Summary
Ex vivo hel-organ avbildning er en hurtig metode for å bestemme de relative konsentrasjoner av fluorescensmerkede forbindelser innenfor og mellom vev eller behandlingsgruppene. Omvendt, kvantitativ fluorescens histologi, mens mer arbeidskrevende, gjør det mulig for kvantifisering av de absolutte vevsnivåer av merkede molekyler.
Abstract
Fluorescerende merking er en godt etablert prosess for å undersøke skjebnen av merkede molekyler under forskjellige eksperimentelle betingelser både in vitro og in vivo. Fluorescerende prober er spesielt nyttige for å bestemme bio-fordelingen av administrert store molekyler, hvor tilsetningen av en liten-molekyl fluorescerende markør antas ikke å påvirke kinetikken eller bio-fordeling av forbindelsen. En rekke metoder eksisterer for å undersøke bio-fordeling som varierer betydelig i mengden av anstrengelse som kreves, og hvorvidt de resulterende målingene er fullstendig kvantitativt, men ved hjelp av flere metoder i kombinasjon kan gi en hurtig og effektivt system for å analysere bio-distribusjoner.
Ex vivo hel-organ avbildning er en metode som kan brukes til raskt å sammenligne de relative konsentrasjoner av fluorescerende molekyler i vev og mellom flere typer vev eller behandlingsgruppene. Ved hjelp av en avbildning platskjema designet for live-dyr eller hel-organ imaging, fluorescens innen intakte vev kan bestemmes uten videre behandling, noe som sparer tid og arbeid samtidig som det gir et riktig bilde av den samlede bio-distribusjon. Denne prosessen er ideelt i forsøk forsøker å bestemme vevsspesifisiteten av en forbindelse eller for sammenligning av flere forskjellige forbindelser. Kvantitativ vev histologi på den annen side krever omfattende videre behandling av vev for å skape et kvantitativt mål på de merkede forbindelser. For å vurdere bio-fordeling nøyaktig, må alle vev av interesse være skiver, skannes, og analysert i forhold til standardkurver for å foreta sammenligninger mellom vev eller grupper. Kvantitativ vev histologi er gullstandarden for å bestemme absolutte sammensatte konsentrasjoner i vev.
Her beskriver vi hvordan begge metoder kan benyttes effektivt sammen for å vurdere evnen til forskjellige administrasjonsmetoder and sammensatte modifikasjoner til målet og levere fluorescerende merkede molekyler til sentralnervesystemet 1.
Introduction
Fluorescerende merking er en lett utnyttes og effektiv fremgangsmåte for å bestemme bio-fordeling av forbindelser, ved hjelp av et utvalg av utstyr som er felles for mange laboratorier. Fluoroforer er allment tilgjengelig, relativt billig, og kommer i en rekke forskjellige bølgelengder, slik at flere merkede molekyler kan benyttes samtidig uten forstyrrelser. De fleste fluoroforer har en rekke kjemikalier for konjugering til forskjellige reaktive grupper på målforbindelser, og prosessen med konjugering er vanligvis en enkel prosess for de fleste typer av reaktive seter. I tillegg er det utstyr som kreves for målingene av fluorescensmerkede forbindelser er vanlig i mange laboratorier. Fluorescent mikroskoper, kameraer og lysbilde skannere kan alle brukes i ulike situasjoner, som gjør bruk av fluorescerende merking svært tilgjengelig. Fluorescerende markører blir ofte brukt til å bestemme den biologiske fordeling og kinetikken av forbindelser både in vivo og ex vivo med live bildebehandlingsenheter, for eksempel IVIS Spectrum Imager, og ved kvantitativ vev histologi 2,3.
Bruken av ex vivo hel-organ avbildning ved hjelp live bildebehandlingsenheter har økt over tid på grunn av sin brukervennlighet og evne til raskt å lage en nøyaktig sammenligning av de relative konsentrasjoner av merkede forbindelser uten at den videre behandlingen av tissues4. Men mens ex vivo hel-organ bildebehandling kan gi rom for enkel analyse og sammenligning, det ikke genererer et kvantitativt mål for absolutte sammensatte konsentrasjoner i en vev. Dette skyldes lysspredning effekter i intakte organer. Siden lysspredning (og, i mindre grad, absorbans) varierer fra vev størrelse og tetthet, kan hel-organ avbildning under vevsnivåer i store eller tette organer. Formulering aktuelle standarder for absolutte konsentrasjonsmålinger er også vanskelig fordi man må etterligne tykkelsenog densitet på hvert enkelt organ. På den annen side, er hel-organ avbildning en rask metode for å skaffe de relative vevsnivåer av et middel, og det er ideell for å sammenligne den relative biologiske fordeling av flere beslektede molekyler (slik som i legemiddel rettet mot studier). En alternativ strategi er å benytte kvantitativ fluorescens histologi, en teknikk som er avledet fra metoden til kvantitativ autoradiografi, for å oppnå absolutte vevsnivåer av et testmiddel 5,6. Snarere enn å plassere en hel dyr eller organ i en forestillingsevne enhet, krever kvantitativ vev histologi at hvert vev være skiver, montert på lysbilder, skannet, og analysert individuelt. Standarder av testmidlet fremstilles og skiver med samme tykkelse som de organprøvene. Ved å kutte alle organer og standarder til den samme tykkelse, er variasjonen på grunn av lysspredning eller absorbans elimineres, og vev fluorescens intensitet kan være egnet til å standardkurven for å bestemme absolutte concentrasjon. Selv om denne fremgangsmåten, når det gjøres riktig, er kvantitativ, er det også arbeidskrevende og lett misbrukes. Gitt mer komplekse natur av kvantitative histologi og betydelig høyere pris på arbeidskraft sammenlignet med hel-organ bildebehandling, blir det verdt å undersøke hvor hver prosess er mest praktisk å bruke når undersøke bio-fordeling av fluorescensmerkede forbindelser. Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan disse metodene kan brukes sammen for effektivt å sammenligne den biologiske fordeling av rhodaminmerkede Elastin-lignende polypeptid (ELP), med eller uten tilsetning av SynB1 eller Tat-cellepenetrerende peptider, via intranasal (IN) og intravenøs (IV) administrasjonsveier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: All bruk av dyr i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Mississippi Medical Center.
1. Behandling av dyr og vev
- Administrasjon og Sacrifice
- Bedøve dyrene ved anvendelse av 3% isofluran i 5 minutter og verifisere anestesidybden ved å observere fravær av tå-klemme refleks. Påfør veterinær salve til øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Vei dyret og pipetter a / kg dose av enten rhodaminmerkede ELP, SynB1-ELP, eller Tat-ELP 50 mg i en 1,5 ml tube. Lagre 100 ul av den administrerte merkede forbindelser for formulering av standardkurver i senere trinn.
Merk: Det er viktig at standarder fremstilles fra det samme partiet av merket protein administrert til dyrene for å unngå forskjeller på grunn av variasjonen i fluorescerende merking effektivitet. For å kunne fjerne bakgrunns Fluorescerendecence fra senere fluorescens målinger, må en ubehandlet dyr ofres bruke de samme metoder / reagenser som de behandlede dyrene. - Administrere en IV-injeksjon som tidligere beskrevet ved bruk av enten en halevenen eller lårvenen (som nås via en 1-cm innsnitt i lysken). For analgesi, hvis du gjør en lyske snitt, administrere carprofen subkutant i en dose på 5 mg / kg, og gjelder sensorcaine til innsnitt området før lukking med et sår klipp. For å administrere via intranasal (IN) rute, legg hunden i liggende stilling.
- Ved hjelp av en 2-mL pipette, utarbeide en 1-mL dråpe merket forbindelse. Skyver dyrets hode av bedøvelsen krage å gi tilgang til svelget.
- Plassere spissen av pipetten til åpningen av en enkelt nblir og langsomt stemplet trykkes inn, slik at dråpen for å kjøre ned nblir inn i nesehulen. Gjenta hver 1 min, alternerende svelget hver dråpe før full dose er adbetjente.
Merk: Maksimalt volum administreres via IN bør ikke overstige 10 - 15 mL for mus. - La dyrene i liggende stilling under narkose i 10 min etter siste administrasjon før du flytter dem hver i en individuell bur.
Merk: Ikke la dyrene uten tilsyn før de har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. - 1 time etter administrasjon, re-bedøve dyrene som før, og ofre dem via transcardial perfusjon ved hjelp av PBS (210,0 mg / l KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / l NaCl, 726 mg / l Na 2 HPO 4 .7H 2 O) på 10 ml / minutt for en total på 20 ml.
Merk: perfusjon av dyrene ved offer for å fjerne alt blod fra vev er nødvendig for å bestemme de ekstravaskulære konsentrasjoner av de merkede forbindelser. Perfusjon reagenser kan føre til endringer i bakgrunnen fluorescens og bør holdes konsekvent. Metoden av offer skal være konsekventinnenfor grupper. Ulike metoder for offer kan resultere i varierende grad av blod inne i vaskulaturen, endring av bakgrunnsfluorescens av vevet.
- Innsamling av Vev
- Forbered PBS som beskrevet ovenfor for å skylle fjernet vev.
Merk: Hvis en annen buffer ble anvendt som perfusjon væske, skyll vev i den samme buffer. - Fjern hjerte, lunger, mage, lever, milt og nyrer ved enkel disseksjon. Kort renset i PBS før du bruker lab kluter til tørk eller transportere bort fuktighet og plassere vevet på bilde matten.
- Halshogge musen og ta toppen av skallen bruker bein kuttere eller Rongeurs. Bruk pinsett, forsiktig fjerne hjernen, holde olfactory pærer intakt. Skyll, tørk, og plassere den på den medfølgende bilde matten.
- For å fjerne ryggmargen via raske utstøting 7, fylle en 10-ml sprøyte med PBS og legge ved en sløv 18-gauge nål.
Merk: 18 gauge fitsden voksne spinalkanalen for mange mus linjer. Den nødvendige diameter vil variere med dyr størrelse. - Plasserer dyret i liggende stilling, slik at åpningen av spinalkanalen ved halshogging stedet er et rent snitt og fri for blod.
- Fjern skinnet fra hele ryggsøylen. Ved hjelp av skarpe bein kniver eller sakser, skjære gjennom ryggsøylen i kors delen direkte rostralt til hoftene.
- I korthet skyll den med PBS å visualspinalkanalen. Forsiktig stikk nålen inn i spinalkanalen.
Merk: Nålen skal føle tettsittende og kan kreve litt treg rulling frem og tilbake under innføring. Skulle nålen føles løse, kan en mer rostralt kutt gjøres, eller en større diameter nål kan være nødvendig. - Ved hjelp av tommelen og pekefingeren, legg press på ryggsøylen rundt satt nålen. Trykk ned stempelet med moderat og konstant trykk. Ryggmargen vil løses intakt ut av rostralt åpning i ryggsøyle.
Merk: fullstendig fjerning, skylling og tørking av alle viktige organer med rimelighet kan gjennomføres i 5-7 min. Denne korte tid hindrer at behovet for lengre lagring i PBS, noe som kan resultere i overdreven eksponering for lys, og utvasking av merkede proteiner fra vevet.
- Forbered PBS som beskrevet ovenfor for å skylle fjernet vev.
2. Hel-organ Ex Vivo Fluorescens Imaging
- Imaging Parametere
- Start image oppkjøpet programvare. Nederst til høyre av oppkjøpet kontrollpanelet, klikk på "initialisere".
- Under "bildemodus", velg "fluoriserende" boksen. Under "eksponeringstid", velg "AUTO".
- Under "binning", velg "liten" og sett F / Stopp for å to.
- Velg 535-nm eksitasjon og 580 nm emisjonsfiltre.
Merk: Denne vil variere avhengig av den anvendte markør. - Velg "Field of View B" og sett TARGEt høyde 0,3 cm.
Merk: Denne vil variere avhengig av vevet som skal avbildes. - Når temperaturen indikatoren blir grønn (som betyr at maskinen er fullt initialisert), plasserer vevet inn den medfølgende svart bakgrunn matte, slik at vevet er helt atskilt fra hverandre. Plasser matten i imager, sikrer at alle vev er innenfor det valgte området rutenettet. Større og ikke-homogene vev, som for eksempel hele leveren, skal legges ut for derved å redusere overlappingen av flikene.
Merk: Vev kan være anordnet sammen i en enkelt gruppe, slik at ett bilde for å få plass til et enkelt dyr, eller alle vev av en lignende type. Dette gjør analyse og organisasjon lettere senere. Ved store forskjeller i fluorescens-intensitet er til stede mellom forskjellige vev, er det best å avbilde dem enkeltvis eller i grupper med samme vevstype som en enkelt eksponering tid ikke kan være ideell for alle vev intensiteter. - Klikk på "Hent".
- Etter bildebehandling, fjerne vev og oppbevare eller fryse dem for kvantitativ histologi, som beskrevet i trinn 4.
3. Standarder og bildebehandling
- Standarder
- I PBS, skape to-gangers serielle fortynninger av hvert protein som brukes i behandlingen av dyrene, som starter på den opprinnelige konsentrasjon, med en total av 15 fortynninger.
Merk: Konsentrasjonsområdet bør ta sikte på å inneholde de forventede konsentrasjoner vev og kan kreve ytterligere fortynning av den opprinnelige prøven, avhengig av utgangskonsentrasjon. - Pipetter 100 pl av hver standard i hver brønn av en sort 96-brønners plate. Omfatte en kilde med ren PBS for å oppnå et mål på bakgrunnsfluorescens.
- Bilde standarder med de samme parametrene som brukes for vevet imaging.
- I bildet oppkjøpet software "Tool Palette" under "ROI Tools," velg "Region of Interest (ROI) "Sirkel og trekke ROI rundt en brønn. Kopier at avkastningen til alle de andre fylte brønner og klikk "måle Rois."
- Trekke verdien i gjennomsnitt strålingseffektiviteten av det rene PBS fra verdiene av de andre standarder; dette fjerner bakgrunnsfluorescens. Plott verdiene mot den kjente konsentrasjonen på et spredningsdiagram.
Merk: Den resulterende ligning av den lineære trendlinjen kan deretter brukes til å beregne den relative fluorescensen verdi.
- I PBS, skape to-gangers serielle fortynninger av hvert protein som brukes i behandlingen av dyrene, som starter på den opprinnelige konsentrasjon, med en total av 15 fortynninger.
- Bildebehandling
- I bildet oppkjøpet programvaren, velger friform ROI-verktøy og tegne ROIs rundt hver av de enkelte vev. Klikk på "tiltak".
- Med de resulterende gjennomsnitts strålende effektivitetsmålinger, trekker verdiene målt fra den ubehandlede dyr for hver vevstype og plotte disse verdiene på den tidligere opprettede standardkurve.
Merk: De resulterende relative fluorescens verdier gir en rask og nøyaktig bilde avBiofordelingen av den merkede forbindelse.
4. Kvantitativ Tissue Histologi
- Utarbeidelse og Frysing av vev for å ha klippet
- Lag eller kjøpe beholdere med tilstrekkelig størrelse til å fryse de valgte vev og kryostaten som skal brukes. Innpakning aluminiumsfolie rundt et passende dimensjonert og formet gjenstand fungerer godt.
- Fremstille en blanding av isopropanol og tørris ved å fylle halvparten av et 500-ml beger med tørr is og tilsetning av ~ 350 ml isopropanol, slik at det er tilstrekkelig væske over tørris for delvis å senke frysebeholderen.
Merk: Flytende nitrogen ofte resulterer i brudd i den optimale skjære temperatur forbindelse (OCT), og innleiret vev og bør unngås. - Fyll fryse beholder delvis med oktober, slik at det ikke er noen bobler tilstede. Dersom det finnes bobler, arbeide bobler ut av oppløsning ved hjelp av pinsett eller et lignende redskap.
- Ta av vevfra PBS og tørk den grundig, enten ved å forsiktig klappe den med en lab klut eller ved å berøre kantene av delikat vev til en lab tørk og la væsken å transportere bort.
- Plasser vevet forsiktig inn i oktober inne i frysebeholderen, og sikrer ikke å innføre bobler under vev. Når vevet er på plass, legger oktober inntil vevet er fullstendig dekket.
- Senke frysepunktet beholder så mye som mulig uten å tillate at isopropanol for å komme i kontakt med den frilagte oktober inne i beholderen. Tillat 30 - 90 s (eller potensielt mer for større vev) for oktober og vev for å fryse helt før lagring ved -80 ° C så lenge som nødvendig.
- Utarbeidelse av standarder for å ha klippet.
- Fremstille og passende etikett 1-ml engangssprøyter ved å fjerne enden av sylinderen, slik at hele lengden av sprøyten er en diameter. Dette vil tillate den frosne sylinderen å bli skjøvet ut senere.
- Ossing oktober, skape en 15-trinns to-gangers seriell fortynning av administrerte forbindelser, slik det ble gjort med PBS som tidligere, men med en endelig resulterende volum på 1 ml. Omfatte en prøve av ren oktober for fjerning av bakgrunnsfluorescens verdier.
- Viskositeten til oktober gjør tilstrekkelig blanding vanskelig. Snu rørene og la oktober til helt bosette før snu igjen. Gjenta dette 10 - 20 ganger for å sikre en ensartet blanding. Hold standardløsningene ved 4 ° C og vekk fra lys under blanding.
- Etter blanding igjen fremstille en blanding av isopropanol og tørris, som før.
Merk: Flytende nitrogen kan også anvendes i stedet for isopropanol / tørris blanding, forutsatt at sprøytene fjernes raskt etter at de har frosset fast. - Tegn oktober standard i sprøyten, ta vare å innføre så få bobler som mulig. Etter utarbeidelse av oktober løsningen umiddelbart dypp sprøyte direkte inn i isopropanol og la løsningen å fryse heltinne i sprøyten i 10 - 20 s. Oppbevar sprøytene ved -80 ° C så lenge som det er nødvendig.
- Skjæring av vev og standarder
- Plasser begge vev og standarder i -20 ° C og gi nok tid for alle prøver å komme til temperatur.
Merk: Den ideelle cutting temperaturen vanligvis faller rundt -10 ° C rekkevidde for de fleste vev, men til syvende og sist avhenger av vev størrelse og fettinnhold, og må være raffinert empirisk. - Ved hjelp av en cryostat, kuttet vev inn i 20-mikrometer tykke skiver og montere dem på lysbilder, som tidligere beskrevet åtte. Oppbevar lysbilder ved -20 ° C og holde dem borte fra lyset så mye som mulig under skjæring og til skanningen.
Merk: Det er viktig her at delene som skal måles, er passende fordelt over hele tykkelsen av vev. - For å montere standardene på cryostat chuck, ta sprøyten fra fryseren og varme utsiden for 3 - 5 s etter holding den i hånden. Presse stempelet til en kort seksjon (~ 1 cm) av oktober sylinderen er utenfor sprøyten.
- Ved hjelp av en barberblad, skjære gjennom sylinderen og plasser den resulterende sylinderseksjon vinkelrett mot chuck, ved hjelp av oktober for å holde den på plass. Denne konfigurasjonen bør resultere i veldefinerte sirkler blir kuttet.
- Skjær sylindrene ved 20 um, å plassere en skive fra hver fortynning på et enkelt lysbilde, slik at en glide representerer hele standardkurve. Oppbevar lysbilder ved -20 ° C til den er klar for skanning.
- Plasser begge vev og standarder i -20 ° C og gi nok tid for alle prøver å komme til temperatur.
- Skanning og kvantifisering
- Start skanningen rekke programvare og klikk på "543 laser" for å starte laseroppstartsprosessen. Vent i 15 minutter for laser for å bli klar.
- Når laseren er ferdig, fjernes lysbildene fra -20 ° C og flytte dem inn i et stort, lett beskyttet av beholderen for å komme til temperatur og tørke i 3 min. Dette vil hindre fuktighet buildup i slide skanner.
- Last inn lysbilde i lysbilde kontakten på lysbilde skanner. Klikk "Scan" og velg "Kjør lett scan."
- Sett skanneoppløsningen til 50 mikrometer.
- Velg den første "Bruk" boksen under "fluorophore" og velg "TRITC." Angi PMT Gain til 80%.
Merk: Disse innstillingene vil variere avhengig av fluoroforen og konsentrasjonen av de merkede molekyler. - På venstre side, sørge for at skanneområdet omfatter hele lysbildet. Klikk på "Start".
- Etter skanning, velger du "Fil" og "Lagre som" og lagre bildet som en TIF.
Merk: Slides av vev og standarder bør skannes på samme innstillinger. - Last de resulterende bildene inn ImageJ og velg ROIs rundt vev og standarder. Under "analysere" -kategorien, velg "satt målinger" og velg "betyr grå verdi." Klikk220, tiltak ".
Merk: Som ved forrige teknikken, må bakgrunnsfluorescens trekkes fra alle måleverdier. - Plotte midlere grå verdi målinger fra standardene mot den kjente konsentrasjon for å opprette en standardkurve.
Merk: De oppnådde måleverdier fra vevene bør midlet innenfor hvert vev og plottet på den standardkurve for å bestemme konsentrasjonen i vevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene nedenfor beskriver levering av tre forbindelser: en narkotika-levering vektor kjent som ELP og to versjoner av ELP modifisert med celle-gjennomtrengende peptider (SynB1-ELP og Tat-ELP) 9. Alle tre forbindelser ble merket med tetramethylrhodamine-5-maleimide og levert via to administrasjonsveier (IN og IV). Målet med disse eksperimentene var å bestemme hvilken forbindelse og tilførselsvei vil resultere i den beste penetrasjon inn i sentralnervesystemet (CNS) 3.
Figur 1A viser representative ex vivo hel-orgel bilder av organer fra de behandlede dyrene. Varmen kart overlegg viser fluorescens nivåer i strålende effektivitet i vev. Ved å trekke ROIs rundt de individuelle vev og ved å plotte disse verdiene på deres tilsvarende standardkurve, er standardiserte fluorescens-verdier som er vist i Figur 1B generert. Den standardiserte fluorescence verdier kan deretter brukes for nøyaktig sammenligning av de relative konsentrasjoner av de forskjellige forbindelser. Disse data nøyaktig beskrive både effekten av ELP modifikasjon på inntrengning i spesifikke vev, så vel som effekten av administrasjonsveien på hver forbindelse. Med disse resultatene, er det umiddelbart klart at ELP levering via I administrasjonen er den mest effektive kombinasjonen å nå CNS.
Selv om disse resultatene bidra til å bestemme den beste trengende sammensatte og leveringsmåte, har de ikke beskrive den faktiske konsentrasjonen eller regional lokalisering av forbindelser innen CNS. Kvantitativ histologisk er derfor ideell for å fullføre beskrivelsen av den bio-fordelingen av disse forbindelser, som gjør det mulig for kvantitative målinger av de utvalgte områder av hjernen. Figur 2A viser et representativt stykke fra den ELP IN-behandlede dyr, og figur 2B beskriver kvantifisering av ROIs skilleolfactory pærer, halvkuler, og lillehjernen. Fra disse dataene, er det klart at mens ELP administrasjon av i rute kan føre til høye CNS konsentrasjoner, det gjør dette først og fremst i olfactory pærer og lillehjernen. Omvendt, ELP levert IV har lavere totale konsentrasjoner, men det er likt fordelt i hele hjernen. Avhengig av målet for disse administrerte forbindelser, og potensialet for effekter i andre organer, kan enten i eller intravenøs administrering være et bedre valg. Dette kunne ikke bli avsluttet uten tilsetning av den kvantitative histologi. Teknisk sett kvantitativ histologisk kunne ha vært brukt i alle vev i hver gruppe, men ved å benytte begge metoder sammen, at en god del tid og arbeidskraft lagret samtidig som resulterer i den samme konklusjon.
Figur 1: Ex Vivo Hel-organ FluorescenceMålinger. A) Representative bilder fra ELP gruppen. Varmen kartmålestokk ble satt som strålende effektivitet. B) Gjennomsnittlig varmeseffektivitetsverdier oppnådd fra etableringen av ROIs rundt de individuelle vev som ble analysert på en standardkurve for å generere de standardiserte fluorescens-verdiene som brukes for sammenlikning av bio-fordelinger. Feilfelt representerer SEM. Scale bar = 5 mm. (Modifisert fra McGowan, et al;. Drug Design, utvikling og terapi; 2016) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kvantitative Tissue Histologi Målinger. A) Representant bilde av ELP IN- eller IV-behandlede dyr skapt av slicing hjerner 20 mikrometer tykke, montering av skiver on lysbilder, og deretter skanne disse lysbildene ved hjelp av en fluorescens lysbilde skanner. B) Gjennomsnittsverdier ble oppnådd fra etableringen av ROIs rundt luktelappen, halvkuler, og cerebellum, målt som den midlere grå verdi og passer til en standardkurve for å generere mikrogram / ml konsentrasjonsmålinger. Feilfelt representerer SEM. Scale bar = 5 mm. (Modifisert fra McGowan, et al;. Drug Design, utvikling og terapi; 2016) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens ex vivo hel-organ bildebehandling er generelt grei, kan det tilslutning til noen grunnleggende begreper og teknikker forbedre nøyaktigheten av bio-distribusjons målinger. Korte bølgelengder av lys oppleve en høy grad av spredning og absorpsjon i de fleste vev, som i betydelig grad påvirker nytten av kort bølgelengde fluorophores de. Disse fluoroforer har begrenset anvendelse i dype vev studier, men de har vært brukt effektivt i eksperimenter ser på overflaten vev eller inn i øyet. Omvendt, lange bølgelengder av lys gjennomgår betydelig mindre spredning og absorpsjon, noe som resulterer i større utbredelse og mer nøyaktige resultater med tykkere vev 10. Fluoroforer som faller ned i den fjerne røde og nær infrarød (NIR) område (eksitasjon ~ 600 nm) av spekteret blir ofte valgt for hele dyr eller større vev. For eksperimenter med disse lang bølgelengde fluoroforer, auto-fluorescens av spesiell tissaksøker eller materiale er sannsynligvis en viktig faktor. For eksempel, galle inne i galleblæren av gnagere er meget auto-fluorescerende ved bølgelengder på 500 - 600 nm. Fordi dette kan i stor grad skew lever verdier, er det ofte best å fjerne galleblæren før bildebehandling. Alternativt, dersom den intakte leveren og galleblæren er nødvendig, å velge en fluorofor med en eksitasjonsbølgelengde på langt enden av spekteret kan begrense innvirkningen av galle auto-fluorescens. I tillegg er mange av de vanligste gnager chows inneholde urenset alfalfa, som fluoresces høyt gjennom midten og vidt områder av spekteret. Hvis de valgte etikettene faller innenfor disse bølgelengdene og fordøyelseskanalen skal avbildes, er en endring i kosthold sannsynligvis det beste alternativet.
Mens levende imaging-systemer er utviklet for å måle tykke vev, med ikke-homogene og spesielt tykke vev (f.eks, hele rottelever), kan mer nøyaktige målinger oftno oppnås ved å spre den ut vev, slik at flikene i leveren overlapper hverandre så lite som mulig. Også i tilfeller hvor vev har et høyt skjev fordeling av merkede molekyler, avbildning fra flere sider av vev og i snitt disse målingene kan øke nøyaktigheten. Til syvende og sist, hvilke typer vev som skal avbildes, bør den auto-fluorescens av de materialer som er knyttet til disse vevene, og den potensialfordeling av de administrerte merkede molekyler vurderes nøye for å velge en fluorofor med passende eksitasjons- og emisjonsbølgelengder som begrenser forstyrrelser så mye som mulig.
Når du utfører kvantitative vev histologi, er det flere viktige detaljer å huske på. For at resultatene skal være nøyaktig, må skiver tas gjennom hele vev eller region som skal analyseres. Dette betyr at disse vev ikke vil være tilgjengelig for andre prosesser. Det kan være mulig å fikse og beis etterskanning, men det er vanligvis best å la skivene tørke litt før du setter dem inn i skanneren, som kan påvirke fremtidig misfarging. Likeledes vil skanne føre til noen grad av foto-bleking, noe som reduserer risikoen signalet i etterfølgende prosesser. For nedstrøms mikroskopi applikasjoner, er overlegne deler vanligvis oppnås ved å feste vev og likevekts dem i en sukrose løsning før seksjonering. Imidlertid er denne fremgangsmåte best unngås i den ovennevnte kvantitative histologi protokollen på grunn av virkningene av fiksering og / eller lang sukrose absorberer på fluorescensintensitet. Også, avhengig av mengden av signal til stede, kan oppleve skiver foto-bleking dersom de utsettes for selv små mengder av lys fra omgivelsene. Å holde skinnene kald og borte fra lys vil forbedre nøyaktigheten av de resulterende målinger. Generelt kan forsiktig håndtering og tilberedning drastisk forbedre det endelige utfallet.
Det finnes en rekke annenfremgangsmåter som anvendes for å studere den bio-fordeling og farmakokinetikk av administrert makromolekyler som varierer vidt i teknisk vanskelighet, gjennomstrømning, nøyaktighet, og det utstyr som kreves 11. Kvantitative immunoassays og bioaktivitet analyser kan begge være teknisk kompliserte og krever antistoffer eller reagenser spesifikke for de administrerte molekylene, og legger betydelig til kostnadene og arbeidskraft. Flere metoder basert på radioaktiv isotop merking er brukt tidligere, med varierende nøyaktighet, men integrering av radioisotoper til makromolekyler, samt innsamling av data i seg selv, kan kreve betydelig forberedelse og kan ofte gjengi vev helt ubrukelig for ytterligere analyser 12. Til slutt, andre metoder vist seg å være effektiv, inkludert positronemisjonstomografi og massespektroskopi, er vanligvis utelukket bare på grunn av mangel på nødvendig utstyr. Protokollen er beskrevet ovenfor bruker to metoder i forbindelse for effektivt å bestemme the bio-fordeling av merkede molekyler i en rask, kostnadseffektiv, nøyaktig og lett tilgjengelig måte på grunn av den vanlige availably av nødvendig utstyr.
Denne metoden ble anvendt for å generere dataene ovenfor, identifisere den beste vektor og tilførselsvei for levering av merkede molekyler til CNS. Fra ex vivo data, ELP administreres og ELP administrert IV ble identifisert for videre karakterisering via kvantitative vev histologi. Kvantitativ vev histologi da forutsatt at konsentrasjonene av merkede molekyler i spesifikke regioner av CNS, slik at de endelige konklusjoner som kan trekkes. De to metodene sammen representerer en rask og effektiv måte for å utføre en detaljert undersøkelse av bio-fordelingen av flere spesifikke forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
