Summary
Ex vivo bütün organ görüntüleme içinde ve doku veya tedavi grupları arasında floresan etiketli bileşiklerin görece konsantrasyonlarının belirlenmesi için hızlı bir yöntem. Daha fazla emek yoğun ise aksine, kantitatif fluoresans histolojisi, işaretli moleküllerin mutlak doku seviyelerinin ölçümü için izin verir.
Abstract
Floresan etiketleme in vitro ve hem de in vivo deneysel koşullar altında çeşitli işaretli moleküllerin kaderini incelemek için iyi bilinen bir işlemdir. Floresan probları bir küçük moleküllü floresan işarete ilave kinetiği ya da bu bileşiğin biyo-dağılımı etkileyecek olası değildir tatbik büyük moleküllerin biyolojik dağılımını belirlenmesinde özellikle yararlıdır. çeşitli yöntemler gerekli çaba miktarda önemli ölçüde değişebilir ve biyo-dağılımını incelemek ana kadar elde edilen ölçümler, tam miktar, ancak biyo-dağılımı analiz etmek için hızlı ve etkili bir sistem sağlayabilir bağlantılı olarak, çeşitli yöntemler kullanılarak ister.
Ex vivo bütün organ görüntüleme hızlı doku içinde ve doku veya tedavi gruplarının çok tip arasındaki flüoresan moleküllerinin görece konsantrasyonlarının karşılaştırma kullanılabilecek bir yöntemdir. Bir görüntüleme plat kullanılmasıdokulara içinde canlı hayvan veya bütün organ görüntüleme, floresan için tasarlanmış form genel biyo-dağılımının doğru bir resim sağlarken zamandan ve işçilikten tasarruf, başka bir işleme tabi belirlenebilir. Bu işlem, bir bileşiğin doku özgüllüğünü belirlemeye çalışan deneylerde veya birden fazla farklı bileşiklerin karşılaştırma için idealdir. Öte yandan kantitatif doku histolojisi etiketli bileşiklerin nicel ölçü oluşturmak üzere dokuların detaylı ilave işlem gerektirmektedir. doğru biyo-dağılımını değerlendirmek için, ilgilenilen tüm dokular, dilimlenmiş taranır ve dokular veya gruplar arasında karşılaştırmalar yapmak için standart eğrileri göreli analiz edilmelidir. Kantitatif doku histoloji dokuları içinde mutlak bileşik konsantrasyonlarını belirlemek için altın standarttır.
Burada, her iki yöntem, farklı uygulama yöntemleri, bir yeteneğinin tayin edilmesi için bir arada etkin bir kullanım şeklini açıklarnd bileşik değişiklikler hedef ve merkezi sinir sisteminde 1'e floresan etiketli molekülleri teslim etmek.
Introduction
Floresan etiketleme bileşiklerin biyo-dağılımını belirlemek birçok laboratuvar için ortak olan bir ekipman kullanılarak çeşitli için kolaylıkla kullanılabilir ve etkili bir yöntemdir. Fluorophores nispeten ucuz, yaygın olarak kullanılabilir ve birden etiketli moleküller müdahalesi olmadan aynı anda kullanılabilir şekilde dalga boylarında, çeşitli gelir. Çoğu fluorophores hedef bileşiklere farklı reaktif gruplara konjugasyon için kimyaları bir dizi var ve konjugasyon süreci reaktif sitelerin çoğu türleri için genellikle basittir. Buna ek olarak, floresan etiketli bileşiklerin ölçümü için gerekli olan ekipmanın birçok laboratuvar yaygındır. Floresan mikroskoplar, kameralar, ve slayt tarayıcıları tüm florasan etiketleme kullanımı son derece erişilebilir hale farklı durumlarda kullanılabilir. Floresan etiketler sıklıkla viv in vivo ve ex hem bileşiklerin biyo-dağılımı ve kinetiklerini belirlemek için kullanılırBöyle IVIS Spektrum Imager olarak ve kantitatif doku histolojisi 2,3 canlı görüntüleme cihazları ile o.
Canlı görüntüleme cihazları kullanılarak ex vivo olarak bütün organ görüntüleme kullanımı nedeniyle kullanımı ve hızlı bir şekilde tissues4 daha işlem gerektirmeden etiketli bileşiklerin nispi konsantrasyonlarının doğru bir karşılaştırma oluşturma yeteneği kolaylıklan zamanla artmıştır. Ex vivo olarak bütün organ görüntüleme kolay analiz ve karşılaştırma için izin verebilir ancak bununla birlikte, bir doku içinde, mutlak bileşik konsantrasyonları bir nicel ölçümünü oluşturmaz. Bu dokunulmamış organlar içindeki ışık dağıtma etkilerine bağlıdır. (Daha az bir ölçüde, absorbans ve) ışık saçılımı doku büyüklüğüne ve yoğunluğuna göre değiştiğinden, bütün organın görüntülenmesi büyük veya yoğun organlarda doku düzeylerini hafife. bir kalınlığa taklit gerekir çünkü mutlak konsantrasyon ölçümleri için uygun standartlar formüle da zordurve her bir organ yoğunluğu. Diğer taraftan, bütün organın görüntülenmesi bir maddenin göreli doku seviyelerini elde etmek için bir hızlı bir yöntemdir ve bu (örneğin ilaç hedefleme çalışmalarda olduğu gibi) çok sayıda ilgili moleküllerin nispi biyo-dağılımı karşılaştırma için idealdir. Alternatif bir diğer strateji, kantitatif fluoresans histolojisi, kantitatif otoradyografi için açıklanan yöntemle elde edilen bir teknik kullanmak için bir deney maddesinin 5,6 mutlak doku düzeylerini elde etmektir. Aksine bir hayal cihaz içine bütün bir hayvan ya da bir organ yerleştirerek daha, nicel doku histolojisi her doku taranan slaytlar, üzerine monte edilmiş, dilimlenmiş ve bireysel analiz gerektirir. Test maddesinin Standartları hazırlanmış ve organ örnekleri gibi aynı kalınlıkta dilimlenir. Aynı kalınlığa tüm organ ve standartlar keserek ışını tarama ya da emiş nedeniyle değişkenlik ortadan kalkar, ve doku floresan yoğunluğu, mutlak konsantrasyonlarda belirlemek için standart eğriye uydurulmuş olabilirrasyon. doğru yapılan bu yöntem, kantitatif olsa da, aynı zamanda, emek-yoğun ve kolay bir şekilde hatalı olduğunu. Bütün organ görüntüleme ile karşılaştırıldığında nicel histoloji ve emek önemli ölçüde daha yüksek maliyetle daha karmaşık doğası göz önüne alındığında, her süreç floresan etiketli bileşiklerin biyo-dağılımını incelerken kullanmak en pratik olduğu incelemek için değerli hale gelir. Bu protokol ile, bu yöntemler ya da SynB1 veya TAT hücre nüfuz peptitlerinin ilavesi olmadan etkili bir şekilde rodamin etiketli elastin gibi polipeptit (ELP) biyo-dağılımı karşılaştırma birlikte kullanılabilir dair ayrıntılı bir açıklama sağlar intranazal (İN) ve damar içi (IV) uygulama yolları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol tüm hayvan kullanımı Mississippi Tıp Merkezi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
Hayvanlar ve Doku 1. Tedavi
- Yönetim ve Kurban
- 5 dakika için% 3 izofluran ile hayvanların anestezisi ve ayak parmağı sıkıştırma refleksinin yokluğu gözlemleyerek anestezi derinliğini kontrol edin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlere veteriner merhem sürün.
- hayvan tartılır ve 1.5 ml tüp içine ya da rodamin etiketli ELP, SynB1-ELP veya Tat-ELP bir 50 mg / kg dozda pipetle. sonraki adımda standart eğrilerin formülasyonu için tatbik edilen işaretlenmiş bileşiklerin 100 uL kaydedin.
Not: standartlar floresan etiketleme etkinliğindeki değişkenlik nedeniyle farklılıklarını önlemek amacıyla hayvanlara uygulanabilir etiketli protein, aynı partiden elde edilmiş olması çok önemlidir. düzgün bir arka Fluores ortadan kaldırmak içinDaha sonra fluoresans ölçümleri ile ilgili artmasına neden olmuştur, işlem görmemiş hayvanlar ile tedavi edilen hayvanlarda da aynı yöntemler / reaktifler kullanılarak kurban gerekir. - Daha önce kuyruk ven ya da (kasıkta 1 cm kesi üzerinden erişilen) femoral ven kullanılarak 1 açıklandığı gibi bir IV enjeksiyon yönetme. kasık kesi durumunda analjezi için, 5 mg / kg bir dozda deri altından karprofen uygulanması ve yara bandı ile kapatılmasından önce insizyon noktasına sensorcaine uygulanır. burun (IN) yoldan yönetmek için, yatar pozisyonda hayvan yerleştirin.
- 2 uL pipet kullanarak, etiketli bileşim bir 1-ul damla yaparlar. Kısaca burun erişmesine izin vermek için anestezi yaka hayvanın kafasını kaydırın.
- Tek bir Nare açılması pipet ucu yerleştirin ve yavaşça damlacık burun boşluğuna Nare aşağı çalışmasına izin veren, piston bastırın. tam doz reklamı kadar burun her damla alternatif, her 1 dakikada bir tekrarlayınızhizmet ettiler.
Not: IN üzerinden uygulanan maksimum hacmi 10 geçmemelidir - fareler için 15 mcL. - bağımsız bir kafes içine, her hareket önce son uygulamadan sonra 10 dakika süre ile anestezi altında yatar pozisyonda hayvanlar bırakın.
Not: sternum yatma muhafaza edilmesi için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvanları bırakmayın. - 1 saat sonra, daha önce olduğu gibi hayvanlar yeniden anestezi en (PO4, 9,000.0 mg / L NaCl, 726 mg / L Na 2 HPO 4 .7H 2 O 210.0 mg / l KH 2) PBS kullanarak transcardial perfüzyon yoluyla kurban 20 ml'lik bir toplam 10 mL / dakika.
Not: kurban perfüzyonundan dokular tüm kan çıkarmak için etiketli bileşiklerin ekstravasküler konsantrasyonlarını belirlemek için gereklidir. Perfüzyon reaktifler eşiğe değişikliklere neden olabilir ve tutarlı tutulmalıdır. Kurban yöntem tutarlı olmalıdırgruplar içinde. Kurban farklı yöntemler, damar içindeki kan düzeyleri değişen dokuların arka floresan değiştirerek neden olabilir.
- Dokuların Koleksiyonu
- dokularının durulanması için yukarıda tarif edildiği gibi PBS hazırlayın.
Not: başka bir tampon perfüzyon sıvısı olarak kullanılır ise, aynı tampon içinde doku yıkayın. - Basit diseksiyon ile kalp, akciğerler, mide, karaciğer, dalak, böbrekler ve çıkarın. laboratuvarı kullanarak kurulayın veya aşırı nem fitil ve görüntüleme hasır üzerine dokuları yerleştirerek mendil kısa bir süre önce PBS içinde yıkayın.
- fare başını kesmek ve kemik kesiciler veya rongeurs kullanarak kafatasının üst kaldırın. forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde bozulmamış koku ampuller tutarak, beyin kaldırmak. Kuru durulayın ve sağlanan görüntüleme mat üzerine yerleştirin.
- Hızlı ejeksiyon 7 vasıtasıyla omurilik kaldırmak için, PBS ile 10 ml şırınga doldurun ve bir dulled 18-iğne takın.
Not: 18 ayar uyuyorBirçok fare hatları yetişkin spinal kanal. gerekli çap boyutu, hayvan ile değişecektir. - decapitation yerinde spinal kanalın açılması temiz kesilmiş ve kan serbest edilmesini sağlamak, yüzükoyun pozisyonda hayvan yerleştirin.
- omurga çevresindeki deri çıkarın. keskin kemik kesiciler veya makas kullanarak, kalça doğrudan rostral bel bölümünde omurga kesti.
- Kısaca spinal kanalı görselleştirmek için PBS ile durulayın. Yavaşça spinal kanal içine iğne takın.
Not: İğne rahat hissetmeniz gerekir ve ileri geri yerleştirilmesi sırasında bazı yavaş haddeleme gerekebilir. İğne gevşek hissetmeniz gerekir, bir daha rostral kesim yapılabilir ya da daha geniş çaplı bir iğne gerekebilir. - başparmak ve işaret parmağı kullanarak, eklenen iğnenin etrafında omuriliğe baskı uygulamak. orta ve sabit basınç ile piston bastırın. Omurilik spinal rostral açıklığın bozulmamış out çıkarırsütun.
Not: uygun 5 içinde tamamlanabilir tüm önemli organların tamamen çıkarılmasını, durulama ve kurutma - 7 dakika. Bu kısa süre, aşırı ışığa maruz kalma ve dokudan etiketli proteinlerin liç neden olabilir PBS içinde genişletilmiş depolama ihtiyacını engeller.
- dokularının durulanması için yukarıda tarif edildiği gibi PBS hazırlayın.
2. Tüm organ Ex Vivo Floresans Görüntüleme
- Görüntüleme Parametreleri
- görüntü elde etme yazılımını başlatın. iktisap kontrol panelinin sağ alt tarafındaki, "başlatılamadı." tıklayın
- Altında "görüntüleme modu," "floresan" onay kutusunu işaretleyin. Altında "maruz kalma süresi", "AUTO" i seçin.
- Altında "binning", "küçük" seçin ve 2 F / Stop ayarlayın.
- 535-nm uyarma ve 580 nm emisyon filtreleri seçin.
Not: Bu, kullanılan etiket bağlı olarak değişecektir. - "Görünüm B Alan" seçin ve targe ayarlamak0.3 cm t yüksekliği.
Not: Bu, görüntülenecek doku bağlı olarak değişecektir. - sıcaklık göstergesi (makine anlamına tamamen başlatılmış olan) yeşil döndüğünde, dokular tamamen birbirinden ayrılır sağlanması, sağlanan siyah arka plan hasır üzerine dokuları yerleştirin. Tüm dokular Seçilen alan ızgara içinde olmasını sağlamak, kamera içinde mat yerleştirin. lobların örtüşme azaltacak şekilde bu tür bütün karaciğer gibi büyük ve homojen olmayan dokular, ortaya konmalıdır.
Not: Dokular, tek bir hayvan veya benzer tipteki tüm dokularını karşılamak için bir resim izin tek bir grupta birlikte düzenlenebilir. Bu daha kolay, daha sonra analiz ve organizasyon yapar. floresans yoğunluğunu büyük farklılıklar, çeşitli dokular arasında varsa, tek bir maruz kalma süresi tüm doku yoğunlukları için ideal olmayabilir gibi, bu görüntü bunları ayrı ayrı ya da aynı doku tipindeki grupları en iyisidir. - Tıklayın "edinin."
- görüntüleme hemen sonra, dokuların kaldırmak ve saklamak veya 4. adımda belirtildiği gibi, nicel histoloji için onları dondurmak.
3. Standartlar ve Görüntü İşleme
- Standartlar
- PBS içinde 15 dilüsyonları toplam orijinal konsantrasyonda başlayarak hayvanların tedavisinde kullanılan her proteininin iki kat seri dilüsyonları oluşturabilir.
Not: konsantrasyon aralığı, beklenen doku konsantrasyonları içerir hedeflemelidir ve başlangıç konsantrasyonuna bağlı olarak, orijinal numune ek seyreltmeler gerektirebilir. - siyah 96 oyuklu plakanın her oyuğuna her bir standart Pipet 100 uL. eşiğe bir ölçü elde etmek için saf PBS bir kuyu yer alır.
- Görüntü doku görüntüleme için kullanılan aynı parametrelerle standartları.
- görüntü elde etme yazılımı altında "Aracı Paleti" "ROI Araçları" seçeneğini İlgi "Bölge (ROI) "Daire ve iyi birinin etrafında ROI çizin. ROI diğer dolu kuyulara tüm kopyalamak ve tıklayın "İB'leri ölçün."
- diğer standartlar değerlerden saf PBS ortalama radyant verimlilik değeri çıkarma; Bu arka plan floresan kaldırır. Bir dağılım arsa üzerinde bilinen konsantrasyonda karşı değerleri çizilir.
Not: Doğrusal eğilim çizgisinin ortaya çıkan denklem daha sonra göreceli floresan değerini hesaplamak için kullanılabilir.
- PBS içinde 15 dilüsyonları toplam orijinal konsantrasyonda başlayarak hayvanların tedavisinde kullanılan her proteininin iki kat seri dilüsyonları oluşturabilir.
- Görüntü işleme
- görüntü elde etme yazılımı olarak, serbest biçimli ROI aracını seçin ve bireysel dokuların her etrafında İB'leri çizin. "Önlem" i tıklayın.
- Elde edilen ortalama radyant verimlilik ölçümleri ile, her bir doku tipi işlenmemiş hayvandan ölçülen değerleri çıkarmak ve önceden oluşturulan standart eğri üzerinde bu değerleri çizmek.
Not: Elde edilen nispi floresan değerleri hızlı ve doğru bir anlık sağlamaketiketli bileşimin biyolojik dağılım.
4. Kantitatif Doku Histoloji
- Dilimleme için Dokuların hazırlanması ve Donma
- Oluşturma veya kullanım için yeterli seçilen dokular donmaya boyut ve kriyostat kapları satın. uygun büyüklükte bir ve şekilli nesnenin etrafında sarma alüminyum folyo iyi çalışıyor.
- kuru buz ile 500 ml beher yarısını dolduran kısmen dondurma kabı daldırın kuru buz üzerinde yeterli miktarda sıvı olacak şekilde izopropanol ~ 350 mL ilave edilerek izopropanol ve kuru buz karışımı hazırlayın.
Not: Sıvı azot genellikle optimum kesim sıcaklık bileşik (OKT) ve gömülü dokuların kırık sonuçlanır ve kaçınılmalıdır. - Mevcut hiçbir kabarcıkları vardır sağlanması, OCT ile kısmen dondurma doldurun. kabarcıkları varsa, forseps kullanarak çözümün dışına kabarcıklar çalışmak ya da benzer bir uygulamaya.
- doku çıkarmakPBS ve kuru iyice ya nazikçe mendil bir laboratuar ya da bir laboratuara hassas dokuların kenarları silin dokunmadan ve sıvı uzak fitil izin vererek onu okşamaya.
- dokuda altında kabarcıklar tanıtmak için sağlanması, dondurma kabının içine OCT içine yavaşça doku yerleştirin. Doku yerleştirildikten sonra doku tamamen kaplıdır kadar, OCT ekleyin.
- izopropanol kabın içinde maruz OCT ile temas etmesine izin vermeden mümkün olduğu kadar dondurma kabı Batmak. gerektiği sürece için -80 ° C'de depolamadan önce, tamamen donmasına OKT ve doku için 90 s (ya da daha büyük dokular için potansiyel olarak daha fazla) - 30 izin verir.
- Dilimleme Standartlar hazırlanması.
- Hazırlama ve uygun haznenin ucunu kaldırarak 1 mL'lik tek kullanımlık şırıngalar etiket, şırınga tüm uzunluğu bir çapı olacak şekilde. Bu donmuş silindir daha sonra dışarı itti olmasını sağlayacaktır.
- BizeDaha önce PBS ile yapıldı okt, uygulanan bileşiklerin bir 15 adımlı, iki kat seri seyreltme oluşturmak ing fakat 1 mL'lik bir son elde edilen hacmi. eşiğe değerleri çıkarmak için saf OCT bir örnek sayılabilir.
- OCT viskozitesi yeterli karıştırma zorlaştırır. tüpleri ters çevirin ve Ekim tamamen yeniden tersini önce yerleşmek için izin verir. homojen bir karışım sağlamak için 20 kez - bu 10 tekrarlayın. Karıştırma sırasında ışıktan 4 ° C'de ve uzak standart çözümler tutun.
- Karıştırma işleminden sonra, daha önce olduğu gibi, izopropanol ve kuru buz karışımı hazırlandı.
Not: Sıvı azot da izopropanol / kuru buz karışımı yerine kullanılan bu donup sonra şırınga hızlı bir şekilde çıkarılır sağlanabilir. - mümkün olduğunca az kabarcıklar tanıtmak için özen, enjektöre Ekim standardını çizin. Ekim çözümü çizdikten sonra, hemen izopropanol doğrudan şırınga daldırma ve çözüm tamamen donmasına izin20 sn - 10 şırınga içinde. gerektiği kadar -80 ° C 'de şırınga saklayın.
- Dokuların ve Standartların Kesme
- -20 ° C hem de doku ve standartlar yerleştirin ve tüm numuneler sıcaklığına gelmesi için yeterli bir zaman tanır.
Not: ideal kesme sıcaklığı genellikle en dokular için -10 ° C aralığında etrafında düşer, ama sonuçta doku boyutu ve yağ içeriğine bağlıdır ve ampirik olarak rafine edilmesi gerekir. - Daha önce 8 açıklandığı gibi bir Kriyostat kullanarak, 20 mikron kalınlığında dilimler halinde dokuları kesmek ve slaytlar üzerine takar. -20 ° C'de slaytlar Mağaza ve kesme sırasında ve tarama kadar uzakta mümkün olduğunca ışık onları tutmak.
Not: Bölümler uygun doku bütün kalınlığı boyunca dağıtılan ölçülecek burada önemlidir. - Kriyostat mandren üzerine standartları monte etmek için, dondurucudan şırıngayı alıp 3 dışında sıcak - hol ile 5 sding o elinde. Ekim silindir kısa bir bölüm (~ 1 cm) kadar pistonu itin şırınga dışındadır.
- Bir jilet kullanarak, silindir kesti ve yerinde tutmak için OCT kullanarak, aynanın üzerine dik ortaya çıkan silindir bölümüne yerleştirin. iyi tanımlanmış çevreler yol açmalıdır Bu yapılandırma kesilmiş.
- bir slayt tüm standart eğri temsil edecek şekilde, tek bir slayt üzerine her seyreltme birer dilim yerleştirerek, 20 mikron silindir dilimleyin. Tarama için hazır olana kadar -20 ° C'de slaytlar saklayın.
- -20 ° C hem de doku ve standartlar yerleştirin ve tüm numuneler sıcaklığına gelmesi için yeterli bir zaman tanır.
- Tarama ve miktar tayini
- Tarama dizi yazılımını başlatın ve lazer başlangıç prosedürü başlatmak için "543 lazer" i tıklayın. Lazer hazır hale getirilmesi için 15 dakika bekleyin.
- Lazer hazır olduğunda, -20 ° slaytlar kaldırmak ve sıcaklığına gelmesi için büyük bir ışık korumalı konteyner içine taşıyın ve 3 dakika boyunca kurumaya. Bu sli nem oluşumunu engellerde tarayıcı.
- slayt tarayıcı slayt yuvasına slayt yükleyin. Click "tarama" ve "kolay tarama çalıştırın."
- 50 um tarama çözünürlüğünü ayarlayın.
- "Florofor" altındaki ilk "kullan" onay kutusunu seçin ve "TRITC."% 80 PMT Gain ayarlayın.
Not: Bu ayarlar florofor ve işaretli moleküllerin konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir. - Sol tarafta, tarama alanı tüm slayt içerdiğinden emin olun. Tıklayın "başlatın."
- Taramadan sonra, "Dosya" seçin ve "olarak kaydetmek" ve sonra bir .tif olarak kaydetmek.
Not: Doku ve standartların Slaytlar aynı ayarlara taranmalıdır. - ImageJ içine sonuçlanan görüntüleri yüklemek ve dokular ve standartları çevresinde İB'leri seçin. "Analiz" sekmesi altında, "ölçümleri set" i seçin ve "gri ortalama değer." Tıklayın220; tedbir ".
Not: Önceki tekniği gibi, arka plan flüoresan tüm ölçülen değerlerden çıkarılmalıdır. - bir standart eğri oluşturmak için bilinen konsantrasyonuna karşı standartları ortalama gri değeri ölçümleri çizilir.
Not: dokulardan elde edilen ölçümler, her doku içinde ortalaması ve doku içinde konsantrasyonunu belirlemek için standart bir eğri çizilmiştir olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre nüfuz peptidler (SynB1-ELP ve Tat-ELP) 9 ile modifiye ELP ve ELP iki sürümü olarak bilinen bir ilaç aktarım vektörü: Bu veriler, üç bileşiğin verilmesini açıklamaktadır. Her üç bileşikler tetramethylrhodamine-5-maleimid ile etiketlenmiş ve iki uygulama yolları aracılığıyla teslim edildi (IN ve IV). Bu deneylerin amacı, merkezi sinir sistemi (MSS) 3 içine en iyi nüfuz neden olur, bu bileşik ve uygulama yoluna belirlemekti.
Şekil 1A görüntüler temsilcisi ex vivo tedavi edilen hayvanlardan elde organlarının bütün organ görüntüler. ısı haritası bindirme dokuları içinde radyant verimlilik floresan seviyelerini gösterir. Bireysel dokular çevresinde ve bunlara karşılık gelen standart bir eğri ile bu değerlerin konulması sureti ile ROI'ler çizerek, Şekil 1B de gösterilen standart floresan değerleri oluşturulur. standart flüoresance değerleri daha sonra farklı terkiplerin göreli konsantrasyonları doğru karşılaştırma için kullanılabilir. Bu veriler, doğru belirli dokulara nüfuz ilgili ELP modifikasyonunun etkisi, hem de her bir bileşik ilgili uygulama yolunun etkisini hem de açıklar. Bu sonuçlarla, IN uygulama yoluyla ELP teslim MSS ulaşmak için en etkili kombinasyon olduğunu hemen açıktır.
Bu sonuçlar iyi nüfuz bileşik ve dağıtım yöntemini belirlemenize yardımcı olsa da, gerçek konsantrasyon veya merkezi sinir sistemi içinde bileşiklerin bölgesel lokalizasyonu tarif yoktur. seçilen beyin bölgelerinin sayısal ölçümler için izin verdiği niceliksel histoloji, bu bileşiklerin biyo-dağılımının açıklamasını tamamlamak için idealdir. Şekil 2A ELP IN ile tedavi edilen hayvanların temsili bir dilim görüntüler ve Şekil 2B ROI ayıran kantifikasyonunu açıklarkoku ampuller, hemisfer ve beyincik. Bu verilerden, IN yoluyla ELP yönetiminin yüksek MSS konsantrasyonlarda neden olabilir iken, öncelikle koku ampuller ve beyincik yapar açıktır. Tersine, ELP IV daha düşük toplam konsantrasyonlarını vardır, ama eşit beyinde boyunca dağıtılır teslim. Bu verilen bileşiklerin hedef ve diğer organlarda etki potansiyeli bağlı olarak, IN veya IV yönetim ya daha iyi bir seçim olabilir. Bu nicel histoloji ilavesi olmaksızın sonucuna olamazdı. Teknik olarak, kantitatif histoloji her grup her dokuda kullanılmış olabilir, ama yine de aynı sonuca neden olurken bu iki yöntem birlikte kullanılarak, zaman ve emek büyük bir kurtuldu.
Şekil 1: Ex Vivo Tüm organ FloresanÖlçümler. A) ELP grubundan Temsilcisi görüntüler. ısı haritası ölçeği radyant verimlilik olarak belirlendi. B) Ortalama ışıma etkinlik değerleri biyo-dağılımının karşılaştırılması için kullanılan standart bir floresan değerleri üretmek için bir standart eğri ile analiz edildi Bireysel dokular yaklaşık ROI oluşturulması ile elde edilmiştir. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 5 mm. (McGowan gelen Modifiye, vd;. İlaç Tasarımı, Geliştirilmesi ve Terapisi; 2016) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kantitatif Doku Histoloji Ölçümleri. Dilimleri O monte ELP içi veya 20 um kalınlıkta dilimleme beyinleri tarafından oluşturulan IV ile tedavi edilen hayvanların A) Örnek görüntün slaytlar ve daha sonra bir floresan slayt tarayıcı kullanarak bu slaytları tarama. B) | ig / ml konsantrasyon ölçümlerini üretmek için standart bir eğri ile ortalama gri değeri olarak ölçülen ve uyum, koku ampul, hemisfer ve beyincik yaklaşık İB'nin oluşturulması ile elde edilen ortalama değerler. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 5 mm. (McGowan gelen Modifiye, vd;. İlaç Tasarımı, Geliştirilmesi ve Terapisi; 2016) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo bütün organ görüntüleme genellikle basit olmakla birlikte, bazı temel kavram ve tekniklerine bağlılık biyo-dağıtım ölçümlerin doğruluğunu artırabilir. Işık deneyimi kısa dalga boyları çoğu dokularda saçılma ve absorbans yüksek derecede anlamlı olan etkileri kısa dalga boylu fluorophores yarar. Bu fluorophores derin doku çalışmalarında uygulama sınırlı, ama onlar yüzey dokuları ya da göz içine bakarak deneylerde etkin olarak kullanılmaktadır. Tersine, ışığın uzun dalga boyları daha penetrasyon ve daha kalın dokular 10 ile daha doğru sonuçlar sonuçlanan önemli ölçüde daha az saçılma ve absorbansı tabi. spektrumun uzak kırmızı ve yakın kızılötesi (NIR) aralık (uyarma ~ 600 nm) düşmek fluorophores yaygın tüm hayvanlar veya daha büyük dokular için tercih edilmektedir. Bu uzun dalga boyu florofor, özellikle tis otomatik floresan kullanarak deneyler içinsues veya malzeme olasılıkla önemli bir husustur. 600 nm aralığında - örneğin, kemirgenler safra kesesinde içinde safra son derece otomatik floresan 500 dalga boylarında olduğunu. Bu büyük ölçüde karaciğer değerleri çarpık olabilir, çünkü görüntüleme önce safra kesesi kaldırmak için sık sık en iyisidir. bozulmamış karaciğer ve safra kesesi gerekli Alternatif olarak, spektrumun çok uzak ucunda bir uyarım dalga boyu ile bir flüorofor seçerek safra otomatik floresan etkisi sınırlayabilir. Ayrıca, ortak kemirgen Chows birçok spektrumun orta ve uzak-aralıkları boyunca yüksek fluoresces saflaştırılmamış yonca, içerirler. seçilmiş etiketler bu dalga boyları giren ve sindirim sistemi yansıması ise, diyet değişikliği muhtemelen en iyi seçenektir.
Canlı görüntüleme sistemleri doğru olmayan homojen ve özellikle kalın dokuları ile kalın dokular (örneğin, bütün sıçan karaciğeri) ölçmek için tasarlanmış olsa da, daha doğru ölçümler sık sık canen karaciğer lobları mümkün olan en az üst üste gelecek şekilde, üzerinden doku yayılma elde edilebilir. Ayrıca, durumlarda dokular doku birden taraftan son derece çarpık işaretli moleküllerin dağılımı, görüntüleme ve bu ölçümlerin ortalama doğruluğunu artırmak nerede. Son olarak, doku tipi, görüntülenecek, dokulara ve tatbik işaretli moleküllerin potansiyel dağılımı ile ilişkili malzemelerin otomatik floresans dikkatle sınırlayan, uygun uyarım ve emisyon dalga boyları ile bir flüorofor seçmek için dikkate alınmalıdır mümkün olduğu kadar çok girişim.
kantitatif doku histolojisi yaparken, akılda tutulması gereken birkaç önemli detay vardır. Sonuçlar doğru olduğu için, dilim tam doku veya bölgede alınmalıdır analiz edilecek. Bu dokular diğer işlemler için uygun olmayacak demektir. Düzeltmek ve leke sonra mümkün olabilirtarama, ancak dilim gelecek boyama etkileyebilecek tarayıcı, içine koyarak önce biraz kurumasını bekleyin, genellikle en iyisidir. Aynı şekilde, tarama sonraki işlemlerde potansiyel sinyali azaltarak, foto-ağartma belli bir düzeyde neden olacaktır. alt mikroskop uygulamalarında, üst bölümleri tipik haliyle dokuları sabitlemek ve kesit önce bir sükroz solüsyonunda dengelenmesi ile elde edilir. Bununla birlikte, bu işlem, en iyi sonucu tespit ve / veya uzun sükroz etkileri yukarıdaki ölçüm histoloji protokolünde flüoresans yoğunluğuna ıslatır önlenir. ortam ışığının bile düşük düzeyde maruz Ayrıca, sinyal miktarına bağlı olarak, dilim fotoğraf ağartma karşılaşabilirsiniz. Soğuk ve ışıktan uzak slaytlar tutulması önemli ölçüde ortaya çıkan ölçümlerin doğruluğunu artıracaktır. Genel olarak, dikkatli kullanım ve hazırlık ölçüde nihai sonucu artırabilir.
Diğer çeşitli vardıryöntemleri biyo-dağılımı ve teknik zorluk, verim, doğruluğu büyük ölçüde değişmektedir uygulanan makromoleküllerin farmakokinetiğini incelemek için kullanılan ve ekipman 11 gerektiriyordu. Kantitatif immüno biyoaktivitenin deneyleri hem teknik karmaşık ve maliyeti ve iş gücü önemli ölçüde ilave tatbik moleküllere ya da antikorlar gerektirebilir. Radyoizotop etiketleme dayalı birden çok yöntem doğruluğu değişen, geçmişte kullanılmıştır, ancak makromoleküllere radyoizotopların entegrasyonu yanı sıra veri kendisi toplanması, önemli bir hazırlık gerektirir ve genellikle daha 12 analizleri için tamamen kullanılamaz dokuları hale getirebilir. Son olarak, pozitron emisyon tomografisi ve kütle spektrometrisi gibi etkili olduğu gösterilmiştir, diğer yöntemler, tipik olarak gerekli olan ekipmanın eksikliği, sadece önceden engellenmektedir. Yukarıda tarif edilen protokol etkin th belirlenmesi için birlikte iki yöntem kullanannedeniyle gerekli olan ekipmanların düzenli availably hızlı, düşük maliyetli, doğru ve kolay erişilebilir bir şekilde etiketlenmiş moleküllerin e biyo-dağılımı.
Bu yöntem, merkezi sinir sistemine işaretli moleküllerin uygulanması için en iyi ve en vektörü ve uygulama yolunun belirlenmesi, yukarıdaki verileri üretmek için kullanıldı. Ex vivo verilerden ELP IN idare ve ELP IV kantitatif doku histolojisi yoluyla ileri karakterizasyon için tespit edilmiştir uyguladı. Kantitatif doku histolojisi nihai sonuçlar çıkarılabilir sağlayan MSS belirli bölgelerde işaretli moleküllerin konsantrasyonları sağladı. iki yöntem birlikte birden fazla spesifik bileşiklerin biyo-dağılımının detaylı bir muayene için hızlı ve etkili bir şekilde temsil etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
