulp van 10x, 20x, 63x en lenzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocyten Direct Transform in botcellen (Osteoblasten en Osteocyten) in de kaakkop en Long Bone.
Aggrecan, een kritische gen voor chondrogenese, voornamelijk in de vroege en volwassen chondrocyten 18. Dientengevolge, de injectie van tamoxifen op 2 weken in Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato muizen geactiveerd de rode tomaten reporter in alle chondrocyten en hun dochter cellen. De 2.3Col1a1 GFP-lijn ontstond een groene oplichtende kleur in collageen-1 tot expressie botcellen specifiek osteoblasten en pre-osteocyten. De gele kleur (rood gecombineerd met groen) gaf de aanwezigheid van chondrocyte afgeleide botcellen dat de collageen 1 gen expressie. In figuur 2A meeste botcellen in het condylaire proces onder het kraakbeen waren rood of yellow (een rode cel die begon te scheiden groen-fluorescerende COL1A1, waardoor verschijnen geel toen de twee fluoroforen werden gelegd). Deze resultaten overtuigend bewezen dat deze botcellen zijn afgeleid van chondrocyten. Soortgelijke resultaten werden ook waargenomen tijdens lange botontwikkeling, waar de meerderheid van botcellen waren afkomstig van chondrocyten in zowel de epifyse (figuur 2B) en de metafyse (figuur 2C).
Om deze resultaten verder te onderzoeken, staken we Col10al-Cre muizen met Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP muizen. Col10a1 is een zeer specifieke merker voor HC, alleen uitgedrukt in HCs en hun nakomelingen. Bovendien Col10a1-Cre is niet induceerbaar, die celdifferentiatie vanaf het begin van Col10a1 expressie (bij E14.5) weerspiegelt. In de trabekels bij de kraakbeen-bot interface (superieur niveau) van 3-weken oude muizen, rood en some gele fluorescerende cellen waren overheersen, terwijl de groene fluorescerende cellen waren schaars. In een iets lagere zone (middenniveau), de meerderheid van de cellen fluorescerend geel, met iets minder rood fluorescerend. Groene fluorescerende cellen verscheen alleen in de onderste zone van de condylaire proces (lagere niveau) (figuur 3) domineren .Deze trend aangeeft dat condylaire groei meestal bijgedragen door getransformeerde botcellen van HC. De verdeling van de rode en groene fluorescerende cellen in de condylaire werkwijze is ook in overeenstemming met de lagere naar hogere richting condylaire groei.
De cellijn tracing techniek duidelijk aan dat apoptose is niet het enige lot voor HC. Zowel de Agg-Cre ERT2 en Col10a1-Cre lijnen geven aan dat-chondrocyte afgeleide botcellen zijn de voornaamste bron voor botontwikkeling bij de condylaire proces en in de epifyseen metafyse in lange bot.
Co-toepassing van immunofluorescentiekleuring en Cell Lineage Tracing Maakt het volgen van de Cel Differentiatie.
De cellijn tracing techniek kan ook worden gecombineerd met fluorescerende immunohistochemie om te bepalen het celtype door het detecteren van een cel-specifieke marker. Deze werkwijze heeft verschillende voordelen voor de studie die het lot. Ten eerste kan de onderzoeker nog steeds de karakteristieken van de cel te definiëren door het selecteren van geschikte markers, zelfs zonder de specifieke GFP muis lijn, die de aanvraag voor de cellijn tracing techniek verbreedt. Ten tweede vereenvoudigt de vorming van verbinding muizen. Zo hoeven we alleen voor het genereren van Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato verbinding muizen om de rode kleur te produceren na het activeren Cre (op postnatale dag 3), in plaats van het creëren van Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato muizen, die meer kruisen vereist.
In deze studie hebben we gekozen voor twee antilichamen voor immunofluorescentie kleuring. Een van hen was tegen Runx2, een kritische transcriptie factor tijdens osteoblast rijping (vroeg stadium van osteogene cellen); de andere was tegen DMP1, uitgedrukt in volwassen osteocyten (late stadium van osteogene cellen). In figuur 4, de groene fluorescentie geeft het Runx2 of DMP1 antilichaamexpressie in de 2 weken oude condylaire proces. In figuur 4A, drie types gekleurde cellen in het subchondrale bot aanwezig. De gele kleur (superpositie van rode en groene fluorescentie) in de kern vertegenwoordigt de chondrocyte-afgeleide botcellen tot expressie Runx2, wat aangeeft dat deze cellen werden onrijpe osteoblasten op het botoppervlak. Daarnaast waren er rood-fluorescerende botcellen die niet Runx2 heeft uitgesproken (rood fluorescence zonder bovenop groen). Deze cellen vormen mature-chondrocyte afgeleide botcellen in het bot matrix. De minst voorkomende cellen waren mensen met alleen een groen-fluorescerende kernen, die wijst op niet-chondrocyten-afgeleide botcellen met Runx2 expressie of een transformatie die zich vóór Cre activering. De afbeelding stelt de rode botcellen en die met gele kernen waren de meeste celpopulaties dragen aan de condylaire subchondrale botvorming.
Anderzijds, bijna elke rood-afgeleide chondrocyten botcellen in de botmatrix had DMP1 kleuring rond hun cellichamen. Weinig osteocyten waren positief voor DMP1 maar miste rood cellichamen (Figuur 4B). Er zijn ook twee mogelijke verklaringen voor deze cellen: ofwel zij zijn niet chondrocyte afgeleide botcellen of zij-chondrocyte afgeleide botcellen die getransformeerd voorafgaand aan de injectie tamoxifen. Bovendien zijn er geen rode botcellenop het oppervlak van het bot DMP1 expressie, wat aangeeft dat zij niet osteocyten waren volwassen.
Samengevat, de gegevens van de expressiepatronen beide vroegtijdige (Runx2) en late stadium markers (DMP1) van osteogene cellen waren consistent met de eerdere resultaten via Cre gecombineerd met 2.3Col1a1-GFP. Deze gegevens tonen aan dat de combinatie van immunofluorescentie en Rosa26 tdTomato tracing is een goede manier om lot van de cel te bestuderen. Wat nog belangrijker is, kunnen de onderzoekers onderscheid maken het celtype, identificeren van de differentiatie podium, en de getransformeerde cel aantallen tegelijk te observeren met behulp van immunofluorescentie met verschillende markers, die meer informatie geeft dan Rosa26 tdTomato alleen traceren.
Figuur 1. Het mechanisme voor Cell Lineage Tracing en the generatie van de verbinding Muizen. A) De Cre-loxP systeem wordt vaak gebruikt in lineage tracing. Cre Accijnzen op de STOP-sequentie tussen de twee loxP plaatsen, en de tdTomato eiwit (fluorescerend rood) permanent tot uitdrukking in de specifieke cellijn. B) Drie diermodellen worden genoemd in dit document. We gebruikten 2,3 COL1A1-GFP; Rosa26 tdTomato muizen en kruiste ze met Col10a1-Cre muizen. Col10a1-Cre is niet induceerbaar, die de celdifferentiatie vanaf het begin van Col10a1 expressie (bij E14.5) weerspiegelt. C) aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) is een ander Cre lijn ook gekruist met 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato muizen. Cre werd geactiveerd bij 2 weken door injectie tamoxifen (Tm: tamoxifen). D) Om de immunofluorescentie met cellijn tracing combineren, genereerden we Agg-Cre ERT2; <em> Rosa26 tdTomato muizen, geactiveerd Cre op postnatale dag 3, en voerde de Runx2 en DMP1 immunofluorescentie (Tm: tamoxifen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De transformatie van chondrocyten naar botcellen (Osteoblasten en Osteocyten) in de kaakkop en Long Bone Met behulp van Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Compound Muizen. A) Cre werd geactiveerd door tamoxifen op postnatale dag 14 en werden de muizen 4 weken opgeofferd. Er waren drie gekleurde cellen in de condylaire proces: zuiver rood (-chondrocyte afgeleide botcellen), geel (rood gecombineerd met groen, wat aangeeft-chondrocyte afgeleide botcellen dat het collageen 1 gen tot expressie gebracht), en puur groene (niet-chondrocyte afgeleide botcellen met het collageen 1 gen) . Het merendeel van de botcellen in de condylaire proces onder het kraakbeen waren geel of zuiver rood (witte pijlen), terwijl enkele botcellen waren groen (blauwe pijlen). Deze gegevens verschaffen sterke aanwijzingen dat direct chondrocyten zetten in botcellen en bijdragen aan de vorming van de condylaire tijdens de ontwikkeling (Tm: tamoxifen; C: kraakbeen; B: bot). B, C) De meerderheid van de botcellen in de epifyse en metafyse werden chondrocyten-afgeleide (witte pijl:-chondrocyte getransformeerde botcellen in geel of zuiver rood, blauwe pijl: niet-chondrocyte afgeleide botcellen in zuiver groen; AC: articulaire kraakbeen; GP: groeischijf).blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De transformatie van chondrocyten naar botcellen in de kaakkop behulp Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Compound Muizen. A) In de condylaire proces van 3 weken oude muizen, groene botcellen waren een duidelijke minderheid in de trabekels in de buurt van het kraakbeen-bot-interface (superieur niveau, A1), terwijl rood en een aantal gele cellen overheersen. In het middelste niveau (A2), gele cellen waren in de meerderheid, met iets minder rode bloedcellen. Groene cellen bleek in de meeste alleen in de onderste zone (a3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. De Co-lokalisatie van twee Markers voor osteogeen Cellen met de Lineage tracing Achtergrond in de Condylaire proces met behulp van 2 weken oude Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Compound Muizen. A) De gele kleur in de kernen vormt chondrocyte-afgeleide botcellen tot expressie Runx2 (witte pijlen) op het oppervlak van het trabeculaire bot onder de condylus kraakbeen. De zuivere rode botcellen zonder Runx2 expressie vertegenwoordigen mature-chondrocyte afgeleide botcellen in het bot matrix (gele pijlen). de fewest cellen waren degenen die alleen groen kernen, die ofwel niet-chondrocyte afgeleide botcellen of getransformeerde botcellen uit chondrocyten voordat Cre activering (Tm: tamoxifen). B) In het trabeculaire bot onder de condylus kraakbeen, bijna elke red-chondrocyten afgeleid bot cel in het bot matrix uitgevoerd DMP1 vlekken rond hun cellichamen (witte pijlen). Slechts een paar van de osteocyten waren positief voor DMP1 maar miste rode kleur in hun cellichamen (gele pijlen). Er zijn twee mogelijkheden voor deze cellen: non-chondrocyte afgeleide botcellen of chondrocyte afgeleide botcellen die vóór tamoxifen injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door de technologische beperkingen, is het altijd moeilijk om het gedrag van cellen in vivo te onderzoeken. Echter, de cellijn tracing techniek blijkt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van celbiologie 7-9 zijn. In deze studie hebben we verder verbeteren dit protocol door het te combineren met immunofluorescentie. Zo kunnen lot van de cel worden gedefinieerd door meerdere gerelateerde markers, die de toepassing van lineage tracing verbreedt. Bovendien is deze co-lokalisatie van immunofluorescentie en tomaat signaal tegelijkertijd geeft het aantal nakomelingen van de stichter cel, hun locatie, en hun differentiatie status, het verstrekken van meer informatie dan cellijn alleen traceren. Bovendien kan het gebruik van celspecifieke markers het genereren van verbinding muizen vereenvoudigen, versnellen het onderzoek.
De specificiteit van Cre is cruciaal voor de ondubbelzinnige toekenning van afstamming en de juistheid van de resultaten 20,21. Het is zeer important de juiste Cre selecteren om het lot van de cel te controleren. In deze studie hebben we gekozen Col10a1, omdat het wordt beschouwd als een marker voor hypertrofe chondrocyten 10,11 en aggrecan, omdat het een goed erkende merker voor chondrocyten 18. Er zijn ook goede Cre modellen die gebruikt worden in andere gebieden. De Scleraxis-Cre (SCX-Cre) lijn, bijvoorbeeld, is nuttig bij pezen en ligament onderzoek sinds scleraxis een basis helix-loop-helix transcriptiefactor die een merker voor de pezen en ligament cellijn 22. Andere Cre genaamd DMP1-Cre wordt vaak gebruikt in skeleton- en tand gerelateerde studies omdat DMP1 hoog tot expressie in odontoblasten en osteocyten 23,24.
Vergeleken met niet-induceerbare Cre systemen kan de activatie van induceerbare Cre ruimtelijk en temporeel 20 beperkt. Er moet echter een aantal beperkingen worden overwogen bij het ontwerpen van het experiment en interpreteren van de resultateninduceerbare modellen Cre. Ten eerste kan de dosis van tamoxifen de efficiëntie van Cre activering en het aantal gelabelde cellen wijzigen. Lage doses zal de bevolking van belang in een klonale dichtheid 25 labelen; hoge doses kunnen het etiket van de hele voorlopercellen pool 7,26. Zo moet de dosering worden gekozen afhankelijk van het doel van het experiment. Ten tweede, tamoxifen mogelijke toxiciteit, vooral bij hoge doses 27,28. Daarom is het beter om de dosis te late termijn abortussen voorkomen bij het injecteren tijdens de zwangerschap 29 verlagen.
Kortom, de co-toepassing van cellijn tracing technieken en immunofluorescentie is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van celbiologie in vivo. In de toekomst, kunnen onderzoekers proberen gelijktijdig uitvoeren immunofluorescentie met twee verschillende antilichamen via tomaat signaalachtergrond. Deze methode kan het expressiepatroon twee markers weergegeven in een sectie, waardoor het voor deonderzoeker te vergelijken en de resultaten te analyseren. Bovendien kan deze gezamenlijk aanbrengen verder worden verbeterd door in situ immunofluorescentie om niet-specifieke kleuring die kan bestaan door conventionele immunofluorescentie verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
