Summary
Proponiamo un protocollo per studiare il trasporto di molecole cariche e scariche attraverso cartilagine articolare con l'ausilio di metodi sperimentali e numerici recentemente sviluppati.
Abstract
L'osteoartrite (OA) è una malattia debilitante che è associata con la degenerazione della cartilagine articolare e dell'osso subcondrale. Degenerazione della cartilagine articolare compromette la sua funzione portante sostanzialmente come sperimenta degradazione chimica tremenda, cioè proteoglicani perdita e fibrille di collagene interruzione. Un modo promettente per indagare meccanismi di danno chimico durante OA è quello di esporre i campioni di cartilagine di un soluto esterna e controllare la diffusione delle molecole. Il grado di danno cartilagineo (cioè la concentrazione e la configurazione delle macromolecole essenziali) è associato con la perdita di energia collisione di soluti esterni mentre si muove attraverso cartilagine articolare crea diverse caratteristiche di diffusione rispetto alla cartilagine sana. In questo studio, si introduce un protocollo, che comprende diverse fasi e si basa su precedentemente sviluppato sperimentale micro-C14px; "> omputed T omography (micro-CT) e elementi finiti Il trasporto di molecole iodurati cariche e non viene prima registrata utilizzando micro-CT, che è seguita applicando multifasici modelli ad elementi finiti per ottenere coefficienti di diffusione bifasica-soluto. e densità di carica fissa in fusi cartilagine.
Introduction
Trasporto molecolare svolge un ruolo fondamentale nell'omeostasi del snodi, la consegna di terapie per cartilagine articolare e della cartilagine di imaging con mdc 1, 2, 3. Fattori come integrazione cartilagine e integrità, carica soluto e dimensione, nonché osmolalità e la concentrazione del bagno in contatto con cartilagine può influenzare la velocità di trasporto 4, 5, 6. Il trasporto di soluti, sia neutre o cariche, può essere differente tra zone della cartilagine articolare, perché ogni zona è formata di diverse concentrazioni e orientamenti di grandi molecole della matrice extracellulare, cioè proteoglicani (PG) e collagene di tipo II 1, 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, 11. Ancora più importante, il trasporto di soluti cariche può essere fortemente dipendente dalla concentrazione di proteoglicani comprendenti cariche fisse negative all'interno della matrice extracellulare che aumenta tutti cartilagine articolare 8, 9. Tali parametri densità di carica particolarmente fissa (FCD), orientamento delle fibrille di collagene e di variazione di contenuto di acqua di tutti cartilagine possono subire alterazioni come osteoartrite (OA) progredisce, indicando così l'importanza di studiare diffusione attraverso cartilagine.
In questo studio, un protocollo basato su studi sperimentali e computazionali stabiliti in precedenza 6, 8, 9 si propone di indagare accuratamente diffusione in varie condizioni al contorno utilizzando soluti neutri e carichi in un modello a stati finiti vasca di diffusione. Tha proposto metodi sono composti di imaging micro-tomografia computerizzata (micro-CT) di un sistema comprendente una cartilagine e finiti vasca sostenuta da advanced modelli ad elementi finiti multifasici bifasica-soluto. Questi modelli consentono di ottenere coefficienti di diffusione delle molecole neutre e cariche nonché FCDS attraverso varie zone della cartilagine articolare. Usando questi modelli, si può ottenere una migliore comprensione del comportamento delle molecole neutre e cariche diffondenti che potrebbero essere utilizzati per studiare le interazioni tra cartilagine e sovrapponendo finita bagno.
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Protocol
NOTA: Il protocollo presentato qui è adottato dalle procedure sperimentali e computazionali di documenti di ricerca recenti 6, 8, 9. Il protocollo è illustrato in Figura 1.
I materiali da cadavere sono stati raccolti con il permesso di Facoltà di Medicina Veterinaria dell'Università di Utrecht.
1. campione e Bath Preparazione
- Trapanare spine osteocondrali cilindrici (diametro di 8,5 mm) dal cadavere condili femorali equina utilizzando punta misura (figura 1) durante la spruzzatura fredda salina tamponata con fosfato (PBS) per evitare il surriscaldamento e conseguenti danni cartilagine.
- Termoretraibile i tappi osteocondrali con una plastica contrazione manicotto per minimizzare la diffusione laterale del bagno sovrapposizione.
- Montare la spina osteocondrale con la cartilagine a The superiore inizialmente all'interno del manicotto contrazione plastica e seguire soffiando aria calda ad esso. Aggiungere i pezzi di cotone bagnato sulla superficie della cartilagine per evitare danni legati al calore.
- Preparare finite-bagni di cariche (ad esempio, 650 ml, 420 mM, ioxaglate, peso molecolare (MW) = 1.269 Da, carica = -1) e neutro (650 uL, 420 mM, iodixanolo, PM = 1.550 Da) soluti separatamente.
- Caricare i finiti bagni di preparati sulla superficie di cartilagine con una siringa e inserire un tappo di sughero sul campione avvolto per evitare l'evaporazione durante gli esperimenti a RT (Figura 2A). Per studiare il trasporto di soluti neutro, posizionare la vasca iodixanolo e studiare il bagno ioxaglate posto trasporto dei soluti carica negativa sulla superficie cartilaginea.
2. Imaging and Image Processing
- Porre i campioni avvolto isolati con spina sughero su un supporto su misura collegata allo stadio motorizzato di un micro-CT. luogo tha campione in modo che la superficie cartilagine rivestita con soluzione di mezzo di contrasto è rivolto verso l'alto.
- Scandire utilizzando il micro-CT (dimensione voxel di 40 × 40 × 40 micron 3, tempo di scansione di 2 min, voltaggio di 90 kV e corrente del tubo di 180 uA) un campo visivo costituito da cartilagine, placca subcondrale, e finite- bagno in vari punti di tempo fino stato di equilibrio (48 h) viene raggiunta (Figura 2A). Lo stato di equilibrio viene raggiunto quando valori di concentrazione non cambiano nel tempo.
- Registrare le immagini 3D in diversi momenti in base l'immagine iniziale per facilitare il posizionamento della regione di interesse (ROI) utilizzando il software del produttore (ad esempio, analizzare).
- Convertire il 3D ricostruito immagini micro-CT in 2D Tagged Image File Format (TIFF) stack prima elaborazione di loro utilizzando il software del produttore.
- A livello globale del segmento (ImageJ> Regola> Soglia) la cartilagine dall'osso subcondrale e oltresdraiato bagno nel software.
- Ottenere il valore di grigio medio della cartilagine a tempi diversi (ImageJ> Analisi> Misura) utilizzando la maschera cartilagine generato nel passaggio precedente.
- Data la concentrazione iniziale e bagno concentrazione iniziale agente di contrasto nella cartilagine, utilizzare una curva di calibrazione lineare per convertire i valori di grigio medi alla concentrazione effettiva di soluti. dati precedenti supportano il fatto che i valori di grigio mantengono una relazione lineare con la concentrazione di agenti di contrasto.
- Tracciare la concentrazione del soluto rispetto punti temporali sperimentali.
3. modellazione computazionale
NOTA: La diffusione di questo problema si presume abbia luogo in 1D (lungo l'asse z), che rispetta la condizione al contorno sperimentale. Pertanto, la geometria potrebbe essere arbitrariamente creato.
- Costruire modelli cartilagine multizona basati finite-bagno: 1) costituito da cartilagine zona superficiale (20% dello spessore totale della cartilagine), zona intermedia (50% dello spessore totale della cartilagine) e la zona profonda (30% dello spessore totale della cartilagine) 12 e 2) finiti bagno nel Febio 13, 14 (figura 2B).
- Assegnare le proprietà meccaniche e fisiche delle diverse zone di cartilagine e bagno in Febio. modulo di Young (10 MPa) è stata assunta essere sufficientemente alta da resistere alla pressione osmotica esercitata dalla vasca sovrastante e quindi proteggere la cartilagine da deformazioni eccessive.
- Utilizzare una permeabilità idraulica di 10 -3 mm 4 / Ns e il rapporto di Poisson di 0. Utilizzare coefficiente effettivo soluto diffusione del bagno nelle simulazioni 8, 9.
- Generare mesh (elementi 8 nodi trilinear esagonali) e definire in prossimità dei confini (Figura 2B)class = "xref"> 8, 9.
- modello bifasica-soluto
- Applicare concentrazione iniziale soluto nel bagno ed efficace pressione corrispondente ad esso. Guarda la descrizione della pressione effettiva in 9, 15.
- Eseguire il modello in modo transitorio per determinare la concentrazione di soluto rispetto curve temporali secondo i coefficienti di diffusione prescritti in diverse zone della cartilagine.
- modello Multiphasic
NOTA: La fluttuazione elettrico tra bagno e tessuto può essere aggirato aggiungendo due monovalenti contro-ioni sia la vasca e il tessuto.- Per i modelli allo stato stazionario: utilizzare le stesse pressioni di fluido efficaci e le concentrazioni in cartilagine e bagno sovrastante aumentando FCD al valore desiderato.
- Per i modelli transitori: creare un ben agitata finiti vasca mantenendo il coefficiente di diffusione soluto nel bagno sufficientemente elevata. iniettare ilsoluto dall'interfaccia bagno-aria nel bagno per raggiungere il suo valore concentrazione desiderata.
- Transitorio: rimuovere la concentrazione di soluto condizione limite prescritto nel passaggio precedente e ripristinare il coefficiente di diffusione del finito-bagno al suo coefficiente di diffusione effettiva.
- Eseguire il modello per ottenere soluto curve concentrazione-tempo basato su FCDS applicata e coefficienti di diffusione in diverse zone della cartilagine.
- Interfaccia Febio-MATLAB
- Sviluppare un codice MATLAB per eseguire automaticamente la simulazione in Febio e trama curve concentrazione-tempo (interfaccia Febio-MATLAB) 8, 9.
- Modificare coefficienti di diffusione e FCDS nelle zone cartilagine utilizzando l'interfaccia Febio-MATLAB. Eseguire modelli in Febio ed estrarre le curve soluto concentrazione-tempo 8, 9.
- Confrontare i soluti ottenute curve concentrazione-tempo con la sperimentaledati e ottenere insiemi di coefficienti di diffusione e FCDS in diverse zone della cartilagine basato su radice minimo errore quadratico medio (RMSE) 8, 9.
Figura 1: Configurazione sperimentale. A) procedura di estrazione del campione con una punta su misura. B) procedura di imaging Micro-CT per monitorare processo di diffusione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema.A) Disegno sperimentale. B) modello computazionale multi-zona costituita dalla vasca finita, zone superficiali, medi e profondi della cartilagine e rete associata. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
I risultati rappresentativi qui fornite sono adottati da documenti di ricerca precedenti 6, 8, 9, 16.
In OA, la cartilagine articolare subisce cambiamenti significativi soprattutto perdita GAG, e fibrille di collagene danno 17, 18, 19. Tali cambiamenti possono influenzare il comportamento diffusiva di soluti attraverso cartilagine articolare 20, 21. Abbiamo studiato diffusione assiale di due mezzi di contrasto iodurati, cioè iodixanolo (carica = 0) e ioxaglate (carica = -1), in cadavere spine osteocondrali equina utilizzando micro-CT. Per quantificare il processo di diffusione di un soluto neutro (iodixanolo), un modello bifasico-soluto e una solu carica TE (ioxaglate) modello multifasico sono stati sviluppati Febio che considera la struttura zonale della cartilagine. Il bifasica-soluto e modelli multifasici potrebbe prevedere la diffusione di iodixanolo e ioxaglate tutti cartilagine articolare (Figura 3). Questi modelli abilitati ottenimento coefficiente di diffusione del iodixanolo (bifasica-soluto) e il coefficiente di diffusione nonché FCD (ioxaglate) in diverse zone della cartilagine 8, 9.
Figura 3: Computationally curva-montato dati. A) multi-zona bifasica-soluto (tratteggiata) rispetto dati sperimentali e B) modelli multifasici attacchi (tratteggiate) rispetto a dati sperimentali (simbolo) 8, 9.: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo presentato un protocollo sperimentale unita ad una procedura elementi finiti per studiare la diffusione di soluti neutri e carichi attraverso cartilagine articolare. Secondo studi recenti, i modelli proposti possono descrivere con precisione il trasporto sia di neutro (bifasico-soluto) e caricati negativamente soluti (multifasici) attraverso diverse zone della cartilagine articolare 8, 9. È opinione diffusa che cartilagine articolare viene funzionalmente limitata tramite perdita delle sue componenti vitali come macromolecole GAG carichi negativamente e fibrille di collagene durante OA progressione 21, 22, 23, 24. Utilizzando la tecnica proposta in questo studio, si può potenzialmente esaminare la salubrità della cartilagine articolare. Il trasporto del soluto neutro può essere aumentato in OA primar ily a causa di minori interazioni tra il soluto e GAG e collagene. D'altra parte, il trasporto di soluti carica negativa potrebbe aiutare acquisire informazioni rispetto alla concentrazione di cariche fisse di proteoglicani, dando così un'indicazione del livello di progressione OA.
Il bifasica-soluto e modelli multifasici che sono stati sviluppati basa sulla comparsa di concetto finito-vasca secondo gli studi precedenti potrebbero servire come piattaforme dalle quali potrebbe essere fornita stima accurata delle proprietà zonali di cartilagine articolare. Limitazioni associate con grandi bagni di agenti di contrasto, ovvero al raggio-indurimento manufatti, e assegnando un singolo coefficiente di diffusione di cartilagine articolare 7, 20, 25, 26, 27, 28,lass = "xref"> 29, 30 ha guidato la motivazione a sviluppare l'attuale studio. In futuro la ricerca OA, i nostri modelli sviluppati potrebbero potenzialmente trovare applicazioni per la diagnosi precoce di OA.
Ci sono alcuni passaggi critici necessari sia in esperimenti e simulazioni computazionali. Per preservare l'integrità della cartilagine durante gli esperimenti, si richiederebbe l'aggiunta di quantità sufficienti di inibitori della proteasi per impedire successive attività enzimatiche. In caso di utilizzo di un campione per più di un esperimento, il tempo di wash-out per soluti danneggiano dopo equilibrazione è stato di circa 48 ore. L'efficienza wash-out deve essere controllato mediante micro-CT. Utilizzando il nostro set up impiegando cartilagine equina, il volume minimo della vasca sovrastante equivalente ad un bagno infinita stato calcolato essere cinque volte superiore volume della cartilagine. Inoltre, effettuare elementi finiti di diffusione, è fondamentale per applicare effettivo soluto diffusione Coëfficiente nella vasca da bagno in quanto deviazione da che potrebbe influenzare i risultati.
Nei modelli elementi finiti sottostanti, effetto di scala soluto non è stata attuata e pertanto non può essere studiata. Il nostro modello proposto finiti bagno offre alcuni vantaggi, ossia processo di diffusione comprensione degli snodi più appropriatamente, e ridurre gli artefatti di indurimento del fascio. La nostra tecnica proposta combinando esperimenti e modelli computazionali permette scrutare gli attributi di diffusione della cartilagine quando sono applicati mezzi di contrasto carica positiva. La conoscenza di effettivo coefficiente di diffusione soluto nel bagno sembra essere cruciale come che potrebbero influenzare significativamente l'accuratezza dei coefficienti di diffusione ottenuti attraverso cartilagine articolare. Ciò richiederebbe se ottenere il coefficiente di diffusione del bagno sperimentalmente o facilmente utilizzando valori di letteratura.
In conclusione, abbiamo proposto un protocollo generale consistente di esperimenti ecalcoli per indagare il trasporto di soluti cariche e non cariche in tutta la cartilagine articolare. Utilizzando il protocollo, si possono ottenere con successo coefficienti di diffusione e densità praticati fissati in diversi strati di cartilagine.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine al Sig Jeroen van den Berg e il signor Matthijs Wassink dal gruppo meccanica di sviluppo a UMC Utrecht per il loro aiuto nel processo di spine osteocondrali da imballaggio. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da olandese Arthritis Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negatively-charged contrast agent |
| Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Nuetral contrast agent |
| PBS (Phosphate-buffered Saline) | Life technologies | 10010023 | Medium |
| micro-CT | Perkin Elmer | Monitoring diffusion | |
| Freezing-point osmometer | Advanced instruments | Measuring solution osmolality |
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