Summary
우리는 최근에 개발 된 실험 및 수치 방법의 도움으로 관절 연골에서 충전 및 충전되지 않은 분자의 이동을 조사하기위한 프로토콜을 제안한다.
Abstract
골관절염 (OA)은 관절 연골과 연골 하골의 변성과 연관된 쇠약하게하는 질병이다. 그것은 상당한 화학적 열화, 즉 손실 프로테오글리칸 및 콜라겐 브릴 중단을 경험으로 관절 연골의 변성이 실질적으로 그 하중 기능을 손상시킨다. OA에서 화학적 손상 메커니즘을 조사하는 한 유망한 방법은 외부 용질에 연골 표본을 노출하고, 분자의 확산을 모니터하는 것입니다. 건강한 연골에 비해 상이한 확산 특성을 생성 관절 연골을 가로 질러 이동하는 동안 연골 손상 (즉, 농도 및 고분자 필수 구성)의 정도는 외부 용질 충돌하는 에너지 손실과 관련된다. 이 연구에서 우리는 몇 가지 단계로 구성되어 있으며 이전에 개발 된 실험 마이크로-C를 기반으로하는 프로토콜을 소개14px; "> omputed T omography (마이크로 CT) 및 유한 요소 모델링 제 이상성-용질 확산 계수를 얻기 다상 유한 요소 모델에 적용함으로써 뒤에 마이크로 CT를 사용하여 기록되어 충전 및 비 대전 요오드 분자의 수송. 연골 영역에 걸쳐 전하 밀도를 고정.
Introduction
분자 수송 관절 형 조인트의 항상성에 중요한 역할을하는 관절 치료제의 전달 연골 및 연골 조영 증강 영상 1, 2, 3. 이러한 연골 통합 intactness, 용질의 전하 및 크기뿐만 아니라 삼투압 및 전송 레이트 4, 5, 6에 영향을 미칠 수있는 연골 접촉 욕의 농도 요소. 각 영역은 다른 농도의 주요 세포 외 매트릭스 분자의 배향으로 구성되어 있기 때문에 중성 또는 충전 중 용질의 수송은, 관절 연골 영역과 상이 할 수있다, 즉, 프로테오글리칸 (PG를) 콜라겐 타입 II (1), 7, 8, 9,아가씨 = "외부 참조"> 10, 11. 더 중요한 것은, 충전 용질의 수송은 관절 연골 (8, 9)에 걸쳐 증가 외 매트릭스 내에 고정 된 네거티브 전하를 포함 프로테오글리칸의 농도에 크게 의존 할 수있다. 골관절염 (OA)가되어 연골 걸쳐 확산 연구의 중요성을 나타내는, 진행됨에 따라 이러한 매개 변수, 특히 고정 된 전하 밀도 (FCD)는 콜라겐 원 섬유 연골 전체 수분 함량의 변화의 방향은 변화를 거칠 수있다.
현재의 연구에서, 프로토콜은 6, 8, 9, 정확하게 확산의 유한 목욕 모델에서 중립 및 충전 용질을 사용하여 다양한 경계 조건에서 확산을 조사하기 위해 제안 이전에 설정된 실험 및 전산 연구를 기반으로. 티그 방법은 연골 및 고급 이상성-용질 다상 유한 요소 모델에 의해지지되는 유한 욕조를 포함하는 시스템의 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 영상 (마이크로 CT)으로 구성되어 제안. 이러한 모델은 관절 연골의 다양한 영역에 걸쳐 중성 및 하전 분자뿐만 아니라 FCDs의 확산 계수를 취득 할 수 있습니다. 이 모델을 사용하여, 하나는 연골 및 오버레이 유한 화장실 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 확산 중립 및 충전 분자의 행동의 더 나은 이해를 얻을 수 있습니다.
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Protocol
참고 : 여기에 제시된 프로토콜은 최근의 연구 논문 6, 8, 9의 실험과 계산 과정에서 채택된다. 이 프로토콜은도 1에 도시되어있다.
사체 자료는 위트레흐트 대학의 수의학 교수의 허가를 수집 하였다.
1. 시료와 욕제
- 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)를 분사하면서 과열 이후 연골의 손상을 방지하기 위해 맞춤 제작 드릴 비트 (도 1)를 이용하여 사후 말 대퇴골로부터 원통 골 연골 플러그 (8.5 mm의 직경) 밖으로 드릴.
- 오버레이 욕의 측면 확산을 최소화하기 위해 슬리브를 수축 플라스틱으로 골 연골 플러그 열 수축.
- 일에서 연골과 골 연골 플러그를 장착E는 플라스틱 슬리브 내부 수축 초기 상단과 열풍을 불어 따른다. 열 관련 손상을 방지하기 위해 연골의 표면에 젖은면 조각을 추가합니다.
- 별도 부과 (예를 들어, 650 μL, 420 mm의 ioxaglate, 분자량 (Mw) = 1,269 다 충전 = -1) 및 중성 (650 μL, 420 mm의 iodixanol, MW = 1,550 다) 용질 유한 화장실을 준비한다.
- 주사기를 사용하여 연골의 표면에 제조 유한 화장실로드 및 RT (도 2A)에서 실험 동안에 증발을 방지하기 위해, 랩 샘플에 코르크 마개를 배치했다. 중립 용질 수송을 연구하기 위해, iodixanol 목욕을 배치하고 연골 표면에 음전하를 띤 용질 수송 장소 ioxaglate 목욕을 연구.
2. 이미징 및 이미지 처리
- 마이크로 CT의 모터 구동 스테이지에 장착 주문품 홀더에 코르크 마개로 감싸 절연 샘플을 놓는다. 장소 t그 때문에 조영제 용액 위를 향하고 덮여 그 연골 표면을 샘플링.
- 마이크로 CT (40 × 40 × 40 μm의 3 복셀의 크기가 2 분의 주사 시간을 90 kV로의 관전압 180 μA의 관전류) 연골 연골 판 구성된 시야를 사용하여 검색하고,의 유한 평형 상태 (48 시간)까지 여러 시점에서의 조를 (도 2A)에 도달한다. 농도 값이 시간에 따라 변화하지 않는 경우에 평형 상태가 달성된다.
- 제조업체의 소프트웨어를 사용하여 관심 (ROI)의 지역의 위치를 용이하게하기 위해 초기 이미지에 따라 서로 다른 시점에서 3D 이미지를 등록합니다 (예를 들어, 분석).
- 변환 3 차원 제조 업체의 소프트웨어를 사용하여 처리하기 전에 2D 태그가 지정된 이미지 파일 형식 (TIFF) 스택에 마이크로 CT 영상을 재구성.
- 글로벌 세그먼트 (ImageJ에> 조정> 임계치) 연골 하골 이상에서 연골소프트웨어에서 목욕을 거짓말.
- 상이한 시점에서 연골의 평균 그레이 값을 구하는 이전 단계에서 생성 된 연골 마스크를 사용하여 (은 ImageJ에>> 측정 분석).
- 연골의 초기 욕 농도 및 초기 조영제 농도 주어 용질의 실제 농도 평균 그레이 값을 변환하는 선형 보정 곡선을 사용한다. 이전의 데이터는 그레이 값 조영제의 농도를 갖는 선형 관계를 유지한다는 사실을지지한다.
- 실험 시점에 비해 용질 농도를 플롯.
3. 전산 모델링
주 :이 문제의 확산은 실험 경계 조건을 준수 (Z 축을 따라) (1D)에서 일어나는 것으로한다. 따라서, 형상 임의로 생성 할 수 있습니다.
- 유한 목욕을 기반으로 연골 멀티 존 모델을 구축 : 1) 연골 표면 영역으로 구성 (전체 연골 두께의 20 %), 중간 영역 (전체 연골 두께의 50 %)과 깊은 영역 (전체 연골 두께의 30 %) 12 FEBio 13, 14 (도 2b 2) 유한 욕).
- FEBio에서 연골 및 목욕의 서로 다른 영역의 기계적 및 물리적 특성을 할당합니다. 영률 (MPa의 10)이 상부로 조 작용 삼투압 레지스트 따라서 과도한 변형에서 연골을 보호하기에 충분히 높은 것으로 가정 하였다.
- 10-3 mm의 유압 투과도를 사용 4 / Ns를 상기 시뮬레이션 8 욕 0 실제 사용 용질 확산 계수의 포아송 비, 9.
- 메쉬 (8 노드 삼선 육면체 요소)를 생성하고, 경계 근처를 세분화 (도 2B)클래스 = "외부 참조"> 8, 9.
- 바이 페이 - 용질 모델
- 이것에 대응하는 욕조 유효 압력에서 용질의 초기 농도를 적용한다. 15 9에서 유효 압력의 설명을보십시오.
- 다른 연골 영역에 소정의 확산 계수에 따른 시간 곡선 대 용질의 농도를 얻기 위해 과도 모드 모델을 실행.
- 다상 모델
참고 : 욕조와 조직 사이의 전기 변동은 욕조와 조직 모두에 두 가의 반대 이온을 추가하여 우회 할 수 있습니다.- 정상 상태 모델 : 소기 FCD 값을 증가시키면서 연골 상부 욕 동일한 유효 유체 압력 및 농도를 사용한다.
- 과도 모델 : 충분히 높은 욕 중에서의 용질 확산 계수를 유지하여 잘 교반 유한 조를 만든다. 주입목욕 욕조에 공기 인터페이스에서 용질의 농도 소정의 값에 도달한다.
- 과도 : 이전 단계에서 소정의 용질 농도 경계 조건을 제거하고 그것의 실제 확산 계수로 유한 욕의 확산 계수를 되돌릴.
- 연골 다른 영역에 적용 FCDs 및 확산 계수에 기초하여 용질 농도 - 시간 곡선을 획득하기 위해 모델을 실행.
- FEBio - MATLAB 인터페이스
- 자동 FEBio 플롯 농도 - 시간 곡선 (FEBio-MATLAB 인터페이스) (8, 9)에서의 시뮬레이션을 수행하는 MATLAB 코드를 개발한다.
- FEBio - MATLAB 인터페이스를 사용하여 연골 영역에서 확산 계수와 FCDs을 변경합니다. FEBio에서 모델을 실행하고, 용질의 농도 - 시간 곡선 9 8 압축을 풉니 다.
- 실험적으로 얻어진 용질 농도 - 시간 곡선을 비교최소 루트에 따라 다른 연골 영역의 데이터 획득 확산 계수들의 세트 FCDs 제곱 오차 (RMSE) (8, 9)를 의미한다.
그림 1 : 실험 설정. A) 사용자 정의 만든 드릴 비트를 사용하여 샘플 추출 과정. B) 마이크로 CT 이미징 절차 확산 프로세스를 모니터링한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 도식.A) 실험 설계. 유한 목욕, 연골 및 관련 메쉬의 표면, 중간과 깊은 영역으로 구성된 B) 다중 영역 계산 모델. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
여기에 제공된 대표적인 결과는 이전의 연구 논문 6, 8, 9, 16에서 채택된다.
OA에서 관절 연골은 큰 변화 가장 중요한 GAG 손실 및 콜라겐 원 섬유 손상 17, 18, 19을 겪는다. 이러한 변화는 관절 연골 (20), (21)를 통해 용질의 확산 행동에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 두 축 요오드화 조영제의 확산, 즉 iodixanol (전하 = 0)과 ioxaglate 공부 (전하 = -1), 마이크로 CT를 이용하여 말 사체 골 연골 플러그이다. 중립 용질 (iodixanol) 이상성-용질 모델 충전 SOLU의 확산 처리를 정량화 TE (ioxaglate) 다상 모델은 연골의 띠 구조를 고려 FEBio 개발되었다. 이상성 (biphasic) - 용질 및 다상 모델은 (그림 3) iodixanol의 확산을 예측하고 관절 연골에 걸쳐 ioxaglate 수 있습니다. 이 모델은 다른 영역 연골 8 9 iodixanol (이상성-용질)과 확산 계수의 확산 계수뿐만 아니라 FCD (ioxaglate)를 얻는 활성화.
도 3 : 계산식 데이터 커브 끼워. 실험 데이터 및 실험 데이터 (심볼 대 B) 점선 다상 모델 근사화 ()) 8, 9 대 점선 A) 멀티 - 존 이상성 용질 ().: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 관절 연골에서 중립 및 충전 용질의 확산을 연구하기 위해 유한 요소 모델링 절차와 결합 된 실험 프로토콜을 제시 하였다. 우리의 최근 연구에 따르면, 제안 된 모델은 정확하게 관절 연골 8, 9의 서로 다른 영역에서 중립 (이상성 - 용질) 모두의 전송 및 음전하 (다상) 용질을 설명 할 수있다. 널리 관절 연골이 기능적으로 같은 OA 진행 21, 22, 23, 24 중 음전하를 띤 GAG의 거대 분자뿐만 아니라 콜라겐 원 섬유로의 중요한 구성 요소의 손익으로 제한된다 것으로 생각된다. 본 연구에서 제안 된 기술을 사용하여, 하나는 잠재적으로 관절 연골의 건강 함을 검사 할 수 있습니다. 중성 용질의 수송은 OA의 PRIMAR에서 증강 될 수있다 ILY 때문에 낮은 용질 사이의 상호 작용뿐만 아니라 개그와 콜라겐의. 반면에, 음으로 하전 된 용질의 수송함으로써 OA 진행의 수준의 어떤 표시를 제공 테오의 고정 전하의 농도에 대한 정보를 얻을 수 있도록 할 수있다.
개발 이전의 연구에 따라 유한 목욕 개념의 출현을 기반으로 한 이상성 - 용질 및 다상 모델은 관절 연골의 동서 특성의 정확한 추정이 제공 할 수있는 플랫폼 역할을 할 수있다. 조영제, 대형 목욕탕과 관련된 제한 즉 가능한 광 경화성 아티팩트 연골 7, 20, 25, 26, 27, 28 관절하는 단일 확산 계수를 할당> 29 아가씨 = "외부 참조는"(30)는 현재 연구 개발 동기를 몰았다. 미래 OA 조사에서, 우리의 개발 모델은 잠재적으로 조기 OA 진단을위한 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다.
실험과 전산 시뮬레이션에 모두 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 실험 기간 동안 연골의 무결성을 유지하기 위해, 하나는 이후의 효소 활동을 방지하기 위해 단백질 분해 효소 억제제의 충분한 양의 추가가 필요. 이상의 실험을 위해 하나 개의 샘플을 사용하는 경우, 평형화 후 투과 용질에 대한 워시 아웃 시간은 약 48 시간이었다. 워시 아웃 효율 마이크로 CT를 이용하여 체크 할 필요가있다. 말 연골을 이용하는 우리 세트를 사용하는 경우, 무한 욕조로 상부 조 상당의 최소 부피 연골 용적의 5 배 이상으로 계산되었다. 또한, 확산의 유한 요소 모델링을 수행하기 위해서는, 실제의 용질 확산 코픽을 적용하는 것이 중요그 편차 이후 목욕 ient는 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.
기본 유한 요소 모델에서, 용질의 크기 효과가 구현되지 않았으며, 따라서 공부를 할 수 없습니다. 우리의 제안 유한 목욕 모델은 몇 가지 장점, 즉 더 적절 관절 관절에 대한 이해 확산 프로세스 및 감소 빔 경화 인공물을 제공합니다. 양으로 하전 된 조영제이 적용될 때 실험과 전산 모델을 결합 우리의 제안 된 기술은 연골의 확산 특성을 자세히 조사 할 수 있습니다. 목욕 실제 용질의 확산 계수의 지식은 크게 관절 연골에서 얻어진 확산 계수의 정확도에 영향을 미칠 수있는 중요한 것 같다. 이것은 실험적 욕의 확산 계수를 취득하거나 즉시 사용 문헌 값 중 어느 하나를 요구한다.
결론적으로, 우리는 실험로 구성되는 일반 프로토콜을 제안계산은 관절 연골에서 충전 및 충전되지 않은 용질의 이동을 조사합니다. 프로토콜을 사용하여, 하나는 성공적 연골 다른 층에서 확산 계수와 고정 된 충전 밀도를 얻을 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 골 연골 플러그의 과정을 포장에있는 그들의 도움을 UMC 위트레흐트에서 개발 역학 그룹에서 씨 제론 반 덴 베르그 씨 Matthijs Wassink 그들의 감사의 말씀을드립니다. 이 작품은 네덜란드 관절염 재단에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negatively-charged contrast agent |
| Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Nuetral contrast agent |
| PBS (Phosphate-buffered Saline) | Life technologies | 10010023 | Medium |
| micro-CT | Perkin Elmer | Monitoring diffusion | |
| Freezing-point osmometer | Advanced instruments | Measuring solution osmolality |
References
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