ניסויי ו אלמנטים סופיים פרוטוקול לחקר התחבורה של מומסים ניטראליים והואשמו ברחבי Articular סחוס

Summary

אנו מציעים פרוטוקול לחקור את התחבורה של מולקולות טעונות uncharged פני סחוס במפרק בעזרת שיטות ניסיוניות שפותחו לאחרונה מספריות.

Abstract

אוסטיאוארתריטיס (OA) היא מחלה מתישה המשויך ניוון של הסחוס במפרק ואת עצם subchondral. ניוון של סחוס במפרק פוגע בתפקוד לטעון הנושאות שלה באופן משמעותי כפי שהוא חווה השפלה כימית עצומה, שיבוש הפיברילות אובדן וקולגן proteoglycan כלומר. אחת הדרכים המבטיחות לחקור מנגנונים נזק כימי במהלך OA היא לחשוף את דגימות סחוס אל המומס חיצוניים ולפקח הדיפוזיה של מולקולות. מידת הנזק בסחוס (ריכוז כלומר ותצורה של מקרומולקולות חיוניים) קשורה לאובדן אנרגיה collisional של מומסים חיצוניים תוך כדי תנועה על פני הסחוס במפרק יוצר המאפיינים דיפוזיה שונים לעומת סחוס בריא. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול, אשר מורכב מכמה שלבים, והוא מבוסס על ניסיוני שפותחו בעבר מיקרו-C14px; "> omputed T omography (מיקרו-CT) ו דוגמנות אלמנטים סופיים הובלת מולקולות יוד טעונה uncharged נרשם לראשונה באמצעות מיקרו-CT, אשר מלווה החלים-המומס פאזי ומודלים אלמנטים סופיים מרובה מצבים לקבל מקדמי דיפוזיה. וקבוע צפיפויות מטען על פני אזורי סחוס.

Introduction

תחבורה מולקולרית ממלא תפקיד חיוני הומאוסטזיס של המפרקים לבטא, משלוח של תרופות כדי במפרק סחוס ודימות סחוס משופר ניגודיות ^{1, 2, 3.} גורמים כגון אינטגרצית סחוס תקינות, המומס תשלום וגודל וכן osmolality וריכוז האמבטיה במגע עם סחוס עשוי להשפיע על שיעור התחבורה ^{4, 5, 6.} ההובלה מומסת, ניטראלי או טעון, יכולה להיות שונה בין אזורי סחוס במפרק, כי כל אזור מורכב ריכוזי אורינטציות שונים של מולקולות תא מטריקס גדולה, כלומר proteoglycans (PGS) וקולגן סוג II ^{1, 7, 8, 9,}נַעֲרָה = "Xref"> ^{10, 11.} וחשוב יותר, התחבורה של מומסים טעונים יכולה להיות תלויה במידה רבה את הריכוז של proteoglycans הכולל שעבודים קבועים שליליים בתוך מטריקס אשר מגביר פני סחוס במפרק ^{8, 9.} פרמטרים אלה צפיפות שעבוד קבוע במיוחד (FCD), האוריינטציה של סיבי קולגן וריאציה תכולת מים על פני הסחוס עשוי לעבור שינויים כמו דלקת מפרקים ניוונית (OA) מתקדמת, אשר סימנה באמצעותם את החשיבות של לימוד דיפוזיה פני הסחוס.

במחקר הנוכחי, פרוטוקול המבוסס על מחקרי ניסויים הקימו בעבר חישובית ^{6, 8, 9} מוצע לחקור דיפוזיה במדויק בתנאי גבול שונים באמצעות מומסים ניטראליים והואשמו ב מודל סופי-אמבטיה של דיפוזיה. Tהוא הציע שיטות מורכבות הדמית טומוגרפיה ממוחשבת מייקרו (micro-CT) של מערכת כולל סחוס ואמבט סופי הנתמך על ידי-המומס פאזי מתקדם ומודלי אלמנטים סופיים מרובים מצבים. מודלים אלה מאפשרים קבלת מקדמי דיפוזיה של מולקולות ניטראליות וטעונות כמו גם FCDs פני אזורים שונים של סחוס במפרק. שימוש במודלים אלה, אפשר לקבל הבנה טובה יותר של ההתנהגות של מולקולות ניטראליות והואשמו לשדר שיכול לשמש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין הסחוס שכיסה-אמבטיה סופית.

Protocol

הערה: הפרוטוקול המובא כאן הוא אימץ מן הפרוצדורות ו חישובית של מחקרים אחרונים ^{6, 8, 9.} הפרוטוקול מתואר באיור 1.

החומרים cadaveric נאספו באישור הסגל וטרינרי של אוניברסיטת אוטרכט.

1. לדוגמא הכנת אמבט

1. לקדוח החוצה תקעי osteochondral גליליים (קוטר של 8.5 מ"מ) מן condyles ירך סוסי cadaveric באמצעות מקדח מחוייט (איור 1), תוך התזה מגניב פוספט שנאגר מלוח (PBS) כדי למנוע התחממות יתר ופגיעה בסחוס עוקבת.
2. לכווץ את המצתים osteochondral עם פלסטיק מתכווץ שרוול כדי למזער את דיפוזיה לרוחב האמבטיה שכיסה.
   1. הר תקע osteochondral עם סחוס בבית הדואר העליון בתחילה בתוך שרוול מתכווץ פלסטיק ופעל ידי נושבת באוויר חם אליו. להוסיף חתיכות צמר גפן רטוב על פני השטח של סחוס כדי למנוע נזק חום-קשורים.
3. כן-אמבטיות סופיות של טיעונים (למשל, 650 μL, 420 מ"מ, ioxaglate, משקל המולקולרי (MW) = 1269 Da, תשלום = -1) ו ניטראלי (650 μL, 420 מ"מ, iodixanol, MW = 1550 Da) מומס בנפרד.
4. טען את הסופים-האמבטיות הכינו על פני השטח של סחוס באמצעות מזרק ולמקם תקע פקק על המדגם העטוף כדי למנוע אידוי במהלך ניסויים ב RT (איור 2 א). כדי ללמוד את התחבורה המומסת הניטראלית, למקם את אמבטית iodixanol וכדי ללמוד באמבטית ioxaglate מקום בתחבורה מומסת הטעונה השלילי על גבי משטח הסחוס.

הדמיה 2. ועיבוד תמונה

1. מניח את הדגימות העטופות מבודדות עם תקע פקק על בעל מחוייט מצורף הבמה הממונעת של א-CT מיקרו. מקום tהוא לדגום כך משטח הסחוס מכוסה פתרון חומר ניגוד פונה כלפי מעלה.
2. סרוק באמצעות מיקרו-CT (גודל voxel של 40 × 40 × 40 מיקרומטר ^3, סריקה בזמן של 2 דקות, מתח צינור של 90 קילו ו הנוכחי צינור של 180 מיקרו-אמפר) שדה הראייה המורכבת של הסחוס, צלחת subchondral, ו finite- אמבטיה בכמה נקודות זמן עד מדינת שיווי משקל (48 ח) הוא הגיע (איור 2 א). מדינת שיווי המשקל מושגת כאשר ערכי ריכוז אינם משתנים לאורך זמן.
3. רשום את תמונות 3D בנקודות זמן שונות המבוססות על התמונה הראשונית כדי להקל מיצוב של האזור של העניין (ROI) באמצעות התוכנה של היצרן (למשל, לנתח).
4. המר את 3D משוחזר תמונות מיקרו-CT לתוך פורמט קובץ תמונה Tagged 2D (TIFF) מחסנית לפני עיבוד אותם באמצעות תוכנה של היצרן.
5. גלובלי פלח (ImageJ> התאם> Threshold) הסחוס מן העצם subchondral ושובשוכב באמבטיה בתוכנה.
6. השג את הערך האפור הממוצע של סחוס בנקודות זמן שונה (ImageJ> לנתח מדוד>) באמצעות מסכת סחוס שנוצרה בשלב הקודם.
7. בהינתן ריכוז אמבטיה הראשוני וריכוז חומר ניגוד ראשוני הסחוס, להשתמש עקומת כיול ליניארית להמיר הערכי האפור הממוצע של ריכוז בפועל של מומסים. נתונים קודמים תומכים בעובדה ערכית אפור לשמור על קשר לינארי עם הריכוז של חומר ניגוד.
8. שרטט את ריכוזי המומס לעומת נקודות זמן הניסוי.

3. מודלים חישוביים

הערה: דיפוזיה בעיה זו הנחה היא להתקיים 1D (לאורך ציר z), אשר עולה בקנה אחד עם המצב בגבול הניסיון. לכן, הגיאומטריה יכולה להיווצר באופן שרירותי.

1. לבנות סחוס מבוסס סופית-אמבטית מודלים רב אזור: 1) סחוס מורכב אזור השטחי (20% מעובי הסחוס סה"כ), אזור הביניים (50% מעובי הסחוס הכולל) ואת אזור עמוק (30% מעובי הסחוס הכל) ¹² ו 2), אמבטיה סופי ב FEBio ^{13, 14} (איור 2B).
2. הקצה את התכונות המכאניות ופיסיות של אזורים השונים של סחוס אמבטית FEBio. מודול יאנג (10 MPA) הונח להיות גבוה מספיק כדי לעמוד בלחץ האוסמוטי שמפעיל באמבטיה שמעליה ולכן להגן על הסחוס מפני עיוותים מוגזמות.
   1. השתמש חדירות הידראוליות של 10 ^-3 מ"מימ ⁴ / NS ו מקדם פואסון של 0. מקדם דיפוזיה המומס השתמש בפועל של האמבט בסימולציות ^{8, 9.}
3. צור רשת (אלמנטי hexahedral טריליניארי 8-צומת) ולעדן אותה ליד הגבולות (איור 2B)class = "Xref"> ^{8, 9.}
4. מודל דו-פאזי-המומס
   1. החל ריכוז מומס ראשוני לחץ האמבטיה ויעיל המתאים לו. תראה את התיאור של לחץ אפקטיבי ^{9, 15.}
   2. הפעל את המודל במצב חולף להשיג ריכוז מומס מול עקומות זמן על פי מקדמי דיפוזיה שנקבעו באזורי סחוס שונים.
5. מודל מרובה מצבים
   הערה: התנודות החשמליות בין אמבטית רקמות ניתן לעקיפה על ידי הוספת שני חד ערכי נגד יונים הוא באמבטיה ואת הרקמות.
   1. עבור דגמים יציבים: להשתמש באותה לחצי נוזל יעילים וריכוזי סחוס האמבטיה שמעליה תוך הגדלת FCD כדי הערך הרצוי שלה.
   2. עבור דגמים חולפים: ליצור סופי-אמבטיה-בחש היטב על ידי שמירה על מקדם דיפוזיה המומס באמבטיה הגבוהה מספיק. להזריק אתמומס מהממשק-האוויר באמבטיה לאמבטיה כדי להגיע לערך הריכוז הרצוי שלה.
   3. חלוף: להסיר את המצב בגבול מומס ריכוז שנקבע בשלב הקודם ולחזור קדם הדיפוזיה של מהמרחץ הסופי אל מקדם הדיפוזיה שלה בפועל.
   4. הפעל את המודל כדי להשיג עקומות ריכוז בזמן מומסות מבוססות על FCDs שיושמה מקדמי דיפוזיה באזורי סחוס שונים.
6. ממשק FEBio-MATLAB
   1. לפתח קוד MATLAB לבצע סימולציה אוטומטית FEBio ועקומות הריכוז בזמן העלילה (ממשק FEBio-MATLAB) ^{8, 9.}
   2. שינוי מקדם דיפוזיה FCDs באזורי סחוס באמצעות ממשק FEBio-MATLAB. הפעל מודלי FEBio ולחלץ עקומות ריכוז בזמן מומס ^{8, 9.}
   3. השווה את עקומות ריכוז בזמן המומסת שהושג עם ניסיוניערכות נתונים ולקבל של מקדמי דיפוזיה FCDs באזורי סחוס שונים המבוססים על שורש מינימום טעות ריבועית ממוצעת (RMSE) ^{8, 9.}

איור 1: הגדרת ניסוי. א) הליך החילוץ לדוגמא באמצעות מקדח מחוייט. B) Micro-CT הליך הדמיה לפקח תהליך דיפוזיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: סכמטי.א) עיצוב ניסיוני. B) מודל חישובי Multi-zone מורכב באמבטיה הסופית, שטחי, באמצע העמוק האזורית של סחוס הרשת מזוהית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Representative Results

תוצאות הנציג הניתנות כאן הם אמצו מן המחקרים קודמים ^{6, 8, 9, 16.}

בשנת OA, הסחוס במפרק עובר שינויים משמעותיים והכי חשוב אובדן GAG, ונזק קולגן הפיברילות ^{17, 18, 19.} שינויים אלה עשויים להשפיע על ההתנהגות המתרחבת של מומסים דרך סחוס במפרק ^{20, 21.} למדנו דיפוזיה צירית של שני סוכנים בניגוד יוד, כלומר iodixanol (תשלום = 0) ו ioxaglate (תשלום = -1), בשנת תקעים cadaveric סוסים osteochondral באמצעות מיקרו-CT. כדי לכמת את תהליך דיפוזיה של המומס נייטרלי (iodixanol), מודל פאזי-המומס ואת solu טעונה טה (ioxaglate) מודל מרובה מצבים פותחו FEBio כי נחשב למבנה אֵזוֹרִי של הסחוס. The-מומס פאזי והמודלים מרובים מצבים יכולים לחזות את הדיפוזיה של iodixanol ו ioxaglate פני סחוס במפרק (איור 3). מודלים אלה מאפשרים קבלת מקדם הדיפוזיה של iodixanol (פאזי-המומס) ואת מקדם הדיפוזיה וכן FCD (ioxaglate) באזורי סחוס שונים ^{8, 9.}

איור 3: ממוחשב Curve מצויד נתונים. א) רב-אזור-המומס פאזי (מקווקו) לעומת נתוני ניסוי ו- B) מתאים למודלים מרובים מצבים (מקווקו) לעומת נתוני ניסוי (סמל) ^{8, 9.}: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הצגנו פרוטוקול ניסוי בשילוב עם הליך דוגמנות אלמנטים סופי ללמוד את הדיפוזיה של מומסים ניטראליים והואשמו פני סחוס במפרק. על פי המחקרים האחרונים שלנו, הדגמים המוצעים יכולים לתאר במדויק את ההובלה של שניהם ניטראלי (-המומס פאזי) טעון שלילי (מרובה מצבים) מומס פני אזורים שונים של סחוס במפרק ^{8, 9.} הוא האמין נרחב כי סחוס במפרק הופך למוגבל תפקודי דרך אובדן הרכיבים החיוניים שלה כגון מקרומולקולות GAG הטעונה שלילי כמו גם סיבים קולגן במהלך התקדמות OA ^{21, 22, 23, 24.} באמצעות הטכניקה המוצעת במחקר זה, אחד עלול לבחון מהבריאות של סחוס במפרק. הובלת המומס נייטרלי ניתן לשפר את העיצוב ב OA primar ily בגלל אינטראקציות תחתונות בין המומס וכן בדיחות collagens. מצד שני, הובלה של מומסים בעלי מטען שלילי יכול לעזור להשיג מידע לגבי ריכוז חיובים קבועים של proteoglycans, ובכך נותן אינדיקציה לרמת התקדמות OA.

The-מומס פאזי והמודלים מרובים מצבים שפותחו מבוססים על הופעתה של מושג סופי-אמבטיה על פי המחקרים הקודמים יכולים לשמש פלטפורמות שבאמצעותם אומדן מדויק של מאפייני אזורים של סחוס במפרק יכול להינתן. מגבלות הקשורות אמבטיות גדולות של חומר ניגוד, כלומר אפשרי קרן התקשות חפצה, והקצאה מקדמים דיפוזיה יחיד במפרק סחוס ^{7, 20, 25, 26, 27, 28,}= נער "Xref"> ^{29, 30} הסיע את המוטיבציה לפתח את המחקר הנוכחי. במחקר OA בעתיד, המודלים שפותחו שלנו עשויים פוטנציאליים למצוא יישומים לאבחון OA מוקדם.

ישנם כמה צעדים קריטיים הדרושים הוא ניסויים והדמיות חישובית. כדי לשמור על שלמות סחוס במהלך ניסויים, אחד ידרוש הוספת כמויות מספיקות של מעכבי הפרוטאז כדי למנוע פעילות אנזימטית עוקבת. במקרה של שימוש בדגימה אחת עבור יותר מניסוי אחד, לשטוף פסק זמן עבור המומסים חדרו לאחר האיזון היה כ 48 h. היעילות לשטוף החוצה צריכה להיבדק באמצעות-CT מיקרו. בעת שימוש הסט למעלה שלנו העסיק סחוס סוסים, הנפח המינימאלי של מקבילת האמבטיה שמעליה כדי באמבט אינסופי חושב להיות חמש פעמים גבוהות יותר מאשר נפח סחוס. יתר על כן, כדי לבצע מידול אלמנטים סופיים של דיפוזיה, חשוב ליישם קואפיק דיפוזיה המומס בפועלient באמבטיה מאז סטייה שעלול להשפיע על התוצאות.

במודלי האלמנטים הסופיים הבסיסיים, אפקט גודל מומס לא יושם ולכן לא יכול להיחקר. המודל סופי-האמבטיה המוצעת שלנו מציע כמה יתרונות, כלומר תהליך דיפוזיה הבנת המפרקים לבטא יותר הולם, ועל חפצי התקשות קרן צמצום. הטכניקה המוצעת שלנו המשלב ניסויים ומודלים חישוביים מאפשר בחינה מדוקדקת של תכונות דיפוזיה של הסחוס כאשר משתמשים בחומרי ניגוד בעלי מטען חשמלי חיובי מוחלים. הידע של מקדם הדיפוזיה המומס בפועל באמבטיה נראה מכריע שכזה עלול להשפיע באופן משמעותי את הדיוק של מקדמי דיפוזיה שהושגו על פני הסחוס במפרק. זה ידרוש משני קבלת מקדם הדיפוזיה של אמבטיה בניסוי או קושי באמצעות ערכים בספרות.

לסיכום, אנו המוצע פרוטוקול כללי מורכב ניסוייםחישובים כדי לחקור את ההובלה של מומסים טעונים uncharged פני סחוס במפרק. שימוש בפרוטוקול, אפשר לקבל מקדמי דיפוזיה צפיפויות טעונה קבועות בהצלחה בשכבות סחוס שונות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexabrix	Guerbet	15HX005D	Negatively-charged contrast agent
Visipaque	GE healthcare	12570511	Nuetral contrast agent
PBS (Phosphate-buffered Saline)	Life technologies	10010023	Medium
micro-CT	Perkin Elmer		Monitoring diffusion
Freezing-point osmometer	Advanced instruments		Measuring solution osmolality