Summary
Ex vivo הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה לקביעת הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו fluorescently בתוך ובין רקמות או קבוצות טיפול. לעומת זאת, היסטולוגיה קרינה כמוני, בעוד יותר עבודה אינטנסיבית, מאפשרת כימות של רמות הרקמות המוחלטות של מולקולות שכותרתו.
Abstract
תיוג פלורסנט הוא תהליך ומבוסס לבחינת גורלו של מולקולות שכותרתו תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי הוא במבחנת in vivo. בדיקות ניאון הם שימושיות במיוחד בקביעה-ההפצה ביו של מולקולות גדולות מנוהלות, שבו התוספת של תווית ניאון מולקולות קטנות, ישפיע על קינטיקה או ביו-הפצה של המתחם. מגוון שיטות קיימים לבחון ביו-הפצה להשתנות באופן משמעותי את כמות המאמץ הנדרשת והאם המדידות וכתוצאה מכך הם כמוני מלאים, אבל בשיטות מרובות בשיתוף יכולות לספק מערכת מהירה ויעילה לניתוח ביו-הפצות.
Ex vivo הדמיה-איבר שלם היא שיטה שניתן להשתמש בהם כדי להשוות את הריכוזים היחסיים במהירות של מולקולות ניאון בתוך רקמות ובין סוגים שונים של רקמות או קבוצות הטיפול. שימוש plat הדמיהטופס מיועד-חי או הדמיה כולו באיברים, קרינה בתוך רקמות שלמות ניתן לקבוע ללא עיבוד נוסף, תוך חיסכון בזמן עבודה תוך מתן תמונה מדויקת של ביו-ההפצה הכוללת. תהליך זה הנו אידיאלי בניסויים מנסים לקבוע את הספציפיות רקמות של תרכובת או עבור ההשוואה של תרכובות שונות מרובות. היסטולוגיה רקמו כמוני המצד השני דורשת עיבוד נוסף נרחב של רקמות על מנת ליצור מדד כמותי של התרכובות שכותרתו. כדי להעריך ביו-הפצה מדויקת, כל הרקמות של עניין חייבות להיות פרוסות, סרק, ונותחו ביחס עקומות סטנדרטיות כדי לערוך השוואות בין רקמות או קבוצות. היסטולוגיה רקמו כמוני הוא תקן זהב להחלטת ריכוזים מתחמים מוחלטים בתוך רקמות.
כאן אנו מתארים כיצד שתי השיטות ניתן להשתמש יחד ביעילות כדי להעריך את היכולת של שיטות ממשל שונות בתnd שינויים במתחם למקד ולספק מולקולות שכותרתו fluorescently למערכת העצבים המרכזית 1.
Introduction
תיוג פלורסנט הוא שיטה מנוצלת בקלות ויעילה לקביעת החלוקה-ביו של תרכובות, באמצעות מגוון של ציוד המשותף במעבדות רבות. Fluorophores זמין באופן נרחב, יחסית לא יקר, מגיע במגוון של אורכי גל, כך מולקולות שכותרתו מרובות ניתן להשתמש בו זמנית ללא הפרעה. לרובם יש fluorophores מגוון של כימיות עבור נטייה לקבוצות תגובתי שונות על תרכובות מטרה, ותהליך הנטייה הוא פשוט בדרך כלל על מרבית סוגי אתרים תגובתי. בנוסף, הציוד הדרוש לשם המדידות של תרכובות שכותרתו fluorescently נפוצים במעבדות רבות. מיקרוסקופים פלורסנט, הדמיה, וסורקים שקופיות יכולים לשמש בנסיבות שונות, מה שהופך את השימוש של תיוג פלורסנט נגיש מאוד. תוויות פלורסנט משמשים לעתים קרובות כדי לקבוע את חלוקת-ביו קינטיקה של תרכובות הן in vivo לשעבר vivo עם מכשירי הדמיה לחיות, כגון Imager ספקטרום IVIS, ועל ידי היסטולוגיה רקמה כמותית 2,3.
שימוש הדמית vivo לשעבר שלמים באיברים באמצעות התקני הדמיה חיה במהלך השנים גדלות בשל קלות שימוש שלהם ואת היכולת ליצור השוואה מדויקת במהירות של הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו ללא צורך בעיבוד הנוסף של tissues4. עם זאת, בעוד הדמית vivo לשעבר שלם-איבר יכולה לאפשר ניתוח קל והשוואה, זה לא ליצור מדד כמותי של ריכוזי מתחם מוחלטים בתוך רקמה. זאת בשל תופעות פיזור אור בתוך איברים שלמים. מאז פיזור אור (ו, במידה, ספיגה פחותה) משתנה לפי גודל רקמות צפיפות, הדמיה כולו באיברים יכולה לזלזל רמות רקמות באיברים גדולים או צפופים. גיבוש סטנדרטים מתאימים למדידות ריכוז מוחלטות הוא גם קשה כי צריך לחקות את העוביוצפיפות של כל איבר יחיד. מצד השני, הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה קבלת רמות הרקמות היחסיות של סוכן, והוא אידיאלי עבור השוואה ביו-ההפצה היחסית של מולקולות הקשורות מרובות (כגון במחקרי מיקוד סמים). אסטרטגיה חלופית היא להשתמש היסטולוגיה הקרינה כמותי, טכניקה נגזר שיטת autoradiography כמותיים, כדי להשיג רמות רקמות מוחלט של סוכן הבדיקה 5,6. במקום למקם חיה או איבר שלמה לתוך מכשיר דמיון, היסטולוגיה רקמה כמוני דורשת שכל רקמה להיות פרוסה, רכוב על שקופיות, סרק, ונותחה בנפרד. התקנים של סוכן הבדיקה ערוכים ופרוסים באותו עובי כמו דגימות איברים. על ידי גזירה כל האיברים ותקנים באותו עובי, השתנות עקב פיזור או ספיגת האור מתבטלת, ועוצמת הקרינה ברקמות יכול להיות בכושר כדי עקומת סטנדרט לקבוע concent מוחלטמָנָה. אמנם שיטה זו, כאשר נעשה כראוי, הוא כמוני, הוא גם עתירי עבודה כשלה בקלות. בהתחשב באופי מורכב יותר של היסטולוגיה כמותיים העלות הגבוהה יותר באופן משמעותי של עבודה בהשוואת הדמיה כולו באיברים, הוא הופך להיות כדאי לבחון היכן כל תהליך הוא הכי פרקטי להשתמש כאשר בוחן את ההתפלגות ביו של תרכובות שכותרתו fluorescently. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של איך שיטות אלה יכולים לשמש יחד כדי להשוות את ביו-הפצה יעילה של פוליפפטיד אלסטין דמוי שכותרתו rhodamine (ELP), עם או בלי תוספת של פפטידים התא חודר SynB1 או טאט, דרך אפי (IN) ו תוך ורידי (IV) נתיבי ממשל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל שימוש בבעלי חיים בפרוטוקול זה אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש של המרכז הרפואי של אוניברסיטת מיסיסיפי.
1. טיפול בבעלי חיים ורקמות
- מנהל וקרבה
- להרדים את החיות באמצעות isoflurane 3% במשך 5 דקות ולאמת את עומק ההרדמה על ידי התבוננות בהעדר רפלקס הבוהן קמצוץ. החל משחת וטרינרים על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
- לשקול את החיה פיפטה מנה 50 מ"ג / ק"ג של ELP או rhodamine שכותרתו, SynB1-ELP, או טאט-ELP לתוך צינור 1.5 מ"ל. שמור 100 μL של תרכובות שכותרתו מנוהל על ניסוח של עקומות סטנדרטיות, בשלבים מאוחרים יותר.
הערה: חשוב כי הסטנדרטים להתבצע מאותה אצווה של חלבון הנקרא מנוהל על בעלי חיים על מנת למנוע הבדלים עקב השתנות יעילות תיוג פלורסנט. על מנת להסיר פלורסנט רקע כראוידעך ממדידות הקרינה מאוחר יותר, חיה מטופל חייב להיות מוקרב באמצעות אותן שיטות / ריאגנטים כמו קבוצת החיות שטופלה. - נהל זריקה IV כפי שתואר לעיל 1 או באמצעות וריד הזנב או וריד הירך (אשר הגישה דרך חתך 1 ס"מ במפשעה). על שיכוך כאבים, אם ביצוע חתך במפשעה, לנהל מתחת לעור carprofen במינון של 5 מ"ג / קילו, ולהחיל sensorcaine לאתר החתך לפני סגירה עם קליפ פצע. על מנת לנהל את דרך המסלול אפי (IN), והמקום החי במצב שכיבה.
- בעזרת פיפטה 2-μL, להכין ירידה של 1-μL של המתחם שכותרתו. בקצרה להחליק את הראש של החיה מן צווארון ההרדמה כדי לאפשר גישה אל nares.
- הניחו את קצה פיפטה כדי פתיחתו של Nare אחת ולאט לאט לוחץ על המתג, המאפשר אגל לרוץ במורד Nare לתוך חלל האף. חזור על כל 1 דקות, לסירוגין nares כל טיפה עד המינון המלא הוא מודעכהן.
הערה: הנפח המקסימאלי מנוהל באמצעות IN לא יעלה על 10 - 15 μL עבור עכברים. - השאירו את חיות במצב שכיבה בהרדמה למשך 10 דקות לאחר מתן הסופי לפני שעבר אותם זה בכלוב הפרט.
הערה: אל תשאיר חיות ללא השגחה עד שהם להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. - 1 שעות לאחר הממשל, מחדש להרדים את החיות כמו קודם ולהקריב אותם דרך זלוף transcardial באמצעות PBS (210.0 מ"ג / L KH 2 PO 4, 9,000.0 מ"ג / L NaCl, 726 מ"ג / L Na 2 HPO 4 .7H 2 O) ב 10 mL / min עבור סכום כולל של 20 מ"ל.
הערה: זלוף של בעלי חיים שנמצאים להקריב כדי להסיר את כל הדם מן הרקמות נדרש לקבוע את ריכוזי extravascular של תרכובות שכותרתו. ריאגנטים זלוף יכולים לגרום שינויי קרינת רקע צריכים להישמר עקבי. שיטת ההקרבה צריכה להיות עקביתבתוך קבוצות. שיטות שונות של קרב יכולות לגרום רמות משתנות של דם בתוך כלי הדם, שינוי קרינת הרקע של הרקמות.
- אוסף של רקמות
- כן PBS כמתואר לעיל לשטיפת הרקמות הוסרו.
הערה: אם חיץ אחר שמש נוזל זלוף, לשטוף רקמות באותו החיץ. - הסר את הלב, ריאות, קיבה, כבד, טחול, וכליות ידי לנתיחה פשוטה. בקצרה לשטוף ב PBS לפני שימוש במעבדת המגבונים ללטף יבשים או פתיל משם לחות עודפת והצבת הרקמות על שטיח ההדמיה.
- לערוף את העכבר להסיר את החלק העליון של הגולגולת באמצעות חותכי עצם או rongeurs. בעזרת מלקחיים, להסיר את המוח בקפידה, תוך שמירה על נורות חוש הריח ללא פגע. לשטוף, יבש, ומניחים אותו על המזרן הדמיה מסופק.
- כדי להסיר את חוט השדרה באמצעות פליטה מהירה 7, למלא מזרק 10 מיליליטר עם PBS ולצרף מחט 18-מד עמומה.
הערה: 18 מתאים מדהתעלה מבוגר השדרה של קווי עכבר רבים. הקוטר הנדרש ישתנה בהתאם לגודל חיה. - מניח את החיה במצב נוטה, על מנת להבטיח כי פתיחת תעלת השדרה באתר עריפת הראש נחתכה בצורה נקיה ונטולת דם.
- הסר את העור מרחב עמוד השדרה. שימוש חותך או מספרי עצם חדים, לחתוך דרך עמוד השדרה בחלק המותני המקורי ישירות הירכיים.
- בקצרה לשטוף אותו עם PBS כדי להמחיש את תעלת השדרה. הכנס בעדינות את המחט לתוך תעלת השדרה.
הערה: המחט צריכה להרגיש חמה והן עשוי לחייב כמה מתגלגלים באטיות הלוך ושוב במהלך החדרה. האם המחט להרגיש משוחררת, חתך מקורי יותר יכול להתבצע או מחט בקוטר גדול יותר עשוי להיות נחוץ. - באמצעות האגודל ואצבע מורה, תפעיל לחץ על עמוד השדרה סביב המחט המוכנסת. לוחץ על המתג עם לחץ מתון וקבוע. חוט השדרה יהיה להוציא החוצה ללא פגע של הפתיחה המקורית של השדרהטור.
הערה: הסרה מלאה, שטיפה, ייבוש של כל האיברים העיקריים ניתן להשלים באופן סביר ב 5 - 7 דקות. זמן קצר זה מונע את הצורך באחסון הוארך ב PBS, אשר עלול לגרום לחשיפה המוגזמת לאור השטיפה של חלבונים שכותרתו מן הרקמה.
- כן PBS כמתואר לעיל לשטיפת הרקמות הוסרו.
2. דימות פלואורסצנטי גופיים Whole-איבר
- פרמטרי הדמיה
- הפעל את תוכנת רכישת תמונה. בפינה השמאלית התחתונה של לוח בקרת רכישה, לחץ על "לאתחל".
- תחת "מצב הדמיה", בחר את תיבת הסימון "ניאון". תחת "זמן החשיפה", בחר "אוטומטי".
- תחת "binning", בחר "קטן" ולהגדיר את F / Stop ל -2.
- בחר את עירור 535 ננומטר ומסננים פליטה 580 ננומטר.
הערה: זה ישתנה בהתאם על התווית בשימוש. - בחר "של שדה נוף B" ולהגדיר את targeגובה t ל -0.3 ס"מ.
הערה: זה ישתנה בהתאם על הרקמות להיות צלם. - לאחר מחוון טמפרטורה נצבעת בירוק (כלומר המכונה מאותחל באופן מלא), הצב את רקמות על השטיח רקע שחור שסופק, וודא כי רקמות מופרדים לחלוטין זה מזה. מניח את המחצלת התרמית, להבטיח כי כל הרקמות בתוך רשת האזור הנבחרת. Larger ורקמות הלא הומוגנית, כגון כבד השלם, צריכות להיות ערוכות על מנת להפחית את החפיפה של האונות.
הערה: רקמות ניתן לארגן יחד בקבוצה אחת, המאפשרות תמונה אחת כדי להכיל חיה אחת או בכל הרקמות מסוג דומה. זה עושה ניתוח וארגון קל בהמשך. אם הבדלים גדולים בעוצמת קרינה נמצאים בין רקמות שונות, עדיף לדמות אותם בנפרד או כקבוצות מאותו סוג הרקמה, כתקופת חשיפה יחידה לא יכולה להיות אידיאלית עבור כל עוצמות הרקמות. - לחץ "רוכש".
- לאחר הדמיה, להסיר את הרקמות מיד ולאחסן או להקפיא אותם עבור היסטולוגיה כמותי, כפי שמתואר בשלב 4.
התקני 3. עיבוד תמונה
- תקנים
- ב PBS, ליצור דילולים סדרתי כפולה של כל חלבון משמש לטיפול של חיות, החל בריכוז המקורי, עם סך של 15 דילולים.
הערה: טווח הריכוז צריך לשאוף לכלול את ריכוזי רקמות הצפויים והן עשוי לחייב דילולים נוספים של המדגם המקורי, תלוי בריכוז ההתחלתי. - פיפטה 100 μL של תקן זה לתוך זה גם צלחת 96-היטב שחורה. כלול גם אחד PBS הטהור להשיג מידה של קרינת רקע.
- תמונה בסטנדרטים עם אותם הפרמטרים המשמשים הדמית הרקמות.
- בתוכנת רכישת תמונה "Palette Tool" תחת "כלי ROI," לבחור "את האזור של העניין (ROI") מעגל לצייר את ההחזר על ההשקעה סביב אחד טוב. העתק כי החזר על השקעה לכל בארות מולא האחרות ולחץ על "למדוד את ROIs."
- הפחת את הערך היעיל קורנת ממוצע של PBS הטהור מן הערכים של סטנדרטים האחרים; זה מסיר את קרינת הרקע. עלילת הערכים נגד הריכוז הידוע על עלילת פיזור.
הערה: המשוואה וכתוצאה מכך של קו המגמה ליניארי לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לחשב את ערך הקרינה היחסי.
- ב PBS, ליצור דילולים סדרתי כפולה של כל חלבון משמש לטיפול של חיות, החל בריכוז המקורי, עם סך של 15 דילולים.
- עיבוד תמונה
- בתוכנת רכישת תמונה, בחר בכלי ROI החופשיים ולהסיק ROIs סביב כל רקמות הפרט. לחץ על "קנה מידה."
- עם מדידות יעילות קורנת הממוצע שהתקבל, כך להפחית את הערכים הנמדדים מן החיה מטופל לכל סוג רקמות לשרטט ערכים אלה על עקומת סטנדרט שנוצר בעבר.
הערה: ערכי הקרינה יחסיים וכתוצאה לספק תמונת מצב מהירה ומדויקת שלbiodistribution של המתחם שכותרתו.
4. היסטולוגיה רקמות כמוני
- הכנה והקפאה של רקמות עבור חיתוך
- יצירה או לרכוש מכולות בגודל מספיק להקפיא את הרקמות נבחרו cryostat לשמש. גלישת רדיד אלומיניום סביב אובייקט בגודלו ובצורתו כראוי ועובד היטב.
- הכינו תערובת של isopropanol וקרח יבש על ידי מילוי חצי כוס 500 מ"ל עם קרח יבש והוספת ~ 350 מ"ל של isopropanol כך שיש נזילים מספיקים מעל קרח יבש כדי להטביע את מיכל הקפאה חלקית.
הערה: חנקן נוזלי לעתים קרובות תוצאות השבר של מתחם טמפרטורת חיתוך האופטימלי (אוקטובר), ורקמות מוטבעות יש להימנע. - מלאו את מיכל הקפאה חלקית עם אוקטובר, להבטיח כי אין בועות בהווה. אם יש בועות, לעבוד בועות מתוך פתרון באמצעות מלקחיים או דומה ליישום.
- הסרת הרקמהמ PBS ויבש אותו ביסודיות, בין אם על ידי ללטף אותה בעדינות עם מעבדה לנגב או על ידי נגיעת הקצוות של רקמות עדינות למעבדת לנגב ומאפשר לנוזל פתיל משם.
- הנח את הרקמה בעדינות לתוך ב- OCT בתוך המכל המקפיא, הבטחה לא להכניס בועות מתחת הרקמות. לאחר הרקמה נמצאת במקום, להוסיף אוקטובר עד הרקמה מכוסית לחלוטין.
- להטביע את מיכל הקפאה ככל אפשרי מבלי לאפשר isopropanol לבוא במגע עם ב- OCT חשוף בתוך המכל. אפשר 30 - 90 s (או פוטנציאל יותר עבור רקמות גדולות יותר) עבור ב- OCT והרקמות להקפיא לחלוטין לפני האחסון ב -80 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל הדרוש.
- הכנת תקנים עבור חיתוך.
- להכין כראוי תווית 1 מ"ל מזרקים לשימוש חד-פעמי על ידי הסרת סוף החבית, כך אורכו של המזרק הוא בקוטר אחד. זה יאפשר הגליל הקפוא להידחף החוצה מאוחר יותר.
- לָנוּing אוקטובר, ליצור דילול סדרה כפול 15-צעד של תרכובות מנוהלות, כפי שנעשה עם PBS בעבר, אבל עם נפח וכתוצאה סופי של 1 מיליליטר. כלול דגימה אחת של אוקטובר הטהור להסרת ערכי קרינת רקע.
- הצמיגות של OCT עושה ערבוב נאות קשה. להפוך את הצינורות ולאפשר ב- OCT להתיישב לחלוטין לפני היפוך שוב. חזור על 10 זה - 20 פעמים כדי להבטיח תערובת אחידה. שמור על פתרונות סטנדרטיים ב 4 ° C, הרחק מן האור במהלך ערבוב.
- לאחר ערבוב, שוב להכין תערובת של isopropanol וקרח יבש, כמו קודם.
הערה: חנקן נוזלי יכול לשמש גם במקום של תערובת קרח isopropanol / יבש, ובלבד המזרקים יוסרו במהירות אחרי שהם קפואים לגמרי. - צייר את תקן אוקטובר לתוך המזרק, מקפיד להכניס בועות מעטות ככל האפשר. לאחר עריכת הפתרון אוקטובר, מיד לטבול את המזרק ישירות לתוך isopropanol ולאפשר הפתרון להקפיא לחלוטיןבתוך המזרק במשך 10 - 20 שניות. אחסן את המזרקים ב -80 מעלות צלזיוס למשך ככל שיידרש.
- חיתוך של רקמות ותקנים
- מניח שני רקמות ותקינות -20 מעלות צלזיוס ולאפשר מספיק זמן עבור כל הדגימות להגיע לטמפרטורה.
הערה: טמפרטורת החיתוך האידיאלית בדרך כלל נופלת סביב טווח -10 מעלות צלזיוס במשך רוב הרקמות, אך בסופו של דבר תלוי בגודל רקמות שומן וחייבת להיות מעודנת אמפירי. - באמצעות cryostat, לחתוך רקמות לפרוסות בעובי 20 מיקרומטר ו לעגן אותן על גבי שקופיות, כפי שתואר לעיל 8. אחסן את השקופיות ב -20 ° C ולהרחיק אותם מן האור ככל האפשר במהלך חיתוך לסיום הסריקה.
הערה: חשוב כאן שהקטעים להימדד מופצים כראוי לכל עובי של הרקמה. - כדי לעלות את הסטנדרטים על צ'אק cryostat, לקחת את המזרק מהמקפיא ולחמם מבחוץ במשך 3 - 5 ימים על ידי חולדינג אותו ביד. דחוף את הבוכנה עד קטע קצר (~ 1 ס"מ) של גליל אוקטובר הוא מחוץ המזרק.
- באמצעות סכיני גילוח, לחתוך דרך הגליל ומקום סעיף גליל וכתוצאה בניצב על צ'אק, באמצעות אוקטובר כדי להחזיקו במקום. תצורה זו צריכה לגרום עיגולים מוגדרים היטב להיחתך.
- פורס את הגלילים ב 20 מיקרומטר, צבת פרוסה אחת מכל דילול לשקופית אחת, כך שקופית אחת מייצגת את העקומה הסטנדרטית כולו. אחסן את השקופיות ב -20 ° C עד מוכן לסריקה.
- מניח שני רקמות ותקינות -20 מעלות צלזיוס ולאפשר מספיק זמן עבור כל הדגימות להגיע לטמפרטורה.
- סריקת כימות
- הפעל את תוכנת מערך סריקה ולחץ על "543 לייזר" כדי להתחיל את הליך ההפעלה של הלייזר. חכו 15 דקות עבור לייזר כדי להתכונן.
- לאחר הליזר הוא מוכן, הוצא את השקופיות מ -20 ° C ולהעביר אותם לתוך מיכל גדול, אור-מוגן להגיע לטמפרטורה ו להתייבש במשך 3 דקות. זה ימנע הצטברות לחות SLIסורק דה.
- טען את השקופית לתוך כלי קיבול השקופית בסורק שקופיות. לחץ על "סרוק" ובחר "להפעיל סריקה קלה."
- הגדר את רזולוציית הסריקה 50 מיקרומטר.
- סמן את תיבת הסימון "השתמש" הראשון תחת "Fluorophore" ובחר "TRITC." קבע את הרווח PMT עד 80%.
הערה: הגדרות אלה ישתנו בהתאם fluorophore ואת ריכוז של מולקולות שכותרתו. - בצד השמאלי, להבטיח כי אזור הסריקה כולל את השקופית כולה. לחץ על "התחל".
- לאחר הסריקה, בחר "קובץ" ו "שמור בשם", ולאחר מכן לשמור את התמונה בתור tif.
הערה: שקופיות של רקמות וסטנדרטים יש לסרוק על אותן ההגדרות. - טען את התמונות המתקבלות לתוך ImageJ ובחר ROIs סביב הרקמות ותקנים. בכרטיסייה "לנתח", ונבחר "סדרת מדידות" ובחר "אומר ערך אפור." לחץ220; מידה ".
הערה: כמו עם הטכניקה הקודמת, קרינת רקע חייבת להיות מופחתת מכל הערכים הנמדדים. - מגרש את מדידות שווי אפור הממוצעות מן הסטנדרטים נגד הריכוז הידוע ליצור עקומת סטנדרט.
הערה: המדידות הנובעים הרקמות צריכות להיות בממוצע בתוך כל רקמה זממו על כי עקומת סטנדרט לקביעת הריכוז בתוך הרקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנתונים שלהלן מתארים את המסירה של שלושת המתחמים: וקטור להולכת תרופות המכונה ELP ואת שתי גרסאות של ELP שונה עם פפטידים חודר תאים (SynB1-ELP ו טאט-ELP) 9. כל שלושת המתחמים תויגו עם tetramethylrhodamine-5-maleimide ונמסרו באמצעות שני מסלולים הממשל (IN ו- IV). מטרת המחקרים הללו הייתה לקבוע אילו מתחם ותוואי ממשל יביא החדירה הכי הטובה למערכת העצבים המרכזית (CNS) 3.
איור מציג 1A נציג לשעבר vivo תמונות-איבר שלם של איברים קבוצת החיות שטופלה. ההצגה על גבי המפה החומה מראה את רמות הקרינה יעילה קורנים בתוך הרקמות. על ידי ציור ROIs סביב רקמות פרט על ידי התוויית הערכים האלה על עקומת הסטנדרט המתאימה, ערכי קרינה סטנדרטיים באיור 1B נוצרים. Fluorescen הסטנדרטיתערכים ce לאחר מכן ניתן להשתמש להשוואות מדויקות של הריכוזים היחסיים של תרכובות שונות. נתונים אלה לתאר במדויק הם את השפעת שינוי ELP על החדירה לרקמות ספציפיות, כמו גם את ההשפעה של מסלול ממשל על כל מתחם. עם תוצאות אלה, ברור מיד כי משלוח ELP באמצעות הממשל הוא השילוב היעיל ביותר להגיע CNS.
למרות שתוצאות אלה לעזור לקבוע את שיטת המתחם המסירה הטובה ביותר חודר, הם לא מתארים את הריכוז בפועל או לוקליזציה האזורי של תרכובות בתוך מערכת העצבים המרכזית. היסטולוגיה כמותי ולכן הוא מתאים ביותר כדי להשלים את התיאור של ביו-ההפצה של תרכובות אלה, שכן היא מאפשרת מדידות כמותיות של האזורים במוח שנבחרו. איור 2 א מציג פרוסה נציג החיות שטופלו לפי ELP, ואיור 2B מתאר כימות של ROIs הפרדתנורה חוש ריח, ההמיספרות, ואת המוח קטן. מנתונים אלו, ברור כי בעוד ממשל ELP ידי התוואי עלול לגרום בריכוזים גבוהים CNS, הוא עושה זאת בעיקר נורה המוח הקטן חוש ריח. לעומת זאת, ELP נמסר יש IV ריכוזים כוללים נמוכים יותר, אבל זה מחולק באופן שווה בכל רחבי המוח. בהתאם ליעד של תרכובות המנוהלות אלה פוטנציאל תופעות באיברים אחרים, דרך או ממשל IV עשוי להיות הבחירה הטובה יותר. זה לא יכול להסתיים בלי התוספת של היסטולוגיה כמותית. מבחינה טכנית, היסטולוגיה כמותיים אפשר היה לנצל בכל רקמות של כל קבוצה, אלא על ידי ניצול שתי השיטות יחד, הרבה זמן ועבודה ניצל ועדיין וכתוצאה מכך לאותה מסקנה.
איור 1: Ex Vivo Whole-איבר קרינהמידות. א) נציג תמונות מקבוצת ELP. סולם מפת החום נקבע ליום יעילות קורן. B) ערכים יעילים קורנים ממוצע המתקבלים יצירת ROIs סביב רקמות הפרט כי נותחו על עקומת סטנדרט כדי ליצור את ערכי קרינה הסטנדרטיים המשמשים להשוואה של הפצות ביו. ברי שגיאה מייצגים SEM. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. (השתנה מ מקגואן, ואח ';. והתרופות עיצוב, פיתוח, ותרפיה; 2016) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מדידות היסטולוגיה רקמות כמוני. א) תמונת נציג ELP-או חיות שטופל IV נוצרו על ידי מוח חיתוך 20 מיקרומטר עבים לתלייה הפרוסה oשקופיות n, ולאחר מכן סריקה אלה שקופיות באמצעות סורק שקופיות קרינה. B) ערכים ממוצעים המתקבלים יצירת ROIs סביב הנורה חוש הריח, ההמיספרות, המוח הקטן, נמדד כערך האפור המרושע לנכון עקומת סטנדרט ליצור מדידות ריכוז מיקרוגרם / מיליליטר. ברי שגיאה מייצגים SEM. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. (השתנה מ מקגואן, ואח ';. והתרופות עיצוב, פיתוח, ותרפיה; 2016) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד הדמית vivo לשעבר שלמים באיברים היא פשוטה בדרך כלל, ההדבקות כמה מושגים בסיסיים וטכניקות יכולות לשפר את הדיוק של מדידות ביו-הפצה. אורכי גל קצרים של ניסיון אור רמה גבוהה של פיזור וספיגה ברוב הרקמות, אשר באופן משמעותי משפיע על השירות של fluorophores-אורך הגל הקצר. fluorophores אלה מוגבלות יישום במחקרי רקמות עמוקות, אבל הם שמשו ביעילות בניסויים מסתכלים רקמות משטח או לתוך העין. לעומת זאת, אורכי גל ארוכים של אור לעבור באופן משמעותי פחות פיזור וספיגה, וכתוצאה מכך חדירה רבות יותר ותוצאות מדויקות יותר עם רקמות עבות 10. Fluorophores אשר נופל רחוק אינפרא אדום-אדום הקרוב (NIR) הטווח (עירור ~ 600 ננומטר) של הספקטרום נבחר בדרך כלל לבעלי חיים שלמים או רקמות גדולות. בניסויים באמצעות fluorophores ארוך הגל אלה, הקרינה האוטומטית של tis בפרטתובעת או חומרים הוא שיקול מרכזי סביר. לדוגמה, המרה בתוך כיס המרה של מכרסמים מאוד אוטומטי פלורסנט באורכי גל של 500 - טווח ננומטר 600. בגלל זה יכול מאוד להטות ערכים כבדים, הוא לעתים קרובות טוב ביותר כדי להסיר את כיס המרה לפני ההדמיה. לחלופין, אם הכבד השלם כיס מרה נדרש, בחירת fluorophore עם גל עירור בסוף רחוק מאוד של הספקטרום יכולה להגביל את השפעתם של פלואורסצנציה האוטומטית המרה. בנוסף, חלק ניכר מן Chows המכרסם הנפוץ לכלול אספסת unpurified, אשר מאירה מאוד ברחבי אמצע ומרחיקות הטווחים של הספקטרום. אם התוויות נבחרו לנפול בתוך באורכי גל אלה ואת מערכת העיכול היא להיות צלמה, שינוי בתזונה הוא האפשרות הטובה ביותר סביר.
בעוד מערכות הדמיה לחיות נועדו למדוד רקמות עבות במדויק, עם הלא הומוגנית עבות במיוחד רקמות (למשל, כבדי עכברוש שלמים), מדידות מדויקות יותר יכולות לעתים קרובותen להיות מושגת על ידי הפצת ממחטת נייר, כך האונות של הכבד חופפים מעט ככל האפשר. כמו כן, במקרים בם יש רקמות חלוקות מוטה מאוד של מולקולות שכותרתו, הדמיה מן מרובי צידי הרקמה והעמידו ממוצע מדידות אלה עשויות לשפר את רמת הדיוק. בסופו של דבר, סוגי הרקמות להיות צלמו, את הקרינה האוטומטית של חומרים הקשורים ברקמות אלו, ואת ההפצה פוטנציאל של מולקולות שכותרתו מנוהלות יש לשקול בזהירות על מנת לבחור fluorophore עם אורכי גל העירור ופליטה המתאימים מגביל התערבות רבה ככל האפשר.
בעת ביצוע היסטולוגיה רקמה כמוני, ישנם מספר פרטים חשובים שכדאי לזכור. על מנת להשיג את התוצאות לדייק, פרוסות חייבות להילקח ברחבי הרקמה או האזור כולו להיות מנותח. משמעות הדבר היא כי רקמות אלה לא תהיינה זמינות עבור תהליכים אחרים. ייתכן שניתן יהיה לתקן כתם לאחרסריקה, אבל זה בדרך כלל טוב ביותר כדי לאפשר את הפרוסות להתייבש מעט לפני שמכניס אותם לתוך הסורק, שעלול להשפיע מכתים בעתיד. כמו כן, הסריקה תגרום רמה מסוימת של צילום לבן, הפחתת אות הפוטנציאל בתהליכים הבאים. עבור יישומים במיקרוסקופ במורד הזרם, סעיפים מעולה בדרך כלל מושגות על ידי תיקון רקמות equilibrating אותן בתמיסה סוכרוז לפני חתך. עם זאת, תהליך זה הוא נמנע הטוב ביותר בפרוטוקול היסטולוגיה הכמותיים לעיל בשל השפעות של קיבעון ו / או סוכרוז ארוך נספג על עוצמת הקרינה. כמו כן, בהתאם לכמות של הווה אות, פרוסות עלולות להיתקל צילום הלבנה אם חשופות אפילו לרמות נמוכות של אור הסביבה. שמירה על השקופיות קרות הרחק מאור תשפר משמעותית את הדיוק של מדידות וכתוצאה מכך. בסך הכל, טיפול והכנה זהירים יכולים לשפר את התוצאה הסופית דרסטי.
יש מגוון של אחריםהשיטות הננקטות לחקר ביו-הפצה הפרמקוקינטיקה של מקרומולקולות מנוהל המשתנות נרחב הקושי הטכני, תפוקה, דיוק, ואת הציוד הנדרש 11. immunoassays כמוני מבחני פעילות ביולוגיים הן יכולים להיות מסובכים טכניות ודורשים נוגדנים או חומרים כימיים ספציפיים המולקולות המנוהלות, מוסיפים תוספת משמעותית את העלות והעבודה. שיטות מרובות המבוססות על תיוג רדיואיזוטופיים שמשו בעבר, עם משתנה דיוק, אבל השילוב של רדיואיזוטופים אל מקרומולקולות, כמו גם האוסף של המידע עצמו, יכול דורש הכנה משמעותית ולעתים קרובות יכול לדקלם רקמות שמישות לחלוטין עבור מנתח 12 נוסף. לבסוף, שיטות אחרות כיעילה, כולל טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים ו ספקטרומטריית מסה, הם בדרך כלל מנועה פשוט בגלל חוסר הציוד הנדרש. הפרוטוקול המתואר לעיל משתמש בשתי שיטות בשיתוף לקביעה ביעילות הדואר ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו בצורה מהירה, חסכונית, מדויק, ונגיש בשל availably הקבוע של הציוד הנדרש.
שיטה זו שימשה כדי להפיק את הנתונים לעיל, זיהוי המסלול וקטור ומינהל הטוב ביותר עבור משלוח של מולקולות שכותרתו אל מערכת העצבים המרכזית. מהנתונים vivo לשעבר, ELP מנוהל ו ELP מנוהל IV זוהו לאפיון נוסף באמצעות היסטולוגיה רקמה כמותית. היסטולוגיה רקמה כמותי אז סיפק הריכוזים של מולקולות שכותרתו באזורים ספציפיים של מערכת העצבים המרכזית, המאפשר להיגרר המסקנות הסופיות. שתי השיטות יחד מייצגות דרך מהירה ויעילה כדי לבצע בחינה מפורטת של ביו-ההפצה של תרכובות מסוימות מרובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
