Summary
2.3Col1a1-GFP（骨芽細胞に特異的）で1と（骨細胞に特異的）免疫蛍光との1：私たちは（特に軟骨細胞で発現さ）/のCreマウス（遍在すべての細胞で発現）Rosa26遺伝子tdtomatoのトレースの組み合わせの2セットを開発しました。データは、骨細胞への軟骨細胞の直接形質転換を実証します。
Abstract
細胞系統追跡システムは、発生生物学研究に主に使用されてきました。 Creリコンビナーゼの使用は、特定の細胞株およびすべての子孫におけるレポーターの活性化を可能にします。ここでは、軟骨細胞は、直接のCre、Col10a1-のCreおよびアグリカン-CreをERT2（ のAgg-CreをERT2）の2種類を使用して、長い骨と下顎頭の開発中に骨芽細胞および骨細胞に変身することを実証するための技術をトレースする細胞系譜を使用し、Rosa26遺伝子と交配tdTomato。 Col10とアグリカンの両方が軟骨細胞のためのマーカーをよく認識しています。
これに基づき、我々は、蛍光免疫組織化学-する特定の細胞マーカーの発現を分析することによって、細胞の運命を定義すると併せてトレース新しい方法細胞系統を開発しました。 Runx2の（早期骨形成細胞のマーカー）および象牙質マトリックスprotein1（DMP1;後期骨形成細胞のマーカー）しました。軟骨細胞由来の骨細胞およびそれらの分化状態を識別するために使用されます。この組み合わせは、細胞系統のトレースの適用を広げるだけでなく、化合物をマウスの生成を簡素化するだけでなく。さらに重要なことは、親細胞の子孫の数、位置、および分化の状態だけではトレース細胞系統よりも多くの情報を提供し、同時に表示されます。結論として、細胞系譜トレース技術および免疫蛍光の同時適用は、in vivoで細胞生物学を研究するための強力なツールです。
Introduction
開発中に、軟骨内骨形成は、骨格の体積の80％以上を占めています。広く、それが肥大軟骨細胞のアポトーシスから始まると考えられています。続いて、下層の骨髄由来の細胞が侵入し、骨髄および骨膜由来の細胞1,2による新たな骨沈着に続いて血管新生を、開始します。肥大軟骨細胞（HCS）の細胞の運命は、しかし、数十年の3のための議論の課題となっています。最初に、のHCは、軟骨細胞分化経路の末端であるとみなされ、アポトーシスは、一般のHCの最終的な運命であると考えられました。今、一部の研究者は、少なくとも一部のHCが生き残ると軟骨内骨形成に寄与し得ることを示唆しています。彼らは成長板軟骨細胞は、超微細構造に基づいて、骨芽細胞に分化転換する能力、免疫組織化学染色を持っていたし、in vitroで 、これらの方法のいずれもが、ワット、46を研究することを提案したが、骨芽細胞系への軟骨細胞の寄与を実証するに決定的なERE。
細胞系譜トレース技術は、細胞の運命を研究するためのより厳密な方法を提供します。簡単に言えば、唯一の細胞の特定の型で表現されるリコンビナーゼ酵素は、レポーター遺伝子の発現を刺激します。このように、この細胞の種類とその子孫は永久に7のラベルが付いています 。 Cre-loxP系は、一般に系統追跡に使用されます。 CRE（リコンビナーゼ酵素）は、2つのloxP部位の間にSTOPシーケンスを切除し、特定の細胞株（ 図1A）でレポーターを活性化します。いくつかのケースでは、研究者は、Creは、エストロゲン受容体（CreをERT2）8の修正された形に融合させ、タモキシフェンなど、薬剤を使用してのCreを活性化するために有利な時点を選択することができます。蛍光レポーターは、彼らが劇的に複雑さを軽減するための実験をトレースする系統における標準となっていますそして、8,9をトレース細胞の運命の精度と効率を向上させます。それはそれは簡単に7（ 図1A）を可視化すること、明るい蛍光タンパク質と最強のエピ蛍光を有しているためtdTomatoは、蛍光レポーターの中で最良の選択となってきています。
トレースシステムのRosa26 tdTomato系統を使用することにより、当社グループおよび他の研究者は、HCSは、開発10-14の間に骨細胞へのそれらの表現型を変更することができることを示しています。これを達成するために、我々は、Rosa26遺伝子tdtomato（全ての細胞中に遍在式）/のCre（軟骨細胞に特異的な）マウスとの組み合わせを追跡する二組の開発：2.3Col1a1-GFP（骨芽細胞に特異的）および免疫蛍光（骨細胞に特異的）。データは、両方の方法は、 インビボでの細胞の運命を研究するための実行可能な方法であることを示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべてのプロトコルは、歯科のテキサスA＆M大学で施設内動物管理使用委員会（IACUC）によってレビューされ、承認されました。
1.動物の繁殖
- 本研究では3動物モデルを使用してください。顆形成に胚の軟骨細胞の運命を調査し、最初の使用Col10a1-Creを 15匹とのRosa26 tdTomatoでそれらを横断するには（B6; 129S6- Gtの（ROSA）26Sor TM9（CAG-tdTomato）Hze / J）マウスはCol10a1-を得るために、 CREとのRosa26 tdTomatoマウス。次に、2.3Col1a1-GFPマウス 16と、これらのマウスを渡ります。 Col10a1-Creをを使用します。 ROSA26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFPマウスは、細胞系譜トレース実験（ 図1B）を実行します。
- 出生後軟骨細胞の運命を研究するために、ステップ1.1と同様の手順に従いますが、 アグリカン-CREのERT2（ のAgg-CreをERT2を使用）17,18ラインとのAgg-CreをERT2を保ちます。 ROSA26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFPマウスは、細胞系譜トレース実験（ 図1C）を実行します。生後14日目にタモキシフェンを注入します。
- 免疫蛍光と技術をトレースする細胞系譜を結合するには、 のAgg-CreをERT2マウスとのRosa26 tdTomatoマウスを渡ります。実験で両方の遺伝子を運ぶマウスを使用し、生後3日目（ 図1D）にタモキシフェンを注入。
2.材料の準備
- 10mg / mlの濃度で10％エタノールおよび90％のトウモロコシ油中タモキシフェン粉末を溶解します。注射のための投与量は75ミリグラム/ kgです。
- 7.4のpH値を調整するために2 M水酸化ナトリウムを使用して、4％の濃度にPBS中パラホルムアルデヒド（PFA）粉末を溶解します。屠殺後（下顎頭と後ろ足がここで使用されている）は、組織を固定するために、4％PFAのソリューションを使用してください。理由は、そのの毒性は、手袋、フェイスマスクとフードにPFAを扱います。
- 7.4のpH値を調整するために2 M水酸化ナトリウムを使用して、10％の濃度になるように蒸留水にEDTA粉末を溶解します。下顎頭と後肢を脱灰するために10％のEDTAを使用してください。
- 15％および30％の濃度で、PBS中のスクロース粉末を溶解します。脱灰後の組織を脱水するためにショ糖溶液を使用してください。
- 2 mg / mlで、pHが5.0の濃度でPBS中のヒアルロニダーゼの粉末を溶かします。このソリューションは、免疫抗原回復のためのものです。
- Runx2のまたはDMP1免疫蛍光染色のためにPBS中の3％ウシ血清アルブミン（BSA）、20％ヤギ血清を含有するブロッキング溶液を調製し、1.5 mlのチューブを使用します。
- Runx2のかDMP1免疫蛍光染色のために、PBS中の2％ヤギ血清が含まれている一次抗体溶液を準備するために1.5 mlチューブを使用してください。 Runx2のための400および1：100 DMP1のための一次抗体の濃度が1です。
- 準備するために1.5 mlチューブを使用します偽陽性の結果を回避するために、免疫蛍光染色のための対照としてのウサギIgG溶液。液をPBS中の2％ヤギ血清が含まれています。 Runx2の制御のためのウサギIgGの濃度は1：400; DMP1は、1：100。同時に実験およびコントロール染色を実行します。
- Runx2のまたはDMP1免疫蛍光染色のためにPBS中の2％ヤギ血清を含有する二次抗体溶液を調製する1.5mlチューブを使用します。 500：1の希釈で二次抗体を使用してください。
3.スライドさせて共焦点顕微鏡のための準備（のみトレース細胞系統、免疫蛍光ではありませんコンビネーション）
- 有利な時点でのAgg-CRE ERT2マウスではタモキシフェンを注入します。
- まず、そのケージからマウスを削除します。その後、腹部を露出させ、マウスの背中の皮膚を取得し、それをひっくり返すために左手の親指と人差し指を使用しています。シリンジを保持するために右手を使用してください。注射のための最適なエントリー・ポイントはリットルでありますEFTや下腹部の右側に、肝臓や膀胱を回避することができます。
- マウスの後肢に注射器を平行に保ち、腹腔内に注入します。注射のための投与量は75ミリグラム/ kgです。それぞれ、18グラム - 9グラム、11 - - 13グラム、および16の2週間、3週間、および4週齢の年齢のマウスの重量は約7です。
- キシラジン/ Ketasetの組み合わせでマウスを麻酔。
- 作業溶液を調製するには、まず、それぞれ、1mg / mlのおよび5mg / mlの濃度に蒸留水でキシラジンとKetasetを希釈します。 2比：次に、1でキシラジンとKetasetを混ぜます。注射のための投与量は30μL/ gです。
- ステップ3.1のように注入します。マウスの足首をつまんで麻酔を確認してください。それは何の反応を持っていない場合は、マウスは無意識です。
- 麻酔した後、4％PFAでマウスを灌流。
- マウスは意識を失った後、entirelするボード上でマウスの4脚を固定しますyは腹部を露出させます。
- 70％エタノールで腹部を飽和させ、中央の線に沿って首に下腹部から切除を行います。ピンチと同時に腹膜を明らかにするために側面に皮膚を引っ張ります。縦方向の切除を行うために解剖ハサミを使用してください。
- カットオフと心臓を露出するためにフロントリブを削除します。 、22 Gシリンジで左心室から心臓に穴を開け、シリンジを保持し、同時に右心耳にスロットを切りました。
- ゆっくりと右心耳からのカットから血液をフラッシュしながら、心血管系に沿って灌流される4％PFAを、注入します。灌流のためのPFAの体積を1ml /グラムです。ハードダクト建物の排気システムにあるクラスI生物学的安全キャビネットの中で、この手順を実行します。
- ピールマウスの皮膚を切り、4℃で一晩固定するための4％PFAの40ミリリットルが含まれている50-mlのポリプロピレン製遠心管に全身を置きます。
- 慎重に身体から下顎骨と後肢を除去し、表面に筋肉や腱を除去するために、解剖ハサミと＃3、＃5鉗子を使用してください。ハードダクト建物の排気システムにあるクラスI生物学的安全キャビネットの中で、この手順を実行します。
- 第三大臼歯の先端領域で、2枚に下顎をカット。同様に、脱灰を促進するために、骨髄腔を露出させるために中間シャフトに大腿骨および脛骨を切断します。顆と関節丘処理を含む部分を入れて、10％のEDTAの40ミリリットルに後ろ足と一緒に2、4℃で脱灰するために - 50-mlのポリプロピレン遠心管中で4日間。
- 50mlのポリプロピレン遠心管中で4℃で一晩顆と後肢を脱水し、15％ショ糖の50ミリリットルを使用してください。
- 50mlのポリプロピレン遠心管中で4℃で一晩顆と後肢を脱水し、30％ショ糖を使用してください。
- 矢状面に沿って、で試料を埋め込みます凍結切片機で切削プレート上の10月
- 水平顆またはマウント型内の後ろ足を置きます。 10月に組織を水没し、10月がフリーズするまで凍結切片機にそれを残します。
- 切削プレート上で10月ブロックをマウントします。 10月は完全に凍結されていることを確実にするために切断する前に、約15分間待ちます。
- 10-μmの切片に顆と後肢をカットします。 -20℃でスライドや店舗のセクションを収集します。
- 染色の前に水を除去するために、37℃の室内でスライドをインキュベートします。
- 5分間蒸留水で2回スライドを洗浄します。
- 各セクションの周りに水を拭き取り。セクションを一周し、円形にDAPIまたは非蛍光退色防止マウントソリューションを削除するには、疎水性のバリアペンを使用してください。慎重にカバースリップを置きます。
Runx2のとDMP1 4.免疫組織化学染色
注：IgGのコン免疫組織化学染色は、偽陽性シグナルを回避するトロールが必要です。実験群および対照群についての染色を同時に行う必要があります。
- 染色の前に水を除去するために37℃のチャンバー内でスライドをインキュベートします。
- 蒸留水で2回スライドを洗浄します。
- スライド上のすべてのセクションを一周する疎水性バリアペンを使用してください。この段階から、完全にセクションをカバーするために円形に調製した溶液のすべてを追加します。
- 37℃で30分間加湿チャンバー内にヒアルロニダーゼを持つセクションを扱います。 （ステップ4.5 - 4.8）溶液の体積は、セクションのサイズによって異なります。顆と長骨のために100μlのための溶液50μlを使用してください。 3回（0.1％のTween 20を含んでいるPBS）PBSTで洗浄します。
- 準備し、各セクションにブロッキング溶液を塗布し、室温で1時間加湿チャンバーでそれらをインキュベートします。
- プライマリを持つセクションをインキュベート一晩4℃で抗体溶液（ウサギ抗マウスRunx2の、またはウサギ抗マウスDMP1）。 PBSで3回洗浄します。
- 室温で2時間、二次抗体溶液（ヤギ抗ウサギアレクサフルオロ488）を用いて切片をインキュベートします。 PBSで3回洗浄します。
- セクションの周りに水を拭き取り、スライド上のセクションをカバーするために円形にDAPIをドロップします。慎重にカバースリップを置きます。
5.共焦点顕微鏡
- 488ミクロン（緑）から561ミクロン（赤）の範囲の波長で共焦点顕微鏡を用いた蛍光細胞画像をキャプチャします。 10X、20X、および63Xレンズを使用して、19 200 Hzで、複数の積み重ねられた画像を撮影（1024×1024の寸法）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
軟骨細胞は直接下顎頭と長骨における骨細胞（骨芽細胞および骨細胞）に変換します。
アグリカン 、軟骨形成のための重要な遺伝子は、主に早期に成熟した軟骨細胞18で表されます。その結果、 のAgg-CreをERT2年齢の2週間でのタモキシフェンの注射; ROSA26 tdTomatoマウスはすべて軟骨細胞とその娘細胞に赤トマトレポーターを活性化しました。 2.3Col1a1-GFPラインは、コラーゲン1発現骨細胞、特に骨芽細胞および前骨細胞における緑色蛍光発光色を生じました。黄色（緑と組み合わせた赤）は、コラーゲン1遺伝子を発現する軟骨細胞由来の骨細胞の存在を示しました。 図2Aでは、軟骨下の顆プロセスにおける骨細胞のほとんどは赤やyの上にありましたellow（2つの蛍光体を重ね合わせたときに、それによって黄色に現れる、緑色蛍光を発するCOL1A1を分泌し始めていた赤血球）。これらの結果は、これらの骨細胞は、軟骨細胞に由来したという強力な証拠を提供しました。同様の結果はまた、骨細胞の大部分は、骨端（ 図2B）と骨幹端（ 図2C）の両方で軟骨細胞に由来した長骨の発達の間に観察されました。
さらに、これらの結果を調べるために、我々は、Rosa26遺伝子tdTomatoとCol10al-Creマウスを交配しました。 2.3Col1a1-GFPマウス 。 Col10a1はのHCのための高度に特異的なマーカーは、のみのHCとその子孫で発現されます。また、Col10a1-Creが（E14.5で）Col10a1式の非常に最初から細胞分化を反映する、非誘導性です。 3週齢のマウス、赤とsの軟骨と骨の界面（優れたレベル）の近く小柱で緑色の蛍光を発する細胞が不足であった青梅黄色の蛍光を発する細胞は、優勢でした。やや劣る領域（中間レベル）で、細胞の大部分は、わずかに少ない蛍光レッドを、黄色の蛍光を発しました。グリーン蛍光を発する細胞は傾向が下顎頭の成長はほとんどのHCから変換された骨細胞によって寄与されることを示している.Thisのみ顆プロセス（劣るレベル）（ 図3）の中で最も劣る領域に支配するために登場しました。顆状プロセスにおける赤と緑の蛍光を発する細胞の分布も顆成長の劣る対優れた方向と一致しています。
細胞系譜トレース技術は明らかにアポトーシスがHCのための唯一の運命ではないことを示しています。両方のAgg-CreをERT2とCol10a1-のCreラインは軟骨細胞由来の骨細胞は、顆プロセスおよび骨端における骨の開発のための主要な源であることを示していますと長骨で骨幹。
免疫染色および細胞系譜トレースの同時適用は、細胞分化の追跡を可能にします。
細胞系譜トレース技術は、細胞特異的マーカーの検出により細胞の種類を決定するための蛍光免疫組織化学と組み合わせることができます。この方法は、細胞の運命の研究のためのいくつかの利点を有します。まず、研究者はまだあっても技術をトレースする細胞系譜のためのアプリケーションを広げる特定のGFPマウスライン、なしで、適切なマーカーを選択することにより、電池特性を定義することができます。第二に、それは、化合物のマウスの生成を簡素化します。例えば、我々は唯一のAgg-CreをERT2を生成する必要があります 。 ROSA26 tdTomato化合マウス代わりのAgg-のCreを作成する、（生後3日目）のCreを活性化した後、赤色を生成しますERT2; 2.3Col1a1-GFP;より多くの十字架を必要とROSA26 tdTomatoマウス、。
本研究では、免疫蛍光染色のための2つの抗体を選択しました。一つはRunx2は、骨芽細胞の成熟の間の重要な転写因子（骨形成細胞の初期段階）に反対しました。他には、DMP1に反対した、成熟した骨細胞（骨形成細胞の後期）で表しました。 図4では、緑色の蛍光は2週齢の顆状プロセス中のRunx2やDMP1抗体発現を表します。 図4Aに、軟骨下骨における着色細胞の3種類が存在します。核内の黄色の色（赤と緑の蛍光の重ね合わせ）は、これらの細胞が骨表面上の未成熟骨芽細胞であることが示された、Runx2のを発現している軟骨細胞由来の骨細胞を表します。また、赤蛍光を発するのRunx2を発現しなかった骨細胞を（赤Fがありました重畳緑なしluorescence）。これらの細胞は骨基質中の成熟軟骨細胞由来の骨細胞を表します。少なくとも一般的な細胞は、Runx2の発現またはCreを活性化する前に発生した変換と非軟骨細胞由来の骨細胞を示す、唯一の緑蛍光を発する核を有するものでした。画像は、赤、骨細胞および黄色の核を有するものが顆の軟骨下骨の形成に寄与し、大部分の細胞集団であったことを示唆しています。
一方、骨基質のほぼすべての赤、軟骨由来骨細胞は、その細胞体の周囲DMP1染色を有していました。いくつかの骨細胞はDMP1のための陽性であったが、赤細胞体（ 図4B）を欠いていました。そこに、これらの細胞のための2つの可能な説明は、また、次のとおりのいずれか、それらは非軟骨細胞由来の骨細胞である、またはそれらはタモキシフェン注射の前に変換された軟骨細胞由来の骨細胞です。また、赤なし骨細胞骨の表面に、彼らは骨細胞を成熟していなかったことを示す、DMP1を表明しました。
まとめると、骨形成細胞の両方の早期（Runx2の）のための発現パターンと後期マーカー（DMP1）からのデータは2.3Col1a1-GFPと組み合わされたCreを使用して、以前の結果と一致しました。これらのデータは、免疫蛍光とのRosa26 tdTomatoトレースの組み合わせは、細胞の運命を研究するための良い方法であることを示しています。さらに重要なことは、研究者らは、細胞型を区別する分化段階を識別し、単独でトレースRosa26遺伝子tdTomatoよりも多くの情報を提供する、別のマーカーを用いて免疫蛍光を用いて同時に形質転換された細胞の数を観察することができます。
図1. 細胞系譜トレースと目のためのメカニズム化合物のマウスの電子の生成。 A）のCre-loxP系は、一般に系統追跡に使用されます。 CREは、2つのloxP部位の間の停止シーケンスを切除し、tdTomatoタンパク質（蛍光赤色）を恒久的に特定の細胞株で発現されます。 B）三動物モデルは、この論文に記載されています。我々は2.3 COL1A1-GFPを使用しました。 ROSA26 tdTomatoマウスとCol10a1-Creマウスでそれらを渡りました。 Col10a1-Creが（E14.5で）Col10a1式の非常に最初から細胞分化を反映する、非誘導性です。 C） アグリカン-CreをERT2（のAgg-CreをERT2）も2.3Col1a1-GFPと交配させ、別のCreラインです。 ROSA26 tdTomatoマウス 。 （：タモキシフェンTm）をCreがタモキシフェン注射によって2週齢で活性化しました。 D）細胞系譜トレースで免疫蛍光を結合するために、我々はのAgg-CreをERT2を生成し; <em>ののRosa26 tdTomatoマウスは、生後3日目のCreを活性化し、Runx2のとDMP1の免疫蛍光（のTm：タモキシフェン）を行いました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. のAgg-Creを ERT2を 使用し た 下顎頭と長骨における骨細胞（骨芽細胞および骨細胞）への軟骨細胞からの変換 。 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato 化合 物のマウス。 A）のCreは生後14日目にタモキシフェンによって活性化し、マウスは4週齢で屠殺しました。三色の細胞がありました顆プロセス：純粋な赤（軟骨細胞由来の骨細胞）、黄色（緑と組み合わせる赤、 コラーゲン1遺伝子を発現する軟骨細胞由来の骨細胞を示す）、および純粋な緑（ コラーゲン1遺伝子を有する非軟骨細胞由来の骨細胞） 。いくつかの骨細胞が緑色（青矢印）であった軟骨下の顆プロセスにおける骨細胞のほとんどは、黄色または純粋な赤（白矢印）でした。 （：; Cタモキシフェン：軟骨; B：骨Tm）をこれらのデータは、直接骨細胞に形質転換し、開発中の顆プロセスの形成に寄与する軟骨細胞の強力な証拠を提供します。 B、C）骨端と骨幹における骨細胞の大部分が軟骨由来した（白矢印：黄色または赤の純粋で軟骨細胞形質転換骨細胞;青矢印：純粋な緑の中の非軟骨細胞由来の骨細胞; AC：関節軟骨; GP：成長板）。「ブランク>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Col10al-Creを 用いて下顎頭の骨細胞への軟骨細胞からの変換3.図 。 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato 化合 物のマウス 。赤といくつかの黄色の細胞が優勢であったのに対し、A）3週齢のマウスからの顆プロセスでは、緑の骨細胞は、軟骨と骨の界面（ 優れたレベル、A1）近く小柱に明確な少数派でした。ミドルレベル（A2）では、黄色の細胞はわずかに少ない赤血球で、大部分でした。グリーン細胞が唯一の最も劣る領域に大部分であるように思われた（A3）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. 2週齢 のAgg-Creを ERT2を 使用し た 顆頭プロセスにおけるリネージュ追跡背景と骨形成細胞のための2つのマーカーの共局在 。 ROSA26 tdTomato 化合物マウス。 A）核における黄色は、顆の軟骨下の骨梁の表面上のRunx2（白矢印）を発現する軟骨細胞由来の骨細胞を表します。 Runx2の発現のない純粋な赤骨細胞は骨基質（黄色の矢印）で成熟した軟骨細胞由来の骨細胞を表します。 fewe目の細胞は、Cre活性化（：タモキシフェンTm）を前に、非軟骨細胞由来のいずれかの軟骨細胞から骨細胞または形質転換骨細胞を表す、緑色のみ核を有するものでした。 B）顆の軟骨下の骨梁では、骨基質のほぼすべての赤軟骨細胞由来の骨細胞は、その細胞体（白矢印）の周りにDMP1染色を実施しました。骨細胞は数が限らDMP1陽性であったが、それらの細胞体（黄色の矢印）に赤色を欠いていました。タモキシフェン注射の前に生じる非軟骨細胞由来の骨細胞や軟骨細胞由来の骨細胞：これらのセルには2つの可能性があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
技術的制限のために、 インビボでの細胞の挙動を研究することは常に困難です。しかし、細胞系譜トレース技術は、細胞生物学7-9を研究するための強力なツールであることが証明されています。本研究では、さらに、免疫蛍光法と組み合わせることにより、このプロトコールを改良します。この方法では、細胞の運命は、系統追跡の適用を拡大する、複数の関連マーカーによって定義することができます。また、免疫蛍光およびトマト信号のこの共局在は、同時に単独のトレース細胞系譜よりも多くの情報を提供し、創始細胞の子孫の数、それらの位置、およびそれらの分化状態を表示します。さらに、細胞特異的マーカーの使用は、調査を促進する、化合物のマウスの生成を単純化することができます。
Creの特異性は、系統の明確な帰属し、結果20,21の正確性が重要です。それは非常にイムです細胞の運命を検証するために、適切なのCreラインを選択するportant。 それはまた、軟骨細胞18のためのよく認識されたマーカーであるので、それは、肥大軟骨細胞10,11、およびアグリカンの特異的マーカーであると考えられるため、本研究では、我々は、Col10a1を選びました。他の分野で使用さ良いのCreモデルもあります。 scleraxisが腱および靭帯細胞系列22のマーカーである塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子であるのでScleraxis-のCre（SCX-CRE）ラインは、例えば、腱や靱帯の研究に有用です。別のCreは、DMP1は非常に象牙芽細胞や骨細胞23,24で表現されているため、DMP1-Creをは一般skeleton-と歯関連の研究で使用されていると呼ばれます。
非誘導性のCreシステムと比較して、誘導性のCreの活性化は、空間的及び時間的に20制限することができます。結果の実験を設計し、解釈するときしかし、いくつかの制限が考慮されるべきです誘導性のCreモデル。まず、タモキシフェンの投与量は、Creの活性化の効率および標識された細胞の数を変更することができます。低用量は、クローン密度25で、関心の人口にラベルを付けます。高用量は、全体の前駆細胞プール7,26にラベルを付けることがあります。したがって、投与量は、実験の目的に応じて選択する必要があります。第二に、タモキシフェンは、特に高用量27,28に、潜在的な毒性を持っています。このため、妊娠29中に注入する際後期流産を回避するために投与量を減少させる方がよいです。
結論として、細胞系譜トレース技術および免疫蛍光の同時適用は、in vivoで細胞生物学を研究するための強力なツールです。将来的には、研究者らは、同時にトマト信号の背景上の2つの異なる抗体を用いて免疫蛍光を実行しようとすることができます。この方法は、簡単のために作り、1セクションの2つのマーカーの発現パターンを示すことができます結果を比較し、分析する研究者。また、この同時出願は、さらに、従来の免疫蛍光を介して存在し得る非特異的な染色を減少させるためにインサイチュ免疫蛍光に向上させることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
