Summary
我々は最近開発された実験と数値解析法を用いて関節軟骨全体に充電し、非荷電分子の輸送を調査するためのプロトコルを提案します。
Abstract
変形性関節症（OA）は、関節軟骨および軟骨下骨の変性に関連している衰弱性疾患です。これは驚異的な化学的分解、 すなわちプロテオグリカン損失及びコラーゲン原線維破壊を経験するように関節軟骨の変性が実質的にその荷重支持機能を損ないます。 OA中に化学的損傷のメカニズムを調査するための一つの有望な方法は、外部の溶質に軟骨標本を公開し、分子の拡散を監視することです。健康な軟骨と比較して異なる拡散特性を作成する関節軟骨を横切って移動しながら、軟骨損傷（ すなわち、濃度及び本質的な巨大分子の構成）の程度は、外部溶質の衝突エネルギー損失と関連しています。本研究では、いくつかのステップで構成され、以前に開発された実験マイクロ-Cに基づいてされているプロトコルを導入します14px; "> omputed T omography（マイクロCT）及び有限要素モデリング第二相、溶質および拡散係数を得るために、多相有限要素モデルを適用することにより、続いてマイクロCTを使用して記録されて充電され、非荷電ヨウ素化分子の輸送。軟骨ゾーン間で電荷密度を修正しました。
Introduction
分子輸送は、関節の関節の恒常性に重要な役割を果たしている関節ための治療薬の配達軟骨と軟骨造影イメージング1、2、3。このような軟骨の統合と完全性、溶質の電荷およびサイズならびに軟骨と接触している浴の重量オスモル濃度および濃度のような因子は、トランスポートレート4、5、6に影響を及ぼし得ます。各ゾーンは、異なる濃度および主要細胞外マトリックス分子の配向から成るので、中性または荷電のいずれかの溶質の輸送は、関節軟骨のゾーン間で異なることができる、すなわち、プロテオグリカン（PG類）及びコラーゲンII型1、7、8、9、小娘= "外部参照"> 10、11。より重要なことに、帯電した溶質の輸送は、関節軟骨8,9を横切って増加、細胞外マトリックス内の負の固定電荷を含むプロテオグリカンの濃度に大きく依存することができます。それらのパラメータ、特に固定電荷密度（FCD）、変形性関節症（OA）は、それによって軟骨を横切る拡散を研究することの重要性を意味する、進行するにつれて、軟骨を横断コラーゲン原線維と含水量変化の向きが変化を受けることができます。
今回の研究では、プロトコルは6、8、9を正確拡散の有限浴モデルに中性および充電溶質を使用して、さまざまな境界条件の下で拡散を調査するために提案され、以前に確立された実験と計算研究に基づきます。 T彼は、方法は、軟骨および高度な二相性-溶質および多相有限要素モデルでサポートされている有限浴を含むシステムのマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）で構成されている提案しました。これらのモデルは、関節軟骨の種々のゾーンを横切って中性と荷電分子ならびにFirstClassディレクトリサービスの拡散係数を得ることができます。これらのモデルを使用して、1は、軟骨および有限風呂を重ねる間の相互作用を調査するために使用することができ、拡散中性及び荷電した分子の挙動をよりよく理解を得ることができます。
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Protocol
注：ここで紹介するプロトコルは、最近の研究論文6、8、9の実験と計算手順から採用されています。プロトコルは、 図1に示されています。
死体の材料はユトレヒト大学の獣医学部の許可を得て収集しました。
1.サンプルおよびバス製造
- クールリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を噴霧しながら過熱とその後の軟骨損傷を防止するために、カスタムメイドのドリルビット（ 図1）を用いて、死体ウマ大腿骨顆から円筒状の骨軟骨プラグ（8.5ミリメートルの直径）をドリル。
- オーバーレイ浴の横方向の拡散を最小限に抑えるためにプラスチック収縮スリーブと骨軟骨プラグを熱収縮。
- 目の軟骨と骨軟骨プラグをマウント電子のトップ当初、プラスチックシュリンクスリーブの内側とそれに熱風を吹き付けてください。熱関連の損傷を防ぐために、軟骨の表面に濡れた綿片を追加します。
- 別料金（ 例えば、650μL、420 mMの、イオキサグレート、分子量（Mw）= 1,269 Daの、電荷= -1）および中性（650μL、420ミリモル、イオジキサノール、MW = 1,550 Da）での溶質の有限浴を準備します。
- 注射器を用いて軟骨の表面上に作製有限浴をロードし、RT（ 図2A）での実験中に蒸発を防ぐためにラップされたサンプル上にコルク栓を配置します。ニュートラル溶質輸送を研究するために、イオジキサノール槽を配置し、軟骨表面に負に帯電した溶質輸送場所のイオキサグレートバスを研究します。
2.画像撮影・画像処理
- マイクロCTの電動ステージに取り付けられた特注ホルダにコルク栓を用いて単離し包まれたサンプルを置きます。置きトン彼は、造影剤溶液で覆われた軟骨表面が上を向いているように、試料。
- マイクロCT（40×40×40μmの3のボクセルサイズ、2分のスキャン時間、90キロボルトの管電圧及び180μAの管電流）軟骨、軟骨下プレートからなる視野を使用してスキャンし、finite-平衡状態（48時間）までのいくつかの時点で浴（ 図2A）に到達します。濃度値が時間とともに変化していない時に平衡状態が達成されます。
- メーカーのソフトウェアを使用して、関心領域（ROI）（ 例えば、分析）の位置決めを容易にするために、最初の画像に基づいて、異なる時点で3D画像を登録します。
- 変換した3Dは、メーカーのソフトウェアを使用して、それらを処理する前に、2Dタグイメージファイル形式（TIFF）スタックにマイクロCT画像を再構成します。
- グローバルセグメント（ImageJの>調整>閾値）軟骨下骨と上から軟骨ソフトウェアのバスタブに横たわっ。
- 前のステップで生成された軟骨のマスクを用いて（ImageJの>>測定分析）異なる時点での軟骨の平均グレー値を得ます。
- 軟骨における初期浴濃度と初期の造影剤濃度を与えられ、溶質の実際の濃度を平均グレー値を変換するために、線形較正曲線を使用します。以前のデータは、グレー値が造影剤の濃度と線形関係を維持することをサポートします。
- 実験の時点対溶質濃度をプロットします。
3.計算モデル
注：この問題に拡散実験境界条件に準拠し、（z軸に沿って）1Dに起こると仮定されます。したがって、ジオメトリが任意に作成することができます。
- 有限風呂に基づく軟骨マルチゾーンモデルを構築する：1）軟骨表面的なゾーンから成ります （全軟骨厚さの20％）、中間ゾーン（全軟骨厚さの50％）と深いゾーン（全軟骨厚さの30％）12とFEBio 13、14（ 図2Bの2）有限浴）。
- FEBioでの軟骨および浴の異なるゾーンの機械的および物理的特性を割り当てます。ヤング率（10 MPa）を上層浴によって及ぼされる浸透圧に抵抗し、従って、過度の変形から軟骨を保護するのに十分高いと仮定しました。
- 10 -3 mmでの透水率を使用して4 / Nsとシミュレーション8浴の0使用実際の溶質の拡散係数のポアソン比、9。
- メッシュを生成する（8ノードトリリニアの六面体エレメント）との境界（ 図2B）の近くに絞り込みますクラス= "外部参照"> 8、9。
- 二相性-溶質モデル
- バスとそれに対応する有効圧力に初期溶質濃度を適用します。 9有効圧力、15の説明を見てください。
- 異なる軟骨ゾーンにおいて所定の拡散係数に応じて時間曲線に対する溶質濃度を得るために過渡モードでモデルを実行します。
- 多相モデル
注：お風呂と組織との間の電気的な変動にはバスタブと組織の両方に2価の対イオンを加えることによって回避することができます。- 定常状態モデルの場合：その所望の値にFCDを増加させながら、軟骨および上層浴中で同じ有効流体圧力および濃度を使用します。
- 過渡モデルの場合：十分に高い浴中の溶質の拡散係数を維持することによって、よく攪拌有限風呂を作成します。注射します浴中に浴 - 空気界面からの溶質は、所望の濃度値に到達します。
- 過渡：前のステップにおける所定の溶質濃度の境界条件を除去し、その実際の拡散係数に有限浴の拡散係数を元に戻します。
- 異なる軟骨ゾーンに適用FirstClassディレクトリサービスと拡散係数に基づいて溶質濃度 - 時間曲線を得るために、モデルを実行します。
- FEBio、MATLABインターフェイス
- 自動的FEBioプロット濃度-時間曲線（FEBio-MATLABインタフェース）8、9でシミュレーションを実行するためにMATLABコードを開発。
- FEBio-MATLABインターフェイスを使用して、軟骨ゾーンの拡散係数とFirstClassディレクトリサービスを変更します。 FEBioでモデルを実行し、溶質濃度-時間曲線8,9を抽出します。
- 実験で得られた溶質濃度 - 時間曲線の比較データおよび平均二乗誤差最小のルートに基づいて、異なる軟骨ゾーンで拡散係数とFirstClassディレクトリサービスのセットを得る（RMSE）8、9。
図1： 実験セットアップ。 A）カスタムメイドのドリルビットを使用してサンプル抽出手順。 B）マイクロCTイメージング手順は、拡散プロセスを監視します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 回路図。A）実験計画。有限浴、表層、中間及び軟骨と関連メッシュの深い領域からなるB）マルチゾーン計算モデル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Representative Results
ここで提供される代表的な結果は、以前の研究論文6、8、9、16から採用されています。
OAは、関節軟骨は有意な変化最も重要なGAGの損失、及びコラーゲン線維の損傷17、18、19を受けます。これらの変更は、関節軟骨20、21を介して溶質の拡散挙動に影響を与える可能性があります。我々は、マイクロCTを用いて死体ウマ骨軟骨プラグでは、軸2ヨウ素化造影剤の拡散、 すなわちイオジキサノール（電荷= 0）、イオキサグレート（電荷= -1）を研究しました。中性溶質（イオジキサノール）、二相性-溶質モデルと荷電ソルの拡散プロセスを定量化します TE（イオキサグレート）多相モデルは、軟骨の帯状構造を考えFEBioに開発されました。二相性-溶質および多相モデルは、関節軟骨を横断イオジキサノール及びイオキサグレートの拡散（ 図3）を予測することができました。これらのモデルは9、8つの異なる軟骨ゾーンに取得イオジキサノール（二相性-溶質）と拡散係数の拡散係数、ならびにFCD（イオキサグレート）を可能にしました。
図3： 計算的データ曲線嵌合。実験データ及び実験データ（シンボル対B）の破線の多相モデルフィット（））8,9対破線A）マルチゾーン二相性-溶質（）。：//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちは、関節軟骨全体で中性および充電溶質の拡散を研究するために、有限要素モデリング手法と組み合わせて実験プロトコルを提示しました。私たちの最近の研究によると、提案されたモデルは、正確に関節軟骨8、9の異なるゾーン間ニュートラル（二相性-溶質）の両方の輸送と負に帯電した（多相）溶質を記述することができます。広く、関節軟骨が機能OA進行21、22、23、24中にこのような負に荷電したGAG巨大分子としての重要な成分の損失ならびにコラーゲン線維を介して制限されるようになると考えられています。本研究で提案された技術を使用して、1は、潜在的に関節軟骨の健全性を調べることができます。ニュートラル溶質の輸送は、OA primarに増補することができます ILYが低いため、溶質の間の相互作用と同様のGAG及びコラーゲンの。一方、負に帯電した溶質の輸送ことによりOAの進行のレベルのいくつかの指標を与え、プロテオグリカンの固定電荷の濃度に関する情報を取得助けることができます。
以前の研究によると、有限浴概念の出現に基づいて開発された二相性-溶質および多相モデルは、関節軟骨の帯状の特性の正確な推定を提供することができたことにより、プラットフォームとしての役割を果たすことができました。造影剤の大浴場、すなわち可能なビーム硬化アーチファクト、及び軟骨7、関節ために単一の拡散係数を割り当てる、20、25、26、27、28、に関連する制限小娘=「外部参照」> 29、30は、現在の研究を発展させる動機を運転しました。将来のOAの研究では、私たちの開発したモデルは、潜在的に早期OA診断用のアプリケーションを見つけるかもしれません。
実験と計算シミュレーションの両方で必要ないくつかの重要なステップがあります。実験中の軟骨の整合性を維持するためには、その後の酵素の活動を防ぐために、プロテアーゼ阻害剤の十分な量を加えることが必要となります。以上の実験のために一つのサンプルを用いた場合には、平衡化後に貫通溶質のためのウォッシュアウト時間は約48時間でした。ウォッシュアウトの効率は、マイクロCTを使用してチェックする必要があります。馬軟骨を採用し、当社のセットを使用する場合は、無限の風呂に上層のバスと同等の最小体積は、軟骨の量の5倍と計算されました。また、拡散の有限要素モデリングを行うためには、実際の溶質拡散coefficを適用することが重要ですそれからの偏差以来浴中のientは転帰に影響を与える可能性があります。
基礎となる有限要素モデルでは、溶質サイズ効果は実装されていなかったので、勉強することができませんでした。私たちの提案する有限浴モデル、すなわち、より適切な関節の関節に拡散プロセスを理解し、いくつかの利点を提供し、ビームハードニングアーチファクトを減らします。実験と計算モデルを組み合わせた提案手法は、正に帯電した造影剤が適用される場合、軟骨の拡散属性を精査できます。お風呂での実際の溶質拡散係数の知識はそれを大幅に関節軟骨間で得られた拡散係数の精度に影響を与える可能性があるとして、非常に重要であると考えられます。これは、実験浴の拡散係数を求めるか、または容易に使用文献値のいずれかを必要とするであろう。
結論として、私たちは実験からなる一般的なプロトコルを提案し、計算関節軟骨全体に充電し、非荷電溶質の輸送を調査します。プロトコルを使用し、一方は正常拡散係数と異なる軟骨層に固定された荷電密度を得ることができます。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、骨軟骨プラグのラッピング過程で彼らの助けのためにUMCユトレヒトでの開発力学グループから氏のJeroenファンデンベルク氏Matthijs Wassinkに感謝の意を表したいと思います。この作品は、オランダの関節炎財団からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negatively-charged contrast agent |
| Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Nuetral contrast agent |
| PBS (Phosphate-buffered Saline) | Life technologies | 10010023 | Medium |
| micro-CT | Perkin Elmer | Monitoring diffusion | |
| Freezing-point osmometer | Advanced instruments | Measuring solution osmolality |
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