Summary
يستخدم عالية الدقة قياس التنفس لتحديد استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا. هذا هو أسلوب واضحة لتحديد المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة الميتوكوندريا نظام نقل الإلكترون، والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.
Introduction
الميتوكوندريا الوفاء أدوارا هامة في التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية، وخاصة باستخدام الأكسجين لإنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). كانوا متورطين في موت الخلايا وفي العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا (OXPHOS) يجمع بين نقل الإلكترون على طول سلسلة نقل الإلكترون مع استهلاك الأكسجين والتوليف اعبي التنس المحترفين. وتشارك حمض (TCA) دورة الثلاثي الكربوكسيل الميتوكوندريا في تحويل البروتينات والكربوهيدرات والدهون إلى طاقة المركبات الغنية ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الأدينين (NADH) وفلافين ثنائي النوكليوتيد الأدينين (القوات المسلحة الهايتية 2). ثم يتم نقل الإلكترونات من NADH والقوات المسلحة الهايتية 2 إلى المجمعات بروتين سلسلة نقل الإلكترون التنفسية (من الأول إلى الرابع) الموجود في غشاء الميتوكوندريا الداخلية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمسارين الأكسدة الأخرى نقل الإلكترونات إلى إلكترون سلسلة النقل: ط) الميتوكوندريا الإلكترون نقل بروتين فلافيني (ETF) الذي يقع على وجه مصفوفة من ميتو الداخليغشاء chondrial، واللوازم الإلكترونات من الأحماض الدهنية β للأكسدة. والثاني) الميتوكوندريا سكرولي نازعة الذي يتأكسد سكرولي إلى فوسفات ثنائي هيدروكسي أسيتون ويغذي الإلكترونات إلى سلسلة نقل الإلكترون الميتوكوندريا. رابعا مجمع (المتقبلة الإلكترون النهائي) بنقل الإلكترونات إلى جزيء أكسجين واحدة، وتحويل الأوكسجين إلى جزيئين من الماء. ويقترن تتحرك الإلكترونات من الجهاز التنفسي مجمع سلسلة نقل الإلكترون من الأول إلى الرابع مع تدفق بروتون من المصفوفة الميتوكوندريا إلى الفضاء intermembrane التي تنص على التدرج الكهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. بعد ذلك، الميتوكوندريا الخامس معقدة (ATP سينسيز) المكوكات أيونات الهيدروجين مرة أخرى إلى مصفوفة الميتوكوندريا ويجمع جزيئات ATP. ويمكن تقييم وظيفة OXPHOS في المجراة في المختبر باستخدام مختلف التقنيات ومختلف الدول التنفس الميتوكوندريا يمكن الحصول عليها. في الميتوكوندريا عزلة الجه التاليةيمكن للدول راي أن تقاس: ط) القاعدية التنفس الميتوكوندريا (الدولة 1)، والثاني) استهلاك الأوكسجين بعد إضافة ركائز محددة من المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا (الدولة 2)، ج) أقصى استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا بعد إضافة تشبع تركيزات ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP) (الدولة 3) و، والرابع) يستريح التنفس بعد استهلاك ADP (تحويلها إلى ATP) (الدولة 4). في خلايا سليمة يمكن قياس دول الجهاز التنفسي التالية: أ) القاعدية الخلوية استهلاك الأكسجين في وجود ركائز الداخلية وشرطة أبوظبي، والثاني) القاعدية الخلوية استهلاك الأكسجين في وجود أوليغوميسين (أوليغوميسين-حساس التنفس) وأوليغوميسين تراعي التنفس (ATP دوران)، الثالث) FCCP التنفس وفكت، والرابع) التنفس غير الميتوكوندريا بعد إضافة أنتيمايسين إيه وروتينون. في الخلايا permeabilized، ركائز محددة من المجمعات سلسلة نقل الإلكترون وADP يمكن إضافة والقصوى التي تعتمد على مجمع وتيرة التنفس الصورةاوك I- معقدة، ثانيا: ومعدلات التنفس IV-تعتمد يمكن قياسها.
قياسات التنفس الخلوي توفر نظرة ثاقبة قدرة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا محددة لالمجمعات من الأول إلى الرابع، سلامة الميتوكوندريا والطاقة والتمثيل الغذائي 1، 2، 3. واحد من الأجهزة التي تتيح قياس استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا مع دقة عالية، قرار والحساسية هي عالية الدقة oxygraph 4. يحتوي الجهاز عالية الدقة oxygraph غرفتين مع منافذ الحقن وتم تجهيز كل غرفة مع جهاز استشعار الأكسجين البولاروجرافي. وأثار الخلوية أو معزولة تعليق الميتوكوندريا مستمر في مقياس التنفس. لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، ركائز ومثبطات للنشاط معقد الميتوكوندريا يمكن أن تضاف التالية البروتوكولات القياسية. ركائز ومثبطات يمكن معاير التي كتبها الباحث حقنس مخادع oxygraph، ومعدلات استهلاك الأوكسجين وتحسب باستخدام البرمجيات ويعبر عنه picomoles في الثانية الواحدة في عدد من الخلايا. يقدم عالية الدقة قياس التنفس العديد من المزايا الأجهزة الكهربائي الأكسجين البولاروجرافي التقليدية والتقليدية بما في ذلك زيادة الحساسية والقدرة على العمل مع أعداد صغيرة من عينات بيولوجية مثل خلايا سليمة أو permeabilized. وبالإضافة إلى ذلك، كل جهاز يحتوي على غرفتين، ومعدلات التنفس يمكن تسجيلها في وقت واحد لمقارنة تركيزات الأكسجين. لديه عالية الدقة oxygraph أيضا ميزة تقليل تسرب الأوكسجين من غرف جهاز مقارنة بالأجهزة الأكسجين الكهربائي التقليدية البولاروجرافي. جهاز آخر وضعت مؤخرا لقياس استهلاك الأوكسجين الخلوية هو 96-جيدا محلل تدفق خارج الخلية 5. وقد تم تجهيز محلل تدفق خارج الخلية مع مضان بدلا من أجهزة الاستشعار البولاروجرافي. مزايا خارج الخليةلذا محلل تدفق مقارنة مع ذات الدقة العالية oxygraph هي ط) هو جهاز آلي إلى حد كبير، والثاني) أنه من الممكن لقياس استهلاك الأوكسجين في 24- ولوحات 96-جيدا لفحص الإنتاجية العالية، التي تتطلب كميات أقل من العينات البيولوجية، وج) قياس إضافية من تدفق حال السكر الخلوي هو ممكن. مساوئ محلل تدفق خارج الخلية بالمقارنة مع ذات الدقة العالية oxygraph هي ط) التكاليف العالية للجهاز والمواد الاستهلاكية مثل لوحات نيون، والتي هي غير قابلة لإعادة الاستخدام، والثاني) مركبات أربعة فقط في فحص / جيد هي غالبا عن طريق الحقن وبالتالي فإن هذا النظام لا يمكن لبروتوكولات المعايرة الركيزة uncoupler المانع.
في هذه الدراسة، ونحن نستخدم عالية الدقة قياس التنفس لتحديد التنفس الميتوكوندريا. للتجارب استهلاك الأوكسجين الخلوية، وpermeabilized الخلايا لتسمح بدخول ADP خارجي وركائز الميتوكوندريا أكسدة لتغذية الإلكترونات إلى المركبالصورة من الجهاز التنفسي. هذا النهج يسمح للتشريح من المجمعات الميتوكوندريا الفردية قدرات الجهاز التنفسي، والذي هو ميزة واضحة مقارنة مع خلايا سليمة (العديد من ركائز هي الخلية impermeant). ومع ذلك، فإن غشاء الخلية permeabilization تعطيل الحاجز بين العصارة الخلوية والفضاء خارج الخلية والمتوسطة (تغسل المواد المذابة عصاري خلوي) وتشكيل الفضاء داخل الخلايا ومعايرتها مع المتوسط خارج الخلية. واحدة من مساوئ الخلايا permeabilized على خلايا سليمة هو أن الغشاء الخارجي الميتوكوندريا يمكن أن تتلف إذا استخدمت كميات كبيرة من المنظفات خلال permeabilization الخلية. في خلايا سليمة، القاعدية، إلى جانب وفكت التنفس من خلايا سليمة يمكن قياسها. هذه طريقة تقييم استهلاك الأوكسجين من خلايا سليمة من دون إضافة ركائز الخارجية وشرطة أبوظبي، إعادة إنتاج وظيفة الجهاز التنفسي في خلية متكاملة، وكذلك توفير المعلومات عن الأقصى TRANSPO الإلكترون الميتوكوندرياالقدرة غ 6 و 7. واحدة من مزايا خلايا سليمة على الخلايا permeabilized هو أن البيئة الخلوية لا تتعطل والميتوكوندريا على اتصال مع مكونات كاملة من الخلايا. من أجل permeabilize غشاء البلازما الخلوي، وقد استخدمت المنظفات مثل ديجيتونين 8. ومع ذلك، الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي يمكن أن يتعرض للخطر إذا استخدمت كميات كبيرة من ديجيتونين. للتأكد من أن الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي عدم المساس في الخلايا permeabilized، يتم تنفيذ المعايرة ديجيتونين لتحديد تركيز الأمثل لpermeabilization الخلوي. لهذه التجارب، ومعلق الخلايا في المتوسط التنفس ومعاير تركيز ديجيتونين بواسطة قياس التنفس في وجود ركائز الميتوكوندريا وشرطة أبوظبي، ومعدلات التنفس وقياس. لا يتم تحفيز التنفس من خلايا سليمة وغير permeabilized بحضور mitochoركائز ndrial وشرطة أبوظبي. ومع ذلك، فإن اللاحقة المعايرة ديجيتونين تدريجي تسفر permeabilization التدريجي للأغشية البلازما، ويتم الحصول على التركيز ديجيتونين الأمثل. ويتضح ذلك من زيادة التنفس حتى permeabilization الكامل. جودة الميتوكوندريا وسلامة الغشاء الخارجي يمكن التحقق منها من خلال إضافة خارجية السيتوكروم ج 2، 9. السيتوكروم هو 12 كيلو دالتون الإلكترون البروتين الدفترية للالميتوكوندريا سلسلة نقل الإلكترون 10 و 11 و 12. يكون موضعيا في الفضاء intermembrane الميتوكوندريا، وتشارك في استهلاك الأوكسجين، ويحمل الإلكترونات من مجمع الثالث إلى الرابع معقدة. مرة واحدة تلف الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، يتم تحريرها السيتوكروم ج، ويتم تقليل استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا. على إضافة الخارجية السيتوكروم ج، أي زيادة في التنفس الميتوكوندريا هو مؤشر علىتعطلت الغشاء الخارجي الميتوكوندريا.
في الخلايا permeabilized، ركائز ومثبطات النشاط المعقد الميتوكوندريا وأضاف التالية بروتوكولات مختلفة 3، 9. على سبيل المثال من أجل التحقيق في وتيرة التنفس الميتوكوندريا يحركها المجمع، وبروتوكول التالية يمكن استخدامها. بعد permeabilization من الخلايا، أولا أنا معقدة يتم تحفيز من قبل مالات ركائز والغلوتامات، التي تولد NADH باعتبارها الركيزة إلى السلسلة التنفسية واستفزاز تفعيل أولا تعقيدا بعد ذلك، يتم إضافة ADP لتحويلها إلى ATP (الدولة 3، نشط أنا التي تعتمد على مجمع التنفس). بعد الوصول إلى إشارة مستقرة، وتدار روتينون (مجمع الميتوكوندريا أنا المانع) لمنع أولا معقدة ويتبع روتنون التي كتبها السكسينات إلى القوات المسلحة الهايتية 2 وتفعيل مجمع الثاني (الدولة 3، ونشط مجمع التنفس II-التابعة). من أجل قياس معقدة التنفس التي تعتمد على الرابع، أول مجمع الثالثهو تحول دون التنفس معتمد على طريق إضافة أنتيمايسين إيه (الميتوكوندريا مجمع الثالث المانع). بعد ذلك، يتم تحفيز معقدة التنفس التي تعتمد على الرابع بالإدارة أسكوربات وtetramethylphenylendiamine (TMPD). TMPD يمكن لصناعة السيارات في أكسدة في المخزن المؤقت التنفس، وبالتالي يتم احتساب الأقصى معقدة معدل التنفس التي تعتمد على الرابع (الدولة 3) عن طريق طرح معدلات التنفس قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم، مثبط لالرابع معقدة الميتوكوندريا. ويمكن إجراء التجارب التنفس في غرفتين من oxygraph في مواز واحد بمثابة التحكم (الخلايا unstimulated)، وأخرى تحتوي على خلايا حفز. ومن الواضح أن الخلايا يمكن أن تكون مرحلة ما قبل المعاملة بطرق مختلفة، على سبيل المثال، مع العقاقير التي تؤثر على وظائف الميتوكوندريا، قبل أن يتم قياس استهلاك الأكسجين في الغرفة oxygraph. يسمح هذا البروتوكول الفحص الوظيفي للمجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن قياس ADP-حفز القصوىالتنفس (الدولة 3) من الخلايا permeabilized، وذلك باستخدام الأحماض الدهنية خارجي في شكل بالميتات. في هذا البروتوكول، ومترافق الأسهم تتركز بالميتات الصوديوم مع الأحماض الدهنية جدا البقري مجانا ألبومين المصل (BSA) (6: 1 المولي نسبة بالميتات: BSA). بعد ذلك، الخلايا أولا وpermeabilized مع التنفس ديجيتونين والميتوكوندريا يتم تقييمها من خلال إضافة الكارنيتين وبالميتات تليها إضافة ADP (الدولة 3، التنفس القصوى). ثم، يضاف أوليغوميسين لتقليد الدولة 4 (4O الدولة) ونسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR قيمة) يتم احتساب كدولة 3 / دولة 4O. β للأكسدة تعزز إنتاج الاسيتيل جنة الزراعة (الذي يدخل في دورة TCA) والجيل القوات المسلحة الهايتية 2 و NADH، والإلكترونات التي تم تمريرها إلى سلسلة نقل الإلكترون من بروتين فلافيني-نقل الإلكترون وβ-هيدروكسي، لجنة الزراعة نازعة. الميتوكوندريا هي في مركز استقلاب الأحماض الدهنية وصفت بروتوكول بالميتات-BSA يمكن استخدامها من قبل الباحثين دراسة الدهونتاي أكسدة الأحماض. في خلايا سليمة، تضاف تفعيل ومثبطات النشاط المعقد الميتوكوندريا التالية بروتوكول آخر 6 و 9. لهذه التجارب، ويتم قياس استهلاك الأوكسجين الأول من خلايا غير permeabilized في غياب ركائز الخارجية (phosphorylating معدل التنفس). ثم، يتم قياس معدل التنفس غير phosphorylating بعد إضافة أوليغوميسين، الذي هو المانع من سينسيز ATP الميتوكوندريا. بعد ذلك، يتم إدارتها من protonophore الكربونيل السيانيد ف trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) بتركيزات مختلفة ويتم قياس معدل التنفس وفكت الميتوكوندريا القصوى. Protonophores مثل FCCP يمكن أن تحفز على زيادة في نفاذية بروتون من الغشاء الداخلي، والسماح حركة سلبية من البروتونات لتبديد التدرج التناضح الكيميائي. زيادة نفاذية بروتون uncouples التنفس الأكسدة (أي إنتاج ATP) ويستحث زيادة في ساستهلاك xygen. بعد ذلك، يتم إضافة روتينون وأنتيمايسين إيه لمنع التنفس الميتوكوندريا، ويتم طرح التنفس غير الميتوكوندريا من كل الأسعار الجهاز التنفسي الأخرى.
ويمكن التعبير عن معدلات استهلاك الأوكسجين كما IO 2 [بمول س ثانية -1 × 10 -6 الخلايا] (تدفق الأوكسجين في خلايا مليون) والذي يحسب بقسمة حجم معين تدفق الأكسجين (في غرفة الأوكسجين مغلقة)، JV، يا 2 [بمول س ثانية -1 س -1 مل] من تركيز خلية في غرفة الخلية (عدد الخلايا في حجم [10 6 خلايا ∙ مل 1]) 15. خلايا الشامل محدد تدفق الأكسجين، JO 2 [بمول س ثانية س -1 ملغ -1]، هو تدفق في الخلية، IO 2 [بمول س ثانية -1 × 10 -6 خلايا]، مقسوما على كتلة كل خلية [ملغ ∙ 10 6 خلايا]. أو حجم معين تدفق، JV، O 2 [بمول س ثانية -1 س -1 مل]، مقسوما على كتلة في المجلدأوميا [ملغ ∙ مل 1]. JO 2 هو تدفق الأكسجين في بروتين الخلية، الوزن الجاف أو حجم الخلية.
في هذه الدراسة باستخدام عالية الدقة قياس التنفس، نحن تصف بروتوكولات لتحديد ط) تركيز ديجيتونين الأمثل لكامل permeabilization الخلوي غشاء البلازما (ديجيتونين المعايرة فحص)، ب) الميتوكوندريا الخارجي سلامة غشاء باستخدام خارجية السيتوكروم ج، ج) الميتوكوندريا المجمعات السلسلة التنفسية أنا ومعدلات التنفس القصوى الثاني والرابع في الخلايا HepG2-permeabilized ديجيتونين في حضور ADP خارجي والميتوكوندريا ركائز السلسلة التنفسية، والرابع) القاعدية، إلى جانب والقصوى التنفس وفكت (أقصى طاقة النقل الإلكترون) من خلايا سليمة من دون إضافة ركائز الخارجية وADP، إعادة إنتاج وظيفة الجهاز التنفسي في خلية متكاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلية ثقافة
- ثقافة الخلايا البشرية الكبدي HepG2 6 في 25 سم 2 قوارير زراعة الخلايا في المتوسط Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) تحتوي على 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة (5٪ CO 2، 95٪ الهواء) (البذر الكثافة: 1 × 10 6 خلايا في 25 سم 2 خلية الثقافة قارورة، فترة حضانة في الحاضنة 37 درجة مئوية: 48 ساعة، كثافة الخلايا في confluency: 4-5 × 10 6 خلايا في 25 سم قارورة الثقافة 2 الخلية).
- إجراء التجارب عندما الخلايا هي 90٪ إلى 95٪ متموجة.
2. عالية الدقة قياس التنفس معايرة مجسات الأكسجين البولاروجرافي
- ماصة 2.1 مل من العازلة التنفس الى غرفة oxygraph ويقلب المخزن المؤقت باستمرار باستخدام شريط التحريك المغناطيسي موجودة في الغرفة (700 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة حتى إشارة مستقر تدفق الأكسجين ليتم الحصول على الأوكسجين الاستشعار البولاروجرافي.
ملاحظة: الأقطاب الأكسجين البولاروجرافي داخل كل تركيز قياس الأكسجين غرفة oxygraph وحساب استهلاك الأوكسجين (تدفق) في كل غرفة. يتم عرض تركيز الأكسجين ومعدلات استهلاك الأوكسجين (تدفق) في الوقت الحقيقي على الانترنت في جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج للحصول على البيانات وتحليلها. - إجراء معايرة الهواء من الأوكسجين الاستشعار البولاروجرافي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة 14.
ملاحظة: يتم تنفيذ معايرة أجهزة استشعار الأكسجين البولاروجرافي في وسائل الإعلام التنفس وتركيز الأكسجين في وسائل الإعلام في تشبع الهواء درجة الحرارة التجريبية فقط مرة واحدة يوميا في الصباح. بعد ذلك وسائل الإعلام يمكن إزالتها من الدوائر والخلايا معلق في وسائل الإعلام التنفس جديدة تضاف إلى غرفة oxygraph ويتم قياس وتيرة التنفس. بعد التجربة الأولى، وغرفة يمكن غسلها وسلسلة إضافية من التجارب لا يمكن أن يؤديها في تيانه نفس الغرفة دون مزيد من المعايرة.
3. Trypsinization من خلايا منتسب، عد خلايا
- في يوم من التجربة، ونضح DMEM من 25 سم 2 خلية قارورة الثقافة.
- شطف أحادي الطبقة زراعة الخلايا في قارورة الثقافة مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- ماصة 0.5 مل من 25 ملغ / مل من محلول التربسين (prewarmed إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي 37 ° C) في أحادي الطبقة خلية في قارورة الثقافة واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة (5٪ CO 2 ، 95٪ الهواء).
- ماصة 5 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS إلى خلايا منفصلة في قارورة زراعة الخلايا وتعليق الخلايا من قبل pipetting.
- نقل معلق الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج في درجة حرارة الغرفة وصب وطاف.
- resuspend الكرية خلية في 1 مل من التنفس عازلة 13 (T قادرة 1).
4. عالية الدقة قياس التنفس
- بعد معايرة الهواء (يؤديها مرة واحدة فقط يوميا، الخطوات 2.1-2.2)، نضح في والمتوسطة التنفس من غرفة من oxygraph وإضافة 2.1 مل من تعليق خلية (1 × 10 6 خلية / مل) من الخطوة 3.7 إلى الغرفة.
- إغلاق غرفة oxygraph ذلك بإدخال سدادة.
- تحريك الخلايا بشكل مستمر باستخدام شريط التحريك المغناطيسي موجودة في الغرفة (700 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
ملاحظة: تركيز الأوكسجين وإشارة الأكسجين تدفق يتم عرض في الوقت الحقيقي على الانترنت في جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج للحصول على البيانات وتحليلهاالصورة = "XREF"> 14. - بعد ذلك، وضخ ركائز ومثبطات للتنفس الميتوكوندريا من خلال الموانئ حقن التيتانيوم من سدادات باستخدام البروتوكولات التالية.
5. ديجيتونين المعايرة في خلايا سليمة من قياس التنفس
- إعداد تعليق خلية غرفة oxygraph تحتوي على (1 × 10 6 / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 من البروتوكول.
- حقن 2 ميكرولتر من 0.2 ملي روتينون (0.2 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph تحتوي على تعليق خلية عن طريق ميناء حقن التيتانيوم سدادة الغرفة باستخدام حقنة وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تدفق .
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الحقن في الخطوات التالية من خلال الموانئ حقن التيتانيوم من سدادات باستخدام الحقن. إضافة روتينون اختيارية (يمنع تدفق الإلكترونات العكسي) ويمكن حذف للتجارب المعايرة ديجيتونين، انظرخطوة 6.3. - ضخ 20 ميكرولتر من 1 M السكسينات (10 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
- ضخ 10 ميكرولتر من 0.5 M ADP (2.5 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
- حقن 2 ميكرولتر من 2 ملي ديجيتونين (2 ميكرومتر) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 2-5 دقائق حتى يتم التوصل إلى إشارة الأوكسجين مستقرة.
- مرة أخرى لضخ 2 ميكرولتر من 2 ملي ديجيتونين في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 2-5 دقائق حتى يتم التوصل إلى إشارة الأوكسجين مستقرة.
ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك بالتدريج من ديجيتونين إلى الخلايا تحفز زيادة في استهلاك الأوكسجين الخلوية وإشارة الأكسجين تدفق وزيادة. - تواصل عن طريق الحقن 2-4 ميكرولتر من 2 ملي تدريجي ديجيتونين (2-4 ميكرومتر كل خطوة) في الغرفة. بعد كل خطوة، تسجيل التنفس الخلوي لمدة 2-5 مفي حين حقق استقرارا إشارة الأكسجين تغير مستمر.
ملاحظة: إيقاف ضخ ديجيتونين عندما تصل إشارة الأكسجين تدفق مستوى الحد الأقصى وحقن مزيد من ديجيتونين لا يزيد من معدل التنفس. يجب على القراء تحديد تركيز ديجيتونين الأمثل في مختبراتهم باستخدام الكواشف الخاصة واستخدام الحصول على تركيز ديجيتونين الأمثل في الخطوات 6.2 و 7.2 من البروتوكولات التالية لتجاربهم.
6. تقييم غشاء النزاهة الميتوكوندريا الخارجي: السيتوكروم C
- إعداد تعليق خلية غرفة oxygraph تحتوي على (1 × 10 6 / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 من البروتوكول.
- حقن 2 ميكرولتر من 8 ملي ديجيتونين (8 ميكرومتر) في غرفة oxygraph التي تحتوي على تعليق خلية (1 × 10 6 / مل)، وpermeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق.
- ضخ 20 ميكرولتر من 1 M السكسينات (10 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل respirat الخلويايون لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
- ضخ 10 ميكرولتر من 0.5 M ADP (2.5 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
ملاحظة: إضافة ADP إلى الخلايا تحفز أنا معقدة وتحفز زيادة في استهلاك الأوكسجين، وسوف إشارة الأكسجين تدفق زيادة واستقرار. - حقن 5 ميكرولتر من 4 مم السيتوكروم ج (10 ميكرومتر) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5-10 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
- وأخيرا حقن 1 ميكرولتر من 4 ملغ / مل أوليغوميسين (2 ميكروغرام / مل)، وتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
7. التنفس حفز ADP-القصوى (الدولة 3) من خلايا Permeabilized HepG2
- إعداد تعليق خلية غرفة oxygraph تحتوي على (1 × 10 6 / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 من البروتوكول.
- حقن 2 ميكرولتر من 8 ملي ديجيتونين (8 ميكرومتر) في غرفة oxygraph التي تحتوي على تعليق خلية وpermeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق.
- ضخ 12.5 ميكرولتر من 0.8 M من مالات (5 ملم) و 10 ميكرولتر من 2 M من الغلوتامات (10 ملم) في غرفة oxygraph. ويتحقق التنفس الخلوي رقم قياسي حتى مستقر إشارة الأكسجين تغير مستمر.
- ضخ 10 ميكرولتر من 0.5 M ADP (2.5 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الأكسجين زيادات إشارة تدفق واستقرار.
ملاحظة: إضافة ADP إلى الخلايا تحفز زيادة في استهلاك الأوكسجين وإشارة الأكسجين تدفق وزيادة. - حقن 2 ميكرولتر من 0.2 ملي روتينون (0.2 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى انخفاض إشارة الأكسجين تدفق واستقرار.
- بعد ذلك، وضخ 20 ميكرولتر من 1 M السكسينات (10 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الزيادات إشارة الأكسجين تدفقوتستقر.
- ثم، وضخ 2 ميكرولتر من 5 ملم أنتيمايسين إيه (5 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى انخفاض إشارة الأكسجين تدفق واستقرار.
- ثم ضخ 2.5 ميكرولتر من 0.8 ملي أسكوربات (1 ملم) وعلى الفور بعد حقن 2.5 ميكرولتر من 0.2 ملي TMPD (0.25 ملم) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الأكسجين زيادات إشارة تدفق واستقرار.
- وأخيرا حقن 10 ميكرولتر من 1 M أزيد الصوديوم (5 ملم) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى انخفاض إشارة الأكسجين تدفق واستقرار.
8. استهلاك الأكسجين للخلايا السليمة
- إعداد تعليق خلية غرفة oxygraph تحتوي على (1 × 10 6 / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 4،1-4،3 من البروتوكول.
- حقن 1 ميكرولتر من 4 ملغ / مل أوليغوميسين (2 ميكروغرام / مل) في غرفة oxygraph تحتوي على تعليق خليةويتحقق د قياسي التنفس الخلوي حتى مستقر إشارة الأكسجين تغير مستمر.
- بعد ذلك حقن 1 ميكرولتر من 0.2 ملي من FCCP (0.1 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الأكسجين زيادات إشارة تدفق واستقرار.
- ضخ 3 ميكرولتر من 0.2 ملي من FCCP (0.4 ميكرومتر) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى الزيادات إشارة الأكسجين تدفق المزيد واستقرار.
- عاير FCCP في 0،1-0،3 ميكرومتر الخطوات عن طريق حقن 1-3 ميكرولتر من 0،2-1 ملم FCCP (0،1-2 ميكرومتر تركيز النهائي في الغرفة) في غرفة oxygraph حتى تصل إشارة الأكسجين تدفق المستويات القصوى وأي زيادات أخرى ثم يبدأ في الانخفاض.
ملاحظة: إيقاف ضخ FCCP عندما تصل إشارة الأكسجين مستوى الحد الأقصى ويبدأ في الانخفاض. - ثم، وضخ 2 ميكرولتر من 0.2 ملي روتينون (0.2 ميكرومتر) و 2 ميكرولتر من 5 ملم أنتيمايسين إيه (5 ميكرومتر) في الغرفة. سجل التنفس حتى رانه الأكسجين تدفق انخفاض إشارة واستقرار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحديد الأمثل ديجيتونين تركيز الخلوية Permeabilization: ديجيتونين المعايرة تجربة
يتم تنفيذ ديجيتونين المعايرة لتحديد تركيز الأمثل لpermeabilization الخلايا HepG2. لهذه التجارب، ومعاير ديجيتونين في خلايا سليمة في وجود روتينون، السكسينات (الميتوكوندريا المجمع الثاني الركيزة) وكمية تشبع من ADP تقاس، وأمراض الجهاز التنفسي معدلات في الأساس وبعد كل (مجمع II-تعتمد الدولة 3 للحث) المعايرة (الشكلان 1A و 1B). ونتيجة لهذه التجربة تبين أنه في حالة عدم وجود ديجيتونين، التنفس الخلوي منخفض جدا والتنفس من خلايا سليمة، غير permeabilized لا يتم تحفيز في وجود الركيزة الميتوكوندريا وشرطة أبوظبي. ومع ذلك، عند إضافة تدريجية من ديجيتونين، وpermeabilized غشاء البلازما الخلوي وmitochonالتنفس drial (المعقدة التي تعتمد على الثاني دولة 3) زيادات تصل إلى permeabilization كامل عندما السكسينات وADP تدخل الخلايا. وأظهرت النتائج أن permeabilization بتركيز ديجيتونين من 8-12 ميكرومتر هو الأمثل للتنفس حفز ADP-خلايا HepG2. ومع ذلك، الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي يمكن أن يتعرض للخطر إذا استخدمت كميات كبيرة من ديجيتونين. كما هو مبين في الشكل رقم 1، التي يسببها كميات كبيرة من ديجيتونين انخفاض في مجمع الثانية التي تعتمد على الدولة 3 التنفس مما يدل خطر الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.
في البروتوكولات الحالية والتالية، يتم التعبير عن معدلات استهلاك الأوكسجين كما IO 2 [بمول س ثانية -1 × 10 -6 الخلايا] (تدفق الأوكسجين في خلايا مليون) والذي يحسب بقسمة حجم معين تدفق الأكسجين (في مغلقة غرفة الأوكسجين)، JV، O 2 [بمول س ثانية -1 س -1 مل] من قبل ويركز خلية أيون في غرفة الخلية (عدد الخلايا في حجم [10 6 خلايا س -1 مل]) 15.
الشكل 1: ديجيتونين المعايرة لتحديد تركيز الأمثل للpermeabilization الخلايا HepG2. يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين (المنحدر من تركيز الأكسجين). يقلل تركيز الأكسجين مع مرور الوقت كما تستخدم الخلايا الأكسجين المتاحة. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (ثانية × عدد الخلايا). (A) الإقتفاء من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام ديجيتونين، ADP والسكسينات كما الركيزة لمجمع الميتوكوندريا التنفس الثانية التي تعتمد على (1 التجربة). قدمت (ب) معدلات التنفس الميتوكوندريا من 4 تجارب فردية كما يعني ± SD.تحميل / 54985 / 54985fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تقييم الميتوكوندريا الخارجي غشاء النزاهة باستخدام تركيز الأمثل ديجيتونين
لتقييم تأثير تركيز ديجيتونين الأمثل (8 ميكرومتر) على الخارجي سلامة غشاء الميتوكوندريا، وpermeabilized الخلايا مع سلامة الغشاء الخارجي ديجيتونين والميتوكوندريا يتم اختباره من خلال قياس التنفس الميتوكوندريا بعد إضافة لاحقة من السكسينات (مجمع الميتوكوندريا II-تعتمد يستريح الدولة 2 التنفس في غياب ADP)، حفز ADP (ADP مجمع الثانية التي تعتمد على الدولة 3 التنفس) والسيتوكروم ج (ADP حفز مجمع الثانية التي تعتمد على الدولة 3 التنفس في وجود السيتوكروم ج)، تليها إضافة أوليغوميسين (مثبط من سينسيز ATP) لتقليد دولة 4. كما هو مبين في الشكل 2
الشكل 2: ج السيتوكروم لا يعزز التنفس من الخلايا المعالجة مع ديجيتونين (8 ميكرومتر). آثار الجهاز التنفسي تمثيلية للاختبار السيتوكروم ج باستخدام عالية الدقة قياس التنفس. وpermeabilized الخلايا مع 8 ديجيتونين ميكرومتر والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي يتم اختباره من خلال قياس معدلات التنفس بعد إضافة اللاحقة من 10 السكسينات ملي (دولة 2)، 2.5 ملي ADP (الدولة 3) و 10 ميكرومتر السيتوكروم ج (الدولة 3 في وجود السيتوكروم ج)، تليها إضافة 2 ميكروغرام / مل أوليغوميسين لتقليد دولة 4. معدل التنفس وكنسبة بمول / (ثانية س millioن الخلايا). CII: مجمع الثاني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تقييم غشاء النزاهة الميتوكوندريا الخارجي عن طريق تركيز عال من ديجيتونين
لإثبات أن تركيز عال جدا من ديجيتونين يمكن حل وسط الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي، أجرينا تجربة باستخدام جرعة عالية من ديجيتونين. لهذه التجربة، وpermeabilized الخلايا مع ديجيتونين 40 ميكرومتر بدلا من 8 ميكرومتر، والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي يتم اختباره من خلال قياس التنفس الميتوكوندريا بعد إضافة لاحقة من السكسينات (مجمع الميتوكوندريا II-تعتمد يستريح الدولة 2 التنفس في غياب ADP) (حفز ADP دولة مجمع الثانية التي تعتمد على 3 التنفس) ADP والسيتوكروم ج (ADP حفز مجمع II-دالدولة ependent 3 التنفس في وجود السيتوكروم ج)، تليها إضافة أوليغوميسين لتقليد الدولة 4 في وجود أوليغوميسين (الشكل 3). ونتيجة لهذه التجربة تبين أن السيتوكروم ج يعزز التنفس من الخلايا المعالجة بجرعة عالية من ديجيتونين، مما يدل على فقدان السيتوكروم ج من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا مشيرا إلى خطر الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.
الشكل (3): جرعة عالية من ديجيتونين (40 ميكرومتر) يهدد الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي. اقتفاء أثر من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام السكسينات كما الركيزة. يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين (المنحدر من تركيز الأكسجين). يقلل تركيز الأكسجين مع مرور الوقت كما تستخدم الخلايا الأكسجين المتاحة. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كمابمول / (ثانية س عدد من الخلايا). يشار إضافة لاحقة من 40 ديجيتونين ميكرومتر، السكسينات (10 ملم)، ADP (2.5 ملم)، السيتوكروم ج (10 ميكرومتر) وأوليغوميسين (2 ميكروغرام / مل). CII: مجمع الثاني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
القصوى ADP-حفز التنفس (الدولة 3) من خلايا Permeabilized HepG2، عن طريق ركائز مصادر خارجية الزائدة
أولا: مجمع، ويقاس ثانيا ورابعا التي تعتمد على أقصى التنفس حفز ADP (الدولة 3) خلايا HepG2 permeabilized (1 × 10 6 خلية / مل) بنجاح باستخدام ركائز الخارجية الزائدة (الشكل 4). لهذه التجربة، وpermeabilized الخلايا مع معدلات استهلاك الأوكسجين ديجيتونين والميتوكوندريا يتم قياسها بعد إضافة لاحقة من ركائز ومثبطات كما هو موضح في قياس ناجحة من التنفس حفز ADP-القصوى (الدولة 3) من خلايا Permeabilized HepG2 أولا: مجمع، لا يقاس ثانيا ورابعا التي تعتمد على أقصى التنفس حفز ADP (الدولة 3) خلايا HepG2 permeabilized (1 × 10 6 خلية / مل) بنجاح باستخدام ركائز الخارجية الزائدة (الشكل 5). لهذه التجربة، وpermeabilized الخلايا مع معدلات استهلاك الأوكسجين ديجيتونين والميتوكوندريا يتم قياسها بعد إضافة لاحقة من ركائز ومثبطات كما هو موضح في الشكل (5). كما هو مبين في الشكل (5) الشكل (4). وثمة تفسير محتمل لانخفاض مستويات الجهاز التنفسي هو تلوث غرف oxygraph مع مثبطات الميتوكوندريا من التجارب السابقة. مثبطات الميتوكوندريا مثل antimycin وروتينون قابلة للذوبان في الإيثانول ويمكن التمسك غرف oxygraph وسدادات. لذا الدوائر وسدادات oxygraph يجب غسلها على نطاق واسع بعد كل تجربة. التنفس إلى جانب وفكت من خلايا سليمة يتم قياس استهلاك الأوكسجين القاعدية الخلايا HepG2 "في وجود أوليغوميسين (التنفس أوليغوميسين-حساس) وبالإضافة إلى ذلك متتابعة من FCCP (الشكل 6). الباسايمثل لتر معدل التنفس الخلوي استهلاك الأكسجين للخلايا HepG2 سليمة في وجود ركائز الخلوية الذاتية ويمكن أن يغير استجابة لطلب ATP الخلوية. يمثل معدل التنفس أوليغوميسين-حساس تسرب التنفس الخلوي ومعدل التنفس أوليغوميسين الحساسة التي تمثل دوران ATP الخلوية ويحسب بطرح معدل التنفس-أوليغوميسين حساسة من القاعدية معدل التنفس الذاتية. يتم إضافة مادة كيميائية uncoupler FCCP بالتتابع بتركيزات مختلفة والتنفس وفكت القصوى المسجلة. يتم الحصول على الميتوكوندريا معدل التنفس وفكت الأقصى (أقصى نقل الإلكترون قدرة النظام) لهذا الشرط التجريبية في 0.9-1.2 ميكرومتر FCCP. اظهرت النتائج النشاط ثنائي الطور من FCCP في الخلايا HepG2 سليمة. ولذلك، لكل حالة تجريبية، ومعاير FCCP للحصول على أقصى معدل التنفس وفكت. يتم حساب نسبة وفكت سيطرة الجهاز التنفسي (uRCR) بقسمة FCCPمعدل التنفس وفكت من معدل التنفس في وجود أوليغوميسين. أوليغوميسين تراعي التنفس يتم احتساب (دوران ATP) عن طريق طرح أوليغوميسين-حساس معدل التنفس من التنفس الذاتية القاعدية. اقتران الكفاءة وهو ما يمثل نسبة استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا تستخدم لتجميع ATP يتم احتساب بقسمة معدل التنفس الحساسة أوليغوميسين من معدل التنفس القاعدية. في نهاية التجربة، للحصول على معدل التنفس غير الميتوكوندريا، تضاف مثبطات سلسلة نقل الإلكترون الميتوكوندريا ويتم طرح معدل التنفس غير الميتوكوندريا من جميع النتائج. للتجربة هو مبين في الشكل (6)، ومعدل التنفس غير الميتوكوندريا هو 26 بمول / (ثانية س مليون خلايا)، ومعدل التنفس القاعدية هو 48 بمول / (ثانية س مليون خلية)، أوليغوميسين-حساس معدل التنفس 7 بمول / (ثانية س مليون خلية)، أوليغوميسين تراعي التنفس (دوران ATP) 41 بمول / (ثانية س مليون خلية) وcouplinكفاءة ز 0.85. الجدول 1: تكوين عازلة التنفس. 
الشكل (4): قياس النجاح في أقصى التنفس حفز ADP (الدولة 3) خلايا HepG2 permeabilized. ويتم التعبير عن معدل التنفس كما بمول / (ثانية س مليون خلية). وpermeabilized الخلايا مع 8 ديجيتونين ميكرومتر ومعدلات التنفس الميتوكوندريا يتم قياسها بعد إضافة لاحقة من الغلوتامات ومالات (الدولة 3، ومجمع)، روتينون لكبح أنا معقدة، السكسينات (الدولة 3، II معقدة)، أنتيمايسين إيه لمنع مجمع الثالث وأسكوربات / TMPD وأزيد الصوديوم لكبح الرابع معقدة. مجمع الرابع التنفس (الدولة 3)يتم تفسيرها عن طريق طرح استهلاك الأوكسجين قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم. CI: أنا معقدة، CII: مجمع الثاني، CIV: الرابع معقدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الرقم 5: قياس غير ناجحة من أقصى التنفس حفز ADP (الدولة 3) خلايا HepG2 permeabilized. آثار الجهاز التنفسي تمثيلية من تجربة فاشلة من I- مجمع، ثانيا ورابعا يحركها القصوى التنفس حفز ADP (الدولة 3) خلايا HepG2 permeabilized باستخدام عالية الدقة قياس التنفس. ويتم التعبير عن معدل التنفس كمابمول / (ثانية س مليون خلية). وpermeabilized الخلايا مع 8 ديجيتونين ميكرومتر ومعدلات التنفس الميتوكوندريا يتم قياسها بعد إضافة لاحقة من الغلوتامات ومالات (الدولة 3، ومجمع)، روتينون لكبح أنا معقدة، السكسينات (الدولة 3، II معقدة)، أنتيمايسين إيه لمنع مجمع الثالث وأسكوربات / TMPD وأزيد الصوديوم لكبح الرابع معقدة. يتم تفسير مجمع الرابع التنفس (الدولة 3) عن طريق طرح استهلاك الأوكسجين قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 6: جانب والتنفس وفكت من خلايا سليمة. آثار الجهاز التنفسي تمثيلية من استهلاك الأوكسجين القاعدية الخلايا HepG2 "قياس بحضور أوليغوميسين (التنفس أوليغوميسين-حساس) وبالإضافة إلى ذلك متتابعة من FCCP باستخدام عالية الدقة قياس التنفس. بعد ذلك، وبمجرد التوصل إلى إشارة مستقرة، هو تحول دون التنفس مع إضافة روتينون وأنتيمايسين إيه والباقي التنفس الخلفية (التنفس غير الميتوكوندريا) هو مطروح من جميع النتائج. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (ثانية × عدد الخلايا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. عازلة التنفس 13 المواد الكيميائية تركيز سكر القصب 110 ملي EGTA 0.5 ملم MgCl 2 3.0 ملم بوكل 80 ملي K-lactobionate 60 ملي KH 2 PO 4 10 ملي التورين 20 ملي HEPES 20 ملي BSA 1.0 جم / لتر الرقم الهيدروجيني 7.1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى استخدام عالية الدقة قياس التنفس لقياس المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة نظام نقل الإلكترون الميتوكوندريا والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.
هناك بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا، وتطبيع معدلات استهلاك الأوكسجين الخلوية عادة إلى عدد من الخلايا (بمول / [ثانية × عدد خلايا]). لذلك، قبل مراقبة استهلاك الأكسجين الخلوية، فمن الأهمية بمكان أن استخدام الجهاز الذي يتيح قياسات دقيقة وموثوق بها من عدد من الخلايا. في هذا البروتوكول قد استخدمت عداد خلية الآلي (الخطوة 3.7 من البروتوكول وجدول المواد). والخطوة الثانية الحاسمة، وخصوصا في الخلايا permeabilized، هو اختيار عازلة التنفس ومعلق الخلايا (خطوة 3.6 البروتوكول) التي permeabilized. منذ permeabilization الخلوي يمكن أن تحفز فقدان intracellulaأيونات ص، هو أمر بالغ الأهمية أن الوسيلة المستخدمة خلال permeabilization متوافق مع البيئة داخل الخلايا. ولذلك، ينبغي أن يتضمن عازلة التنفس تكوين والأسمولية الذي يعكس كلا من داخل والبيئة خارج الخلية (الجدول 1) 13. وبالإضافة إلى ذلك، لpermeabilization الخلوي الأمثل والفعال، من الأهمية بمكان أن يعاير ديجيتونين التركيز ليس فقط لكل نوع من الخلايا ولكن أيضا لكل كثافة الخلايا، لتحديد تركيز الأمثل و الأدنى الفعال. إذا تركيز ديجيتونين منخفض جدا، لن permeabilized الخلايا. في المقابل، سوف تعرض الخلايا لكميات كبيرة من ديجيتونين تلف الغشاء الخارجي الميتوكوندريا. لذلك، نقطة أخرى مهمة في التحقيق الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي. ولكي لا نقلل من قدرة الجهاز التنفسي الخلوية، فمن المهم أيضا أن يتم تنفيذ تجارب قياس التنفس عند درجة حرارة الفسيولوجية (37 درجة مئوية). نقطة هامة أخرى للنظر هو استخدام تشبع كميات من ADP، ويرجع ذلك إلى الحد من انتشار ADP مقابل الأكسجين في الخلايا permeabilized ومستويات الركيزة الكافية للحصول على تدفق الجهاز التنفسي القصوى. في بعض التجارب في الخلايا permeabilized، فإنه قد يحدث أن إضافة ركائز الخارجية وADP لا يؤدي إلى زيادة كبيرة في معدل التنفس. يمكن أن يكون سبب ذلك عن طريق عدة عوامل. على سبيل المثال، استخدام تركيزات عالية من ديجيتونين إلى permeabilize الخلايا قد يؤدي إلى تلف الغشاء الخارجي الميتوكوندريا. ولذلك، ينبغي للمرء أن يعاير ديجيتونين لتحديد تركيز الأمثل لكل نوع من الخلايا وكثافة. وعلاوة على ذلك، نقاء ديجيتونين هو أيضا حرجة للغاية، ومتاحة تجاريا ديجيتونين يمكن أن تختلف بشكل كبير في الطهارة ودفعات جديدة من ديجيتونين شراؤها يجب معاير لتحديد تركيزها الأمثل لpermeabilization الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدة أنواع من غشاء البلازما الخلوي المسام تشكيلوكلاء مع خصائص مختلفة. على سبيل المثال، سابونين هو المنظفات أخف من ديجيتونين، واعتمادا على نوع من الخلايا، وينبغي اختيار كاشف خلية permeabilization المناسب.
معظم مثبطات وظيفة الميتوكوندريا المستخدمة في فحوصات قياس التنفس، مثل روتينون أنتيمايسين إيه، قابلة للذوبان في الإيثانول إلا والعصا إلى غرف oxygraph وسدادات، مما يعوق التنفس الخلوي. لتجنب هذه المشكلة، غرف oxygraph وسدادات يجب غسلها على نطاق واسع مع 95٪ من الإيثانول بعد كل فحص. نقطة هامة أخرى للنظر هو أن لكلا المقايسات التنفس الخلوي سليمة وpermeabilized، كثافة الخلية ونوع والتقاء ثقافة الخلية قد تؤثر على وتيرة التنفس. على سبيل المثال، مع خلايا HepG2، ونحن عادة استخدام كثافة الخلية بين 1 و 2 مليون خلية لكل غرفة. يمكن استخدام كثافة الخلايا منخفضة جدا خلال قياس التنفس تؤدي إلى إشارة ضعيفة جدا. لاحظنا أيضا أن زراعة الخلايا confluency قد تؤثر على وتيرة التنفس. لإكساءmple، عندما تزرع الخلايا HepG2 متكدسة جدا (أكثر من 100٪)، وأنها تستهلك أقل بكثير الأكسجين.
للحصول على مستقرة وقابلة للتكرار تدفق الأكسجين أثناء التجارب، نقطة هامة أخرى للنظر هو صيانة عالية الدقة قياس التنفس instrument- أي التبادل المنتظم للالبولاروجرافي الأغشية مستشعر الاوكسجين والتصويبات الخلفية مفيدة. لإجراء التجارب مع FCCP uncoupler، قد يكون من أن إضافة FCCP إلى الخلايا لا يحفز لم يتم الحصول على التنفس الخلوي وتدفق القصوى، ولكن بدلا من ذلك هو تحول دون التنفس الخلوي. قد يشير تثبيط استهلاك الأوكسجين الخلوية على إضافة FCCP أن تركيز FCCP لم يكن الأمثل وكانت عالية جدا. لهذه التجارب، لكل فحص، فمن الضروري أن يعاير بدقة تركيز FCCP للحصول على تدفق القصوى.
وجود قيود على عالية الدقة قياس التنفس هو أن فحص عالية الإنتاجية، وإنشاءمنحنيات الاستجابة للجرعة والوقت التجارب بالطبع لكميات محدودة من العينات البيولوجية ليست مجدية. لهذه المقايسات، يمكن للمرء أن استخدام أدوات أخرى، مثل محلل تدفق خارج الخلية. القيود الأخرى ط) لم يتم آليا الجهاز وتتطلب وجود مستمر للعامل، والثاني) أنها تستغرق وقتا طويلا، الثالث) فقد اثنين فقط الغرف واثنين فقط من فحوصات يمكن تشغيلها في وقت واحد، والرابع) صيانة وثيقة ، مثل تغيير الأغشية والمعايرة، ويتطلب الكثير من الوقت والخامس) غرف ليست تستخدم مرة واحدة ويمكن أن تصبح ملوثة مع مثبطات. مزايا oxygraph دقة عالية عبر أجهزة الأكسجين الكهربائي التقليدية البولاروجرافي هي ط) حساسية أعلى، والثاني) أعداد أقل من العينات البيولوجية المطلوبة، ج) يمكن قياس وتيرة التنفس في وقت واحد في غرفتين والرابع) الجهاز قد قلل تسرب الأوكسجين. بعض مزايا oxygraph عالية الدقة على محلل تدفق خارج الخلية هي ط) أقل تكاليفالجهاز والمواد الاستهلاكية وب) الجدوى من بروتوكولات المعايرة الركيزة uncoupler المانع.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية هي القياسات في وقت واحد من التنفس الخلوي، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا، H 2 O 2، ATP والكالسيوم مستويات باستخدام أجهزة الاستشعار البصرية في نفس الغرفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| FCCP | Sigma | C 2920 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | n/a | Automated cell counting instrument |
| Cytochrome c | Sigma | C 7752 | Chemical |
| Digitonin | Sigma | D 5628 | Chemical, dissolve in DMSO |
| DMEM | Gibco | 31966021 | Medium |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| FBS | Gibco | 26010-074 | Medium component |
| Glutamate | Sigma | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Oligomycin | Sigma | O 4876 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
| Trypsin | Sigma | T 4674 | Chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes. PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, P. Cytochrome c binding to enzymes and membranes. Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).
- Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c. Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).
- Gorbenko, G. P. Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer. Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. Mitochondr Physiol Network 17.18. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).
