Summary
Ex vivo hel-organ imaging er en hurtig metode til bestemmelse af de relative koncentrationer af fluorescens mærkede forbindelser inden for og mellem væv eller behandlingsgrupper. Omvendt kvantitativ fluorescens histologi, mens mere arbejdskrævende, giver mulighed for kvantificering af de absolutte væv niveauer af mærkede molekyler.
Abstract
Fluorescerende mærkninger er en veletableret fremgangsmåde til at undersøge skæbne af mærkede molekyler under forskellige eksperimentelle betingelser både in vitro og in vivo. Fluorescerende prober er særligt anvendelige til bestemmelse af biodistribution af administrerede store molekyler, hvor tilsætning af en lille-molekyle fluorescerende mærke påvirker sandsynligvis kinetik eller bio-fordeling af forbindelsen. En række fremgangsmåder er til for at undersøge biodistributionen der varierer betydeligt i mængden af nødvendige indsats og om de heraf målinger er fuldt kvantitativ, men ved hjælp af flere metoder i forbindelse kan tilvejebringe en hurtig og effektiv system til analyse bio-fordelinger.
Ex vivo hel-organ billeddannelse er en metode, der kan bruges til hurtigt at sammenligne de relative koncentrationer af fluorescerende molekyler i væv og mellem flere typer af væv eller behandlingsgrupper. Brug af en billeddannende platform med henblik levende dyr eller hel-organ billeddannelse, fluorescens inden intakte væv kan bestemmes uden yderligere behandling, hvilket sparer tid og arbejdskraft, samtidig med at et præcist billede af den samlede bio-fordeling. Denne proces er ideel til forsøg forsøger at bestemme vævsspecificitet af en forbindelse eller til sammenligning af flere forskellige forbindelser. Kvantitativ væv histologi derimod kræver omfattende yderligere behandling af væv med henblik på at skabe et kvantitativt mål for de mærkede forbindelser. For præcist at vurdere bio-fordeling, skal alle væv af interesse skiver, scannes, og analyseret i forhold til standard kurver for at foretage sammenligninger mellem væv eller grupper. Kvantitativ væv histologi er den gyldne standard for bestemmelse af absolutte sammensatte koncentrationer inden væv.
Her beskriver vi, hvordan begge metoder kan anvendes effektivt sammen for at vurdere evnen af forskellige administrationsmetoder ennd sammensatte modifikationer til at målrette og levere fluorescensmærkede molekyler til centralnervesystemet 1.
Introduction
Fluorescerende mærkning er et nemt udnyttes og effektiv metode til bestemmelse af biodistribution af forbindelser, ved anvendelse af en række af udstyr, der er fælles for mange laboratorier. Fluoroforer er bredt tilgængelige, relativt billige, og kommer i mange forskellige bølgelængder, således at multiple mærkede molekyler kan anvendes samtidigt uden indblanding. De fleste fluoroforer har en række kemier til konjugering til forskellige reaktive grupper på målforbindelser, og processen med konjugation er generelt ligetil for de fleste typer af reaktive steder. Derudover det nødvendige udstyr til målingerne af fluorescensmærkede forbindelser er almindelige i mange laboratorier. Fluorescerende mikroskoper, kameraer og dias scannere kan alle anvendes under forskellige omstændigheder, som gør brugen af fluorescerende mærkning meget tilgængeligt. Fluorescerende mærker anvendes hyppigt til at bestemme biodistributionen og kinetik af forbindelser både in vivo og ex vivo med levende imaging enheder, såsom IVIS Spectrum Imager, og ved kvantitativ væv histologi 2,3.
Brugen af ex vivo hel-orgel imaging brug af live-billeddannende indretninger er steget over tid på grund af deres brugervenlighed og evne til hurtigt at oprette en nøjagtig sammenligning af de relative koncentrationer af mærkede forbindelser uden at kræve yderligere behandling af tissues4. Men mens ex vivo hel-organ- billeddannelse kan åbne mulighed for nem analyse og sammenligning, det genererer ikke en kvantitativ måling af absolutte koncentrationer forbindelse inden et væv. Dette skyldes lysspredning virkninger inden intakte organer. Eftersom lysspredning (og, i mindre omfang, absorbans) varierer ved væv størrelse og tæthed, kan hel-organ- billeddannelse undervurdere vævsniveauer i store eller tætte organer. Formulere passende standarder for absolutte koncentrationsmålinger er også svært, fordi man skal efterligne tykkelsenog densiteten af hvert enkelt organ. På den anden side, hel-organ billeddannelse er en hurtig metode til at opnå de relative vævsniveauer af en agent, og det er ideelt til sammenligning af den relative biodistribution af multiple relaterede molekyler (såsom i lægemiddelmålretning undersøgelser). En alternativ strategi er at anvende kvantitativ fluorescens histologi, en teknik afledt af metode til kvantitativ autoradiografi til opnåelse absolutte vævsniveauer af et testmiddel 5,6. Snarere end at placere en hel dyr eller organ i en imagining enhed, kvantitativ væv histologi kræver, at hver væv skæres i skiver, monteret på dias, scannede, og analyseret individuelt. Standarder for testmidlet fremstilles og skåret på samme tykkelse som de organprøver. Ved at skære alle organer og standarder til samme tykkelse, er variabilitet skyldes lysspredning eller absorbans elimineret, og væv fluorescensintensiteten kan være egnet til at standardkurven for at bestemme absolut concentrationere. Selv om denne fremgangsmåde, når det gøres ordentligt, er kvantitativ, er det også arbejdskrævende og nemt mishandlet. I betragtning af den mere komplekse karakter af kvantitativ histologi og den væsentligt højere omkostninger på arbejdskraft i forhold til hel-orgel billedbehandling, bliver det umagen værd at undersøge, hvor hver proces er mest praktisk at bruge, når man undersøger bio-distribution af fluorescens mærkede forbindelser. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af, hvordan disse fremgangsmåder kan anvendes sammen til effektivt sammenligne biodistribution af rhodamin-mærket Elastin-lignende polypeptid (ELP), med eller uden tilsætning af SynB1 eller Tat-celle-penetrerende peptider, via intranasal (IN) og intravenøs (IV) administrationsveje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyr brug i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Mississippi Medical Center.
1. Behandling af dyr og væv
- Administration og offer
- Bedøve dyrene anvendelse af 3% isofluran i 5 minutter og kontrollere dybden af bedøvelse ved at observere fraværet af tåen-pinch refleks. Påfør veterinær salve til øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Afvej dyret og afpipetteres en 50 mg / kg dosis af enten rhodamin-mærket ELP, SynB1-ELP, eller Tat-ELP i et 1,5-ml rør. Spare 100 pi af de administrerede mærkede forbindelser til formulering af standardkurver i senere trin.
Bemærk: Det er vigtigt, at standarder foretages fra samme parti mærket protein administreres til dyrene for at undgå forskelle på grund af variabilitet i fluorescerende effektivitet mærkning. For at kunne fjerne baggrund Lysstofrørblomsterstand fra senere fluorescens målinger skal et ubehandlet dyr blive ofret med de samme metoder / reagenser som de behandlede dyr. - Administrere en IV injektion som tidligere beskrevet 1 under anvendelse af enten halevenen eller den femorale vene (der er adgang via en 1-cm incision i lysken). For analgesi, hvis der gøres en lyske indsnit, administrere carprofen subkutant i en dosis på 5 mg / kg, og anvende sensorcaine til incisionssted før lukning med et sår klip. For at administrere via den intranasale (IN) vej, sende dyret i liggende stilling.
- Ved hjælp af en 2-uL pipette, udarbejde en 1-ul dråbe mærket forbindelse. Tryk kortvarigt på dyrets hoved fra anæstesi kraven at give adgang til næseborene.
- Placér spidsen af pipetten til åbningen af en enkelt nare og langsomt trykkes stemplet, så dråben til at køre ned nare ind i næsehulen. Gentag hver 1 min, skiftevis næsebor hver eneste dråbe, indtil den fulde dosis er annoncenbetjente.
Bemærk: Den maksimale lydstyrke administreres via IN bør ikke overstige 10 - 15 uL for mus. - Lad dyrene i den liggende stilling under anæstesi i 10 min efter den sidste administration, før du flytter dem hver ind i en individuel bur.
Bemærk: Lad ikke dyr uden opsyn, indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. - 1 time efter administration, re-bedøver dyrene som før og ofre dem via transcardial perfusion hjælp PBS (210,0 mg / L KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / l NaCl, 726 mg / l Na 2 HPO 4 .7H 2 O) på 10 ml / min i i alt 20 ml.
Bemærk: perfusion af dyrene på offer for at fjerne alt blod fra væv er nødvendig for at bestemme de ekstravaskulære koncentrationer af mærkede forbindelser. Perfusion reagenser kan resultere i ændringer i baggrunden fluorescens og bør holdes konsistent. Fremgangsmåden til aflivning bør være i overensstemmelseinden for grupper. Forskellige metoder til aflivning kan resultere i varierende niveauer af blod i vaskulaturen, ændre baggrunden fluorescens af vævene.
- Indsamling af væv
- Forbered PBS som beskrevet ovenfor til skylning de fjernede væv.
Bemærk: Hvis en anden puffer blev anvendt som perfusionsvæsken, skylles væv i den samme buffer. - Fjern hjerte, lunger, mave, lever, milt og nyrer ved simpel dissektion. Kort skylles i PBS, før du bruger lab vådservietter at klappe tør eller væge væk overskydende fugt og placere væv på imaging måtten.
- Halshugge musen og fjern den øverste del af kraniet ved knogle kuttere eller Rongeurs. Ved hjælp af pincet, forsigtigt fjerne hjernen, holde olfaktoriske pærer intakt. Skyl, tør, og læg den på den medfølgende imaging måtten.
- For at fjerne rygmarven via hurtig udslyngning 7, fylde en 10-ml sprøjte med PBS og vedhæfte et dulled 18-gauge kanyle.
Bemærk: 18 gauge passerden voksne rygmarvskanalen af mange muselinjer. Den krævede diameter vil variere med dyrets størrelse. - Placer dyret i bugleje, at åbningen af rygmarvskanalen ved halshugning stedet rent skæres og fri for blod.
- Fjern skindet fra hele rygsøjlen. Brug skarpe knogle kuttere eller saks, skære gennem rygsøjlen i lænden afsnittet direkte rostral til hofterne.
- Kort skyl den med PBS for at visualisere rygmarvskanalen. Sæt forsigtigt nålen ind i rygmarvskanalen.
Bemærk: Nålen skal føles lunt og kan kræve nogle langsomme rullende frem og tilbage under indføring. Bør nålen føler sig løs, kan en mere rostralt snit foretages eller en større nål diameter kan være nødvendig. - Med tommelfingeren og pegefingeren, lægge pres på rygsøjlen omkring den indsatte nål. Tryk stemplet med moderat og konstant tryk. Rygmarven vil skubbe intakt ud af rostralt åbning i spinalkolonne.
Bemærk: Den komplette fjernelse, skylning og tørring af alle større organer med rimelighed kan afsluttet i 5-7 min. Denne korte tid forhindrer behovet for udvidet opbevaring i PBS, som kan resultere i overdreven udsættelse for lys og udvaskningen af mærkede proteiner fra vævet.
- Forbered PBS som beskrevet ovenfor til skylning de fjernede væv.
2. Hele-organ ex vivo Fluorescens Imaging
- Imaging Parametre
- Start købet billedet software. I nederste højre hjørne af erhvervelse kontrolpanel, klik på "initialisere".
- Under "imaging mode" vælge afkrydsningsfeltet "fluorescerende". Under "eksponeringstid," vælge "AUTO."
- Under "binning," vælg "små" og indstil F / Stop for to.
- Vælg 535-nm excitation og 580-nm emission filtre.
Bemærk: Dette vil variere afhængigt af den anvendte mærkning. - Vælg "Field of View B", og indstil udsigt til rentenedsættelsert højden til 0,3 cm.
Bemærk: Dette vil variere efter væv, der skal afbildes. - Når indikatoren temperaturen bliver grøn (dvs. maskinen er fuldt initialiseret), placere vævene onto billede sort baggrund mat, der sikrer, at vævene er fuldstændig adskilt fra hinanden. Placer måtten i billeddanneren, der sikrer, at alle væv er i det valgte område gitteret. Større og ikke-homogene væv, såsom hele leveren, bør fastsættes ud for at reducere overlapning af lapper.
Bemærk: Væv kan arrangeres sammen i en enkelt gruppe, hvilket tillader et billede til at rumme et enkelt dyr eller alle væv af en lignende type. Dette gør analyse og organisering lettere senere. Hvis store forskelle i fluorescensintensitet er til stede blandt forskellige væv, er det bedst at billedet dem enkeltvis eller som grupper af samme vævstype, som en enkelt eksponeringstid ikke kan være ideel for alle intensiteter væv. - Klik på "Acquire".
- Efter billedbehandling, straks fjerne væv og opbevare eller fryse dem til kvantitativ histologi, som beskrevet i trin 4.
3. Standarder og billedbehandling
- standarder
- I PBS, oprette to-fold serielle fortyndinger af hvert protein anvendes i behandlingen af dyrene, begyndende ved den oprindelige koncentration, med i alt 15 fortyndinger.
Bemærk: Koncentrationsområdet bør sigte mod at inkludere de forventede koncentrationer væv og kan kræve yderligere fortyndinger af den oprindelige prøve, afhængigt af udgangskoncentrationen. - Tilsæt 100 pi af hver standard i hver brønd i en sort 96-brønds plade. Indbefatter en brønd af ren PBS at opnå et mål for baggrundsfluorescens.
- Billede standarderne med de samme parametre, der anvendes til vævet billeddannelse.
- I købet billedet software "Tool Palette" under "ROI Tools," vælge "Region of Interest (ROI) "Cirkel og trække ROI omkring en godt. Kopier, at ROI til alle de andre fyldte brønde og klik på "måle ROI'er."
- Fratræk værdien i gennemsnit strålende effektivitet af den rene PBS fra værdierne af de andre standarder; dette fjerner baggrundsfluorescens. Plot værdierne mod den kendte koncentration om et scatter plot.
Bemærk: Den resulterende ligning for den lineære trend linie kan derefter anvendes til at beregne den relative fluorescens værdi.
- I PBS, oprette to-fold serielle fortyndinger af hvert protein anvendes i behandlingen af dyrene, begyndende ved den oprindelige koncentration, med i alt 15 fortyndinger.
- billedbehandling
- I købet billedet software, skal du vælge freeform værktøj ROI og tegne ROI omkring hver af de enkelte væv. Klik på "foranstaltning".
- Med de resulterende gennemsnitlige strålende målinger effektivitet, trække de målte værdier fra den ubehandlede dyr for hver vævstype og plot disse værdier på den tidligere oprettede standardkurve.
Bemærk: De resulterende relative fluorescensværdier giver en hurtig og præcis øjebliksbillede afbiofordeling af den mærkede forbindelse.
4. Kvantitativ Tissue Histologi
- Forberedelse og indefrysning af væv til udskæring
- Opret eller købe beholdere af tilstrækkelig størrelse til at fryse de valgte væv og kryostat der skal anvendes. Indpakning aluminiumsfolie omkring en hensigtsmæssigt dimensioneret og formet objekt fungerer godt.
- Der fremstilles en blanding af isopropanol og tøris ved at fylde halvdelen af en 500-ml-bæger med tøris og tilsætning ~ 350 ml isopropanol, således at der er tilstrækkelig væske over tøris til delvist nedsænkes beholderen frysning.
Bemærk: Flydende nitrogen ofte resulterer i brud af den optimale skærende temperatur forbindelse (OLT) og indlejrede væv og bør undgås. - Fyld beholderen frysning delvist med OLT sikrer, at der ikke er nogen bobler til stede. Hvis der er bobler, arbejder boblerne ud af opløsning ved hjælp af pincet eller et lignende redskab.
- Fjern vævetfra PBS og tør den grundigt, enten ved forsigtigt at duppe den med en lab tørre eller ved at røre kanterne af sarte væv til en lab tørre og lade væsken at væge væk.
- Placer vævet forsigtigt ind OLT inde indefrysning container, sikrer ikke at indføre bobler under vævet. Når vævet er på plads, tilføje okt til vævet er helt dækket.
- Sænk kølecontaineren så meget som muligt uden at tillade isopropanol at komme i kontakt med den blotlagte oktober inden i beholderen. Tillad 30 - 90 s (eller potentielt mere for større væv) for OLT og væv til at fryse helt før opbevaring ved -80 ° C, så længe det er nødvendigt.
- Udarbejdelse af standarder for udskæring.
- Forberede og passende etiket 1-ml engangssprøjter ved at fjerne ende af cylinderen, således at hele længden af sprøjten er en diameter. Dette vil give frosne cylinder til at blive skubbet ud senere.
- Osing OLT skabe en 15-trins dobbelt seriel fortynding af indgivne forbindelser, som blev udført med PBS tidligere, men med et endeligt resulterende volumen på 1 ml. Medtag en prøve af ren OLT fjernelse af baggrundsfluorescens værdier.
- Viskositeten OLT gør tilstrækkelig blanding vanskelig. Vend rørene og tillade OLT til helt bosætte før invertere igen. Gentag dette 10 - 20 gange for at sikre en ensartet blanding. Hold standardløsninger ved 4 ° C og væk fra lys under blanding.
- Efter blanding igen fremstille en blanding af isopropanol og tøris, som før.
Bemærk: Flydende nitrogen kan også anvendes i stedet for isopropanol / tøris-blanding, forudsat sprøjterne hurtigt fjernes efter at de er frosset fast. - Tegn OLT standarden i sprøjten, der tager sig at indføre så få bobler som muligt. Efter udarbejdelsen OLT løsning, straks dyppe sprøjten direkte ind i isopropanol, og lad opløsningen fryse heltinde i sprøjten i 10 - 20 s. Opbevar sprøjterne ved -80 ° C, så længe det er nødvendigt.
- Skæring af væv og standarder
- Placer begge væv og standarder i -20 ° C og tid nok til alle prøver at komme til temperatur.
Bemærk: Den ideelle skære temperatur generelt falder omkring -10 ° C interval for de fleste væv, men det i sidste ende afhænger af væv størrelse og fedtindhold og skal raffineres empirisk. - Ved hjælp af en kryostat, skæres væv i 20-um tykke skiver og montere dem på objektglas, som tidligere beskrevet 8. Opbevar objektglassene ved -20 ° C og holde dem væk fra lys så meget som muligt under skæring og til scanningen.
Bemærk: Det er vigtigt her at afsnittene, der skal måles er hensigtsmæssigt fordelt gennem hele tykkelsen af vævet. - For at montere standarderne på kryostat chuck, tage sprøjten fra fryseren og varme udenfor i 3 - 5 s ved holding den i hånden. Skub stemplet indtil et kort afsnit (~ 1 cm) af OLT cylinder er uden for sprøjten.
- Ved hjælp af en barberblad, skære igennem cylinderen og placere det resulterende cylinder afsnittet vinkelret på borepatronen, ved hjælp af OLT til et holde det på plads. Denne konfiguration bør resultere i veldefinerede cirkler bliver skåret.
- Skær cylindrene ved 20 um, placere en skive fra hver fortynding på en enkelt objektglas, således at én slide repræsenterer hele standardkurve. dias ved -20 ° C Opbevar indtil den er klar til scanning.
- Placer begge væv og standarder i -20 ° C og tid nok til alle prøver at komme til temperatur.
- Scanning og kvantificering
- Start scanningen vifte software og klik på "543 laser" for at starte laser opstart procedure. Vent i 15 min for laser til at blive klar.
- Når laseren er klar, fjernes objektglassene fra -20 ° C og flytte dem ind i en stor, lys-beskyttet beholder til at komme til temperatur og tørre i 3 min. Dette vil forhindre fugt oprustning i SLIde scanner.
- Læg slide på slide beholderen på dias scanner. Klik på "scan" og vælg "køre let scanning."
- Indstil scanningsopløsning til 50 um.
- Vælg først afkrydsningsfeltet "Brug" under "fluorofor" og vælg "TRITC." Indstil PMT Gain til 80%.
Bemærk: Disse indstillinger vil variere afhængigt af fluoroforen og koncentrationen af de mærkede molekyler. - På den venstre side, at scanningsområdet omfatter hele dias. Klik på "Start".
- Efter scanning, skal du vælge "file" og "gem som" og derefter gemme billedet som en .tif.
Bemærk: Slides af væv og standarder skal scannes på de samme indstillinger. - Læg de resulterende billeder i ImageJ og vælg ROI'er omkring væv og standarder. Under fanebladet "analysere", vælg "sæt målinger" og vælg "betyder grå værdi." Klik220; foranstaltning ".
Bemærk: Som med den tidligere teknik, skal baggrundsfluorescens trækkes fra alle målte værdier. - Plot de gennemsnitlige grå værdi målinger fra de standarder, mod den kendt koncentration til at skabe en standardkurve.
Bemærk: De resulterende målinger fra vævene, beregnes gennemsnittet inden hvert væv og afbildes på denne standardkurve for at bestemme koncentrationen i vævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene nedenfor beskriver leveringen af tre forbindelser: en lægemiddel-levering vektor kendt som ELP og to versioner af ELP modificeret med celle-gennemtrængende peptider (SynB1-ELP og Tat-ELP) 9. Alle tre forbindelser blev mærket med tetramethylrhodamin-5-maleimid og leveret via to administrationsveje (IN og IV). Målet med disse forsøg var at bestemme hvilken forbindelse og indgivelsesvej ville resultere i den bedste indtrængning i centralnervesystemet (CNS) 3.
Figur 1A viser repræsentative ex vivo hel-organ billeder af organer fra de behandlede dyr. Varmen kort overlay viser fluorescens niveauer i strålende effektivitet inden for de væv. Ved at trække ROIs omkring de enkelte væv og ved at plotte disse værdier på deres tilsvarende standard kurve, er standardiserede fluorescensværdier illustreret i figur 1B genereret. Den standardiserede fluorescence værdier kan derefter anvendes til nøjagtige sammenligninger af de relative koncentrationer af de forskellige forbindelser. Disse data beskriver nøjagtigt både virkningen af ELP modifikation på indtrængning i specifikke væv, såvel som effekten af indgivelsesvej på hver forbindelse. Med disse resultater er det umiddelbart klart, at ELP levering via IN administration er den mest effektive kombination til at nå CNS.
Mens disse resultater at bestemme den bedste gennemtrængende forbindelse og levering metode, de ikke beskrive den faktiske koncentration eller regional lokalisering af forbindelser indenfor CNS. Kvantitativ histologi er derfor velegnet til at afslutte beskrivelsen af biodistribution af disse forbindelser, da det giver mulighed for kvantitative målinger af de udvalgte områder af hjernen. Figur 2A viser et repræsentativt udsnit fra ELP IN-behandlede dyr, og 2B beskriver kvantificering af ROIs adskilleolfaktoriske pærer, halvkugler, og lillehjernen. Ud fra disse data er det klart, at mens ELP administration af i rute kan resultere i høje CNS koncentrationer, det sker primært i olfaktoriske pærer og cerebellum. Omvendt ELP leverede IV har lavere samlede koncentrationer, men det er jævnt fordelt i hele hjernen. Afhængigt af mål for disse administrerede forbindelser og potentialet for effekter i andre organer, kan enten IN eller IV administration være bedre valg. Dette kunne ikke konkluderes uden tilsætning af den kvantitative histologi. Teknisk set kunne kvantitativ histologi er blevet anvendt i alle væv af hver gruppe, men ved at anvende begge metoder sammen, blev en stor del tid og arbejdskraft gemt mens den stadig resulterer i samme konklusion.
Figur 1: Ex Vivo Whole-orgel FluorescensMålingerne. A) Repræsentative billeder fra ELP gruppen. Varmen map skala blev sat som strålende effektivitet. B) Gennemsnitlige strålende virkningsgrader opnået fra oprettelsen af ROIs omkring de individuelle væv, der blev analyseret på en standardkurve for at generere de standardiserede fluorescensværdier anvendes til sammenligning af bio-fordelinger. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Scale bar = 5 mm. (Modificeret fra McGowan, et al,. Drug Design, udvikling og terapi, 2016) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvantitative Tissue Histologi Målinger. A) Repræsentant billede af ELP IN- eller IV-behandlede dyr skabt af udskæring hjerner 20 pm tykke, montering af skiver on dias, og derefter scanne disse dias ved hjælp af en fluorescens dias scanner. B) Gennemsnitlige værdier opnået fra oprettelsen af ROIs omkring lugtekolben, halvkugler, og lillehjernen, målt som den gennemsnitlige grå værdi og fit med en standardkurve for at generere ug / m koncentrationsmålinger. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Scale bar = 5 mm. (Modificeret fra McGowan, et al,. Drug Design, udvikling og terapi, 2016) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens ex vivo hel-orgel imaging er generelt ligetil, kan overholdelsen af nogle grundlæggende begreber og teknikker forbedre nøjagtigheden af bio-distributions- målinger. Korte bølgelængder af lys erfaring en høj grad af spredning og absorbansen i de fleste væv, som i væsentlig grad påvirker nytte af de korte bølgelængde fluoroforer. Disse fluorophorer har begrænset anvendelse i dyb-væv studier, men de har været anvendt effektivt i forsøg ser på overfladen væv eller ind i øjet. Omvendt lange bølgelængder af lys undergår signifikant mindre spredning og absorbans, hvilket resulterer i større penetration og mere præcise resultater med tykkere væv 10. Fluoroforer der falder i langt rødt og nær infrarød (NIR) område (excitation ~ 600 nm) af spektret er almindeligt valgt til hele dyr eller større væv. For forsøg med disse lange bølgelængde fluoroforer, auto-fluorescens af særlig tissagsøger eller materiale er sandsynligvis en vigtig overvejelse. For eksempel galden inde i galdeblæren hos gnavere er meget autofluorescente ved bølgelængder i 500 - 600 nm området. Da dette i høj grad kan forvrænge levertal, er det ofte bedst at fjerne galdeblæren før billeddannelse. Alternativt, hvis det intakte lever og galdeblære er påkrævet, at vælge en fluorofor med en excitationsbølgelængde i meget langt ende af spektret kan begrænse indflydelsen af galde autofluorescens. Derudover har mange af de fælles gnaver chows indeholder urenset lucerne, der fluorescerer meget gennem midten og langt-intervaller af spektret. Hvis de valgte etiketter falder inden for disse bølgelængder og fordøjelseskanalen skal afbildes, en ændring i kost sandsynligvis den bedste mulighed.
Mens levende billeddannende systemer er designet til nøjagtigt at måle tykke væv, med ikke-homogene og især tykke væv (f.eks, hele rottelevere), kan mere nøjagtige målinger oftOr opnås ved at sprede vævet ud, således at lapperne i leveren overlapper så lidt som muligt. Også i tilfælde, hvor væv har en højt skæv fordeling af mærkede molekyler, billeddannelse fra flere sider af væv og midling af disse målinger kan øge nøjagtigheden. I sidste ende er de typer af væv, der skal afbildes, skal autofluorescens af de materialer, der er forbundet med de pågældende væv og potentialet fordeling af de administrerede mærkede molekyler overvejes nøje for at vælge en fluorofor med de passende excitations- og emissionsbølgelængder, der begrænser interferens så meget som muligt.
Når der udføres kvantitativ væv histologi, er der flere vigtige detaljer at huske på. For resultaterne at være korrekte, skal der tages skiver hele væv eller region, der skal analyseres. Dette betyder, at disse væv ikke vil være til rådighed for andre processer. Det kan være muligt at fastsætte og plet efterscanning, men det er typisk bedst at lade skiverne tørre lidt, før du sætter dem ind i scanneren, hvilket kan påvirke den fremtidige farvning. Ligeledes vil scanningen forårsage en vis grad af foto-blegning, hvilket reducerer den potentielle signal i efterfølgende processer. For downstream mikroskopi applikationer, er overlegne sektioner typisk ved fastsættelse af væv og ækvilibrere dem i en sucrose opløsning før sektionering. Imidlertid er denne proces bedst undgås i ovenstående kvantitative histologi protokol skyldes virkningerne af fiksering og / eller lange saccharose opsuger på fluorescensintensitet. Også, afhængigt af mængden af signal til stede, kan skiver opleve foto-blegning, hvis de udsættes for selv lave niveauer af omgivende lys. Holde dias koldt og væk fra lys i væsentlig grad vil forbedre nøjagtigheden af de resulterende målinger. Samlet set kan omhyggelig håndtering og forberedelse drastisk forbedre det endelige resultat.
Der er en række andreanvendte metoder til at studere bio-distribution og farmakokinetik administrerede makromolekyler, der varierer meget i tekniske vanskeligheder, gennemløb, nøjagtighed, og det nødvendige udstyr 11. Kvantitative immunassays og bioaktivitetsanalyser kan både være teknisk kompliceret og kræver antistoffer eller reagenser specifikke for de administrerede molekyler, tilføjer væsentligt til omkostninger og arbejdskraft. Flere metoder baseret på radioaktive isotoper mærkning er anvendt i fortiden, med varierende nøjagtighed, men integrationen af radioisotoper til makromolekyler, samt indsamling af selve data, kan kræve betydelige forberedelse og kan ofte gengive væv fuldstændig ubrugelig for yderligere analyser 12. Endelig andre vist sig at være effektive metoder, herunder positron emission tomografi og massespektrometri, typisk udelukket simpelthen på grund af mangel på det nødvendige udstyr. Den ovenfor beskrevne protokol anvender to metoder sammenholdt til effektiv bestemmelse the bio-fordeling af mærkede molekyler i en hurtig, omkostningseffektiv, præcis og let tilgængelig måde på grund af den regelmæssige availably af det nødvendige udstyr.
Denne fremgangsmåde blev anvendt til at generere dataene ovenfor, identificere den bedste vektor og indgivelsesvej til afgivelse af mærkede molekyler til CNS. Fra de ex vivo-data, ELP administreret IN og ELP administreret IV blev identificeret til yderligere karakterisering via kvantitativ væv histologi. Kvantitativ væv histologi derefter forudsat koncentrationerne af mærkede molekyler i bestemte områder af CNS, så de endelige konklusioner. De to metoder tilsammen repræsenterer en hurtig og effektiv måde at udføre en detaljeret undersøgelse af den bio-fordeling af flere specifikke forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
