Introduction
Fluorescensmikroskopi har længe været anvendt til at undersøge virkningerne af transgener i zebrafisk CNS, navnlig deres virkninger på udviklingen 1. Høj opløsning mikroskopi har tilladt en detaljeret kortlægning af de cellulære processer involveret i hjernens udvikling, muskel generation, og mange andre udviklingsmæssige begivenheder 2. Undersøgelse af død af en individuel celle har været mere udfordrende, hovedsageligt på grund af de tekniske vanskeligheder for at fremkalde selektiv celledød under standard billeddiagnostiske procedurer. Men kombinationen af single-celle opløsning billeddannelse og meget målrettede ablationsteknikker tillader, undersøgelse af umiddelbare cellulære reaktioner på stress og skade, samt af de deraf følgende celle-celle-interaktioner. Forståelsen af disse processer er kritisk, især for neurodegenerative sygdomme, såsom motor neuron disease (MND), hvor neuron-glia-interaktioner er blevet vist at bidrage til progressionaf sygdommen 3.
MND, eller amyotrofisk lateral sklerose (ALS), er en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der påvirker motorneuroner i hjernestammen, motor cortex, og rygmarven. Tab af disse neuroner fører til muskeltab, og patienterne dør inden for 3 - 5 år efter diagnosen 4. Motoriske neuroner i rygmarven link i muskelfibrene og spiller en afgørende rolle ved at lette muskelkontraktion. Svigt af denne meddelelse eller død af disse neuroner gradvist svækker musklerne og påvirker patientens evne til at sluge, gå, tale, og trække vejret. Visualisere døden af en motor neuron og de kortsigtede konsekvenser i et levende dyr giver en glimrende mulighed for bedre at forstå de dynamiske processer involveret i normal celle homeostase og sygdom.
Zebrafisk er dukket op som en attraktiv model-system til at studere neurodegenerative sygdomme 1. Det herskyldes de fordele, som denne model organisme, såsom ekstern befrugtning, kort- udviklingsmæssige tid, optisk adgang til nervesystemet og let transgenese. Desuden evnen til nemt generere forbindelse transgene zebrafisk giver mulighed for flere strategier i forskellige celletyper mærkning. Genetisk ablation tilgange til at dræbe bestemte celletyper tillader temmelig bred forstyrrelse, men mangler den fine kontrol målrette individuelle celler 5. Laser-assisteret teknikker, på den anden side, tilvejebringe fine tidsmæssige og rumlige kontrol og er blevet anvendt til forskellige dyremodeller. Mens de fleste tilgange anvender specialiserede udstyr, såsom pulserende lasere 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 eller to-foton set-ups 13, andreforskergrupper har for nylig benyttet sig af en UV-laser i konventionelle konfokale mikroskoper 14.
Den her beskrevne teknik kombinerer høj opløsning konfokal mikroskopi med en UV-laser-medieret fremgangsmåde til at forårsage cellulær stress eller død i en dosisafhængig måde i udvalgte motorneuroner. Den er afhængig af brugen af almindeligt installeret 405-nm laser, er blevet testet med succes i cellekultur og i levende dyr, og giver mulighed for detaljeret karakterisering af cellulære interaktioner, såsom mikroglial opstod efter neuronal død.
Protocol
BEMÆRK: Design, adfærd, og rapportering af dyreforsøg skal tage hensyn til gældende retningslinjer 15. Dette arbejde skal godkendes på forhånd af den lokale dyrevelfærd myndighed (i vores tilfælde, Det Dyreetiske Komité Macquarie University).
1. Forbered Zebrafisk for Montering og UV Cell ablation
- Generere zebrafisk (Danio rerio), der udtrykker fluorescerende proteiner.
- For at udtrykke fluorescerende proteiner af interesse i zebrafisk, udføre plasmid injektioner i én-celle stadiet af zebrafisk æg (som beskrevet andetsteds 16) eller bruge fluorescerende transgene linjer. For at mærke flere celletyper, skabe sammensatte transgene zebrafisk linjer ved at krydse etablerede transgene linjer relevante for spørgsmålet om renter. Placer en mandlig og en kvindelig zebrafisk på hver side af en falsk bund par parring tank i aften og fjern divider med debut af lysnæste morgen (som beskrevet detaljeret andetsteds 17). Hold zebrafisk ved 28 ° C, og håndtere dem i overensstemmelse med de etablerede protokoller 17, 18.
- Saml embryoner efter succesfuld gydning ved at belaste tanken vand indeholder embryoner gennem en plastik tesi. Skyl æggene med systemet vand og overføre dem til æg vand i en petriskål.
- Undersøge dem under et lysmikroskop til bestemmelse befrugtning. Store befrugtede æg i en petriskål og placere dem i en inkubator ved 28 ° C 18.
- Valgfrit: Udfør en mikroinjektion at mærke bestemte cellepopulationer.
BEMÆRK: Dette er en alternativ metode, der giver mulighed for ekspression og visualisering af proteiner uden behov for at hæve stabile transgene linjer. Denne fremgangsmåde er også fordelagtigt, når proteinet af interesse er giftigt og forbyder frembringelsen af en stabil transfremkaldende linjer.- Injicer plasmidkonstruktioner i én-celle stadium af zebrafisk embryoner, som beskrevet andetsteds 19, 20, 21.
BEMÆRK: Denne metode resulterer i mosaik ekspression af proteinet af interesse. Proteinet af interesse er drevet fra en valgt promotor (f.eks islet1 22, -3mnx1 23, 24, mødtes 25, eller MPEG1 26) flankeret af Tol2 omvendte gentagelser 20.
- Injicer plasmidkonstruktioner i én-celle stadium af zebrafisk embryoner, som beskrevet andetsteds 19, 20, 21.
- Ældning af fisk til den ønskede størrelse.
- Hæv fisk til 3 - 5 dage efter befrugtning (dpf) og placere dem under en fluorescerende forbindelse mikroskop. Screen dyrene for passende fluorophor udtryk og vælg flotte mærkede fisk. Adskil passende larver i en anden skål med æg vand til indlejring sentr på (butik i en 28 ° C inkubator).
Valgfrit: Embryoner kan anbringes i en 0,2 mM 1-phenyl-2-thioures (PTU) Ringers opløsning ved 24 timer efter befrugtning (HPF) til at inhibere dannelsen af pigmentering. Skal man være omhyggelig med PTU, da det er giftigt og kan have negative fysiologiske, genetiske, eller morfologiske virkninger. - For studier på et tidligt udviklingstrin (<2 dpf), dechorionate embryoner manuelt ved hjælp skarpe pincet. Dechorionate stort antal embryoner enzymatisk ved tilsætning pronase (2 mg / ml) til ægget vand og inkubere dem i 10 minutter ved 28 ° C.
- Passere embryoner periodisk gennem en plastik Pasteur pipette til let dechorionation. Afslutte processen, når hovedparten af embryoner er opstået fra deres chorions ved vask dem flere gange med æg vand.
- Hæv fisk til 3 - 5 dage efter befrugtning (dpf) og placere dem under en fluorescerende forbindelse mikroskop. Screen dyrene for passende fluorophor udtryk og vælg flotte mærkede fisk. Adskil passende larver i en anden skål med æg vand til indlejring sentr på (butik i en 28 ° C inkubator).
- Forbered løsninger til zebrafisk indlejring i agarose.
- Forbered en anæstesi opløsning ved tilsætning af 4 g / l MS222 (tricaine stamopløsning, pH 7,0)dråbevis til en petriskål indeholdende æg vand. En dosis på 50 mg / L er en anbefalet startpunkt (figur 1A).
- Forbered et lager af lavt-smeltende agarose (0,8 - 1,5%) i æg vand og udportionerer det ind 1,5 ml mikrocentrifugerør. Anbringes en alikvot i en forvarmet varmeblok (38 - 40 ° C), og lad det ækvilibrere til den indstillede temperatur (~ 30 min; Figur 1 B).
- Valgfrit: Ved længere tids imaging (> 4 timer), forberede lidt agarose cirkel, inden den 35-mm glas-bund petriskål og lad det sætte (Supplerende figur 1).
BEMÆRK: Dette ekstra trin var effektiv i at undgå enhver bevægelse af hele agarose dråbe med zebrafisk over længere tidsrammer.- For at gøre dette, sted ~ 300 pi agarose langs den indre kreds af glas-bund skål til at forberede en doughnut-formet cirkel med en lille åbning i midten, hvor at placere fisk (trin 1.5.3; Supplerende figur 1) .
- Monter zebrafisk i agarose til mikroskopi.
- Vælg 1 - 3 af den præ-screenet fisk til ablation og bedøver larverne ved at overføre dem (under anvendelse af en overførsel pipette) til en skål med anæstesi opløsning (trin 1.4.1, figur 1C, ca. 5 min).
BEMÆRK: Fiskene bedøves, når de viser en lavvandet opercular bevægelse og en nedsat hjertefrekvens og ikke længere vise en touch-fremkaldt flugt reaktion (TEER, manglende svømme væk efter blidt røre deres hale med en pensel). Sikre passende anæstesi for etisk behandling af fisk og for at forhindre, trækninger ved overførsel til agarose eller udsættelse for fluorescerende lys. - Efter bedøvelsen er bekræftet, suge en larve ved anvendelse af en justerbar pipette (med en cut-off på 200 pi spids indstillet til ~ 30 pi) og lad det synke til bunden af spidsen. Overfør larve i forvarmet agarose (trin 1.4.2) ved at frigive en dråbe af væsken medlarve i agarose (forsøge at minimere mængden af æg vand går ind i agarose; figur 1 D).
- Suge fisken omgivet af agarose. Dispensere det hurtigt ind i tidligere fremstillede glas-bottom 35-mm skål.
- Brug en dissektion mikroskop og en standard pensel (lang foring, størrelse 1) til position dyret inden agarosen på siden (hoved til venstre), således at kroppen og halen er flade (fig 1E). Hvis du arbejder med flere fisk, justere alle de fisk i skålen så de nemt er placeret ved hjælp af den konfokalmikroskop senere.
BEMÆRK: Hurtigt udføre denne procedure for positionering og justering (det kan kræve lidt øvelse, da agarose begynder at sætte umiddelbart efter udsættelse for koldere temperaturer). - Lad agarose-embedded fisk til 10 - 15 min, indtil agarosen er indstillet fast. Top forsigtigt 35-mm petriskål med ~ 2 ml af æg vand indeholdende tricaine (figur 1F).
- Vælg 1 - 3 af den præ-screenet fisk til ablation og bedøver larverne ved at overføre dem (under anvendelse af en overførsel pipette) til en skål med anæstesi opløsning (trin 1.4.1, figur 1C, ca. 5 min).
2. Opsæt konfokalmikroskop og Imaging Parametre
- Anbring petriskålen med den integrerede larve på konfokalt mikroskop scenen og fokus på den dorsale side af dyret rygmarv (ved hjælp lysfelt). Undersøge dyrene under passende forstørrelse (40X) og fluorescerende indstilling og visualisere strukturen af interesse (f.eks fluorescensintensitet af de mærkede neuroner eller mikroglial bevægelse) for at bekræfte, at alle imaging parametre er efter behov til efterfølgende ablation (figur 2). Vi bruger rutinemæssigt den 40X målsætning at udføre vores tid bortfalder undersøgelser.
- Valgfrit: Hvis du vil udføre en time-lapse studie i flere timer, er det tilrådeligt at indspille en enkelt eller nogle få tidspunkter forud for ablation at etablere uforstyrret fysiologiske reaktion af cellen og dens omgivelser (f.eks mikroglial bevægelse for at etablere baseline hastighed og motilitet).
- Bestemmelse af tykkelsen af den structure af interesse for UV-laser ablation.
- Brug af z-drive, verificere toppen og bunden af strukturen af interesse (f.eks cellen soma) ved manuelt at fokusere op og ned. Notér z-planet, der vil blive ablateres (f.eks centrum af cellen).
BEMÆRK: Af erfaring, denne metode var mest effektive ved at målrette rygmarvsneuroner der blev lyst mærkede (et højt signal-til-støj-forhold, der tillader nem time-lapse visualisering efter ablation; f.eks, figur 4) og ved ablation midten af celle soma. Cellekerne fluorescens kan være fordelagtigt at sikre nøje målretning og høj ablation effektivitet.
- Brug af z-drive, verificere toppen og bunden af strukturen af interesse (f.eks cellen soma) ved manuelt at fokusere op og ned. Notér z-planet, der vil blive ablateres (f.eks centrum af cellen).
3. Udfør Målrettet Laser Ablation af de enkelte celler i Zebrafisk Spinal Cord
BEMÆRK: For denne ablation og visualisering tilgang, blev et konfokalt mikroskop (Leica SP5), der anvendes. Ablationsproceduren anvendelse af en 405-nm diode for cellespecifik destruction er detaljeret i henhold til softwaren (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). enhver konventionel konfokal mikroskop, der er udstyret med en 405-nm laser og en FRAP (fluorescens bedring efter fotoblegning) eller blegemiddel modul, vil dog tillade udførelsen af de samme celle manipulationer, men potentielt med lidt forskellige indstillinger, parametre og navne.
- Start FRAP guiden ved at klikke på dropdown menuen øverst af softwaren menuen (figur 3A, 1 og 2). Observere et nyt vindue med forskellige trin, der tillader nedsat de specifikke parametre for laserablation (figur 3B, 3).
- Bestemme parametrene billede til ablation tilgang ved at vælge det format, scanningshastighed (figur 3B, 4), og midling (figur 3B, 5). Et billedformat på 1.024 x 1.024 ved en scanningshastighed på 400 Hz og en linjegennemsnit på 4 var mest anvendelig.
BEMÆRK: Der er generelt ikke nødvendigt at ændre den spektrale detektering (såsom excitation eller emission parametre), som de er fastlagt i den foregående erhvervelse.- Hvis der ikke allerede er valgt z-planet for ablation (som beskrevet i trin 2.4.), Skal du trykke på "live" knappen og fokus gennem prøven, indtil fluorescerende struktur eller den ønskede z-planet, der vil skal fjernes, er i fokus.
- Når de generelle billede parametre er indstillet, få adgang til "Bleach" trin (figur 3C, 6) til at styre de specifikke ablation komponenter.
BEMÆRK: En kombination af laseren intensitet (figur 3C, 8), scanningshastighed, og midlingen, som er blevet indstillet i trin 3.2 (figur 3B, 4 og 5), samt antallet af gentagelser, der vil blive sat i trin 3.5 (fig 3E,12), vil bestemme den samlede opholdstid af UV-laser på ROI, og derfor blegningen effektivitet.- Aktiver 405-nm laser ved at aktivere det til blegning procedure (figur 3C, 8).
BEMÆRK: De fleste succes med de førnævnte indstillinger blev opnået med 405-nm laser intensiteter mellem 60 - 80% vores forsøgsopstillingen. Vær opmærksom på at denne laser effekt er instrument-specifikke og vil variere for hver konfokal opsætning. - Brug "zoom ind" (figur 3C, 7) for at maksimere blegning intensitet ved den valgte ROI ved at reducere scannings feltet, og maksimerer derfor opholdstid. Alternativt kan du bruge "Bleach point" valgmulighed af softwaren valg for denne proces.
- Aktiver 405-nm laser ved at aktivere det til blegning procedure (figur 3C, 8).
- Vælg en eller flere ROIs (figur 3D, 10) for ablation ved hjælp af en af tegneværktøjer i købet billedet vindow (figur 3D, 9). Target Axon højen, for eksempel med den cirkulære tegneværktøj på ca. 4 - 8 um.
BEMÆRK: ablation område kan indstilles fra en enkelt pixel til et større område, afhængigt af programmet. - Efter oprettelse af ROI, skal du vælge "Time Course" knappen (Figur 3E, 11), og bekræft antallet af cykler i ROI'er vil blive scannet / poleres (figur 3E, 12). Vælg "Pre-Bleach" og "Post-Bleach" rammer som ønsket for at tillade et overblik over hele billedet lige før og umiddelbart efter blegning processen.
- Efter etablering af alle de nødvendige ablation parametre, skal du trykke "Kør Experiment" (Figur 3E, 13) og overvåge effektiviteten af ablation.
BEMÆRK: I vores FRAP setup, et enkelt billede vil blive taget før og efter FRAP cyklus med den passende laser excitation (f.eks 488-nm excitation for EGFP-udtrykkende celler). Disse præ- og post-ablation billeder tillade en hurtig dom om, hvor tilfredsstillende ROI blev bleget, og hvor effektive de valgte ablation parametre var. - Gentage processen ved at justere laser intensitet (figur 3C, 8), scanningshastighed og gennemsnitsberegning (figur 3B, 4 og 5), og gentagelser (figur 3E, 12) i tilfælde af den valgte ROI viser stadig høj fluorescensintensitet efter afslutning af FRAP cyklus.
4. Udfør Opfølgning Procedure, herunder fisk "Rescue" eller bortskaffelse
- Hvis forsøget er terminal, aflive dyret med en overdosis af tricaine. Tag ægget vand og erstatte det med anæstesi stamopløsning i 10 min. For at sikre eutanasi, check under mikroskopet for ophør af hjerteslag.
- Valgfri:Hvis forsøget ikke terminal, fjerne fisken forsigtigt fra agarosen med fin pincet og en børste. Læg fisken i frisk æg vand og lad den komme under observation i 15 min. Hvis normal svømmeadfærd tilbage, returnere fiskene til inkubatoren.
- Bortskaf transgene dyr i henhold til institutionens godkendte GMO affaldsstrømmen.
Representative Results
Den her beskrevne fremgangsmåde tillader ablation af motoriske neuroner i zebrafisk rygmarv under anvendelse af FRAP modul af en kommerciel konfokalt mikroskop. Transgene zebrafisk linjer, der udtrykker et grønt fluorescerende protein i neuroner under kontrol af specifikke promotorer, såsom - 3mnx1, islet1, eller mødte, blev anvendt. Ekspressionen af GFP drevet af motoren neuron-promotoren (såsom -3mnx1 eller opfyldt) tillader høj opløsning visualisering af cellelegemer, de vigtigste axoner og de perifere grene strækker til musklerne (Figur 4 og video 1).
Neuroner i rygmarven af 3- til 5 dage gammel fisk med succes er blevet poleres med en samlet opholdstid på 60 - 80 s ved en laser magt ~ 70%, og de generelle indstillinger beskrevet i trin 3. Vellykket ablation er opnås, når fluorescensen svinder umiddelbart efter ablationog aldrig genoptages (figur 5, C og D). Forsøg på ablation med andre laserlinjer (såsom 488-nm laser linje) ikke resultere i permanent fading, og fluorescens blev restaureret inden for korte tidsrammer. Vigtigere er det, denne teknik demonstrerede karakteristiske træk ved apoptotisk celledød i UV-poleres neuroner, såsom tilstedeværelsen af Annexin V, konsistente morfologiske ændringer af somal degeneration, og axonal blæredannelse af løsrevne neuron 27.
Specificiteten af denne fremgangsmåde bekræftes i forsøgene ved hjælp af den photoconvertible fluoroforen Kaede (der skifter sin emission fra grøn til rød efter udsættelse for UV-lys), hvor en enkelt målrettet neuron blev konverteret (figur 5, A og B) uden tegn på cellulær ødelæggelse over flere timer. Anvendelse af en højere lasereffekten i stedet fører to udslettelse af det målrettede neuron (ingen fotokonvertering eller tilbagevenden af fluorescens) og fotokonvertering (uden død) af cellerne i umiddelbar nærhed (~ 20 um) til ablationsstedet (figur 5, C og D).
En vigtig fordel ved denne laser-induceret ablation teknik er dosisafhængighed af tilgangen. Til at målrette celler med forskellige intensiteter, flere lag af fin-tuning er tilgængelige ved at justere lasereffekten (figur 3C, 8), scanningshastighed og line gennemsnitsberegning (figur 3B, 4 og 5), størrelsen af ROI, der skal ablateres (figur 3D, 10), og de gentagelser (Figur 3E, 12). Især kan denne tilgang også anvendes til at anvende cellulært stress til individuelle celler i stedet for at inducere celledød. For eksempel har finjustering væretganske værdifuldt at vurdere cellulære processer under død af en neuron. Motoriske neuroner med lange axonale projektioner, der blev ablerede med lavere UV laser intensiteter afslørede karakteristiske "blebbing" (dannelse og fragmentering af cellulære vesikler), som begyndte på den målrettede soma og fortsatte langs Axon over tid (40 - 90 min; Figur 4 ; 3D afsmeltet film af denne ablation i Video 1). Følgelig modulere forskellige laser ablation parametre og derfor niveauet af induceret cellulært stress og tidsforløbet for døden giver forskere et højt eksperimentel fleksibilitet.
Figur 1: Integrering af zebrafisk til direkte billedvisning. (AF) Integrering procedure for levende billeddannelse: (A) tricaine tilsættes æg vand at bedøve den zebrafisk en ta startdosis på 50 mg / l. (B) lavtsmeltende agarose (0,8 - 1,5%) fremstilles og varmes op til 38 - 40 ° C. (C) Ved hjælp af en overførsel pipette, er den screenet og udvalgt zebrafisk overført til et fad med tricaine løsning. Efter vellykket sedation (lavvandet opercular bevægelse, nedsat hjertefrekvens, manglende en touch-fremkaldt reaktion), en fisk overføres til den forvarmede agarose (D). Minimere mængden af æg vand, der overføres til agarosen at forhindre efterfølgende fortynding. (E) Overfør en dråbe agarose (~ 30 - 50 u) indeholdende zebrafisk på en glas-bottom 35-mm skål. Udfør denne under en dissektion mikroskop og bruge en børste til forsigtigt at tilpasse zebrafisk til sin foretrukne orientering. Vent 10 - 15 minutter, indtil agarosen er indstillet, og tilføj ~ 2 ml tricaine løsning på skålen (F).ank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Visualisering af neuroner og mikroglia i rygmarven af en 3-dpf zebrafisk. Visualisering af mikroglia og neuroner i rygmarven af en 3 dage gammel transgene zebrafisk udtrykke (A) GFP-positive neuroner (islet1: GFP) og (B) mCherry-positive mikroglia (MPEG1: GAL4, UAS: mCherry). (C) Sammensat billede af neuron og mikroglia kanal sammen med den lysfeltsbillede. Den skematiske insertet i (C) viser orienteringen af fisk og skitserer præsenteret område. Scale bar = 30 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Trin i processen med UV-laser ablation (som skitseret i protokollen, trin 3). Skridt til at styre FRAP software modul i konfokale software (Leica Application Suite). (A) Start af FRAP modulet som et redskab til at udføre UV-laser ablation. (B) Opsætning af z-planet for ablation og andre FRAP indstillinger som format, hastighed og gennemsnitsberegning, som vil bestemme opholdstiden af laseren. (C) Kontrollen med laser intensitet og "zoom i" mulighed for at maksimere blegning effektivitet. (D) Valg af en eller flere regioner af interesse (ROI), der vil blive poleres. (E) Indstilling tidsforløbet af blegning bestemmer blegemiddel cykler og den samlede laser opholdstiden på ROI'er. Klik hende e for et større version af denne figur.
Figur 4: anterograd forandringer i en UV-ablateret neuron. Time-lapse billeddannelse af neurodegeneration af en UV-ablated spinal neuron. (AF) UV-bestråling af en enkelt spinal neuron (met: GAL4, UAS: EGFP; A; cirkel) resulterede i soma af neuron skrumpende og afrunding op over tid (AC), efterfulgt af axonal opsplitning (CF; pilespidser) . Den axonal degenerering startede i soma (stedet for ablation) og skred anterograd mod den distale ende af axon indtil endelig den fluorescens i soma forsvandt og hele Axon viste "blebbing" (DF). Scale barer = 20 pm. 3D-renderet time-lapse film af denne ablation er vist i Video 1.es / ftp_upload / 54.983 / 54983fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Bekræftelse af effekten af enkeltcelle-UV-bestråling under anvendelse af en photoconvertible fluorofor (Kaede) i en motor neuron. Validering af encellede UV-bestråling gennem aktivering af photoconvertible fluorofor Kaede i en neuron. (AD) UV-bestråling af neuroner mærket med Kaede. (A) fotokonvertering af en enkelt neuron (cirkel) med en lasereffekt på 30% i 10 s ført til fotokonvertering af Kaede (fra grøn til rød) i kun den målrettede individuelle neuron (B). Bemærk, at den konverterede celle overlevede i flere timer, og viste ingen synlige tegn på forringelse, såsom blebbing eller oprunding. Ablation af en enkelt neuron (C ; cirkel) med en højere lasereffekten (95% i 10 s) resulterede i øjeblikkelig forsvinden af denne neuron (D) og efterfølgende fotokonvertering af Kaede i et lille antal omgivende neuroner inden for en radius på ca. 20 um. Scale barer = 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: 3D overfladegengivelse (Imaris) af UV ablateret neuron illustreret i figur 4.
Den time-lapse video af neuron afbildet i figur 4 er overflade gengives ved hjælp af en visualisering software (Imaris, Bitplane). Den fremhæver krympeprocessen af løsrevne soma, efterfulgt af axonal fragmentering anterogradely mod den distale ende af cellen.euron_ablation-3D_rendered.mov "target =" _ blank "> Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Figur 1: Valgfri agarose støbt til lang tid billeddannelse.
For at undgå bevægelse af fisk og agarosen under lange erhvervelse sigt forberede en ringformet kreds af agarose langs kanterne i midten af glasbund 35 mm skål (A). Lad agarose sæt til ~ 10 min og overført fisk i den indre cirkel med en dråbe agarose (B). Forsøger at minimere mængden af agarose for indlejring (børste overskydende agarose til ydersiden, efter orientering af fisk). Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Laserablation Approaches
Laser-assisteret ablationsteknikker tillader den præcise målretning af individuelle eller små grupper af celler. Kombinere denne teknik med høj opløsning mikroskopi og genetiske manipulationer i dyremodeller såsom zebrafisk tillader forskerne til systematisk at undersøge skæbne af en individuel celle og interaktionerne efter skade.
UV (405 nm) laserablation Protokollen beskrevet her skitserer, hvordan individuelle celler kan understreges eller dræbt selektivt (på en dosis-afhængig måde), mens tilstødende neuroner, glia, og axoner efterlades uskadte. Vi har med succes anvendt denne fremgangsmåde i celledyrkningsforsøg og beskriver her den detaljerede fremgangsmåde for zebrafisk rygmarven. Vi viser gennemførelsen af denne tilgang i zebrafisk rygmarven ved selektivt at understrege en individuel neuron i et netværk af andre celler (Figur 5, A og
Tidligere special lasersystemer, såsom pulseret nitrogen laser eller to-foton lasersystemer, skulle inducere vævsskade og motorisk nerve transections 10, 11, 12, 13. Disse lasersystemer med succes er blevet anvendt til at forårsage cellebeskadigelse, såsom trombose i arterier og vener 6, akut nyreskade 7, kardiel skade 8, og til at studere calcium bølger og mikroglial respons efter hjerneskade 9. Endvidere Soustelle og kolleger brugte en konventionel konfokal setup (351-nm og 364-nm UV-lasere) for at inducere skade på epitel- og gliaceller i Drosophila 14 </ Sup>.
Relevansen af zebrafisk modeller til at forstå ALS (og andre sygdomme hos mennesker)
Zebrafisk er en udbredt model organisme, især for udviklingsmæssige undersøgelser 28, 29, 30. Mens de har visse begrænsninger, deres potentiale til at modellere sygdom hos mennesker og give en forståelse af patogene molekylære mekanismer er enorm. Zebrafisk modeller er blevet veletableret for studiet af MND og har ført til vigtige molekylære indsigter 31, 32, 33, 34. Transgene zebrafisk linjer hurtigt kan generere (4 - 5 måneder) og tillade selektiv sporing af en specifik celletype, funktioner, der gør dem en værdifuld tilføjelse til de aktuelle dyremodeller af ALS. Zebrafisk embryoner / larver er optisk transparente og tilbyde unikke erfamentale fordele, som tillader langvarig, levende billeddannelse ved encellede niveau i hjernen eller rygmarven, hvilket ikke umiddelbart kan opnås i gnavermodeller (eller i mennesker). Når det kombineres med molekylære teknikker, såsom encellede ablation, dette giver en unik eksperimentel platform til undersøgelse præcise molekylære mekanismer in vivo.
Motoriske neuroner kan selektivt målrettet Brug UV Laser Ablation
Spinal neuroner i zebrafisk begynder at udvikle sig inden 10 timer efter fødslen og er etableret efter ca. 48 h 35, 36. Denne hurtige udvikling muliggør visualisering af disse neuroner i korte tidsrammer og med høj kapacitet. Motoriske neuroner som det væsentlige bindeled mellem hjerne og muskler, og i ALS, påvirkes i den motoriske hjernebark (øverste motoriske neuroner), hjernestammen og rygmarven (lavere motoriske neuroner). Tab af disse neuroner fører uundgåeligt til muscle atrofi og svaghed. Motoriske neuroner i rygmarven af zebrafisk kan identificeres ved deres forskellige fremskrivninger og ved brugen af motor-neuron promotorer som -3MNX1. Målretning cellen soma af sådanne fremspringende neuroner afslørede anterograd degeneration langs axonal projektion over tid (figur 4 og Video 1). Encellede opløsning billeddannelse af spinale motoriske neuroner desuden bekræftet phosphatidylserin translokation og deraf følgende Annexin V-mærkning efter laser ablation (se figur 4 og supplerende Video 3 i Referenceeksempel 27). Selvom vi rapporterer aktiveringen af Annexin V i døende neuroner efter vores UV laser ablation tilgang, kan vi ikke være sikre på, at den kaskade af død, der udløses under denne fremskyndede proces svarer nøjagtigt til neuronal død, der opstår i løbet af neurodegeneration eller normal celle homeostase.
Mens denne ablation tilgang er meget reproducerbarog specifikke, forskellige indlejring strategier kan også påvirke effektiviteten af UV ablation. Det er vores erfaring, var det mest succesfulde at minimere laget af agarose vi indlejret vores fisk i. Tykkere lag af omsluttende medium med et ekstra lag af æg vand kan reducere UV strøm endeligt modtages af cellen pga dæmpning og spredningseffekter, der forekommer langs strålevejen.
I fremtiden vil passage af forskellige transgene fisk linjer muliggøre visualisering af den umiddelbare og kortvarig (op til 12 timer) responser af andre påvirkede celler, såsom glia, til laser-induceret celleødelæggelse. For eksempel har astrocyt og ikke-celleautonom toksicitet i neurodegenerative lidelser, såsom ALS været i forskning spotlight og er stærkt impliceret i patogeniciteten af sporadisk og familiær ALS 37, 38. Men mekanismerne bag glial toksicitet og selektivitetmod motor neuroner er fortsat uklare. Vi og andre tog for nylig fordel af denne tilgang til at studere engulfment af døende neuroner ved mikroglia og visualiseres clearance af neuronale rester 27, 39, 40.
Kombinere ablation teknik med høj opløsning mikroskopi og markører for neuroinflammation kan forskere i fremtiden at udvide forståelsen af enkelt-celle funktion og indbyrdes forbundne cellesystemer. Karakterisering af disse processer i en in vivo indstilling er kritisk ikke blot i udviklingsmæssige indstillinger, men også i modeller for neurodegenerative sygdomme, herunder MND, hvor cellulære interaktioner kan forringes 3, 41.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8 - 1.5% | |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 - 7 MΩ |
| Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4 mL of 1 mg/mL methylene blue in 10 L deionized water | ||
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
| Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
| Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
| Microscope | Leica | SP5 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Becker, T. S., Rinkwitz, S. Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders. Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).
- Philips, T., Robberecht, W. Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease. Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis. Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845 (2011).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish. J Vis Exp. (76), (2013).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Villegas, R., et al. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Dev. 7, 19 (2012).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy. Neural Dev. 3, 11 (2008).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Essentials of Biology 2. JoVE. , JoVE Science Education Database. Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques (2016).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).
- Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front. Cell. Neurosci. , (2015).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Lele, Z., Krone, P. H. The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Kabashi, E., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).
- Laird, A. S., et al. Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).
- Lemmens, R., et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).
- Ramesh, T., et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).
- Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo. Development. 103 (1), 49-58 (1988).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Philips, T., Rothstein, J. D. Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 262, Pt B 111-120 (2014).
- Mazaheri, F., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nat Commun. 5, 4046 (2014).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).
- Radford, R. A., et al. The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).
