En eksperimentell og Finite Element-protokollen for å undersøke Transport av nøytrale og siktet Oppløste stoffer over Leddbrusk

Summary

Vi foreslår en protokoll for å undersøke transporten av ladede og uladede molekyler på tvers av leddbrusk ved hjelp av nylig utviklede eksperimentelle og numeriske metoder.

Abstract

Osteoartritt (OA) er en ødeleggende sykdom som er assosiert med degenerering av leddbrusk og subkondrale ben. Degenerering av leddbrusk svekker dets lastbærende funksjon i det vesentlige som den opplever enorm kjemisk nedbrytning, det vil si proteoglykan og kollagen tap fibril avbrudd. En lovende måte å undersøke kjemiske skademekanismer i løpet av OA er å eksponere brusk prøvene til en ekstern oppløst stoff og overvåke diffusjon av molekyler. Graden av bruskskader (dvs. konsentrasjon og konfigurasjon av essensielle makromolekyler) er forbundet med kollisjonsenergi tap av ytre oppløselige forbindelser mens flytter over leddbrusk gir forskjellige diffusjonsegenskaper i forhold til frisk brusk. I denne studien, introduseres en protokoll, som består av flere trinn og er basert på tidligere utviklet eksperimentell mikro-C14 piksler; "> omputed T omography (mikro-CT) og endelig elementmodellering for transport av ladede og uladede joderte molekyler er først registrert ved hjelp av mikro-CT, som blir fulgt ved å anvende to-fase-oppløst stoff og multifaset endelig-element-modeller for å oppnå diffusjonskoeffisienter. og faste ladningstettheter på tvers av brusk soner.

Introduction

Molekyl transport spiller en vital rolle i homeostasen av artikulerte ledd, levering av terapeutiske midler til leddbrusk og kontrastforsterket avbildning brusk ^{1, 2, 3.} Faktorer som brusk integrasjon og intakthet, oppløst stoff ladning og størrelse, så vel som osmolalitet og konsentrasjon av badet i kontakt med brusk kan påvirke transporthastigheten ^{4, 5, 6.} Transporten av de oppløste stoffer, enten nøytrale eller ladede, kan være forskjellig mellom leddbrusk soner, fordi hver sone består av forskjellige konsentrasjoner og orienteringer av store ekstracellulære matriks-molekyler, nemlig proteoglykaner (PG-er) og kollagen type ^{II-1, 7, 8, 9,}lass = "ekstern referanse"> ^{10, 11.} Enda viktigere, kan transporten av ladede oppløste stoffer være sterkt avhengig av konsentrasjonen av proteoglykaner som omfatter negative faste ladninger i den ekstracellulære matriks som øker på tvers av leddbrusk ^{8, 9.} Disse parametrene særlig fast ladningstetthet (FCD), kan orienteringen av kollagenfibriller og vanninnhold variasjon på tvers av brusk gjennomgå forandringer som osteoartritt (OA) skrider frem, og derved betegner viktigheten av å studere diffusjon over brusk.

I denne studien, en protokoll basert på tidligere etablerte eksperimentelle studier og beregnings ^{6, 8, 9} er foreslått for nøyaktig å undersøke diffusjon under forskjellige grensebetingelser ved bruk av nøytrale og ladede stoffer i en endelig-bad modell av diffusjon. THan foreslo metoder er sammensatt av mikro-Computed Tomography bildebehandling (mikro-CT) til et system med brusk og en endelig-bad med avansert bifasisk-oppløst stoff og multifaset endelig-element-modeller. Disse modellene gjør det mulig å oppnå de diffusjonskoeffisientene nøytrale og ladede molekyler, så vel som FCDs på tvers av ulike soner av leddbrusk. Ved hjelp av disse modellene, kan man få bedre forståelse av oppførselen til Diffuseranordningen nøytrale og ladede molekyler som kan brukes til å undersøke samspillet mellom brusk og overliggende endelig-bad.

Protocol

MERK: Protokollen som presenteres her er adoptert fra de eksperimentelle og beregningsprosedyrer av nyere forskningsrapporter ^{6, 8, 9.} Protokollen er illustrert i figur 1.

De avdød materialene ble samlet inn med tillatelse fra veterinær fakultet Utrecht University.

1. Prøve og Bath Preparat

1. Bore ut sylindriske osteokondrale plugger (diameter 8,5 mm) fra kadaver equine femurkondyler ved hjelp av spesiallagde borekrone (figur 1) under sprøyting av kul fosfatbufret saltvann (PBS) for å hindre overoppvarming og påfølgende bruskskader.
2. Krympe de osteokondrale pluggene med en plastkrympehylse for å minimalisere den sideveis spredning av det overliggende bad.
   1. Monter osteochondral pluggen med brusk på the topp innledningsvis inne i plasten krymper hylsen og følger ved å blåse varm luft til det. Legg våte bomulls stykker på overflaten av brusk for å hindre varmerelatert skade.
3. Forbered endelig-badene i belastet (f.eks, 650 ul, 420 mM, ioxaglate, molekylvekt (MW) = 1269 Da, sats = -1) og nøytrale (650 ul, 420 mM, iodixanol, MW = 1550 Da) oppløste stoffer separat.
4. Laste de fremstilte endelig-bad på overflaten av brusken ved hjelp av en sprøyte og plassere en kork plugg på den innpakkede prove for å forhindre fordampning under eksperimenter ved RT (figur 2A). For å studere den nøytrale oppløste stoff transport, plasserer iodixanol badet og for å studere den negativt ladede oppløsningsmaterialet transport sted ioxaglate bad på bruskoverflaten.

2. Imaging og bildebehandling

1. Plasser de viklede prøvene isolert med kork plugg på en skreddersydd holder festet til den motoriserte trinn av en mikro-CT. Place than prøve slik at bruskoverflaten dekket med kontrastmiddeloppløsning er vendt oppover.
2. Skanne ved hjelp av mikro-CT (voxel størrelse på 40 x 40 x 40 um ^3, skanning av 2 min, rørspenning på 90 kV og rør strøm på 180 uA) et synsfelt som består av brusk, subkondrale plate, og finite- bad i flere tidspunkter inntil likevektstilstanden (48 h) nås (figur 2A). Den likevektstilstand oppnås når konsentrasjonsverdier ikke endrer seg over tid.
3. Registrere 3D-bilder i forskjellige tidspunkter basert på den opprinnelige bildet for å lette plassering av det aktuelle området (ROI) ved hjelp av produsentens programvare (f.eks Analyse).
4. Konverter 3D rekonstruert mikro-CT-bilder i 2D Tagged Image File Format (TIFF) stack før du behandler dem ved hjelp av produsentens programvare.
5. Globalt segment (ImageJ> Juster> terskel) brusken fra det subkondrale ben og i løpetliggende bad i programvaren.
6. Gjennomsnittet gråverdien av brusk ved forskjellige tidspunkter (ImageJ> Analyse> Measure) ved hjelp av den genererte brusk masken i det foregående trinn.
7. Gitt den innledende badkonsentrasjonen og utgangskontrastmiddelkonsentrasjon i brusken, bruke en lineær kalibreringskurve for å omdanne de gjennomsnittlige gråverdiene til den aktuelle konsentrasjon av oppløste stoffer. Tidligere data understøtter det faktum at gråverdier opprettholde et lineært forhold til konsentrasjonen av kontrastmidler.
8. Plotte oppløste konsentrasjon versus eksperimentell tidspunkter.

3. Computational modellering

MERK: diffusjon i dette problemet antas å finne sted i 1D (langs z-aksen), som er i samsvar med den eksperimentelle grensebetingelsen. Derfor kan geometrien vilkårlig opprettet.

1. Bygge endelig-bad basert brusk flersone modeller: 1) som består av brusk overfladisk sonen (20% av den totale brusk tykkelse), midtre sone (50% av den totale brusk tykkelse) og dyp sone (30% av den totale brusk tykkelse) ¹² og 2) endelig-bad i FEBio ^{13, 14} (figur 2B).
2. Tilordne de mekaniske og fysiske egenskaper til ulike soner av brusk og bad i FEBio. Youngs modul (10 MPa) ble antatt å være høy nok til å motstå det osmotiske trykk som utøves av den overliggende bad, og den vil derfor beskytte brusk fra store deformasjoner.
   1. Bruke en hydraulisk permeabilitet på 10 ^-3 mm ⁴ / Ns og Poissons tall fra 0. Bruk selve oppløst stoff diffusjonskoeffisienten av badet i simuleringene ^{8, 9.}
3. Generer masken (8-node trelineær Sekskantelementer), og raffinere det nær grensene (figur 2B)class = "ekstern referanse"> ^{8, 9.}
4. Bifasisk-oppløst stoff modell
   1. Påfør innledende konsentrasjon av oppløste stoffer i badet og effektive trykk som svarer til den. Se på beskrivelsen av effektive trykk i ^{9, 15.}
   2. Kjøre modellen i transient-modus for å oppnå oppløst stoff-konsentrasjon mot tid-kurver i henhold til de foreskrevne diffusjonskoeffisientene i ulike soner brusk.
5. multiphasic modell
   NB: Den elektriske svingninger mellom bad og vev kan omgås ved å legge til to monovalente motionene til både badet og vev.
   1. For steady-state-modeller: å bruke de samme effektive fluidtrykk og konsentrasjoner i brusk og overliggende bad samtidig som det øker FCD til sin ønskede verdi.
   2. For transiente modeller: opprette en godt omrørt endelig-bad ved å holde det oppløste stoffet diffusjonskoeffisient i badet tilstrekkelig høy. injisereoppløst materiale fra badet-luftgrensesnitt inn i badet for å oppnå den ønskede konsentrasjon verdi.
   3. Transient: fjerne den foreskrevne konsentrasjon av oppløste stoffer grensebetingelse i det foregående trinn og tilbake diffusjonskoeffisienten for den endelig-bad til dens aktuelle diffusjonskoeffisient.
   4. Kjøre modellen for å oppnå oppløst stoff konsentrasjon-tidskurver basert på anvendt FCDs og diffusjonskoeffisienter i ulike soner brusk.
6. FEBio-MATLAB grensesnitt
   1. Utvikle en MATLAB kode til automatisk å utføre simulering i FEBio og plottet konsentrasjons-tidskurvene (FEBio-MATLAB grensesnitt) ^{8, 9.}
   2. Endre Diffusjonskoeffisientene og FCDs i brusk soner ved hjelp FEBio-MATLAB grensesnitt. Drevne modeller i FEBio og ekstrahere løsningskonsentrasjon-tidskurver ^{8, 9.}
   3. Sammenligne de oppnådde oppløste konsentrasjon-tidskurver med den eksperimentelledata og få sett av diffusjonskoeffisienter og FCDs i ulike brusksoner basert på minimum root mean square error (RMSE) ^{8, 9.}

Figur 1: Forsøksoppsett. A) Prøve ekstraksjon prosedyre ved bruk av et skreddersydd borkronen. B) Mikro-CT-avbildningsprosedyre for å overvåke diffusjonsprosess. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Skjematisk.A) Eksperimentell design. B) flere soner modell som består av den endelige bad, overfladiske, midtre og dype soner av brusk og tilhørende mesh. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

De representative resultatene gitt her er adoptert fra tidligere forskningsrapporter ^{6, 8, 9, 16.}

I OA, gjennomgår leddbrusk vesentlige endringer viktigst GAG tap, og collagen fibril skade ^{17, 18, 19.} Disse endringene kan påvirke diffusive oppførselen løste stoffer gjennom leddbrusk ^{20, 21.} Vi studerte aksiell spredning av to joderte kontrastmidler, det vil si iodixanol (sats = 0) og ioxaglate (sats = -1), i avdød equine osteokondrale plugger ved hjelp av mikro-CT. For å kvantifisere diffusjonsprosessen av et nøytralt oppløst stoff (iodixanol), en bifasisk og oppløst materiale modell og en ladet oppløse te (ioxaglate) multiphasic modell ble utviklet i FEBio den som betraktes som den sonevise oppbyggingen av brusk. Tofase-oppløste stoff og multifaset modeller kan forutsi diffusjon av iodixanol og ioxaglate på tvers av leddbrusk (figur 3). Disse modellene aktivert skaffe diffusjonskoeffisienten av iodixanol (bifasisk-oppløste stoffer) og diffusjonskoeffisienten samt FCD (ioxaglate) i forskjellige brusk sonene ^{8, 9.}

Figur 3: beregningsmessig kurve-tilpasset data. A) flere soner bifase-oppløst materiale (stiplet) mot eksperimentelle data og B) multifaset modeller anfall (stiplede) som funksjon av eksperimentelle data (symbol) ^{8, 9.}: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi presentert en eksperimentell protokoll kombinert med en endelig elementmodellering fremgangsmåte for å studere diffusjon av nøytrale og ladede oppløste stoffer på tvers av leddbrusk. Ifølge våre nyere studier, kan de foreslåtte modellene nøyaktig beskrive transport av både nøytral (bifasisk-oppløst stoff) og negativt ladede (av multi) oppløsninger på tvers av ulike soner av leddbrusk ^{8, 9.} Det er derfor antatt at leddbrusken blir funksjonsmessig begrenses gjennom tap av dens vitale komponenter slik som negativt ladede GAG makromolekyler så vel som kollagenfibriller i løpet OA progresjon ^{21, 22, 23, 24.} Ved hjelp av teknikken foreslått i denne studien, kan man potensielt undersøke sunnhet av leddbrusk. Transporten av nøytrale oppløste produktet kan bli utvidet i OA fyller ily på grunn av lavere interaksjoner mellom det løste stoff samt GAG og kollagener. På den annen side, kan transporten av negativt ladede oppløste stoffer hjelp skaffe informasjon med hensyn til konsentrasjonen av faste ladninger til proteoglykaner, og dermed gi en viss indikasjon på nivået av OA progresjon.

Den bifasisk-oppløst stoff og av multi-modeller som ble utviklet på grunnlag av fremveksten av endelig-bad konsept i henhold til tidligere studier kan tjene som plattform der nøyaktig estimering av sone egenskaper av leddbrusk kan bli gitt. Begrensninger forbundet med store bad av kontrastmidler, nemlig mulig bjelke-herdende gjenstander, og å tildele en enkelt diffusjonskoeffisienten artikulær brusk ^{7, 20, 25, 26, 27, 28,}lass = "xref"> ^{29, 30} kjørte motivasjon til å utvikle den aktuelle studien. I fremtiden OA forskning, kan våre utviklede modeller potensielt finne programmer for tidlig OA diagnose.

Det er noen viktige skritt som kreves både i eksperimenter og datasimuleringer. For å bevare brusk integritet under eksperimenter, ville man kreve tilsetning av tilstrekkelige mengder av protease-inhibitorer for å hindre etterfølgende enzymatiske aktiviteter. Ved hjelp av en prøve for mer enn ett eksperiment, utvasking tid for de penetrerte oppløste stoffer etter likevekt var omtrent 48 timer. Utvaskings effektivitet må kontrolleres ved hjelp av mikro-CT. Ved bruk av vår satt opp ansette hest brusk ble minimumsvolum av den overliggende bad tilsvarer en uendelig bad beregnet til å være fem ganger høyere enn brusk volum. Dessuten, for å utføre endelig element modellering av diffusjon, er det avgjørende å anvende selve oppløst stoff diffusjon coefficient i badekaret siden avvik fra det som kan påvirke resultatene.

I de underliggende elementmodeller, ble løst stoff størrelseseffekt ikke gjennomføres, og derfor ikke kunne bli studert. Vår innretning finite-bad modell gir noen fordeler, nemlig forståelse diffusjonsprosess i bevegelig ledd mer hensiktsmessig, og redusere artefakter. Vår foreslåtte teknikk kombinere eksperimenter og beregningsmodeller muliggjør saumfarer diffusjon attributter av brusk når positivt ladede kontrastmidler brukes. Kunnskapen om selve oppløst stoff diffusjonskoeffisienten i badekaret synes å være avgjørende som som kan ha betydelig innvirkning på nøyaktigheten av de innhentede Diffusjonskoeffisientene over leddbrusk. Dette ville kreve enten ved hjelp av diffusjonskoeffisienten for badekar eller eksperimentelt lett ved hjelp av litteraturverdier.

Som konklusjon, foreslo vi en generell protokoll som består av eksperimenter ogberegninger for å undersøke transporten av ladede og uladede oppløsninger over leddbrusk. Ved anvendelse av protokollen, kan man oppnår en diffusjonskoeffisienter og faste ladede tettheter i forskjellige brusk lag.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexabrix	Guerbet	15HX005D	Negatively-charged contrast agent
Visipaque	GE healthcare	12570511	Nuetral contrast agent
PBS (Phosphate-buffered Saline)	Life technologies	10010023	Medium
micro-CT	Perkin Elmer		Monitoring diffusion
Freezing-point osmometer	Advanced instruments		Measuring solution osmolality