Summary
فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة لتحديد التركيزات النسبية للمركبات fluorescently المسمى داخل وبين الأنسجة أو مجموعات العلاج. على العكس من ذلك، كمية الأنسجة مضان، في حين أن أكثر كثيفة العمالة، يسمح لتقدير مستويات الأنسجة المطلقة من الجزيئات المسمى.
Abstract
وضع العلامات الفلورية هو عملية راسخة لدراسة مصير الجزيئات المسمى في إطار مجموعة من الظروف التجريبية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية. تحقيقات الفلورسنت مفيدة بشكل خاص في تحديد التوزيع الحيوي من الجزيئات الكبيرة التي يديرها، حيث إضافة تسمية فلوري جزيء صغير من غير المحتمل أن تؤثر على حركية أو توزيع الحيوي للمجمع. مجموعة متنوعة من أساليب وجود لدراسة توزيع الحيوية التي تختلف بشكل كبير في مقدار الجهد المطلوب وعما إذا كانت القياسات الناتجة بشكل كامل الكمية، ولكن باستخدام أساليب متعددة بالتزامن يمكن توفير نظام سريع وفعال لتحليل-توزيعات الحيوي.
فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز هو الطريقة التي يمكن استخدامها لمقارنة بسرعة تركيزات النسبية للجزيئات الفلورسنت داخل أنسجة وبين أنواع متعددة من الأنسجة أو مجموعات العلاج. باستخدام بلات التصويرالنموذج المعد لالحيوانات الحية أو التصوير كامل الجهاز، مضان داخل أنسجة سليمة يمكن تحديد دون مزيد من المعالجة، وتوفير الوقت والعمل في الوقت الذي توفر صورة دقيقة عن مجمل توزيع الحيوي. هذه العملية هي مثالية في التجارب محاولة تحديد خصوصية نسيج مركب أو المقارنة بين مركبات مختلفة متعددة. الأنسجة الأنسجة الكمية من ناحية أخرى تتطلب مزيد من المعالجة واسعة من الأنسجة من أجل إنشاء مقياس كمي للمركبات المسمى. إجراء تقييم دقيق الحيوي التوزيع، جميع أنسجة الفائدة يجب أن تكون شرائح، مسح، وتحليل نسبة إلى منحنيات القياسية من أجل إجراء مقارنات بين الأنسجة أو مجموعات. الأنسجة الأنسجة الكمية هي المعيار الذهبي لتحديد تركيز مركب المطلقة داخل الأنسجة.
هنا، نحن تصف كيف كلتا الطريقتين يمكن استخدامها معا بشكل فعال لتقييم قدرة أساليب إدارة مختلفةالثانية التعديلات مجمع لاستهداف وتقديم جزيئات fluorescently المسمى إلى الجهاز العصبي المركزي 1.
Introduction
وضع العلامات الفلورية هو طريقة استخدامها وفعالة بسهولة لتحديد التوزيع الحيوي للمركبات، وذلك باستخدام مجموعة من المعدات التي هي مشتركة بين العديد من المختبرات. وFluorophores على نطاق واسع، وغير مكلفة نسبيا، ويأتي في مجموعة متنوعة من الأطوال الموجية، بحيث متعددة وصفت الجزيئات يمكن استخدامها في وقت واحد دون أي تدخل. معظم fluorophores لديها مجموعة من كيمياء لتصريف الافعال لمختلف المجموعات رد الفعل على المركبات المستهدفة، وعملية اقتران واضح ومباشر عموما لمعظم أنواع المواقع التفاعلية. بالإضافة إلى ذلك، المعدات اللازمة لقياس المركبات fluorescently المسمى شائعة في العديد من المعامل. المجهر الفلورسنت، والتصوير، والماسحات الضوئية الشرائح يمكن لجميع استخدامها في ظروف مختلفة، مما يجعل استخدام العلامات الفلورية الوصول للغاية. وكثيرا ما تستخدم تسميات الفلورسنت لتحديد توزيع الحيوية وحركية من المركبات على حد سواء في الجسم الحي وخارج فيفس مع أجهزة التصوير الحية، مثل الطيف IVIS تصوير، والأنسجة الأنسجة الكمية 2،3.
وقد زاد استخدام خارج الجسم الحي التصوير كامل الجهاز باستخدام أجهزة الحية التصوير مع مرور الوقت نظرا لسهولة استخدامها والقدرة على خلق بسرعة إجراء مقارنة دقيقة لتركيزات النسبية للمركبات وصفت دون الحاجة إلى مزيد من المعالجة tissues4. ومع ذلك، في حين فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز يمكن أن تسمح لتحليل سهلة والمقارنة، فإنه لا تولد مقياس كمي للتركيز مركب المطلقة داخل الأنسجة. ويرجع ذلك إلى آثار تشتت الخفيفة داخل أجهزة سليمة هذا. منذ تشتت الضوء (وإلى حد أقل، الامتصاصية) يختلف حسب حجم الأنسجة وكثافة، ويمكن تصوير كامل الجهاز يقلل مستويات الأنسجة في أجهزة كبيرة أو الكثيفة. وضع معايير مناسبة لقياس تركيز المطلقة هي أيضا صعبة لأن واحدا يجب أن تحاكي سمكوكثافة كل جهاز على حدة. من ناحية أخرى، والتصوير كامل الجهاز هو طريقة سريعة للحصول على مستويات الأنسجة النسبية للعامل، وأنها مثالية للمقارنة بين النسبي الحيوي توزيع ذات الصلة متعددة الجزيئات (كما هو الحال في الدراسات التي تستهدف المخدرات). استراتيجية بديلة هو استخدام الأنسجة مضان الكمية، وهي تقنية مشتقة من طريقة تصوير الإشعاع الذاتي الكمي، للحصول على مستويات الأنسجة المطلقة من وكيل اختبار 5،6. بدلا من وضع كامل الحيوان أو جهاز إلى جهاز تخيل، تتطلب الأنسجة الأنسجة الكمية التي يتم شرائح كل الأنسجة، التي شنت على الشرائح، وفحصها، وتحليلها بشكل فردي. يتم إعداد معايير وكيل اختبار وشرائح في سمك نفس العينات الجهاز. من خلال قطع جميع الأجهزة ومعايير لنفس السمك، والقضاء على التباين يرجع ذلك إلى تشتت الضوء أو الامتصاصية، وكثافة مضان الأنسجة يمكن أن يكون لائقا لمنحنى القياسية لتحديد تناسق المطلقحصة. في حين أن هذا الأسلوب عندما يوظف بشكل صحيح، هو الكمي، كما أنها كثيفة العمالة وأسيء التعامل معها بسهولة. ونظرا لطبيعة أكثر تعقيدا من الأنسجة الكمية والتكلفة أعلى بكثير من العمل بالمقارنة مع التصوير كامل الجهاز، فإنه يصبح من المفيد دراسة حيث كل عملية هي الأكثر عملية لاستخدامها عند النظر في توزيع الحيوي لمركبات fluorescently المسمى. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية هذه الأساليب يمكن أن تستخدم جنبا إلى جنب لمقارنة كفاءة توزيع الحيوي من المسمى رودامين الإيلاستين مثل ببتيد (ELP)، مع أو بدون إضافة SynB1 أو تات الببتيدات اختراق الخلية، عن طريق الأنف (IN) وعن طريق الوريد (IV) طرق الإدارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع استخدام الحيوانات في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من المركز الطبي بجامعة ميسيسيبي.
1. علاج الحيوانات والأنسجة
- إدارة والتضحية
- تخدير الحيوانات باستخدام 3٪ الأيزوفلورين لمدة 5 دقائق والتحقق من عمق التخدير عن طريق ملاحظة غياب منعكس إصبع القدم قرصة. تطبيق مرهم البيطرية للعيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- وزن الحيوان وماصة 50 ملغم / كغم من ال المسمى رودامين إما ELP، SynB1-ELP، أو تات-ELP في أنبوب 1.5 مل. انقاذ 100 ميكرولتر من المركبات المسمى تدار لصياغة المنحنيات القياسية في خطوات لاحقة.
ملاحظة: من المهم أن المعايير أن تكون مصنوعة من نفس دفعة من البروتين المسمى تدار على الحيوانات من أجل تجنب الخلافات بسبب التباين في الفلورسنت تصنيف كفاءة. من أجل إزالة fluores الخلفية بشكل صحيحcence من قياسات مضان في وقت لاحق، لا بد من التضحية حيوان غير المعالجة باستخدام نفس الأساليب / الكواشف مثل الحيوانات المعالجة. - إدارة حقنة الرابع كما هو موضح سابقا 1 باستخدام الوريد ذيل أو الوريد الفخذي (التي يتم الوصول إليها عن طريق 1 سم شق في الفخذ). لتسكين الألم، إذا جعل شق في الفخذ وإدارة تحت الجلد كاربروفين بجرعة 5 ملغ / كغ، وتطبيق sensorcaine إلى موقع شق قبل الإغلاق مع مقطع الجرح. لإدارة من طريق الأنف (IN)، وضع الحيوان في موقف ضعيف.
- باستخدام ماصة 2 ميكرولتر، وضع قطرة 1 ميكرولتر من المجمع المسمى. لفترة وجيزة الشريحة رأس الحيوان من ذوي الياقات البيضاء تخدير للسماح بالوصول إلى فتحتي الأنف.
- مكان غيض من ماصة لافتتاح n هل واحد وخفض ببطء الغطاس، مما يسمح الحبرية لتشغيل أسفل n هل في تجويف الأنف. كرر كل 1 دقيقة، بالتناوب فتحتي الأنف كل قطرة حتى الجرعة الكاملة هي إعلانخدم.
ملاحظة: الحد الأقصى لحجم تدار عن طريق IN ينبغي ألا يتجاوز 10-15 ميكرولتر للفئران. - ترك الحيوانات في موقف ضعيف تحت التخدير لمدة 10 دقيقة بعد الاعتماد النهائي قبل أن ينتقل كل منهم في قفص فردي.
ملاحظة: لا تترك الحيوانات غير المراقب إلا بعد أن استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. - 1 ساعة بعد تناوله، وإعادة تخدير-الحيوانات كما كان من قبل والتضحية بهم عبر نضح transcardial باستخدام برنامج تلفزيوني (210.0 ملغم / لتر KH 2 PO 4، 9،000.0 ملغم / لتر كلوريد الصوديوم، 726 ملغ / لتر نا 2 هبو 4 .7H 2 O) في 10 مل / دقيقة ليصبح المجموع 20 مل.
ملاحظة: نضح من الحيوانات في التضحية لإزالة كل الدم من الأنسجة مطلوب لتحديد تركيزات خارج الأوعية من المركبات المسمى. يمكن الكواشف نضح يؤدي إلى تغييرات في مضان الخلفية ويجب أن تبقى ثابتة. وينبغي أن تكون طريقة التضحية ثابتضمن مجموعات. أساليب مختلفة للتضحية يمكن أن يؤدي إلى مستويات الدم متفاوتة داخل الأوعية الدموية، وتغيير مضان الخلفية للأنسجة.
- مجموعة من الأنسجة
- إعداد برنامج تلفزيوني كما هو موضح أعلاه لالشطف الأنسجة إزالتها.
ملاحظة: إذا تم استخدام عازلة أخرى مثل السائل نضح، شطف الأنسجة في المخزن نفسه. - إزالة القلب والرئتين والمعدة والكبد والطحال، والكلى عن طريق تشريح بسيط. شطف لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني قبل استخدام المختبر تقضي على اتركها حتى تجف أو الفتيل بعيدا الرطوبة الزائدة ووضع الأنسجة على حصيرة التصوير.
- قطع رأس الماوس وإزالة الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام قطع العظام أو رينجرز. باستخدام ملقط، إزالة بعناية الدماغ، والحفاظ على بصيلات الشم سليمة. شطف وجافة، ووضعه على حصيرة التصوير المقدمة.
- لإزالة الحبل الشوكي عن طريق قذف السريع 7، وملء حقنة 10 مل مع برنامج تلفزيوني وإرفاق مبلد إبرة قياس 18.
ملاحظة: 18 نوبات قياسالقناة الشوكية الكبار من العديد من خطوط الماوس. وقطر المطلوبة تختلف مع حجم الحيوان. - وضع الحيوان في وضعية الانبطاح، وضمان أن افتتاح القناة الشوكية في موقع قطع الرأس هو قطع نظيفة وخالية من الدم.
- إزالة الجلد من حول العمود الفقري. عن طريق قطع العظام حادة أو مقص، وقطع طريق العمود الفقري في الجزء القطني منقاري مباشرة إلى الوركين.
- شطف لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني لتصور القناة الشوكية. إدراج بلطف الإبرة في القناة الشوكية.
ملاحظة: الإبرة يجب أن يشعر دافئ وقد تتطلب بعض المتداول بطيئة ذهابا وإيابا خلال الإدراج. يجب أن يشعر الإبرة فضفاضة، وقطع أكثر منقاري يمكن إجراء أو قد تكون هناك حاجة إلى إبرة قطرها أكبر. - باستخدام الإبهام والسبابة، والضغط على العمود الفقري في جميع أنحاء إبرة. كساد الغطاس مع ضغط معتدل وثابت. والحبل الشوكي إخراج الخروج سليما من افتتاح منقاري في العمود الفقريعمود.
ملاحظة: إزالة كاملة، الشطف، وتجفيف جميع الأجهزة الرئيسية يمكن أن تكتمل معقولة في 5-7 دقيقة. هذا الوقت القصير يمنع الحاجة إلى التخزين الموسعة في برنامج تلفزيوني، مما قد يؤدي إلى الإفراط في التعرض للضوء والرشح من البروتينات وصفت من الأنسجة.
- إعداد برنامج تلفزيوني كما هو موضح أعلاه لالشطف الأنسجة إزالتها.
2. الجامع جهاز فيفو السابقين الإسفار التصوير
- معلمات التصوير
- بدء تشغيل البرنامج الحصول على الصور. في أسفل اليمين من لوحة التحكم الاستحواذ، انقر فوق "تهيئة".
- تحت عنوان "وضع التصوير"، حدد خانة الاختيار "الفلورسنت". تحت عنوان "وقت التعرض،" حدد "AUTO".
- تحت عنوان "binning"، حدد "صغيرة" وتعيين F / إيقاف ل2.
- حدد الإثارة 535 نانومتر والمرشحات انبعاث 580 نانومتر.
ملاحظة: هذا وسوف تختلف اعتمادا على التسمية المستخدمة. - حدد "مجال الرؤية ب" وتعيين المستهدفينر الارتفاع إلى 0.3 سم.
ملاحظة: هذا وسوف تختلف اعتمادا على أنسجة للتصوير. - مرة واحدة يتحول مؤشر درجة الحرارة الأخضر (أي آلة تتم تهيئة بالكامل)، وضع الأنسجة على حصيرة خلفية سوداء المقدمة، وضمان أن يتم فصل الأنسجة تماما عن بعضها البعض. وضع حصيرة في تصوير، وضمان أن جميع الأنسجة ضمن شبكة المنطقة المختارة. الأنسجة أكبر وغير متجانسة، مثل الكبد كله، وينبغي وضع خارج وذلك للحد من التداخل من الفص.
ملاحظة: يمكن ترتيب الأنسجة معا في مجموعة واحدة، مما يسمح للصورة واحدة لاستيعاب حيوان واحد أو جميع أنسجة من نفس النوع. وهذا ما يجعل التحليل والتنظيم أسهل في وقت لاحق. إذا اختلافات كبيرة في كثافة مضان موجودة بين الأنسجة المختلفة، فمن الأفضل أن صورة لهم بشكل فردي أو مجموعات من نفس نوع الأنسجة، ووقت التعرض مرة واحدة قد لا تكون مثالية لجميع كثافة الأنسجة. - انقر على "اكتساب".
- بعد التصوير، وإزالة الأنسجة على الفور وتخزين أو تجميدها لعلم الأنسجة الكمية، كما هو موضح في الخطوة 4.
3. معايير ومعالجة الصور
- المعايير
- في برنامج تلفزيوني، وخلق التخفيفات المسلسل شقين من كل بروتين يستخدم في علاج الحيوانات، بدءا من التركيز الأصلي، مع ما مجموعه 15 التخفيفات.
ملاحظة: ونطاق التركيز ينبغي أن تهدف لتشمل تركيزات الأنسجة المتوقعة وقد تتطلب التخفيفات إضافية من العينة الأصلية، اعتمادا على تركيز البداية. - ماصة 100 ميكرولتر من كل مستوى في كل بئر من لوحة 96-جيدا السوداء. وتشمل أيضا واحدة من برنامج تلفزيوني النقي للحصول على قياس مضان الخلفية.
- صورة معايير بنفس المعايير المستخدمة للتصوير الأنسجة.
- في البرنامج الحصول على صورة "أداة لوحة" تحت عنوان "أدوات العائد على الاستثمار"، حدد "المنطقة ذات الاهتمام (ROI) "الدائرة ورسم دوروا حول واحدة أيضا. نسخ ذلك العائد على الاستثمار لجميع الآبار وليس صحيحا أخرى وانقر على "قياس رويس".
- طرح القيمة في متوسط كفاءة اشعاعا من برنامج تلفزيوني النقي من قيم المعايير الأخرى؛ هذا يزيل مضان الخلفية. رسم القيم مقابل تركيز معروفة على مؤامرة مبعثر.
ملاحظة: ويمكن بعد ذلك المعادلة الناتجة من خط الاتجاه الخطي أن تستخدم لحساب قيمة مضان النسبية.
- في برنامج تلفزيوني، وخلق التخفيفات المسلسل شقين من كل بروتين يستخدم في علاج الحيوانات، بدءا من التركيز الأصلي، مع ما مجموعه 15 التخفيفات.
- معالجة الصورة
- في البرنامج الحصول على الصور، حدد أداة العائد على الاستثمار حر ورسم رويس حول كل من الأنسجة الفردية. انقر على "قياس".
- مع قياسات كفاءة مشع متوسط الناتج، طرح القيم المقاسة من الحيوانات غير المعالجة لكل نوع من أنواع الأنسجة ورسم تلك القيم على منحنى القياسية التي تم إنشاؤها مسبقا.
ملاحظة: القيم مضان النسبية الناتجة توفر لقطة سريعة ودقيقة للbiodistribution المجمع المسمى.
4. الكمي الأنسجة الأنسجة
- إعداد وتجميد الأنسجة لالتقطيع
- إنشاء أو شراء حاويات ذات حجم كاف لتجميد الأنسجة المختار وناظم البرد لاستخدامها. التفاف رقائق الألومنيوم حول كائن الحجم والشكل بشكل مناسب يعمل بشكل جيد.
- تحضير خليط من الأيزوبروبانول والثلج الجاف عن طريق ملء نصف كوب 500 مل مع الثلج الجاف وإضافة ~ 350 مل من الأيسوبروبانول حتى لا يكون هناك ما يكفي من السائل فوق الثلج الجاف لغمر جزئيا الحاوية التجمد.
ملاحظة: النيتروجين السائل غالبا ما يؤدي إلى كسر من الأمثل مجمع درجة حرارة القطع (أكتوبر)، والأنسجة جزءا لا يتجزأ ويجب تجنبها. - ملء حاوية تجميد جزئي مع أكتوبر، وضمان عدم وجود فقاعات الحالية. إذا كان هناك فقاعات، والعمل على فقاعات من حل باستخدام ملقط أو ما شابه تنفيذ.
- إزالة الأنسجةمن برنامج تلفزيوني وجففه جيدا، وإما عن طريق الربت برفق مع مختبر محو أو عن طريق لمس حواف الأنسجة الرقيقة الى مختبر مسح والسماح السائل إلى ذبالة بعيدا.
- وضع الأنسجة بلطف في أكتوبر داخل الحاوية تجميد، وضمان عدم إدخال فقاعات تحت الأنسجة. مرة واحدة الأنسجة في مكان، إضافة أكتوبر حتى يتم تغطية الأنسجة تماما.
- غمر الحاوية تجميد بقدر ما هو ممكن دون السماح للالأيسوبروبانول تأتي في اتصال مع أكتوبر يتعرض داخل الحاوية. اسمحوا 30-90 ثانية (أو يحتمل أن تكون أكثر لأنسجة أكبر) لأكتوبر والأنسجة لتجميد تماما قبل تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة ما دامت هناك حاجة.
- إعداد معايير التقطيع.
- تحضير تسمية بشكل مناسب 1 مل الحقن ذات الاستخدام الواحد عن طريق إزالة نهاية برميل، على ان يكون طول الحقنة هو قطرها واحد. هذا سوف يسمح للاسطوانة المجمدة إلى أن دفعت في وقت لاحق.
- لناجي أكتوبر، إنشاء 15 خطوة التخفيف المتسلسل شقين مركبات تدار، كما حدث مع برنامج تلفزيوني في وقت سابق، ولكن مع حجم الناتج النهائي من 1 مل. تشمل عينة واحدة من أكتوبر النقي لإزالة القيم مضان الخلفية.
- اللزوجة من أكتوبر يجعل خلط كاف صعوبة. وعكس أنابيب والسماح للأكتوبر ليستقر تماما قبل قلب مرة أخرى. كرر هذه 10-20 مرات لضمان مزيج موحد. حافظ على الحلول القياسية في 4 درجات مئوية، وبعيدا عن الضوء أثناء الخلط.
- بعد الاختلاط، ومرة أخرى إعداد خليط من الأيزوبروبانول والثلج الجاف، كما كان من قبل.
ملاحظة: يمكن أيضا النيتروجين السائل أن تستخدم بدلا من الأيسوبروبانول / جاف خليط الجليد، شريطة أن يتم إزالة الحقن بسرعة بعد أن جمدت الصلبة. - رسم معيار أكتوبر إلى الحقنة، مع الحرص على تقديم عدد قليل من الفقاعات ممكن. بعد وضع الحل أكتوبر، وتراجع فورا حقنة مباشرة في الأيسوبروبانول والسماح للحل لتجميد تماماداخل الحقنة ل10-20 ق. تخزين المحاقن في -80 درجة مئوية لمدة طالما كان ذلك ضروريا.
- قطع الأنسجة والمعايير
- وضع كل من الأنسجة والمعايير في -20 درجة مئوية، وإتاحة الوقت الكافي لجميع العينات للتوصل إلى درجة الحرارة.
ملاحظة: تنخفض درجة حرارة القطع المثالية عموما في جميع أنحاء -10 ° C النطاق لمعظم الأنسجة، ولكن ذلك يعتمد في النهاية على حجم الأنسجة والدهون، ويجب أن يتم تكريره تجريبيا. - باستخدام ناظم البرد، وقطع الأنسجة إلى شرائح سميكة 20 ميكرون وجبل لهم على الشرائح، كما هو موضح سابقا 8. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية، والاحتفاظ بها بعيدا عن الضوء قدر الإمكان خلال عدة قطاعات وحتى المسح الضوئي.
ملاحظة: من المهم هنا أن المقاطع ليتم قياس توزع بشكل مناسب في جميع أنحاء كامل سماكة الأنسجة. - لتحميل معايير على تشاك ناظم البرد، واتخاذ حقنة من الفريزر وتدفئة خارج عن 3-5 الصورة من قبل الحولدينغ أنه في متناول اليد. دفع المكبس حتى مقطع قصير (~ 1 سم) من اسطوانة أكتوبر هو خارج من الحقنة.
- باستخدام razorblade، قطع طريق اسطوانة ووضع القسم اسطوانة الناتجة عموديا على ظرف، وذلك باستخدام أكتوبر ليثبت في مكانه. هذا التكوين ينبغي أن يؤدي إلى دوائر محددة جيدا يجري خفض.
- شريحة اسطوانات في 20 ميكرون، ووضع شريحة واحدة من كل تخفيف على شريحة واحدة، بحيث تمثل شريحة واحدة المنحنى القياسي بأكمله. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للمسح.
- وضع كل من الأنسجة والمعايير في -20 درجة مئوية، وإتاحة الوقت الكافي لجميع العينات للتوصل إلى درجة الحرارة.
- المسح الضوئي والكميات
- بدء تشغيل البرنامج مجموعة المسح الضوئي وانقر على "543 ليزر" لبدء عملية بدء التشغيل ليزر. الانتظار لمدة 15 دقيقة ليزر للحصول على استعداد.
- مرة واحدة ليزر جاهز، وإزالة الشرائح من -20 درجة مئوية، ونقلها إلى والحاويات محمية ضوئية كبيرة للوصول إلى درجة الحرارة ولتجف لمدة 3 دقائق. وهذا يمنع الرطوبة تراكم في سليالماسح الضوئي دي.
- تحميل الشرائح في وعاء الشريحة على الماسح الضوئي الشرائح. انقر على زر "مسح" وحدد "تشغيل سهلة المسح الضوئي."
- تعيين دقة المسح الضوئي إلى 50 ميكرون.
- حدد الأول "استخدام" مربع تحت عنوان "Fluorophore" وحدد "TRITC." تعيين كسب PMT إلى 80٪.
ملاحظة: تختلف هذه الإعدادات اعتمادا على fluorophore وتركيز الجزيئات المسمى. - على الجانب الأيسر من ناحية، وضمان أن منطقة المسح الضوئي وتشمل الشريحة بأكملها. انقر على زر "ابدأ".
- بعد المسح، حدد "ملف" و "حفظ باسم" ثم قم بحفظ الصورة على شكل. TIF.
ملاحظة: يجب أن يتم فحصها الشرائح من الأنسجة والمعايير على نفس الإعدادات. - تحميل الصور الناتجة في يماغيج وحدد رويس في جميع أنحاء الأنسجة والمعايير. تحت علامة التبويب "تحليل"، اختار "أعد القياسات" وحدد "يعني قيمة الرمادي." انقر220؛ تدبير ".
ملاحظة: كما هو الحال مع تقنية السابقة، لا بد من طرح مضان الخلفية من كل القيم المقاسة. - رسم قياسات قيمة الرمادي المتوسط من المعايير ضد تركيز المعروف أن إنشاء منحنى قياسي.
ملاحظة: يجب أن يكون متوسط القياسات الناتجة من الأنسجة داخل كل الأنسجة وتآمر على أن منحنى القياسية لتحديد تركيز داخل الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصف البيانات دون تقديم ثلاث مركبات: متجه لتوصيل العقاقير المعروفة باسم ELP ونسختين من ELP تعديل مع الببتيدات اختراق الخلية (SynB1-ELP وتات-ELP) 9. وصفت كل المركبات الثلاث مع tetramethylrhodamine-5-maleimide وتسليمها عبر طريقين الإدارة (في والرابع). وكان الهدف من هذه التجارب لتحديد المركبة والطريق الإدارة من شأنه أن يؤدي في أفضل تغلغل في الجهاز العصبي المركزي (CNS) 3.
الشكل يعرض 1A ممثل فيفو السابقين الصور كامل الجهاز من الأجهزة من الحيوانات المعالجة. يظهر خريطة الحرارة تراكب مستويات مضان في كفاءة مشع داخل الأنسجة. عن طريق رسم رويس في جميع أنحاء الأنسجة الفردية والتآمر تلك القيم على منحنى معيار المقابلة، ويتم إنشاؤها القيم مضان موحدة موضح في الشكل 1B. وfluorescen موحدويمكن بعد ذلك قيم م استخدامها لإجراء مقارنات دقيقة لتركيزات النسبية للمركبات مختلفة. هذه البيانات تصف بدقة كل من تأثير تعديل ELP على اختراق أنسجة معينة، فضلا عن تأثير مسار الإدارة في كل مجمع. مع هذه النتائج، فمن الواضح على الفور أن تسليم ELP عبر الإدارة في هو مزيج الأكثر فعالية للوصول إلى الجهاز العصبي المركزي.
في حين أن هذه النتائج تساعد على تحديد أفضل اختراق المجمع وتسليم طريقة، أنها لا تصف التركيز الفعلي أو توطين الإقليمي للمركبات داخل الجهاز العصبي المركزي. الأنسجة الكمية هي بالتالي مثالية لاستكمال وصف للتوزيع الحيوي من هذه المركبات، لأنها تسمح لقياس الكمية من مناطق الدماغ المحدد. يعرض الشكل 2A شريحة تمثيلية من الحيوانات المعالجة IN-ELP، ويصف الشكل 2B الكمي لرويس فصلبصيلات الشم، نصفي الكرة الأرضية، والمخيخ. من هذه المعطيات، فمن الواضح أنه في حين أن إدارة ELP من قبل في الطريق قد يؤدي إلى تركيزات عالية الجهاز العصبي المركزي، فإنه يفعل ذلك في المقام الأول في بصيلات الشم والمخيخ. على العكس من ذلك، سلمت ELP الرابع ديها تركيزات إجمالية أقل، ولكن يتم توزيعه بالتساوي في جميع أنحاء الدماغ. اعتمادا على الهدف من هذه المركبات تدار واحتمال الآثار في الأجهزة الأخرى، سواء في أو الإدارة الرابع قد يكون الخيار الأفضل. لا يمكن اختتمت هذه دون إضافة الأنسجة الكمية. من الناحية الفنية، كان من الممكن استخدام الأنسجة الكمية في كل نسيج من كل مجموعة، ولكن عن طريق استخدام كلتا الطريقتين معا، وحفظ قدرا كبيرا من الوقت والعمل في حين لا يزال يؤدي إلى نفس النتيجة.
الشكل 1: فيفو السابقين الجامعة، الجهاز الإسفارقياسات. أ) صور الممثل من مجموعة ELP. تم تعيين مقياس الخريطة الحرارة وكفاءة مشع. ب) متوسط قيم الكفاءة مشع تم الحصول عليها من إنشاء رويس في جميع أنحاء الأنسجة الفردية التي تم تحليلها على منحنى قياسي من أجل توليد القيم مضان موحدة تستخدم للمقارنة-توزيعات الحيوي. أشرطة الخطأ تمثل SEM. شريط مقياس = 5 ملم. (معدلة من مكجوان، وآخرون؛ تصميم المخدرات والتنمية، والعلاج، 2016) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: كمية الأنسجة القياسات الأنسجة. أ) صورة الممثل من ELP IN-أو معاملة الحيوانات الرابع إنشاؤها من قبل تشريح أدمغة 20 ميكرون سميكة، وتركيب شرائح سالشرائح n ومن ثم تفحص تلك الشرائح باستخدام ماسح ضوئي الشريحة مضان. ب) متوسط القيم التي تم الحصول عليها من إنشاء رويس حول البصلة الشمية، نصفي الكرة الأرضية، والمخيخ، ويقاس كقيمة رمادية يعني ويصلح لمنحنى القياسية لتوليد قياسات تركيز ميكروغرام / مل. أشرطة الخطأ تمثل SEM. شريط مقياس = 5 ملم. (معدلة من مكجوان، وآخرون؛ تصميم المخدرات والتنمية، والعلاج، 2016) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين فيفو السابقين التصوير كامل الجهاز غير واضحة عموما، والتمسك بعض المفاهيم والتقنيات الأساسية يمكن أن يحسن من دقة القياسات توزيع الحيوي. موجات قصيرة من الخبرة الخفيفة على درجة عالية من التشتت والامتصاص في معظم الأنسجة، والتي كثيرا يؤثر على فائدة fluorophores الطول الموجي القصير. وهذه fluorophores تطبيق في دراسات عميقة الأنسجة محدودة، ولكنها كانت تستخدم على نحو فعال في التجارب تبحث في الأنسجة السطحية أو في العين. على العكس من ذلك، موجات طويلة من ضوء تخضع أقل بكثير نثر والامتصاصية، مما أدى إلى مزيد من الاختراق والنتائج أكثر دقة مع الأنسجة سمكا 10. Fluorophores التي تقع في الأشعة تحت الحمراء بعيدة الحمراء وبالقرب من (الجرد) مجموعة (الإثارة ~ 600 نانومتر) من الطيف يتم اختيار عادة للحيوانات كلها أو الأنسجة أكبر. في تجارب تستخدم هذه fluorophores الطول الموجي الطويل، لصناعة السيارات في مضان تيس معينيقاضي أو مواد من المحتمل أن تكون الاعتبارات الرئيسية. على سبيل المثال، الصفراء داخل المرارة من القوارض هي غاية لصناعة السيارات في فلوري في موجات في 500 - مجموعة نانومتر 600. لأن هذا يمكن أن تحرف كثيرا القيم الكبد، غالبا ما يكون أفضل لإزالة المرارة قبل التصوير. بدلا من ذلك، إذا طلب من الكبد سليمة والمرارة، واختيار fluorophore مع الطول الموجي الإثارة في مكان ناء جدا من الطيف يمكن أن تحد من نفوذ الصفراء لصناعة السيارات في مضان. بالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من الأطعمة القوارض المشتركة يحتوي البرسيم غير المكرر، الذي تتفلور للغاية في جميع أنحاء بعيدة نطاقات المتوسطة ومن الطيف. اذا انخفضت التسميات المختار ضمن تلك الموجات والجهاز الهضمي هي للتصوير، وتغيير في النظام الغذائي هو على الأرجح أفضل خيار.
في حين نظم التصوير الحية تهدف إلى قياس دقيق الأنسجة السميكة، مع الأنسجة غير متجانسة وسميكة بشكل خاص (على سبيل المثال، كبد الفئران كلها)، يمكن قياسات أكثر دقة كثيرايتم أون الحصول عليها عن طريق نشر الأنسجة خارج، بحيث فصوص الكبد تتداخل بأقل قدر ممكن. أيضا، في الحالات التي تكون فيها الأنسجة توزيع انحراف كبير من الجزيئات المسمى، والتصوير من الجانبين متعددة من الأنسجة ومتوسط تلك المقاييس قد تزيد من دقة. في نهاية المطاف، وأنواع من الأنسجة ليمكن تصوير، لصناعة السيارات في مضان من المواد المرتبطة بتلك الأنسجة، والتوزيع المحتمل للجزيئات المسمى تدار ينبغي النظر بعناية من أجل اختيار fluorophore مع الإثارة وانبعاث موجات المناسبة التي تحد من التدخل قدر الإمكان.
عند تنفيذ الأنسجة الأنسجة الكمية، وهناك العديد من التفاصيل المهمة أن نأخذ في الاعتبار. من أجل أن تكون النتائج دقيقة، يجب أن تؤخذ شرائح في جميع أنحاء الأنسجة بأكملها أو المنطقة المراد تحليلها. وهذا يعني أن هذه الأنسجة لن تكون متاحة لعمليات أخرى. قد يكون من الممكن لإصلاح وصمة عار بعدالمسح الضوئي، وإنما هو عادة أفضل للسماح للشرائح حتى يجف قليلا قبل وضعها في الماسح الضوئي، والتي يمكن أن تؤثر على تلطيخ المستقبل. وبالمثل، فإن المسح يسبب بعض مستوى من الصور وتبييض، والحد من إشارة محتملة في العمليات اللاحقة. لتطبيقات المجهر المصب، وتتحقق أقسام متفوقة عادة عن طريق تحديد الأنسجة وتوازنه لهم في محلول السكروز قبل باجتزاء. ومع ذلك، فإن هذه العملية هو الأفضل تجنبها في أعلاه بروتوكول الأنسجة الكمي بسبب آثار تثبيت و / أو السكروز طويلة تتسرب على كثافة مضان. أيضا، اعتمادا على كمية من إشارة الحاضر، شرائح قد تواجه الصور وتبييض إذا تعرضت لحتى مستويات منخفضة من الضوء المحيط. والحفاظ على الشرائح البرد وبعيدا عن الضوء تحسن ملحوظ في دقة القياسات الناتجة عن ذلك. وبشكل عام، معالجة دقيقة وإعداد يمكن أن تحسن بشكل كبير من النتيجة النهائية.
وهناك مجموعة متنوعة من الآخرالطرق المستخدمة لدراسة توزيع الحيوية والدوائية من الجزيئات تدار التي تختلف على نطاق واسع في الصعوبة التقنية، والإنتاجية، والدقة، والمعدات المطلوبة 11. المناعية الكمية والمقايسات النشاط الحيوي على حد سواء يمكن أن تكون معقدة فنيا وتتطلب الأجسام المضادة أو الكواشف محددة لجزيئات تدار، مضيفا إلى حد كبير في التكاليف والعمل. وقد استخدمت طرق متعددة على أساس وضع العلامات النظائر المشعة في الماضي، مع اختلاف دقة، ولكن التكامل بين النظائر المشعة للجزيئات، فضلا عن مجموعة من البيانات نفسها، يمكن أن تتطلب إعداد كبير ويمكن في كثير من الأحيان تجعل الأنسجة غير صالحة للاستعمال تماما لإجراء المزيد من التحليلات 12. وأخيرا، وأساليب أخرى أظهرت أن تكون فعالة، بما في ذلك التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ومطياف الكتلة، وعادة ما يمنع ببساطة بسبب عدم وجود المعدات اللازمة. يستخدم بروتوكول المذكورة أعلاه طريقتين بالتعاون لتحديد ال بكفاءةه الحيوي توزيع الجزيئات المسمى بطريقة سريعة، ودقيقة، ويمكن الوصول إليها بسهولة فعالة من حيث التكلفة نظرا لavailably العادية للمعدات المطلوبة.
وقد استخدم هذا الأسلوب لتوليد البيانات الواردة أعلاه، وتحديد أفضل النواقل وإدارة الطريق لإيصال الجزيئات المسمى إلى الجهاز العصبي المركزي. من البيانات خارج الحي، ELP تدار في وELP تدار تم تحديد الرابع لمزيد من توصيف عبر الأنسجة الأنسجة الكمية. ثم قدمت الأنسجة الأنسجة الكمية تركيزات الجزيئات المسمى في مناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي، مما يتيح للاستنتاجات نهائية التي يمكن استخلاصها. طريقتين تمثل معا وسيلة سريعة وفعالة لإجراء دراسة مفصلة للتوزيع الحيوي لمركبات محددة متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
