Summary
Vi utvecklade två uppsättningar spåra kombinationer i ROSA26 tdTomato (ubiquitously uttryckt i alla celler) / Cre (specifikt uttryckt i kondrocyter) möss: en med 2.3Col1a1-GFP (specifik för osteoblaster) och en med immunofluorescens (specifik för benceller). Data visar den direkta omvandlingen av kondrocyter i benceller.
Abstract
Cell härstamning spåra systemet har använts främst i utvecklingsbiologi studier. Användningen av Cre-rekombinas möjliggör aktivering av reportern i en specifik cellinje och all avkomma. Här har vi använt cell härstamning spåra teknik för att visa att kondrocyter direkt omvandlas till osteoblaster och osteocyter under lång ben och mandibulära Condyle utveckling med två typer av Cre, Col10a1-Cre och aggrekan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), korsas med ROSA26 tdTomato. Både Col10 och aggrekan är välkänd markörer för kondrocyter.
På grundval av detta har vi utvecklat en ny metod-cellinje spårning i samband med fluorescerande immunohistokemi till definiera cell öde genom att analysera uttrycket av specifika cellmarkörer. Runx2 (en markör för tidig fas osteogena celler) och Dentin matris protein1 (DMP1, en markör för sent stadium osteogena celler) varanvänds för att identifiera kondrocytceller härrörande benceller och deras differentieringsstatus. Denna kombination inte bara breddar tillämpningen av cellhärstamning spårning, utan förenklar även generering av sammansatta möss. Ännu viktigare är de antal, plats och differentierings status för modercellen avkomma visas samtidigt, vilket ger mer information än cellinje spåra ensam. Sammanfattningsvis är co-tillämpning av cell härstamning spåra tekniker och immunofluorescens ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellbiologi in vivo.
Introduction
Under utveckling står endokondral benbildning för över 80% av skelettet volym. Det anses allmänt att det börjar med apoptos av hypertrofiska kondrocyter. Därefter cellerna från den underliggande benmärgen invadera och initiera angiogenes, följt av nytt ben avsättning av ben marrow- och periosteum härledda celler 1,2. Cell öde hypertrofiska kondrocyter (HC), har dock varit en fråga för debatt för årtionden 3. Inledningsvis var HC anses vara slutet av chondrocyte differentieringsvägen, och apoptos i allmänhet tros vara den slutliga öde HC. Nu, vissa forskare tyder på att åtminstone en del HC kunde överleva och bidra till endokondral benbildning. Även om de föreslog att tillväxtplattan kondrocyter hade förmågan att transdifferentiera i osteoblaster baserade på ultra, immunhistokemisk färgning och in vitro studier 46, ingen av dessa metoder were slutgiltigt visa kondrocyter bidrag till osteoblast härstamning.
Cell härstamning spåra teknik ger en mer noggrant sätt att studera cell öde. I korthet, ett rekombinas enzym, som endast uttrycks i en viss typ av cell, stimulerar expression av rapportörgenen. På detta sätt är den här typen av cell och deras avkomlingar permanent märkt 7. Cre-loxP-systemet används ofta i härstamning spårning. Cre (rekombinaset enzym) kommer skära ut STOP-sekvensen mellan de två loxP-ställen och aktivera reportern i ett visst cellinje (Figur 1A). I vissa fall, kan undersökaren välja en gynnsam tidpunkt för att aktivera Cre genom att använda ett läkemedel, såsom tamoxifen, vilket orsakar Cre att smälta till en modifierad form av östrogenreceptorn (Cre ERT2) 8. Fluorescerande reportrar har blivit standard i härstamning spåra experiment eftersom de dramatiskt minska komplexitetenoch förbättra noggrannheten och effektiviteten av cell öde spårning 8,9. tdTomato blir det bästa valet bland fluorescerande reportrar, eftersom det har den ljusaste fluorescerande proteinet och den starkaste epifluorescence, vilket gör det enkelt visualiseras 7 (Figur 1A).
Genom att använda ROSA26 tdTomato härstamning system för spårning, har vår grupp och andra forskare visat att HC kan ändra sin fenotyp till benceller under utveckling 10-14. För att uppnå detta har vi utvecklat två uppsättningar spåra kombinationer med ROSA26 tdTomato (ubiquitous uttryck i alla celler) / Cre (specifikt för kondrocyter) möss: 2.3Col1a1-GFP (specifik för osteoblaster) och immunofluorescens (specifikt för benceller). Data visar att båda metoderna är viabla sätt att studera cellernas öde in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll granskades och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Texas A & M University College of Dentistry.
1. husdjursförädling
- Använd tre djurmodeller i denna studie. För att undersöka vad som händer med de embryonala kondrocyter i ledhuvud bildning, första användning Col10a1-Cre 15 möss och korsa dem med ROSA26 tdTomato (B6, 129S6- Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) Hze / J) möss för att erhålla Col10a1- Cre och ROSA26 tdTomato möss. Därefter korsa dessa möss med 2.3Col1a1-GFP möss 16. Använda Col10a1-Cre; ROSA26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP möss för att utföra cell härstamning spårningsförsök (Figur 1B).
- För att studera öde postnatal kondrocyter, följ samma procedur som i steg 1,1, men använd aggrekan-cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) 17,18 linje och hålla Agg-Cre ERT2; ROSA26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP möss för att utföra cell härstamning spårningsförsök (Figur 1C). Injicera tamoxifen på postnatal dag 14.
- Att kombinera cell härstamning spåra teknik med immunofluorescens, korsa Agg-Cre ERT2 möss och ROSA26 tdTomato möss. Använd möss som bär båda generna i försöket och injicera tamoxifen på postnatal dag 3 (figur 1D).
2. Material Förberedelser
- Lös upp tamoxifen pulver i 10% etanol och 90% majsolja vid en koncentration av 10 mg / ml. Doseringen för injektion är 75 mg / kg.
- Upplösa paraformaldehyd (PFA) pulver i PBS till en koncentration av 4%, med användning av 2 M natrium hydrat för att justera pH-värdet till 7,4. Använd 4% PFA lösning för att fixera vävnaden (mandibular Condyle och bakben används här) efter avlivning. På grund av desstoxicitet, handtag PFA i huven med handskar och en ansiktsmask.
- Lös upp EDTA pulver i destillerat vatten till en koncentration av 10%, med användning av 2 M natrium hydrat för att justera pH-värdet till 7,4. Använd 10% EDTA att avkalka käken Condyle och bakben.
- Lös sackaros pulver i PBS vid koncentrationer av 15% och 30%. Använd sackaroslösningen att torka vävnaden efter avkalkning.
- Lös upp hyaluronidas pulver i PBS vid en koncentration av 2 mg / ml, pH 5,0. Denna lösning är för immunofluorescens antigenåtervinning.
- Använda en 1,5-ml rör för att framställa en blockeringslösning, som innehåller 3% bovint serumalbumin (BSA) och 20% getserum i PBS under Runx2 eller DMP1 immunofluorescerande färgning.
- Använd en 1,5-ml rör för att framställa en primär antikroppslösning som innehåller 2% getserum i PBS för Runx2 eller DMP1 immunofluorescerande färgning. Koncentrationen av den primära antikroppen är ett: 400 för Runx2 och 1: 100 för DMP1.
- Använda en 1,5-ml rör för att beredakanin IgG-lösningen som källa för immunofluorescerande färgning för att undvika falska positiva resultat. Lösningen innehåller 2% getserum i PBS. Koncentrationen av kanin-IgG för Runx2 kontroll är ett: 400; för DMP1, 1: 100. Utför experimentet och kontroll färgning samtidigt.
- Använda ett 1,5 ml rör för framställning av en sekundär antikropp lösning som innehåller 2% getserum i PBS under Runx2 eller DMP1 immunofluorescerande färgning. Använda den sekundära antikroppen vid en utspädning av 1: 500.
3. Skjut Förberedelse för konfokalmikroskopi (Cell Lineage Tracing Endast Ingen kombination med Immunofluorescens)
- Injicera tamoxifen i Agg-CRE ERT2 möss vid en gynnsam tidpunkt.
- Först ta bort en mus från sin bur. Använd sedan vänster tumme och pekfinger för att ta tag i huden på baksidan av musen och vänd på den, exponera buken. Använd höger hand för att hålla sprutan. Den optimala startpunkt för injektion är på left eller höger sida av hypogastrium, undvika levern och urinblåsa.
- Förvara sprutan parallellt med bakbenen på musen och injicera intraperitonealt. Doseringen för injektion är 75 mg / kg. Vikterna av de möss vid åldrarna av 2 veckor, 3 veckor och 4 veckor gamla är ungefär 7-9 g, 11-13 g, och 16 till 18 g, respektive.
- Söva möss med en Xylazine / Ketaset kombination.
- För att framställa den verksamma lösningen, först späda Xylazin och Ketaset med destillerat vatten till en koncentration av 1 mg / ml och 5 mg / ml, respektive. Därefter blanda Xylazine och Ketaset i en 1: 2 förhållande. Doseringen för injektion är 30 l / g.
- Injicera som i steg 3,1. Bekräfta anesthetization genom att klämma musens fotled. Musen är medvetslös om den inte har någon reaktion.
- BEGJUTA mössen med 4% PFA efter bedövning.
- Efter musen förlorar medvetandet, fastställa fyra ben på musen på en bräda att entirely exponera buken.
- Mätta buken med 70% etanol och göra en excision från nedre delen av buken till halsen längs mittlinjen. Nypa och samtidigt dra i huden för att de laterala sidorna för att avslöja det peritoneala membranet. Använd dissekering sax för att göra ett längsgående excision.
- Klipp av och ta bort de främre revbenen att exponera hjärtat. Punktera hjärtat från den vänstra kammaren med en 22 G sprutan, håll sprutan, och samtidigt skära en slits i högra förmaket.
- Långsamt injicera 4% PFA, som perfuseras längs det kardiovaskulära systemet medan blod spolar ut av snittet från högra förmaket. Volymen av den PFA för perfusion är en ml / gram. Utför detta steg i en klass I biosäkerhet skåp som är hårt leds till byggnaden avgassystemet.
- Dra av musens hud och sätta hela kroppen i en 50-ml polypropylen centrifugrör som innehåller 40 ml 4% PFA att fixa över natten vid 4 ° C.
- Använd dissektion sax och # 3 och # 5 pincett för att försiktigt ta bort underkäken och bakben från kroppen och ta bort de muskler och senor på ytan. Utför detta steg i en klass I biosäkerhet skåp som är hårt leds till byggnaden avgassystemet.
- Skär underkäken i två delar vid den distala regionen av den tredje molar. På samma sätt skär lårben och skenben i midshaft att exponera benmärgen hålighet för att påskynda avkalkning. Sätta den del som inkluderar det kondylen och kondylära processen och tillsammans med bakbenet i 40 ml 10% EDTA för att avkalka vid 4 ° C under 2 - 4 dagar i en 50-ml polypropylen centrifugrör.
- Använd 50 ml av 15% sackaros för att dehydratisera kondylen och bakben över natten vid 4 ° C i en 50-ml polypropylen centrifugrör.
- Använda 30% sackaros för att dehydratisera kondylen och bakben över natten vid 4 ° C i en 50-ml polypropylen centrifugrör.
- Längs sagittalplanet, bädda in provet medOktober på skärplattan i kryosektion maskinen.
- Horisontellt låg Condyle eller bakbenet i monterings mögel. Sänk vävnaden i oktober och lämna den i kryosektion maskinen tills den oktober fryser.
- Montera oktober blocket på skärplattan. Vänta ungefär 15 minuter innan du skär för att säkerställa att oktober är helt fryst.
- Skär Condyle och bakben i 10-ìm sektioner. Samla avsnitten på objektglas och förvara vid -20 ° C.
- Inkubera objektglaset i ett 37 ° C kammaren för att avlägsna vattnet före färgning.
- Tvätta bilderna två gånger med destillerat vatten under 5 min.
- Torka av vattnet runt varje sektion. Använd en hydrofob barriär penna för att ringa sektionerna och släppa DAPI eller icke-fluorescerande anti-fade monteringslösning in i cirkeln. Lägg försiktigt ner täckglaset.
4. Immunohistokemisk färgning för Runx2 och DMP1
OBS: IgG conkontroll är nödvändig för immunohistokemisk färgning för att undvika falska positiva signaler. Den färgning för de experimentella och kontrollgrupperna behöver utföras samtidigt.
- Inkubera objektglasen i ett 37 ° C kammaren för att avlägsna vattnet före färgning.
- Tvätta bilderna två gånger med destillerat vatten.
- Använd den hydrofoba barriär pennan för att ringa in alla avsnitt på bilden. Från detta steg, lägga till alla för den beredda lösningen in i cirkeln för att helt täcka sektionerna.
- Behandla de sektioner med hyaluronidas i en fuktig kammare vid 37 ° C under 30 min. Volymen av lösningen (i steg 4,5 - 4,8) beror på storleken av sektionen. Använd 50 pl lösning för Condyle och 100 pl för den långa ben. Tvätta med PBST (PBS innehållande 0,1% Tween 20) tre gånger.
- Förbereda och applicera den blockerande lösningen till varje avsnitt och inkubera dem i en fuktkammare under 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera sektioner med primärantikropplösning (kanin-anti-mus-Runx2, eller kanin-anti-mus-DMP1) vid 4 ° C över natten. Tvätta med PBS tre gånger.
- Inkubera sektioner med sekundär antikroppslösning (get-anti-kanin, Alexa Fluor 488) under 2 h vid rumstemperatur. Tvätta med PBS tre gånger.
- Torka av vattnet runt sektionen och släppa DAPI i cirkeln för att täcka den del på bilden. Lägg försiktigt ner täckglaset.
5. konfokalmikroskopi
- Fånga fluorescerande cellbilder med hjälp av en konfokalmikroskop vid våglängder som sträcker sig från 488 m (grön) till 561 pm (röd). Ta flera staplade bilder på 200 Hz (dimensionerna 1024 x 1024) 19 med hjälp av 10X, 20X och 63x objektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kondrocyter direkt omvandla till benceller (osteoblaster och osteocyter) i Mandibular Condyle och rörben.
Aggrekan, en kritisk gen för kondrogenes, huvudsakligen uttrycks i tidiga och mogna kondrocyter 18. Som ett resultat, injektion av tamoxifen vid 2 veckors ålder i Agg-Cre ERT2; ROSA26 tdTomato möss aktiverade röda tomat reporter i alla kondrocyter och deras dotterceller. Den 2.3Col1a1-GFP linje gav upphov till en grön fluorescerande färg i collagen ett uttryck benceller, speciellt osteoblaster och pre-osteocyter. Den gula färgen (röd kombinerad med grön) indikerade närvaron av kondrocytceller härledda benceller som uttryckte kollagen 1-genen. I figur 2A, de flesta av de benceller i kondylära processen under brosket var röda eller yGul (en röd cell som hade börjat utsöndra grön fluorescerande Col1a1, därmed förekommer gult när de två fluoroforerna överlagrades). Dessa resultat visade tydligt att dessa benceller härrör från kondrocyter. Liknande resultat observerades också under lång ben utveckling, där majoriteten av benceller erhölls från kondrocyter både epifysen (Figur 2B) och metafysen (figur 2C).
För att ytterligare undersöka dessa resultat, korsade vi Col10al-Cre möss med ROSA26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP-möss. Col10a1 är en mycket specifik markör för HC, uttryckt endast i HC och deras ättlingar. Dessutom är Col10a1-Cre icke-inducerbar, som återspeglar celldifferentiering från början av Col10a1 expression (vid E14.5). I trabeculae nära brosk-ben gränssnitt (överlägsen nivå) av tre veckor gamla möss, röd och some gula fluorescerande celler var dominerande, medan de gröna fluorescerande celler var knappa. I en något mer underlägsna område (mellannivå), majoriteten av cellerna var fluorescerande gul, med något färre fluorescerande rött. Gröna fluorescerande celler tycktes dominera endast i den mest underlägsna delen av kondylära processen (sämre nivå) (Figur 3) .Denna trend indikerar att kondylär tillväxt är oftast bidragit till genom transformerade benceller från HC. Fördelningen av de röda och gröna fluorescerande celler i kondylär processen är också i linje med sämre till överlägsen riktning kondylär tillväxt.
Cell härstamning spåra teknik visar tydligt att apoptos är inte den enda öde för HC. Både Agg-Cre ERT2 och Col10a1-Cre linjer indikerar att kondrocytceller-härledda benceller är den viktigaste källan för ben utveckling i kondylär processen och i epifysenoch metafys i långa ben.
Samtidig tillämpning av immunofluorescerande färgning och Cell Lineage Tracing möjliggör spårning av celldifferentiering.
Den cellhärstamning spårning teknik kan även kombineras med fluorescerande immunohistokemi för bestämning av celltyp genom detektering av en cellspecifik markör. Denna metod har flera fördelar för studier av cell öde. För det första kan forskaren fortfarande definiera cellegenskaper genom att välja lämpliga markörer, även utan specifika GFP mus linje, som breddar programmet för cellen härstamning spåra teknik. För det andra, förenklas generering av sammansatta möss. Till exempel, vi behöver bara generera Agg-Cre ERT2; ROSA26 tdTomato sammansatta möss för att producera den röda färgen efter aktivering Cre (vid postnatal dag 3), istället för att skapa Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato möss, vilket kräver fler korsningar.
I denna studie valde vi två antikroppar för immunfluorescensfärgning. En var mot Runx2, en kritisk transkriptionsfaktor under osteoblaster mognad (tidigt stadium av osteogena celler); den andra var emot DMP1, uttryckt i mogna osteocyter (sent skede av osteogena celler). I fig 4, representerar grön fluorescens den Runx2 eller DMP1 antikroppsexpression i två veckor gamla kondylära process. I figur 4A, tre typer av färgade celler i det subkondrala benet är närvarande. Den gula färgen (överlagring av röd och grön fluorescens) i kärnan representerar kondrocytceller härledda benceller som uttrycker Runx2, vilket indikerar att dessa celler var omogna osteoblaster på benytan. Dessutom fanns det röda fluorescerande benceller som inte uttryckte Runx2 (röd fluorescence utan överlagrad grön). Dessa celler representerar mogna kondrocytceller härrörande benceller i benvävnad. Den minsta gemensamma celler var de med bara grön fluorescerande kärnor, vilket indikerar icke-kondrocyter härledda benceller med Runx2 uttryck eller en omvandling som inträffade före Cre aktivering. Bilden antyder att de röda benceller och de med gula kärnor var majoriteten cellpopulationer som bidrar till kondylär subkondrala benbildning.
Å andra sidan, nästan varje röd, kondrocyt härledda ben cell i benmatrisen hade DMP1 färgning runt sina cellkroppar. Få osteocyter var positiva för DMP1 men saknade röda blodkroppar (Figur 4B). Det finns också två möjliga förklaringar till dessa celler: antingen de är icke-kondrocytceller härledda benceller, eller de är kondrocytceller härledda benceller som transformerade före tamoxifen injektion. Dessutom inga röda bencellerpå ytan av benet uttryckt DMP1, vilket indikerar att de inte var mogna osteocyter.
Sammantaget data från uttrycksmönstren för både tidig (Runx2) och slutskedet markörer (DMP1) av osteogena celler överensstämde med tidigare resultat med hjälp av Cre i kombination med 2.3Col1a1-GFP. Dessa data visar att kombinationen av immunofluorescens och ROSA26 tdTomato spårning är ett bra sätt att studera cell öde. Ännu viktigare, kan utredarna urskilja celltyp, identifiera differentieringsstadiet, och observera de transformerade cellantal samtidigt med hjälp av immunfluorescens med olika markörer, som ger mer information än ROSA26 tdTomato spåra ensam.
Figur 1. Mekanism för Cell Lineage Tracing och the generationen av föreningen möss. A) Den Cre-loxP-systemet används ofta i härstamning spårning. Cre skär ut STOP-sekvensen mellan de två loxP-ställen, och tdTomato proteinet (fluorescerande röd) är permanent uttrycks i den specifika cellinjen. B) Tre djurmodeller nämns i detta dokument. Vi använde 2,3 Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato möss och korsade dem med Col10a1-Cre möss. Col10a1-Cre är icke-inducerbar, som återspeglar celldifferentiering från början av Col10a1 expression (vid E14.5). C) aggrekan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) är en annan Cre linje också korsas med 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato möss. Cre aktiverades vid 2 veckors ålder med en tamoxifen injektion (Tm: tamoxifen). D) För att kombinera immunofluorescens med cell härstamning spårning, genererade vi Agg-Cre ERT2; <em> ROSA26 tdTomato möss, aktiverad Cre vid postnatal dag tre, och utförde Runx2 och DMP1 immunofluorescens (Tm: tamoxifen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Transformation från Kondrocyter till benceller (osteoblaster och osteocyter) i Mandibular Condyle och rörben Använda Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato Sammansatta möss. A) Cre aktiverades med tamoxifen på postnatal dag 14, och mössen avlivades vid 4 veckor gammal. Det fanns tre färgade celler i kondylär process: ren röd (kondrocytceller härrörande benceller), gul (röd kombination med grönt, vilket indikerar kondrocytceller-derived benceller som uttryckte kollagen 1-genen), och ren grön (icke-kondrocytceller härlett benceller med kollagen 1-genen) . De flesta av de benceller i kondylär processen under brosket var gula eller rent rött (vita pilar), medan några benceller var grön (blå pilar). Dessa data ger starka belägg för att kondrocyter direkt omvandlas till benceller och bidra till bildandet av kondylär processen under utveckling (Tm: tamoxifen; C: brosk; B: ben). B, C) Huvuddelen av benceller i epifysen och metafysen var kondrocyt-derived (vit pil: kondrocytceller-transformerade benceller i gult eller ren röd, blå pil: icke-kondrocytceller härrörande benceller i ren grön, AC: artikulära brosk, GP: tillväxt platta).blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Transformation från Kondrocyter till benceller i Mandibular ledhuvud Använda Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato Sammansatta möss. A) I kondylär processen från tre veckor gamla möss, grön benceller var en tydlig minoritet i trabeculae nära brosk-ben gränssnitt (högre nivå, a1), medan rött och några gula celler var dominerande. I den mellersta nivån (a2), gula celler var i majoritet, med något färre röda blodkroppar. Gröna celler verkade vara i de flesta endast på de mest underlägsna området (a3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Co-lokalisering av två markörer för osteogena celler med Lineage-spårning Bakgrund i kondylär processen med hjälp av två veckor gamla Agg-Cre ERT2; ROSA26 tdTomato Sammansatta möss. A) Den gula färgen i kärnan representerar kondrocytceller härledda benceller som uttrycker Runx2 (vita pilar) på ytan av det trabekulära benet nedanför condyle brosk. De rena röda benceller utan Runx2 uttryck representerar mogna kondrocytceller härrörande benceller i benvävnad (gula pilar). den fewest celler var de som bär endast gröna kärnor, som representerar antingen icke-kondrocytceller härrörande benceller eller transformerade benceller från kondrocyter före Cre aktivering (Tm: tamoxifen). B) I trabekulärt ben under ledhuvud brosk, nästan varje röd kondrocyter härrörande ben cell i benmatrisen genom DMP1 färgning runt deras cellkroppar (vita pilar). Endast ett fåtal av de osteocyter var positiva för DMP1 men saknade röd färg i sina cellkroppar (gula pilar). Det finns två möjligheter för dessa celler: icke-kondrocytceller härrörande benceller eller kondrocytceller härrörande benceller som uppstår innan tamoxifen injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av tekniska begränsningar, är det alltid svårt att undersöka beteendet hos celler in vivo. Emellertid är cell härstamning spåra teknik visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att studera cellbiologi 7-9. I denna studie har vi ytterligare förbättra detta protokoll genom att kombinera den med immunofluorescens. På detta sätt kan cellöde definieras av flera relaterade markörer, vilket breddar tillämpningen av härstamning spårning. Dessutom har denna samlokalisering av immunofluorescens och tomat signal visar samtidigt antalet avkomma av grundaren cell, deras placering och deras differentieringsstatus, vilket ger mer information än cellinje spåra ensam. Dessutom kan användningen av cellspecifika markörer förenkla alstringen av sammansatta möss, accelererar undersökningen.
Specificiteten för Cre är avgörande för entydig tilldelning av härstamning och noggrannheten i resultat 20.21. Det är mycket imtigt att välja lämpliga Cre linjer för att kontrollera cell öde. I denna studie valde vi Col10a1, eftersom det anses vara en specifik markör för hypertrofiska kondrocyter 10,11, och aggrekan, eftersom det är också en välkänd markör för kondrocyter 18. Det finns också goda Cre modeller som används inom andra områden. Den Scleraxis-Cre (SCX-Cre) linje, till exempel, är användbar i senor och ligament forskning sedan scleraxis är en grundläggande helix-loop-helix transkriptionsfaktor som är en markör för den sen- och ligamentcellhärstamning 22. Annan Cre kallas DMP1-Cre är vanligt i skeleton- och tandrelaterade studier på grund DMP1 uttrycks kraftigt i odontoblaster och osteocyter 23,24.
Jämfört med icke-inducerbara Cre system kan aktiveringen av inducerbara Cre begränsas geografiskt och tidsmässigt 20. Dock bör vissa begränsningar övervägas vid utformningen av experimentet och tolkningen av resultaten avinducerbara Cre modeller. Först, kan dosen av tamoxifen ändra effektiviteten för Cre aktivering och antalet märkta celler. Låga doser kommer märka populationen av intresse på en klonal densitet 25; höga doser kan märka hela stamcellspoolen 7,26. Således måste dosen väljas beroende på syftet med försöket. För det andra, har tamoxifen potentiella toxiciteten, särskilt i höga doser 27,28. Av detta skäl är det bättre att minska dosen för att undvika sena aborter vid injektion under graviditet 29.
Sammanfattningsvis är co-tillämpning av cell härstamning spåra tekniker och immunofluorescens ett kraftfullt verktyg för att undersöka cellbiologi in vivo. I framtiden kan utredarna försöka att samtidigt utföra immunofluorescens med två olika antikroppar över tomatsignalen bakgrunden. Denna metod kan visa uttrycksmönstret för två markörer i ett avsnitt, vilket gör det lättare förutredare för att jämföra och analysera resultaten. Dessutom kan detta samarbete ansökan förbättras ytterligare genom in situ immunofluorescens för att minska icke-specifik färgning som kan finnas genom konventionell immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
