En eksperimentel og Finite Element-protokollen til undersøgelse af Transport af Neutrale og sigtet Opløste stoffer tværs Ledbrusken

Summary

Vi foreslår en protokol til at undersøge transport af ladede og uladede molekyler tværs ledbrusken ved hjælp af nyligt udviklede eksperimentelle og numeriske metoder.

Abstract

Osteoarthritis (OA) er en invaliderende sygdom, der er associeret med degeneration af ledbrusk og subchondral knogle. Degeneration af ledbrusk forringer dets bærende funktion i det væsentlige som den oplever enorm kemisk nedbrydning, dvs. proteoglycan tab og collagen fibril forstyrrelser. En lovende måde at undersøge kemisk skadesmekanismer under OA er at udsætte brusk prøver til en ekstern opløst stof og overvåge diffusionen af ​​molekylerne. Graden af bruskskader (dvs. koncentration og konfiguration af væsentlige makromolekyler) er tilknyttet kollisionskøling energitab af eksterne opløste stoffer samtidig bevæger sig på tværs ledbrusk skaber forskellige diffusionskarakteristika sammenlignet med sund brusk. I denne undersøgelse, introducerer vi en protokol, der består af flere trin, og er baseret på tidligere udviklet eksperimentelle mikro-C14px; "> omputed T omography (mikro-CT) og finite element modeling The transport af ladede og uladede ioderede molekyler første registrering med micro-CT, som efterfølges af påføring bifasisk-opløst stof og flerfasede finite element modeller for at opnå diffusionskoefficienter. og faste ladningstætheder tværs brusk zoner.

Introduction

Molekylær transport spiller en afgørende rolle i homeostase leddelte forbindelser, levering af terapeutiske midler til ledbrusk og kontrastforøget brusk billeddannelse ^{1, 2, 3.} Faktorer som brusk integration og intakthed, opløst stof ladning og størrelse samt osmolalitet og koncentration af bad i kontakt med brusk kan påvirke transporthastigheden ^{4, 5, 6.} Transport af opløste stoffer, enten neutrale eller ladede, kan være forskellig mellem artikulære brusk zoner, fordi hver zone består af forskellige koncentrationer og orienteringer af store ekstracellulære matrixmolekyler, nemlig proteoglycaner (PS) og collagen type II ^{1, 7, 8, 9,}tøs = "xref"> ^{10, 11.} Endnu vigtigere er, kan transport af ladede opløste stoffer være stærkt afhængig af koncentrationen af proteoglycaner omfattende negative faste afgifter inden den ekstracellulære matrix, som forøger tværs ledbrusk ^{8, 9.} Disse parametre særligt fast ladningstæthed (FCD), kan orienteringen af ​​collagenfibriller og vandindholdet variation på tværs af brusk undergå ændringer som osteoarthritis (OA) skrider frem, derved at det er vigtigt at studere diffusion over brusk.

I den aktuelle undersøgelse, en protokol baseret på tidligere etablerede eksperimentelle og beregningsmæssige undersøgelser ^{6, 8, 9} foreslås præcist undersøge diffusion under forskellige grænsebetingelser under anvendelse neutrale og ladede opløste stoffer i en finit-bad model for diffusion. Than foreslog metoder er sammensat af mikro-computertomografi billeddannelse (mikro-CT) af et system, herunder brusk og en finite-bad understøttes af avancerede bifasisk-opløst stof og flerfasede finite element modeller. Disse modeller muliggøre opnåelse diffusionskoefficienterne af neutrale og ladede molekyler samt FCDs tværs af forskellige zoner af ledbrusk. Ved anvendelse af disse modeller, kan man opnå bedre forståelse af opførslen af ​​de spredende neutrale og ladede molekyler, der kunne anvendes til at undersøge samspillet mellem brusk og overlejring finite-bad.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen præsenteres her er adopteret fra de eksperimentelle og beregningsmæssige procedurer seneste forskning papirer ^{6, 8, 9.} Protokollen er illustreret i figur 1.

De kadaver-materialer blev indsamlet med tilladelse fra veterinære fakultet Utrecht Universitet.

1. Prøve og Bath Fremstilling

1. Udbore cylindriske osteochondrale propper (diameter på 8,5 mm) fra kadaver equine lårknoer anvendelse skræddersyet borekrone (figur 1) under sprøjtning køligt phosphatbufret saltvand (PBS) for at forhindre overophedning og efterfølgende bruskskade.
2. Varmekrympende de osteochondrale stikpropper med en plast skrumpende muffe for at minimere den laterale diffusion af overliggende bad.
   1. Montere det osteochondrale stik med brusken på the top som oprindeligt var inde plastik skrumpende muffe og følg ved at blæse varm luft til det. Tilføj våde bomuld stykker på overfladen af ​​brusk at forhindre varme-relaterede skader.
3. Forberede finite-bade af ladede (fx 650 pi, 420 mM, ioxaglat, molekylvægt (Mw) = 1.269 Da, ladning = -1) og neutrale (650 pi, 420 mM, iodixanol, molekylvægt = 1.550 Da) opløste stoffer separat.
4. Indlæse fremstillede finite-bade på overfladen af brusk ved hjælp af en sprøjte og placere en kork prop på den omviklede prøve at forhindre fordampning under forsøg ved stuetemperatur (figur 2A). For at undersøge den neutrale stoftransport, placere iodixanol bad og til at studere det negativt ladede stoftransport sted ioxaglat bad på bruskoverfladen.

2. Billedbehandling og billedbehandling

1. Placer de indpakkede prøver isoleret med kork prop på en specialfremstillet holder fastgjort til den motoriserede etape af en mikro-CT. Placer than prøve så brusk overflade dækket med kontrastmiddel opløsning vender opad.
2. Scanne med mikro-CT (voxel størrelse på 40 × 40 × 40 pm ^3, gennemsøgningstid på 2 min, rørspænding 90 kV og rør strøm på 180 uA) et synsfelt, der består af brusk, subchondrale plade og finite- bad i flere tidspunkter indtil ligevægt tilstand (48 h) er nået (figur 2A). Ligevægtstilstanden er nået, når koncentrationsværdier ikke ændre sig over tid.
3. Registrer 3D-billeder i forskellige tidspunkter baseret på den indledende billede for at lette positionering af regionen Interest (ROI) ved hjælp af producentens software (f.eks Analyse).
4. Konverter 3D rekonstrueret mikro-CT-billeder i 2D tiff (TIFF) stak før bearbejdning dem ved hjælp af producentens software.
5. Globalt segment (ImageJ> Juster> Threshold) brusk fra den subchondrale knogle og overliggende bad i softwaren.
6. Hent den gennemsnitlige grå værdi af brusk på forskellige tidspunkter (ImageJ> Analyse> Measure) ved hjælp af den genererede brusk maske i det foregående trin.
7. I betragtning af den indledende badkoncentration og startkoncentrationen kontrastmiddel i brusk, brug en lineær kalibreringskurve til at konvertere de gennemsnitlige grå værdier til den faktiske koncentration af opløste stoffer. Tidligere data understøtter det faktum, at gråværdier opretholde en lineær sammenhæng med koncentrationen af ​​kontrastmidler.
8. Plot koncentrationer af opløst stof versus eksperimentelle tidspunkter.

3. Computational Modelling

BEMÆRK: Diffusionen i dette problem antages at finde sted i 1D (langs z-aksen), der er i overensstemmelse med den eksperimentelle randbetingelse. Derfor kunne geometrien vilkårligt oprettet.

1. Bygge finite-bad baseret brusk multi-zone modeller: 1) brusk bestående af overfladiske zone (20% af den totale brusk tykkelse), midterste zone (50% af den totale brusk tykkelse) og dyb zone (30% af det samlede brusk tykkelse) ¹² og 2) finite-bad i FEBio ^{13, 14} (figur 2B).
2. Tildele de mekaniske og fysiske egenskaber af forskellige zoner af brusk og bad i FEBio. Youngs modul (10 MPa) blev antaget at være høj nok til at modstå det osmotiske tryk, der udøves af det overliggende bad og derfor beskytte brusk mod overdrevne deformationer.
   1. Anvende en hydraulisk permeabilitet på 10 ^-3 mm ⁴ / Ns og Poissons forhold på 0. Brug faktiske opløste diffusionskoefficient af badet i simuleringerne ^{8, 9.}
3. Generere mesh (8-node trilineære sekssidede elementer) og finjustere den nær grænserne (figur 2B)class = "xref"> ^{8, 9.}
4. Bifasisk-opløst stof model
   1. Anvende startkoncentration opløst stof i badet og effektiv tryk svarende til det. Se på beskrivelsen af effektive tryk i ^{9, 15.}
   2. Køre modellen i forbigående tilstand for at opnå opløste versus tidskurver henhold til de foreskrevne diffusionskoefficienter i forskellige brusk zoner.
5. flerfasede model
   NOTE: El udsving mellem bad og væv kan omgås ved at tilsætte to monovalente modioner til både badet og vævet.
   1. For steady state modeller: bruge de samme effektive fluidtryk og koncentrationer i brusk og overliggende bad samtidig øge FCD til dens ønskede værdi.
   2. For forbigående modeller: skabe en godt omrørt finite-bad ved at holde det opløste stof diffusionskoefficient i badet tilstrækkelig høj. Sprøjtsolut fra badet-luftgrænsefladen i badet for at nå sin ønskede koncentration værdi.
   3. Forbigående: Fjern den foreskrevne koncentration af opløst stof randbetingelse i det foregående trin og vende diffusionskoefficienten for finite-badet til dens faktiske diffusionskoefficient.
   4. Køre modellen for at opnå opløste koncentration-tid-kurver baseret på anvendt FCDs og diffusionskoefficienter i forskellige brusk zoner.
6. FEBio-Matlab-interface
   1. Udvikle en MATLAB kode til automatisk at udføre simulering i FEBio og plot koncentrations-tidskurver (FEBio-MATLAB interface) ^{8, 9.}
   2. Ændre diffusionskoefficienter og FCDs i brusk zoner under anvendelse FEBio-MATLAB interface. Køre modeller i FEBio og udtrække koncentration af opløst stof-tidskurver ^{8, 9.}
   3. Sammenligne de opnåede koncentration af opløst stof-tidskurver med den eksperimentelledata og opnå sæt af diffusionskoefficienter og FCDs i forskellige brusk zoner efter minimum kvadratisk middelfejl (RMSE) ^{8, 9.}

Figur 1: Eksperimentel opsætning. A) Prøve ekstraktionsprocedure ved anvendelse af et specialfremstillet borekrone. B) Micro-CT imaging procedure for overvågning diffusionsproces. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Skematisk.A) Eksperimentelt design. B) Multi-zone beregningsmæssige model, som består af finite bad, overfladiske, midterste og dybe zoner af brusk og tilhørende mesh. Klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

De repræsentative resultater forudsat her er adopteret fra tidligere forskning papirer ^{6, 8, 9, 16.}

I OA, ledbrusk undergår betydelige ændringer vigtigst GAG tab og collagen fibril skade ^{17, 18, 19.} Disse ændringer kan påvirke diffusive opførsel af opløste stoffer gennem ledbrusk ^{20, 21.} Vi studerede aksiale diffusion af to jodholdige kontrastmidler, dvs. iodixanol (ladning = 0) og ioxaglat (ladning = -1), i kadaver equine osteochondrale skruer med mikro-CT. Til kvantificering af diffusionsprocessen af ​​en neutral opløst stof (iodixanol), en tofaset-opløst stof model og en ladet Solu te (ioxaglat) flerfaset model blev udviklet i FEBio der betragtes zoneopdelt struktur af brusk. Den tofasede-opløst stof og flerfasede modeller kunne forudse diffusionen af iodixanol og ioxaglat tværs ledbrusk (figur 3). Disse modeller aktiveret opnåelse diffusionskoefficient iodixanol (bifasisk-opløst stof) og diffusionskoefficienten samt FCD (ioxaglat) i forskellige brusk zoner ^{8, 9.}

Figur 3: Beregningsmæssigt kurvetilpassede data. A) Multizone bifasisk-opløst stof (stiplet) versus forsøgsdata og B) flerfasede modeller passer (stiplede) versus forsøgsdata (symbol) ^{8, 9.}: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi præsenterede en forsøgsprotokol kombineret med en finite element modeling procedure at undersøge udbredelsen af ​​neutrale og ladede opløste stoffer tværs ledbrusk. Ifølge vores nylige undersøgelser, kunne de foreslåede modeller præcist beskriver transport af både neutral (bifasisk-opløst stof) og negativt ladede (flerfasede) opløste stoffer på tværs af forskellige zoner af ledbrusk ^{8, 9.} Det er en udbredt opfattelse, at ledbrusk bliver funktionelt begrænset ved tab af de vitale komponenter, såsom negativt ladede GAG makromolekyler samt kollagenfibriller løbet OA progression ^{21, 22, 23, 24.} Brug af teknik, der foreslås i denne undersøgelse, kan man potentielt undersøge sundhed af ledbrusken. Transporten af ​​neutrale opløste stof kan forøges i OA Primar ily grund af lavere interaktioner mellem det opløste stof samt GAG'er og collagener. På den anden side kunne transporten af ​​negativt ladede opløste stoffer hjælpe erhverve information med hensyn til koncentrationen af ​​faste afgifter af proteoglycaner, hvilket giver en indikation af niveauet af OA progression.

Den tofasede-opløst stof og flerfasede modeller, som blev udviklet baseret på fremkomsten af ​​finite-bad koncept ifølge de foregående undersøgelser kunne tjene som platforme, hvorved nøjagtig estimering af zoneinddeles egenskaber af ledbrusk kunne være tilvejebragt. Begrænsninger forbundet med store bade af kontrastmidler, nemlig mulig stråle-hærdende artefakter, og tildeling af en enkelt diffusionskoefficient at ledbrusk ^{7, 20, 25, 26, 27, 28,}lass = "xref"> ^{29, 30} kørte motivationen til at udvikle den aktuelle undersøgelse. I fremtiden OA forskning, kan vores udviklede modeller potentielt finde ansøgninger om tidlig OA diagnose.

Der er nogle kritiske trin, der kræves både i eksperimenter og beregningsmæssige simuleringer. At bevare brusk integritet under eksperimenter, ville man kræve tilsætning tilstrækkelige mængder af proteaseinhibitorer for at forhindre efterfølgende enzymatiske aktiviteter. I tilfælde af anvendelse af en prøve for mere end et eksperiment, vask-ud for de penetrerede opløste stoffer efter ækvilibrering var ca. 48 timer. Den wash-out effektivitet skal kontrolleres ved hjælp af mikro-CT. Når der anvendes vores set up anvendelse equin brusk, blev det minimale volumen af ​​det overliggende bad svarende til en uendelig bad beregnet til at være fem gange højere end bruskvolumen. Endvidere at udføre finite element modellering af diffusion, er det vigtigt at anvende faktiske opløste diffusion coefficient i badet, da afvigelsen fra, der kunne påvirke resultaterne.

I de underliggende finite element modeller, blev opløst stof størrelse effekt ikke implementeret, og derfor ikke kunne blive undersøgt. Vores foreslåede finite-bad-modellen giver nogle fordele, nemlig forståelse diffusionsproces i de leddelte leddene mere passende, og reducerer beam hardening artefakter. Vores foreslåede teknik kombinerer eksperimenter og beregningsmodeller muliggør granske diffusions- egenskaber brusk når positivt ladede kontraststoffer anvendes. Kendskabet til faktiske opløste diffusionskoefficient i badet synes at være afgørende, da der kan påvirke nøjagtigheden af ​​de opnåede diffusionskoefficienterne tværs ledbrusk betydeligt. Dette ville kræve enten opnå diffusionskoefficient bad eksperimentelt eller umiddelbart ved hjælp litteraturværdier.

Afslutningsvis vi foreslået en generel protokol, der består af øvelser ogberegninger til at undersøge transport af ladede og uladede opløste stoffer på tværs ledbrusken. Ved hjælp af protokollen, kan man med held få diffusionskoefficienter og faste ladede tætheder i forskellige brusk lag.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexabrix	Guerbet	15HX005D	Negatively-charged contrast agent
Visipaque	GE healthcare	12570511	Nuetral contrast agent
PBS (Phosphate-buffered Saline)	Life technologies	10010023	Medium
micro-CT	Perkin Elmer		Monitoring diffusion
Freezing-point osmometer	Advanced instruments		Measuring solution osmolality