Summary
Wir entwickelten zwei Sätze von Kombinationen in Rosa26 tdTomato Tracing (ubiquitär in allen Zellen exprimiert) / Cre (insbesondere in Chondrozyten exprimiert) Mäuse: eine mit 2.3Col1a1-GFP (spezifisch für Osteoblasten) und eine mit Immunofluoreszenz (spezifisch für Knochenzellen). Die Daten zeigen die direkte Umwandlung von Chondrozyten in Knochenzellen.
Abstract
Die Zelllinie Tracing-System wurde in erster Linie in der Entwicklungsbiologie Studien verwendet. Die Verwendung von Cre-Rekombinase erlaubt die Aktivierung des Reporters in einer bestimmten Zelllinie und alle Nachkommen. Hier haben wir die Zelllinie Tracing - Technik verwendet , um nachzuweisen , dass Chondrozyten direkt verwandeln sich in Osteoblasten und Osteozyten während der langen Knochen und Kiefergelenkkopfs Entwicklung unter Verwendung von zwei Arten von Cre, Col10a1-Cre und Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), gekreuzt mit Rosa26 tdTomato. Sowohl Col10 und Aggrecan sind gut erkannt Marker für Chondrozyten.
Auf dieser Basis haben wir eine neue Methode-cell lineage in Verbindung mit fluoreszierenden Immunhistochemie-to Verfolgungszellschicksal bestimmen, indem die Expression von spezifischen Zellmarkern analysiert. Runx2 (ein Marker für osteogene Zellen im Frühstadium) und Dentinmatrix protein1 (DMP1; ein Marker für osteogene Zellen im Spätstadium) warenverwendet, um Chondrozyten stammende Knochenzellen und deren Differenzierungsstatus zu identifizieren. Diese Kombination erweitert nicht nur die Anwendung von Zelllinie Verfolgung, sondern vereinfacht auch die Erzeugung von Verbindung Mäusen. Noch wichtiger ist, sind die Anzahl, Position und Differenzierung Status der Mutterzelle Nachkommen gleichzeitig angezeigt, Tracing allein mehr Informationen als Zelllinie bereitstellt. Abschließend ist die Co-Anwendung von Zelllinie Verfolgungstechniken und Immunofluoreszenz ein mächtiges Werkzeug der Zellbiologie in vivo zu untersuchen.
Introduction
Während der Entwicklung Konten endochondral Knochenbildung für mehr als 80% des Skelettvolumen. Es wird allgemein angenommen, dass es mit der Apoptose von hypertrophen Chondrozyten beginnt. Anschließend dringen in die Zellen von der darunter liegenden Knochenmark und initiieren Angiogenese, gefolgt von einer Knochenneubildung durch aus Knochenmark und Periost-abstammenden Zellen 1,2. Die Zelle Schicksal von hypertrophen Chondrozyten (HC-) jedoch seit Jahrzehnten 3 eine Frage der Debatte. Zunächst wurden HCs als das Ende der Chondrozyten-Differenzierungsweges zu sein, und wurde Apoptose allgemein das endgültige Schicksal der HCs zu denken. Jetzt schlagen einige Forscher, dass zumindest einige HCs überleben könnten und tragen zur enchondralen Knochenbildung. Obwohl sie , dass das Wachstum Platte Chondrozyten hatte die Fähigkeit , in Osteoblasten auf Ultra, immunhistochemischen Färbung und in vitro basierend auf transdifferentiate vorgeschlagenen Studien 46, keine dieser Methoden wehe endgültige Chondrozyten Beitrag zur Osteoblasten-Linie zu demonstrieren.
Die Zelllinie Tracing-Technik liefert eine strengere Weise Zellschicksal zu studieren. Kurz gesagt, eine Rekombinase-Enzym, das nur in einem bestimmten Zelltyp exprimiert wird, stimuliert die Expression des Reportergens. Auf diese Weise kann diese Art von Zelle und ihre Nachkommen sind 7 dauerhaft markiert. Das Cre-loxP-System wird häufig in Lineage Tracing verwendet. Cre (die Rekombinase - Enzym) wird die STOP - Sequenz zwischen den zwei loxP - Stellen und aktivieren Sie den Reporter in einer bestimmten Zelllinie (Abbildung 1A) auszuschneiden. In einigen Fällen kann der Prüfer einen günstigen Zeitpunkt wählen Cre zur Aktivierung durch ein Medikament, wie Tamoxifen verwendet, Cre was bewirkt , daß eine modifizierte Form des Östrogenrezeptors (Cre ERT2) 8 zu verschmelzen. Fluorescent Reporter haben die Standard-in-Linie Tracing-Experimente geworden, weil sie drastisch die Komplexität reduzierenund verbessern die Genauigkeit und Effizienz des Zellschicksals Tracing 8,9. tdTomato wird immer die beste Wahl unter den fluoreszierenden Reportern , da es die hellsten fluoreszierende Protein und das stärkste Epifluoreszenz- hat, so dass es leicht 7 (Abbildung 1A) sichtbar gemacht .
Durch die Nutzung der Rosa26 tdTomato Linie Tracing - System, unsere Gruppe und andere Forscher gezeigt , dass HCs ihren Phänotyp in Knochenzellen während der Entwicklung 10 bis 14 ändern. Um dies zu erreichen, entwickelten wir zwei Sätze von Kombinationen mit Rosa26 tdTomato (ubiquitäre Expression in allen Zellen) / Cre (spezifisch für Chondrozyten) -Mäuse Tracing: 2.3Col1a1-GFP (spezifisch für Osteoblasten) und Immunofluoreszenz (spezifisch für Knochenzellen). Die Daten zeigen , dass beide Methoden sind gangbare Wege des Zellschicksals in vivo zu untersuchen.
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Protocol
Alle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Texas A & M University College of Dentistry, geprüft und genehmigt.
1. Tierzüchtung
- Verwenden Sie drei Tiermodellen in dieser Studie. Um das Schicksal der embryonalen Chondrozyten in Kondylus Bildung, dem ersten Gebrauch Col10a1-Cre 15 Mäuse untersuchen und überqueren sie mit Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) hze / J) Mäuse zu erhalten Col10a1- Cre und Rosa26 tdTomato Mäuse. Als nächstes überqueren diese Mäuse mit 2.3Col1a1-GFP - Mäuse 16. Verwenden Sie Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP - Mäuse die Zelllinie Verfolgungsexperimente (1B) durchzuführen.
- Um das Schicksal der postnatalen Chondrozyten studieren, folgen dem gleichen Verfahren wie in Schritt 1.1, sondern verwenden Sie die Aggrecan-cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) 17,18 Leitung und die Agg-Cre ERT2 halten; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP - Mäuse die Zelllinie Verfolgungsexperimente (1C) durchzuführen. Injizieren Tamoxifen am postnatalen Tag 14.
- Um die Zelllinie kombinieren Technik mit Immunofluoreszenz Tracing, überqueren Agg-Cre ERT2 Mäuse und Rosa26 tdTomato Mäuse. Verwenden Sie Mäuse , die beide Gene in das Experiment durchführen und injizieren die Tamoxifen auf postnatalen Tag 3 (Abbildung 1D).
2. Materialvorbereitung
- Man löst das Tamoxifen Pulver in 10% Ethanol und 90% Maisöl in einer Konzentration von 10 mg / ml. Die Dosierung für Injektion 75 mg / kg.
- Auflösen des Paraformaldehyd (PFA) -Pulver in PBS auf eine Konzentration von 4% unter Verwendung von 2 M Natronlauge den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Verwenden Sie 4% PFA-Lösung um das Gewebe zu fixieren (die Kondylus und Hinterbein verwendet hier) nach der Tötung. Wegen seinerToxizität, Griff PFA in der Haube mit Handschuhen und Gesichtsmaske.
- Löse das EDTA-Pulver in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 10% unter Verwendung von 2 M Natronlauge den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Verwenden Sie 10% EDTA des Kondylus und Hinterbein zu entkalken.
- Auflösen Saccharosepulver in PBS bei Konzentrationen von 15% und 30%. Verwenden Sie die Saccharose-Lösung in das Gewebe nach dem Entkalken zu entwässern.
- Man löst das Hyaluronidase Pulver in PBS bei einer Konzentration von 2 mg / ml, pH 5,0. Diese Lösung ist für Immunofluoreszenz Antigen Retrieval.
- Verwenden, um eine 1,5-ml-Röhrchen eine blockierende Lösung herzustellen, die 3% Rinderserumalbumin enthält (BSA) und 20% Ziegenserum in PBS für Runx2 oder DMP1 Immunofluoreszenzfärbung.
- Verwenden Sie ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer primären Antikörperlösung herzustellen, die für Runx2 oder DMP1 Immunfluoreszenzanfärbung in PBS 2% Ziegenserum enthält. Die Konzentration des primären Antikörpers beträgt 1: 400 für Runx2 und 1: 100 für DMP1.
- Verwenden Sie ein 1,5-ml-Röhrchen herzustellendas Kaninchen-IgG-Lösung als Kontrolle für Immunfluoreszenzanfärbung falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Die Lösung enthält 2% Ziegenserum in PBS. Die Konzentration des Kaninchen-IgG für Runx2 Kontrolle 1: 400; für DMP1, 1: 100. Führen Sie das Experiment und die Steuerung gleichzeitig Färbung.
- Verwenden Sie ein 1,5-ml-Röhrchen einen sekundären Antikörper-Lösung herzustellen, die für Runx2 oder DMP1 Immunfluoreszenzanfärbung in PBS 2% Ziegenserum enthält. Verwenden Sie den sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 500.
3. Schieben Vorbereitung für die konfokale Mikroskopie (Cell Lineage Tracing Nur, keine Kombination mit Immunfluoreszenz)
- Injizieren Tamoxifen in der Agg-cre ERT2 Mäuse zu einem günstigen Zeitpunkt.
- Erstens, eine Maus aus dem Käfig entfernen. Verwenden Sie dann den linken Daumen und Zeigefinger die Haut auf der Rückseite der Maus zu greifen und umdrehen, Freilegung der Bauch. Verwenden Sie die rechte Hand auf die Spritze halten. Die optimale Einstiegspunkt für die Injektion ist auf der links oder rechten Seite des Unterbauches, die Vermeidung der Leber und der Blase.
- Halten Sie die Spritze parallel zu den Hinterbeinen der Maus und injizieren intraperitoneal. Die Dosierung für Injektion 75 mg / kg. Die Gewichte der Mäuse im Alter von 2 Wochen, 3 Wochen und 4 Wochen alt sind etwa 7 bis 9 g, 11-13 g und von 16 bis 18 g.
- Anästhesieren die Mäuse mit Xylazin / Ketaset Kombination.
- Um die Arbeitslösung herzustellen, verdünntem zuerst die Xylazin und Ketaset mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 1 mg / ml und 5 mg / ml. 2-Verhältnis: Als nächstes wird in einem 1 die Xylazin und Ketaset mischen. Die Dosierung für Injektion 30 & mgr; l / g.
- Injizieren, wie in Schritt 3.1. Bestätigen Sie die anesthetization mit der Maus Knöchel Kneifen. Die Maus ist bewusstlos, wenn es keine Reaktion.
- Perfuse die Mäuse mit 4% PFA nach anesthetization.
- Nachdem der Maus das Bewusstsein verliert, fixieren die vier Beine der Maus auf einem Brett zu entirely den Bauch aus.
- Tränken Sie den Bauch mit 70% Ethanol und machen eine Exzision von den unteren Bauch bis zum Hals entlang der Mittellinie. Einzuklemmen und gleichzeitig die Haut zu den seitlichen Seiten ziehen, um die Peritonealmembran offenbaren. Verwenden Sie Dissektion Schere, um eine Längs Exzision machen.
- Abgeschnitten und entfernen Sie die vorderen Rippen das Herz aussetzen. Stechen Sie das Herz aus dem linken Ventrikel mit einer 22 G Spritze, halten Sie die Spritze, und gleichzeitig einen Schlitz in der rechten Ohrmuschel schneiden.
- Langsam injizieren, um die 4% PFA, die entlang des Herz-Kreislauf-System, während die Blutwallungen aus dem Schnitt von der rechten Ohrmuschel perfundiert wird. Das Volumen des PFA für die Perfusion beträgt 1 ml / Gramm. Führen Sie diesen Schritt in der Klasse I Biosicherheitsschrank, der auf das Gebäude Abgasanlage hart geleitet ist.
- Ziehen Sie die Haut der Maus und setzen den ganzen Körper in einen 50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen, die 40 ml 4% PFA enthält über Nacht bei 4 ° C zu beheben.
- Verwenden Dissektion Schere und # 3 und # 5 Pinzette vorsichtig die Mandibula und Hinterbein aus dem Körper zu entfernen und die Muskeln und Sehnen auf der Oberfläche zu entfernen. Führen Sie diesen Schritt in der Klasse I Biosicherheitsschrank, der auf das Gebäude Abgasanlage hart geleitet ist.
- Schneiden, den Unterkiefer in zwei Teile an dem distalen Bereich des dritten molar. In ähnlicher Weise schneiden die Femur und Tibia in den midshaft die Knochenmarkhöhle, um Entkalkung zu beschleunigen auszusetzen. Setzen Sie den Teil, der die Kondylen und Gelenkfortsatz und zusammen mit dem Hinterbein in 40 ml 10% EDTA enthält für 2 bei 4 ° C zu entkalken - 4 Tage in einem 50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen.
- Verwenden 50 ml 15% Sucrose Kondylus und Hinterbein zu entwässern über Nacht bei 4 ° C in einem 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen.
- Verwenden 30% Saccharose Kondylus und Hinterbein über Nacht bei 4 ° C in einem 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen zu dehydratisieren.
- Entlang der Sagittalebene, betten die Probe mitOktober auf der Schneidplatte in der Kryoschnittes Maschine.
- Horizontal lag der Kondylus oder die Hinterbein in der Montageform. Tauchen Sie das Gewebe in OCT und lassen Sie ihn in der Kryoschnittes Maschine, bis die OCT gefriert.
- Montieren Sie den Oktober-Block auf der Schneidplatte. Warten Sie ca. 15 Minuten vor dem Schneiden, um sicherzustellen, dass die OCT vollständig gefroren ist.
- Schneiden Sie den Gelenkkopf und Hinterbein in 10-um-Schnitte. Sammeln Sie die Abschnitte auf Folien und bei -20 ° C.
- Inkubieren der Objektträger in einem 37 ° C Kammer das Wasser vor der Färbung zu entfernen.
- Waschen Sie die Objektträger zweimal mit destilliertem Wasser für 5 min.
- Wischen Sie das Wasser um jeden Abschnitt aus. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift, um die Abschnitte zu umkreisen und fallen DAPI oder nicht-fluoreszierendes anti-fade Montagelösung in den Kreis. legen Sie die Abdeckung vorsichtig nach unten rutschen.
4. immunhistochemischen Färbung für Runx2 und DMP1
HINWEIS: Die IgG-control ist notwendig für die immunhistochemischen Färbung falsch-positive Signale zu vermeiden. Die Färbung für die Versuchs- und Kontrollgruppen muss gleichzeitig durchgeführt werden.
- Inkubieren der Objektträger in einem 37 ° C Kammer das Wasser vor der Färbung zu entfernen.
- Waschen Sie die Objektträger zweimal mit destilliertem Wasser.
- Verwenden Sie die hydrophobe Barriere Stift alle Abschnitte auf der Folie zu umkreisen. Von diesem Schritt werden alle der hergestellten Lösung in den Kreis in den vollständig die Abschnitte umfassen.
- Behandlung der Schnitte mit Hyaluronidase in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 30 min. Das Volumen der Lösung (in Schritten von 4,5 bis 4,8) ist abhängig von der Größe des Abschnitts. Verwenden Sie 50 ul Lösung für die Kondylus und 100 & mgr; l für den langen Knochen. Waschen mit PBST (PBS, das 0,1% Tween 20 enthält) dreimal.
- Vorbereiten und gelten für jeden Abschnitt die Blockierungslösung und Inkubation sie in einer feuchten Kammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Abschnitte mit primärenAntikörper-Lösung (Kaninchen-anti-Maus Runx2 oder Kaninchen-anti-Maus DMP1) bei 4 ° C über Nacht. Waschen mit PBS dreimal.
- Inkubieren der Schnitte mit sekundären Antikörperlösung (Ziege-anti-Kaninchen, Alexa Fluor 488) für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Waschen mit PBS dreimal.
- Wischen Sie das Wasser um den Abschnitt und fallen DAPI in den Kreis aus dem Abschnitt auf der Folie abzudecken. legen Sie die Abdeckung vorsichtig nach unten rutschen.
5. konfokale Mikroskopie
- Erfassen fluoreszierenden Zellbildern ein konfokales Mikroskop bei Wellenlängen im Bereich von 488 & mgr; m (grün) bis 561 um (rot). Nehmen Sie mehrere gestapelte Bilder bei 200 Hz (Abmessungen von 1.024 × 1.024) 19 unter Verwendung von 10X, 20X, 63X und Linsen.
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Representative Results
Chondrozyten Transform direkt in Knochenzellen (Osteoblasten und Osteozyten) in der Kondylus und langen Knochen.
Aggrecan, ein kritisches Gen für Chondrogenese, ist vor allem in der frühen und reifen Chondrozyten 18 ausgedrückt. Als Ergebnis der Injektion von Tamoxifen bei 2 Wochen alten in Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Mäusen aktiviert , um die rot-Tomaten - Reporter in allen Chondrozyten und ihre Tochterzellen. Die 2.3Col1a1-GFP Linie ergab sich ein grün fluoreszierender Farbe in Kollagen Knochenzellen 1-exprimierenden, insbesondere Osteoblasten und Pre-Osteozyten. Die gelbe Farbe (rot mit grün kombiniert) zeigte die Anwesenheit von Chondrozyten stammenden Knochenzellen, die das Kollagen - 1 - Gen exprimiert. In 2A wurden die meisten der Knochenzellen in den Kondylen - Prozess unter dem Knorpel rot oder yellow (eine rote Zelle, die grün fluoreszierender COL1A1 begonnen hatte, zu sezernieren, dadurch erscheinen gelb, wenn die beiden Fluorophore überlagert wurden). Diese Ergebnisse lieferten starke Hinweise, dass diese Knochenzellen von Chondrozyten abgeleitet wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei langen Knochenentwicklung beobachtet, wo die Mehrheit der Knochenzellen beide und abgeleitet wurden aus Chondrozyten in der Epiphyse (2B) der Metaphyse (2C).
Um diese Ergebnisse zu untersuchen, überquerten wir Col10al-Cre Mäusen mit Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP - Mäuse. Col10a1 ist ein hochspezifischer Marker für HCS, ausgedrückt nur in HCs und deren Nachkommen. Außerdem ist Col10a1-Cre nicht-induzierbare, die Zelldifferenzierung von Anfang an Col10a1 Ausdruck (bei E14.5) widerspiegelt. In der Knochenbälkchen in der Nähe der Knorpel-Knochen-Schnittstelle (höheres Niveau) von 3 Wochen alten Mäusen, rot und some gelb fluoreszierende Zellen waren vorherrschend, während grün fluoreszierende Zellen knapp waren. In einem etwas minderwertig Bereich (mittlere Ebene), waren die Mehrzahl der Zellen fluoreszieren gelb, mit etwas weniger fluoreszieren rot. Grün fluoreszierender Zellen erschien nur in der am meisten inferior Bereich des Gelenkfortsatzes (inferior Ebene) (Abbildung 3) .Diese Trend zu dominieren zeigt an, dass kondylären Wachstum wird hauptsächlich von transformierten Knochenzellen von HCs beigetragen. Die Verteilung der roten und grünen fluoreszierenden Zellen in condylaris Prozess steht auch im Einklang mit dem minderwertigen zu überlegen Richtung Kondylenwachstum.
Die Zelllinie Verfolgungstechnik zeigt deutlich, dass die Apoptose für HCS nicht das einzige Schicksal. Sowohl die Agg-Cre ERT2 und Col10a1-Cre Linien zeigen , dass Chondrozyten stammende Knochenzellen sind die Hauptquelle für die Knochenentwicklung in condylaris Prozess und in der Epiphyseund Metaphysis in langen Knochen.
Co-Anwendung von Immunfluoreszenzanfärbung and Cell Lineage Tracing ermöglicht die Verfolgung der Zelldifferenzierung.
Die Zelllinie Verfolgungs Technik kann auch mit fluoreszierenden Immunhistochemie kombiniert werden, um den Zelltyp durch den Nachweis eines zellspezifischen Marker zu bestimmen. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile für die Untersuchung von Zellschicksal. Erstens kann der Forscher noch die Zelleigenschaften definieren, indem geeignete Marker Auswahl, auch ohne die spezifischen GFP Mauslinie, die die Anwendung für die Zelllinie Verfolgungstechnik erweitert. Zweitens, es vereinfacht die Erzeugung von Verbindung Mäusen. Zum Beispiel brauchen wir nur Agg-Cre ERT2 zu erzeugen; Rosa26 tdTomato Verbindung Mäuse die rote Farbe nach der Aktivierung Cre (am postnatalen Tag 3), statt der Schaffung Agg-Cre zu produzierenERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Mäuse, die mehr Kreuze erfordert.
In dieser Studie haben wir zwei Antikörper für Immunfluoreszenzanfärbung. Einer war gegen Runx2, einen kritischen Transkriptionsfaktor während der Osteoblasten-Reifung (Frühstadium von osteogenen Zellen); der andere war gegen DMP1, ausgedrückt in reifen Osteozyten (Spätstadium von osteogenen Zellen). In Figur 4 stellt die grüne Fluoreszenz der Runx2 oder DMP1 Antikörperexpression in den 2-Wochen alten kondylären Prozess. In 4A sind drei Arten von farbigen Zellen in dem subchondralen Knochen vorhanden sind. Die gelbe Farbe (Überlagerung der roten und grünen Fluoreszenz) im Kern stellt die Chondrozyten stammenden Knochenzellen exprimieren Runx2, was anzeigt, dass diese Zellen unreife Osteoblasten an die Knochenoberfläche waren. Darüber hinaus gab es Knochenzellen rot fluoreszierender, die nicht Runx2 geäußert hat (rot fluorescence ohne überlagerte grün). Diese Zellen repräsentieren reifen Chondrozyten stammende Knochenzellen in der Knochenmatrix. Die kleinsten gemeinsamen Zellen waren solche mit nur grün fluoreszierender Kerne, was darauf hinweist nicht Chondrozyten stammKnochenZellen mit Runx2 Ausdruck oder einer Transformation, die vor dem Cre-Aktivierung aufgetreten. Das Bild zeigt, dass die roten Knochenzellen und solche mit gelben Kerne die Mehrheit Zellpopulationen zu condylaris subchondralen Knochenbildung beitragen waren.
Auf der anderen Seite, fast jeder rot, Chondrozyten stammende Knochenzellen in der Knochenmatrix hatte DMP1 Färbung um ihre Zellkörper. Nur wenige osteocytes waren positiv für DMP1 aber es mangelte an roten Zellkörper (4B). Darüber hinaus gibt es zwei mögliche Erklärungen für diese Zellen: entweder sind sie nicht-Chondrozyten stammenden Knochenzellen, oder sie sind Chondrozyten stammenden Knochenzellen, die vor der Injektion tamoxifen umgewandelt. Darüber hinaus keine roten Knochenzellenauf der Oberfläche des Knochens ausgedrückt DMP1, was darauf hinweist, dass sie Osteozyten nicht ausgereift waren.
Zusammengenommen sowohl die Daten aus den Expressionsmuster für Früh- (Runx2) und Spätstadium Marker (DMP1) von osteogenen Zellen wurden im Einklang mit dem vorhergehenden Resultat unter Verwendung von Cre kombiniert mit 2.3Col1a1-GFP. Diese Daten zeigen , dass die Kombination von Immunofluoreszenz und Rosa26 tdTomato Tracing ein guter Weg ist , Zellschicksal zu studieren. Noch wichtiger ist , können Forscher die Zelltyp zu identifizieren , die Differenzierung der Bühne, zu unterscheiden und die transformierten Zellzahlen gleichzeitig unter Verwendung von Immunfluoreszenz mit verschiedenen Markern, die als weitere Informationen beobachten liefert allein Rosa26 tdTomato Tracing.
Abbildung 1. Der Mechanismus für Zell Lineage Tracing und the Erzeugung der Verbindung Mäuse. A) Das Cre-loxP - System wird häufig in Lineage Tracing verwendet. Cre schneidet das STOP - Sequenz zwischen den zwei loxP - Stellen, und die tdTomato Protein (fluoreszieren rot) permanent in der spezifischen Zelllinie exprimiert. B) Drei Tiermodelle werden in diesem Papier erwähnt. Wir haben 2,3 COL1A1-GFP; Rosa26 tdTomato Mäuse und kreuzten sie mit Col10a1-Cre Mäusen. Col10a1-Cre ist nicht-induzierbare, die die Zelldifferenzierung von Anfang an Col10a1 Ausdruck (bei E14.5) widerspiegelt. C) Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) ist eine weitere Cre Linie auch mit 2.3Col1a1-GFP gekreuzt; Rosa26 tdTomato Mäuse. (: Tamoxifen Tm) Cre wurde in 2 Wochen alt sind durch eine Tamoxifen-Injektion aktiviert. D) Um die Immunfluoreszenz mit Zelllinie Verfolgung zu kombinieren, wir erzeugt Agg-Cre ERT2; <em> Rosa26 tdTomato Mäuse, aktiviert Cre am postnatalen Tag 3 und führte die Runx2 und DMP1 Immunofluoreszenz (Tm: Tamoxifen). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Transformation von Chondrozyten zu Knochenzellen (Osteoblasten und Osteozyten) in der Kondylus und langen Knochen Mit Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Verbindung Mäuse. A) Cre wurde von Tamoxifen am postnatalen Tag aktiviert 14, und die Mäuse wurden in 4 Wochen alt geopfert. Es gab drei farbigen Zellen in der condylaris Prozess: reines Rot (Chondrozyten stammende Knochenzellen), Gelb (Rot mit Grün kombiniert, was darauf hinweist Chondrozyten stammende Knochenzellen, die das Kollagen 1 Gen exprimiert) und reines Grün (nicht Chondrozyten abgeleitet Knochenzellen mit dem Kollagen 1 - Gen) . Die meisten der Knochenzellen in condylaris Prozess unter dem Knorpel waren gelb oder reines Rot (weiße Pfeile), während nur wenige Knochenzellen grün (blaue Pfeile) waren. Diese Daten liefern starke Beweise dafür, dass während der Entwicklung zur Bildung des kondylären Prozess Chondrozyten Transformation direkt in Knochenzellen und tragen (Tm: Tamoxifen; C: Knorpel, B: Knochen). B, C) Die Mehrheit der Knochenzellen in der Epiphyse und Metaphyse wurden Chondrozyten-derived (weißer Pfeil: Chondrozyten-transformierten Knochenzellen in gelb oder rein rot, blauer Pfeil: non-Chondrozyten stammende Knochenzellen in reines Grün, AC: Gelenk Knorpel, GP: Wachstumsfuge).blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Transformation von Chondrozyten zu Knochenzellen im Kondylus Mit Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Verbindung Mäuse. A) Im Prozess von kondylären 3 Wochen alten Mäusen, waren grün Knochenzellen eine deutliche Minderheit in der Knochenbälkchen in der Nähe der Knorpel-Knochen - Schnittstelle (übergeordnete Ebene, a1), während rote und einige gelbe Zellen waren vorherrschend. In der mittleren Ebene (a2), waren gelb - Zellen in der Mehrheit, mit etwas weniger rote Blutkörperchen. Grüne Zellen erschien nur in der minderwertigsten Bereich (a3) in der Mehrheit zu sein. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Co-Lokalisation von zwei Marker für osteogenen Zellen mit der Lineage-Tracing - Hintergrund in Condylar Verfahren unter Verwendung von 2 Wochen alten Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Verbindung Mice. A) Die gelbe Farbe in den Kernen darstellt Chondrozyten stammenden Knochenzellen Runx2 (weiße Pfeile) auf der Oberfläche des trabekulären Knochens unterhalb des Condylus Knorpel exprimiert. Die reinen roten Knochenzellen ohne Runx2 Ausdruck repräsentieren reifen Chondrozyten stammende Knochenzellen in der Knochenmatrix (gelbe Pfeile). Die fewest Zellen waren solche, die nur grüne Kerne tragen, die entweder nicht Chondrozyten stammende Knochenzellen oder transformierten Knochenzellen von Chondrozyten vor Cre-Aktivierung (Tm: Tamoxifen). B) Im trabekulären Knochen unterhalb des Condylus Knorpel, fast jeder roten Chondrozyten stammKnochenZellen in der Knochenmatrix durch DMP1 Färbung um ihre Zellkörper (weiße Pfeile). Nur ein paar der Osteozyten waren positiv für DMP1 aber es mangelte an der roten Farbe in ihren Zellkörpern (gelbe Pfeile). Es gibt zwei Möglichkeiten für diese Zellen: non-Chondrozyten stammende Knochenzellen oder Chondrozyten stamm entstehenden Knochenzellen vor Tamoxifen Injektion. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Aufgrund der technologischen Einschränkungen , ist es immer schwierig , das Verhalten von Zellen in vivo zu untersuchen. Allerdings erweist sich die Zelllinie Tracing - Technik für das Studium der Zellbiologie 7-9 ein mächtiges Werkzeug zu sein. In dieser Studie, verbessern wir weiter dieses Protokoll indem sie sie mit Immun kombiniert. Auf diese Weise kann das Zellschicksal von mehreren verwandten Marker definiert werden, die die Anwendung von Lineage Tracing erweitert. Darüber hinaus ist diese Co-Lokalisation von Immunofluoreszenz und Tomaten Signal zeigt gleichzeitig die Anzahl der Nachkommen der Gründerzelle, deren Standort und ihren Differenzierungsstatus, mehr Informationen als Zelllinie Bereitstellung Verfolgung allein. Darüber hinaus kann die Verwendung von zellspezifischen Marker die Erzeugung von Mäusen Verbindung zu vereinfachen, zu beschleunigen die Untersuchung.
Die Spezifität von Cre ist entscheidend für die eindeutige Zuordnung der Linie und die Genauigkeit der Ergebnisse 20,21. Es ist sehr imtigsten die entsprechenden Cre Linien zu markieren Sie die Zelle Schicksal zu überprüfen. In dieser Studie haben wir Col10a1, weil es ein spezifischer Marker für hypertrophen Chondrozyten 10,11 und Aggrecan angesehen wird, weil es auch eine gut bekannte Marker für Chondrozyten 18 ist. Es gibt auch gute Cre-Modelle in anderen Bereichen. Die Scleraxis-Cre (SCX-Cre) -Leitung, ist beispielsweise nützlich in Sehnen- und Bänder - Forschung seit Scleraxis ein Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren Transkriptionsfaktor ist, der ein Marker für den Sehnen- und Bänder - Zelllinie ist 22. Ein weiterer Cre genannt DMP1-Cre üblicherweise in Skelett- und Zahnbezogenen Studien verwendet, weil DMP1 hoch in Odontoblasten exprimiert und Osteozyten 23,24.
Im Vergleich zu nicht-induzierbaren Cre Systemen kann die Aktivierung der induzierbaren Cre räumlich beschränkt werden und zeitlich 20. Allerdings sollten einige Einschränkungen in Betracht gezogen werden, wenn das Experiment der Gestaltung und Interpretation der Ergebnisseinduzierbare Cre-Modelle. Zunächst wird die Dosis von Tamoxifen kann die Effizienz des Cre-Aktivierung und die Anzahl der markierten Zellen ändern. Niedrige Dosen wird die Bevölkerung von Interesse an einer klonalen Dichte 25 kennzeichnen; hohen Dosen kann den gesamten Vorläufer Pool 7,26 beschriften. Somit muss die Dosis je nach dem Zweck des Experiments werden ausgewählt. Zweitens hat Tamoxifen potenzielle Toxizität, insbesondere in hohen Dosen 27,28. Aus diesem Grund ist es besser , die Dosis zu verringern späten Abtreibungen zu vermeiden , wenn während der Schwangerschaft 29 injiziert wird .
Abschließend ist die Co-Anwendung von Zelllinie Verfolgungstechniken und Immunofluoreszenz ein mächtiges Werkzeug der Zellbiologie in vivo zu untersuchen. In Zukunft können die Ermittler versuchen, gleichzeitig Immunofluoreszenz mit zwei verschiedenen Antikörpern über das Tomaten Signal Hintergrund durchführen. Dieses Verfahren kann das Expressionsmuster für zwei Marker in einem Abschnitt zeigen, ist es einfacher für die Herstellung vonErmittler zu vergleichen und die Ergebnisse analysieren. Darüber hinaus kann diese Co-Applikation weiter durch Immunfluoreszenz in situ verbessert werden unspezifische Färbung zu verringern , die durch herkömmliche Immunofluoreszenz existieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
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- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
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