Summary
离体全器官成像是用于确定内和组织或治疗组之间的荧光标记的化合物的相对浓度快速方法。相反，定量荧光组织学，而更多的劳动力密集的，允许对标记分子的绝对组织水平的量化。
Abstract
荧光标记是用于在各种体外和体内实验条件下检验标记的分子的命运成熟过程。荧光探针在确定施用大分子的生物分布，其中，除了一小分子荧光标记的是不太可能影响的动力学或化合物的生物分布是特别有用的。多种方法可用来检验生物分布，在努力所需的显著变化，并且所得到的测量结果是否完全定量的，但是使用在结合多个方法可以提供用于分析生物分布的快速和有效的系统。
离体全器官成像是可以用于对组织内和多种类型的组织或治疗组之间快速比较荧光分子的相对浓度的方法。使用成像开发平台无需进一步处理决定的形式完整的组织内专为活的动物或整个器官成像，荧光，省时省力，同时提供全面的生物分布的准确描述。这个过程是在实验试图确定的化合物的组织特异性或多个不同的化合物的比较理想的。另一方面定量组织组织学要求，以创建标记的化合物的定量测量组织的广泛进一步处理。准确评估生物分布，所有感兴趣的组织必须被切片，扫描，以使组织或组之间的比较相对于标准曲线进行分析。定量组织病理是确定组织中的绝对化合物浓度的黄金标准。
在这里，我们描述了如何两种方法可以一起有效地用于评估不同的给药方法的能力第二化合物修饰靶向和递送荧光标记的分子在中枢神经系统1。
Introduction
荧光标记是用于确定化合物的生物分布，使用一系列的设备是共同的许多实验室一个容易使用的，有效的方法。荧光团是广泛可用的，相对便宜的，以及各种波长，使得多个标记分子可以同时使用无干扰的进入。大多数荧光团具有一系列化学缀合到目标化合物不同的活性基团的，和缀合的过程通常是简单的为大多数类型的反应性位点的。此外，对于荧光标记的化合物的测量所需的设备在许多实验室是常见的。荧光显微镜，成像仪，和滑动扫描器都可以在不同的情况下使用，使得使用荧光标记的高度可访问的。荧光标记经常用于确定在体内和离VIV化合物的生物分布和动力学Ø与实时成像设备，如IVIS光谱成像仪，并通过定量组织组织学2,3。
离体全器官成像的使用实时成像设备的使用增加了随着时间的推移，由于其易于使用和快速创建标记的化合物的相对浓度的准确的比较，而无需tissues4的进一步处理能力。然而，虽然离体全器官成像可以允许容易分析和比较，它不产生一个组织内绝对化合物浓度的定量测量。这是由于完整的器官内的光散射的影响。由于光散射（以及在较小程度上，吸光度）由组织的大小和密度而变化，整个器官成像能够低估在大型或密集的器官组织水平。制定相应的标准绝对浓度测量也很困难，因为我们必须模仿厚度和每个器官的密度。另一方面，整个器官成像获得的试剂的相对组织水平的快速方法，它是理想的比较多个相关分子的相对生物分布（例如，在药物靶向研究）。一种替代的策略是利用荧光定量组织学，从定量放射自显影的方法中派生的技术，以获得测试试剂5,6-绝对组织水平。而不是将整个动物或器官成为一个想象设备，定量组织组织学要求每个组织切片，固定在载玻片上，扫描，单独分析。测试剂的标准制备并在相同的厚度器官样品切片。通过切割所有器官和标准，以相同的厚度，由于光散射或吸收可变性被消除，和组织的荧光强度可以配合到标准曲线来确定绝对concent配给。虽然这种方法中，当正确完成，是定量的，它也是劳动密集的，容易处理不当。给出定量组织学和劳动的显著成本较高的更复杂的性质相比整个器官成像时，它成为值得研究，其中每个过程是最实际的检验荧光标记的化合物的生物分布时使用。这个协议提供了如何这些方法可以一起使用，以有效地比较罗丹明标记的弹性蛋白样多肽（ELP）的生物分布，有或没有加入SYNB1或达细胞穿透肽的详细描述，通过鼻内（IN）和静脉内（IV）给药途径。
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Protocol
注：在本协议中的所有动物的使用是经密西西比医学中心大学的机构动物护理和使用委员会。
1.动物和组织处理
- 管理和牺牲
- 麻醉，用3％异氟烷将动物5分钟，并通过观察不存在脚趾捏反射的验证麻醉深度。应用兽医软膏眼睛防止干燥时的麻醉下。
- 称重动物并吸取或罗丹明标记的ELP，SYNB1-ELP，或达-ELP的50毫克/公斤的剂量为1.5毫升管中。减100微升施用标记的化合物用于后续步骤的标准曲线的制剂。
注意：重要的是，标准从同一批次向动物给药标记的蛋白质的，以避免在荧光标记效率由于变性的差异进行。为了正确地去除背景fluores从后荧光测量萤光，未处理的动物必须使用相同的方法/试剂作为治疗的动物被处死。 - 管理与使用任一尾静脉或股静脉（其通过1厘米的切口在腹股沟访问）先前描述1的IV注射。镇痛，如果制作腹股沟切口，辖卡洛芬皮下剂量为5毫克/公斤，并与伤口夹子闭合之前申请sensorcaine到切口部位。要通过鼻内（IN）航线管理，将动物在仰卧位。
- 使用2μL移液器，制定标记化合物的1μL下降。简言之，将动物的头从麻醉衣领滑动以允许访问鼻孔。
- 吸移管的尖端放置到单个鼻孔的开口，慢慢压下柱塞，从而允许所述液滴向下运行的鼻孔进入鼻腔。重复每1分钟，交替鼻孔每一滴直到全部剂量广告服侍。
注意：通过在管理的最大音量不得超过10 - 15μL鼠。 - 他们每移动到一个单独的笼子前，留在仰卧位动物麻醉下进行10分钟的最后给药后。
注意：不要离开无人看管的动物，直到他们重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧。 - 给药后1小时，如之前重新麻醉的动物，并使用PBS（210.0毫克/升KH 2 PO 4，9,000.0毫克/升氯化钠，726毫克/升的 Na 2 HPO 4·7H 2 O）在经由穿心灌注牺牲他们10毫升/分钟，总共20毫升。
注意：动物在处死灌注以从组织中移除所有的血液需要确定的标记的化合物的血管外的浓度。灌注试剂可导致改变的背景荧光，并应保持一致。牺牲的方法应该是一致的内的组。牺牲的不同方法会导致在脉管内变化的血液水平，改变了组织的背景荧光。
- 组织集合
- 如上述用于漂洗除去组织描述制备PBS中。
注意：如果另一个缓冲器被用作灌注液，在相同的缓冲液冲洗组织。 - 通过简单的夹层中取出心脏，肺，胃，肝，脾，肾。在PBS溶液清洗使用实验室之前湿巾抹干或吸走多余的水分，并把组织上的成像垫子。
- 斩首鼠标和使用刀具骨或骨钳去除头骨的顶部。使用镊子，小心地取出大脑，保持嗅球完好。冲洗，干燥，并将其放置在所提供的影像垫。
- 要通过快速弹射7去除脊髓，填充10毫升的注射器，用PBS和附加迟钝18号针头。
注：18号适合许多鼠标线的成人椎管。所需的直径将动物大小而异。 - 置于俯卧位的动物，以确保椎管在断头站点的开口被干净地切割和自由的血液。
- 来自各地的脊柱去除皮肤。使用锋利的刀骨或剪刀，通过在腰节直接喙臀部脊柱切断。
- 简单地说，用PBS冲洗可视化椎管。轻轻插入针头进入椎管。
注：针应该感到舒适，并可能需要一些缓慢滚动的插入过程中来回穿梭。如果针松的感觉，更切喙可作出或可能需要较大的直径针。 - 用拇指和食指，将压力施加到插入针周围的脊柱。按下中度和恒压活塞。脊髓将弹出完整出喙开放的脊髓柱。
注：彻底清除，冲洗，以及所有主要器官可以在5合理完成烘干 - 7分钟。这样短的时间内阻止对PBS扩展存储，这可能会导致过度曝光，并从组织标记的蛋白质浸出的需要。
- 如上述用于漂洗除去组织描述制备PBS中。
2.全器官离体荧光成像
- 成像参数
- 启动图像采集的软件。在收购控制面板的右下方，点击“初始化”。
- 在“成像模式”，选择“荧光”复选框。在“曝光时间”，选择“自动”。
- 在“分级”，选择“小”和F /停止设置为2。
- 选择535 nm激发和580 nm发射过滤器。
注意：这将取决于所使用的标签上会有所不同。 - 选择“视图B场”，并设置圆盾ŧ高度0.3厘米
注意：这将取决于组织被成像而变化。 - 一旦温度指示器变为绿色（意味着机器完全初始化），将组织到提供黑色背景垫，从而确保组织被完全彼此分离。放置在成像器的垫，以确保所有的组织都在所选区域的网格内。较大的和非均质的组织，如全肝，应布置，以便减小波瓣重叠。
注意：组织可以一起在单个组被布置，使一个图像，以容纳一单个动物或相似类型的所有组织中。这使得更容易稍后的分析和组织。如果在荧光强度大的差异是各种组织中本，最好是图像它们单独或作为同一组织类型的基团，作为一个单一的曝光时间可能不适合于所有的组织的强度。 - 点击“获取”。
- 成像后，立即取出组织并存储或冻结它们定量组织学，如在步骤4中概述。
3.标准和图像处理
- 标准
- 在PBS中，创建在动物用于治疗，开始于原始浓度各蛋白质的两倍连续稀释，以总共15稀释液。
注意：浓度范围应该旨在包括预期的组织浓度，并可能需要与原始样品的附加的稀释，这取决于起始浓度。 - 吸取100μL的每个标准成黑色的96孔板的每个孔中的。包括纯PBS中的一个孔中，以获得背景荧光的测量。
- 图像与用于组织成像相同的参数标准。
- 在图像采集软件“工具选项板”下的“投资回报工具”，选择“感兴趣区域（ROI）“圈子，并绘制一个井周围的投资回报率。复制ROI所有其他填充井，然后点击“衡量投资回报率。”
- 减去在从其他的标准值的纯PBS中平均辐射效率的值;这消除了背景荧光。上绘制散点图对已知浓度值。
注意：得到的线性趋势线的方程可以被用于计算相对荧光值。
- 在PBS中，创建在动物用于治疗，开始于原始浓度各蛋白质的两倍连续稀释，以总共15稀释液。
- 图像处理
- 在图像采集软件，选择自由ROI工具，绘制的ROI周围每个独立的组织。点击“措施”。
- 用所得平均辐射效率的测量，减去未处理动物的每个组织类型测量的值和先前创建标准曲线上绘制这些值。
注意：得出的相对荧光值提供的快速，准确的快照标记化合物的生物分布。
4.定量组织组织学
- 对切片的制备和冷冻的组织
- 创建或购买足够的尺寸以冻结所选组织和低温恒温器的容器中使用。周围适当尺寸和形状的物体包裹铝箔效果很好。
- 通过填充一个500ml的烧杯中的一半用干冰和加入异丙醇的〜350毫升，以便有足够的液体的干冰以上以部分地浸没冷冻容器准备异丙醇和干冰的混合物中。
注意：液氮经常导致最佳切割温度化合物（OCT）和包埋组织的断裂，应该避免。 - 与华侨城部分填充冷冻集装箱，确保有不存在泡沫。如果有气泡，使用镊子工作气泡从溶液或类似的工具。
- 除去组织从PBS中并干燥它彻底，或者用一个实验室擦拭或通过触摸细腻组织到实验室的边缘擦拭和允许液体吸走轻轻拍打它。
- 轻轻地放在组织到华侨城的冷冻集装箱内，确保不引入气泡组织下方。一旦组织就位，添加OCT中直至组织被完全覆盖。
- 浸没冷冻集装箱尽可能是可能的，而不使异丙醇进来与暴露十月接触的容器内。允许30 - 90秒（或可能更多更大的组织）的OCT和组织在-80℃保存，只要需要之前完全冻结。
- 标准的制备切片。
- 准备并通过去除筒的端部正确标记1毫升一次性使用的注射器，使得所述注射器的整个长度为一个直径。这将允许冷冻汽缸后面将要推出。
- 我们ING OCT中，创建施用的化合物的15步两倍系列稀释，如用PBS先前完成的，但用1 mL的最终所得的体积。包括用于去除背景荧光值纯OCT的一个样本。
- OCT的粘度使得充分混合困难。反转试管，华侨城再次反转之前，彻底解决。重复此10 - 20次，以确保一均匀的混合物。混合过程中，使标准溶液在4℃和避光。
- 混合后，再次准备异丙醇和干冰的混合物中，如前。
注意：液态氮也可以代替异丙醇/干冰混合物的使用，只要它们冻结固体后注射器迅速取出。 - 绘制OCT标准入注射器，同时注意引进尽可能少的气泡越好。拟定OCT溶液后，立即直接浸注射器插入异丙醇，并允许该溶液完全冻结20秒 - 注射器10中。存储注射器在-80℃下，只要必要的。
- 组织和标准的切割
- 将两种组织和标准-20°C和足够的时间让所有样品来温度。
注：理想的切削温度一般落在周围的-10°C范围内对大多数组织中，但它最终取决于组织的大小和脂肪含量必须凭经验细化。 - 使用低温恒温器，切割组织成20微米厚的切片，并将其安装到滑动，如前所述8。在-20℃保存幻灯片和切割过程中，直到扫描使他们免受光线尽可能远。
注意：重要的是在这里，要测量的部分在整个组织的整个厚度被适当地分布。 - 要安装到标准的低温恒温器吸盘，采取从冷冻注射器和温暖外3 - 5秒通过霍尔鼎在手里。推动柱塞，直到在OCT气缸的短节（约1厘米）是注射器的外部。
- 用剃刀刃，切通过气缸和垂直放置所得汽缸部上的卡盘，使用OCT以保持它在适当位置。这种构造应该导致良好定义的圆圈被切断。
- 切片气缸20微米，从每个稀释放置一个片到单个滑动，使一个滑动表示整个标准曲线。储存在-20℃下将载玻片直到准备扫描。
- 将两种组织和标准-20°C和足够的时间让所有样品来温度。
- 扫描和定量
- 启动扫描阵列软件，点击“543激光”开始激光启动过程。等待15分钟的激光做好准备。
- 一旦激光准备就绪时，从-20取出幻灯片℃，并将它们移动到一个大的，光保护的容器来的温度和干燥3分钟。这将防止受潮在SLI德扫描仪。
- 加载滑入上滑动扫描器滑动容器。点击“扫描”，选择“运行轻松扫描。”
- 设置扫描分辨率为50微米。
- 在“荧光团”选择第一个“使用”复选框，并选择“TRITC”设置PMT增益为80％。
注意：这些设置将取决于荧光团和标记分子的浓度变化。 - 在左手侧，确保了扫描区域包括整个幻灯片。点击“开始”。
- 扫描后，选择“文件”，“另存为”，然后将图像保存为.tif。
注意：组织和标准的幻灯片应在相同的设置进行扫描。 - 加载生成的图像转换成ImageJ的，选择投资回报组织和标准各地。在“分析”选项卡中，选择“设置测量”，选择“平均灰度值。”点击220;措施“。
注意：与前面的技术中，背景荧光必须从所有测量值中减去。 - 从绘制对已知浓度的标准平均灰度值测量，以创建标准曲线。
注意：从身体组织将所得的测量应在每个组织内进行平均并绘制该标准曲线上，以确定在组织内的浓度。
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Representative Results
下面的数据说明三种化合物的递送：被称为ELP和ELP的两个版本与细胞穿透肽（SYNB1-ELP和康达-ELP）9修饰的药物递送载体。所有这三个化合物标记四甲-5-马来酰亚胺和通过两个给药途径交付（IN和IV）。这些实验的目的是确定将导致最好渗透到中枢神经系统（CNS）3，其化合物和给药途径。
图1A显示代表离体从处理过的动物的器官的整个器官的图像。热图叠加显示在组织内的辐射效率荧光水平。通过绘制的ROI周围的各个组织和其相应的标准曲线上绘制这些值时，产生图1B中所示的标准化的荧光值。标准化fluorescen然后CE值可以用于不同的化合物的相对浓度的准确的比较。这些数据准确地描述ELP修饰对渗入特定组织两者的效果，以及给药途径的每个化合物的作用。与这些结果，它是立即清楚的是通过在施用ELP递送是到达CNS中最有效的组合。
虽然这些结果有助于确定最佳的穿透化合物和交付方法，他们不描述实际的浓度或中枢神经系统内的化合物的区域定位。定量组织学因此理想完成这些化合物的生物分布的说明中，因为它允许对所选脑区的定量测量。 图2A显示了从ELP中处理的动物的代表性切片，而图2B描述了感兴趣区分离的量化嗅球，半球，和小脑。从这些数据，很明显，虽然ELP施用由IN途径可以导致高的CNS浓度，它本主要在嗅球和小脑。相反地，ELP递送IV具有较低的总浓度，但它是整个大脑均匀分布。根据这些施用的化合物的靶和用于在其它器官作用的潜力上，无论是在或IV给药可能是更好的选择。这不可能不加入定量组织学结束。从技术上讲，定量组织学可能已在每一组的每一个组织使用，但通过利用这两种方法一起的时间和劳力大量同时仍然导致同样的结论已保存。
图1： 离体全器官荧光测量。 A）从ELP组的代表图像。热图刻度设置为辐射效率。 B）选自以产生用于生物分布的比较的标准化荧光值进行分析的标准曲线上，个人组织周围创建ROI的获得平均发光效率值。误差棒表示SEM。比例尺= 5毫米。 （麦高恩从改良等;药物设计，开发和治疗; 2016） 点击此处查看该图的放大版本。
图2：定量组织组织学测量。 A）ELP IN-或20微米厚的大脑切片创建IV治疗的动物的形象代表，安装切片Øñ幻灯片，然后扫描用荧光扫描幻灯片这些幻灯片。 B）从周围嗅球，半球，和小脑的创建ROI的获得，测量为平均灰度值和拟合标准曲线来生成微克/毫升浓度测量的平均值。误差棒表示SEM。比例尺= 5毫米。 （麦高恩从改良等;药物设计，开发和治疗; 2016） 点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
而离体全器官成像一般是直接的，粘附到一些基本概念和技术可以改善生物分布测量的准确度。的光的经验短的波长在大多数组织中高度的散射和吸收的，这显著影响短波长的荧光团的效用。这些荧光限制了深部组织研究中的应用，但他们已在实验中有效地用于寻找表面组织或进入眼内。相反，光的长波长经受显著较少的散射和吸收，造成更大的渗透和具有较厚组织10更准确的结果。落入在光谱的远红和近红外（NIR）范围（激发〜600纳米）的荧光团通常选择用于整体动物或更大的组织。使用这些长波长的荧光团，特别那朵的自发荧光实验起诉或材料可能是一个重要的考虑因素。例如，啮齿动物的胆囊内胆汁是高度自动荧光在500波长 - 600纳米范围内。因为这样可以大大歪曲肝脏的价值观，它往往是最好删除之前，成像胆囊。可替代地，如果需要完整的肝和胆囊，在频谱的很远端选择具有激发波长的荧光团可以限制胆汁自发荧光的影响。此外，许多普通的啮齿动物松狮的含有未纯化苜蓿，其高度荧光在整个频谱的中期和远范围。如果选择的标签落在那些波长范围内和消化道被成像，改变饮食可能是最好的选择。
而实时成像系统被设计成精确地测量厚组织，与非均匀和特别厚的组织（ 例如 ，整个大鼠肝脏），更精确的测量可经常烯由出扩频所述组织，使得肝脏的裂片重叠尽可能少来获得。另外，在情况下，组织中有标记分子的来自组织的多个边的高度偏态分布，成像和平均这些测量可能会增加精度。最终，类型的组织将被成像，这些组织和所施用的标记的分子的电势分布相关的材料的自发荧光应仔细，以便选择与适当的激发和发射波长，限制荧光团考虑干扰尽可能。
当执行定量组织组织学，还有要记住几个重要的细节。为了使结果精确，切片必须采取在整个组织或区域进行分析。这意味着，这些组织将不能用于其他处理。有可能以固定和染色后扫描，但通常是最好让片，将它们放入扫描仪，这可能会影响未来的染色前稍干。同样地，扫描将导致光致漂白的某些水平，减少在随后的工艺的电位信号。下游显微镜应用，上级部分通常是由固定组织之前，切片中平衡的蔗糖溶液来实现。然而，这种方法在上述定量组织学协议最好避免由于固定和/或长蔗糖的影响浸泡上的荧光强度。另外，根据信号的存在量，片可能暴露在甚至低环境光的水平经历光致漂白。保持滑动冷和远离光将显著改善所得测量的精确度。总体而言，谨慎处理和准备可以大大改善最终结果。
有多种其它方法用于研究生物分布和给药的大分子，在技术难度，吞吐量，准确性千差万别的药代动力学和所需的设备11。定量免疫测定和生物活性测定可以既在技术上复杂并且需要特定的给药分子的抗体或试剂，显著增加了成本和劳动。基于放射性同位素标记多种方法已经在过去被使用，具有不同的精确度，但放射性同位素的整合，大分子，以及数据本身的收集，可以要求显著制备和通常可以使组织完全无法用于进一步分析12。最后，显示有效的其他方法，包括正电子发射断层摄影和质谱，通常简单地排除由于缺乏必要的设备。上述协议使用结合两种方法有效地确定第E在一个快速，经济高效，准确，方便地标记分子的生物分布，由于所需设备的正常有效地。
用这种方法来生成上述数据，识别用于递送标记的分子的至CNS的最佳载体和给药途径。从体外数据，ELP给药和ELP给予IV，确定了通过定量组织组织学进一步鉴定。定量组织组织学然后提供标记分子的浓度在CNS的特定区域，从而可以得出最后结论。这两种方法一起表示执行多个具体化合物的生物分布的详细检查了快速和有效的方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
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