Summary
Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een snelle werkwijze voor het bepalen van de relatieve concentraties van fluorescent gelabelde verbindingen binnen en tussen weefsels of behandelingsgroepen. Omgekeerd kwantitatieve fluorescentie histologie, terwijl arbeidsintensiever, maakt de kwantificering van de absolute weefselconcentraties van gelabelde moleculen.
Abstract
Fluorescentielabelling is een gevestigde werkwijze voor behandeling van het lot van gelabelde moleculen onder verschillende experimentele omstandigheden, zowel in vitro als in vivo. Fluorescerende probes zijn bijzonder nuttig bij het bepalen van de biologische verdeling van toegediende grote moleculen kan toevoeging van een kleine moleculen fluorescent label is onwaarschijnlijk dat de kinetiek of biodistributie van de verbinding beïnvloeden. Diverse methoden bestaan om de biodistributie die aanzienlijk verschillen in de hoeveelheid inspanning vereist en of de verkregen metingen een goed kwantitatief, maar via meerdere methoden in combinatie kunnen snel en doeltreffend systeem voor het analyseren van biologische verdelingen.
Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een werkwijze die kan worden gebruikt om snel de relatieve concentraties van fluorescerende moleculen kunnen vergelijken weefsels en tussen verschillende typen weefsels of behandelingsgroepen. Middels een beeldvormende platformulier ontworpen voor levende dieren of hele-orgel beeldvorming, fluorescentie binnen intact weefsel kan worden bepaald zonder verdere verwerking, bespaart tijd en arbeid, terwijl het verstrekken van een nauwkeurig beeld van de totale bio-distributie. Dit proces is ideaal experimenten poging om de weefselspecificiteit van een verbinding te bepalen of de vergelijking van meerdere verschillende verbindingen. Kwantitatieve weefsel histologie anderzijds vereist uitgebreide verdere behandeling van weefsels om een kwantitatieve maat van de gemerkte verbindingen te maken. Om nauwkeurig te beoordelen bio-distributie, moeten alle weefsels van belang worden gesneden, gescand, en ten opzichte van standaard curves geanalyseerd om vergelijkingen te maken tussen weefsels of groepen maken. Kwantitatieve weefsel histologie is de gouden standaard voor het bepalen van absolute verbinding concentraties in weefsels.
Hier beschrijven we hoe beide methoden samen effectief kan worden gebruikt om het vermogen van verschillende toedieningsmethoden een beoordelingnd verbinding wijzigingen bij het toewijzen en fluorescent gelabelde moleculen aan het centrale zenuwstelsel 1.
Introduction
Fluorescentielabelling is een gemakkelijk benut en effectieve werkwijze voor het bepalen van de biologische verdeling van verbindingen met een reeks van apparatuur die wordt veel laboratoria voorkomende. Fluoroforen zijn overal verkrijgbaar, relatief goedkoop en zijn in verschillende golflengten, zodat meerdere gelabelde moleculen gelijktijdig kunnen worden gebruikt zonder interferentie. Meeste fluoroforen hebben verschillende chemie voor conjugatie aan verschillende reactieve groepen op doelverbindingen, en het proces van conjugatie algemeen eenvoudiger voor de meeste types reactieve plaatsen. Bovendien moeten de voor de metingen van fluorescent gemerkte verbindingen apparatuur in veel laboratoria. Fluorescerende microscopen, imagers, en schuif scanners kunnen allemaal worden gebruikt in verschillende omstandigheden, waardoor het gebruik van fluorescerende labeling zeer toegankelijk. Fluorescerende merkers worden veelvuldig gebruikt om de biodistributie en kinetiek van verbindingen zowel in vivo als ex viv bepaleno met live imaging-apparaten, zoals de IVIS Spectrum Imager, en door middel van kwantitatieve weefsel histologie 2,3.
Het gebruik van ex vivo geheel-orgaan beeldvorming met levende-beeldvorming is toegenomen in de tijd vanwege hun gebruiksgemak en het vermogen om snel een nauwkeurige vergelijking van de relatieve concentraties van gelabelde verbindingen te maken zonder dat de verdere verwerking van tissues4. Hoewel ex vivo gehele orgaan beeldvorming kan zorgen voor een gemakkelijke analyse en vergelijking, genereert geen een kwantitatieve maat absolute verbinding concentraties in weefsel. Dit komt door lichtverstrooiing effecten op organen intact. Aangezien lichtverstrooiing (en, in mindere mate, absorptie) afhankelijk van weefselgrootte en dichtheid kunnen geheel-orgaan imaging onderschatten weefselconcentraties in grote of dichte organen. Het formuleren van de juiste normen voor de absolute concentratie metingen is ook moeilijk omdat men de dikte moet nabootsenen dichtheid van elk orgaan. Anderzijds, hele organen beeldvorming is een snelle methode om de relatieve weefselconcentraties van een middel, en het is ideaal voor het vergelijken van de relatieve biodistributie van meerdere gerelateerde moleculen (zoals drug targeting studies). Een andere mogelijkheid is kwantitatieve fluorescentie histologie, een techniek afgeleid van de werkwijze van kwantitatieve autoradiografie gebruiken, absolute weefselconcentraties van een testmiddel 5,6 te verkrijgen. In plaats van het plaatsen van een hele dier of orgaan in een verbeelding apparaat, kwantitatieve weefsel histologie vereist dat elk weefsel worden gesneden, gemonteerd op dia's, gescand en individueel geanalyseerd. Normen van het testmiddel worden bereid en gesneden op dezelfde dikte als orgaanmonsters. Door snijden van alle organen en normen dezelfde dikte, is variatie door licht verstrooiing of absorptie verwijderd en weefsel fluorescentie-intensiteit kan fit met de standaardkromme om te bepalen absolute concentrantsoen. Hoewel deze methode, wanneer goed uitgevoerd, is kwantitatief, is arbeidsintensief en gemakkelijk verkeerd. Gezien de complexe aard van kwantitatieve histologie en de aanzienlijk hogere arbeidskosten in vergelijking met hele-orgaan beeldvorming, wordt het zinvol te onderzoeken waarbij elk proces het meest praktisch in gebruik bij het onderzoek van de biologische verdeling van fluorescent gemerkte verbindingen. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van deze werkwijzen samen kunnen worden gebruikt om efficiënt vergelijken de biodistributie van rhodamine gemerkte elastine-achtig polypeptide (ELP), met of zonder toevoeging van de SynB1 of Tat-cel penetrerende peptiden, via de intranasale (IN) en intraveneuze (IV) toediening routes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: alle dieren gebruik in dit protocol werd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Mississippi Medical Center goedgekeurd.
1. Behandeling van Dieren en weefsels
- Administratie en Sacrifice
- Verdoven van de dieren met behulp van 3% isofluraan voor 5 min en controleer de diepte van anesthesie door het observeren van de afwezigheid van de teen-pinch reflex. Toepassen veterinaire zalf voor de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
- Weeg het dier en Pipetteer 50 mg / kg dosis van ofwel rhodamine gemerkte ELP, SynB1-ELP of Tat-ELP in een 1,5 ml buis. Opslaan 100 pi van de toegediende gemerkte verbindingen voor bereiding van standaard curves in latere stappen.
Opmerking: Het is belangrijk dat normen uit dezelfde partij gemerkt eiwit toegediend aan dieren om verschillen van de variabiliteit van fluorescente merkingsefficiëntie voorkomen. Met het oog op de achtergrond FLUORES goed te verwijderencentie uit latere fluorescentiemetingen, moet een onbehandeld dier geofferd volgens dezelfde methoden / reagentia behandelde dieren. - Dien een intraveneuze injectie zoals eerder beschreven 1 met behulp van de staartader of de lies (die toegankelijk is via een 1 cm incisie in de lies). Voor analgesie, indien het maken van een incisie lies, bestuurt carprofen subcutaan toegediend in een dosis van 5 mg / kg en sensorcaine toepassing op de incisie voor het sluiten van een wond clip. Te beheren via de intranasale (IN) route, plaats het dier in rugligging.
- Met behulp van een 2-pi pipet, het opstellen van een 1-pi druppel gemerkte verbinding. Verschuift u kop van het dier uit de narcose kraag om toegang tot de neusgaten toestaan.
- Plaats de punt van de pipet om de opening van een enkele nare en langzaam op de zuiger, waardoor de druppel naar beneden te lopen het nare in de neusholte. Herhaal elke 1 min, afwisselend neusgaten elke druppel totdat de volledige dosis is adgediend.
Opmerking: Het maximale volume toegediend via IN mag niet meer dan 10 - 15 pi muizen. - Laat de dieren in de rugligging onder narcose gedurende 10 minuten na de laatste toediening alvorens ze elk in een individuele kooi.
Opmerking: Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten totdat ze voldoende bewustzijn hebben herwonnen om borstligging handhaven. - 1 uur na toediening, re-verdoven van de dieren als voorheen en offeren ze via transcardial perfusie met behulp van PBS (210,0 mg / l KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / l NaCl, 726 mg / l Na 2 HPO 4 .7H 2 O) op 10 ml / min voor een totaal van 20 ml.
Opmerking: de perfusie van de dieren bij offer al het bloed uit de weefsels te verwijderen moet het extravasculaire concentratie van de gelabelde verbindingen vast te stellen. Perfusie reagentia kunnen leiden tot wijzigingen in de achtergrond fluorescentie en consistent moeten worden gehouden. De werkwijze van het offer dient consistent te zijnbinnen groepen. Verschillende methoden van opoffering kan resulteren in verschillende niveaus van bloed binnen de vasculatuur, veranderen de achtergrondfluorescentie van de weefsels.
- Het verzamelen van weefsels
- Bereid PBS zoals boven beschreven voor het spoelen van de weefsels verwijderd.
Opmerking: Als een andere buffer werd gebruikt als perfusievloeistof, spoel weefsels in dezelfde buffer. - Verwijder het hart, longen, maag, lever, milt en nieren door eenvoudige dissectie. Kort spoelen in PBS voordat met behulp van lab doekjes droog te deppen of lont weg overtollig vocht en het plaatsen van de weefsels naar de beeldvorming mat.
- Onthoofden de muis en verwijder de top van de schedel met behulp van bot frezen of rongeurs. Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig de hersenen, het bijhouden van de olfactorische bollen intact. Spoel, droog en plaats deze op de meegeleverde imaging mat.
- Aan het ruggenmerg te verwijderen via een snelle uitworp 7, het invullen van een 10-mL spuit met PBS en bevestig een afgestompt 18-gauge naald.
Let op: 18 gauge fitsde volwassen wervelkanaal van veel muis lijnen. De vereiste diameter verschilt naargelang grootte van het dier. - Plaats het dier in de buikligging, ervoor te zorgen dat de opening van het wervelkanaal aan de onthoofding plaats is afgesneden en vrij van bloed.
- Verwijder de huid rond de wervelkolom. Met behulp van scherpe bot snijders of schaar, snijden door de wervelkolom in de lumbale gedeelte direct rostraal van de heupen.
- Kort spoelen met PBS om het wervelkanaal te visualiseren. Steek de naald in het wervelkanaal.
Opmerking: De naald moet behaaglijk voelen en kunnen sommige langzame rollen heen en weer tijdens het inbrengen vereisen. Moet de naald helemaal los, kan een meer rostrale snede worden gemaakt of een grotere diameter naald nodig zou zijn. - Met duim en wijsvinger, druk uitoefenen op de wervelkolom rond de ingestoken naald. Druk de zuiger met matige en constante druk. Het ruggenmerg intact uit de rostrale opening uit te werpen in het ruggenmergkolom.
Opmerking: de volledige verwijdering, spoelen en drogen van alle belangrijke organen redelijkerwijs kan worden afgerond in 5-7 min. Deze korte tijd voorkomt de noodzaak van langdurige opslag in PBS, die kunnen leiden tot overmatige blootstelling aan licht en de uitloging van gelabelde proteïnen uit het weefsel.
- Bereid PBS zoals boven beschreven voor het spoelen van de weefsels verwijderd.
2. Whole-orgel Ex Vivo Fluorescence Imaging
- Imaging parameters
- Start de afbeelding acquisitie software. In de rechterbenedenhoek van de overname control panel, klikt u op "initialiseren."
- Onder 'imaging-modus, "selecteert u de" fluorescerende "checkbox. Onder "exposure tijd", selecteer "AUTO."
- Onder "binning" te selecteren "kleine" en zet de F / Stop om 2.
- Selecteer de 535-nm excitatie en 580 nm emissie filters.
Opmerking: Dit zal variëren afhankelijk van het etiket. - Selecteer "Field of View B" en stel de target hoogte 0,3 cm.
Opmerking: Dit zal variëren afhankelijk van het weefsel af te beelden. - Zodra de temperatuurindicator groen wordt (wat betekent dat de machine volledig geïnitialiseerd), plaatst de weefsels op de ontvangen zwarte achtergrond mat, zodat de weefsels volledig van elkaar gescheiden. Plaats de mat in de imager, ervoor te zorgen dat alle weefsels binnen het geselecteerde gebied net. Grotere en niet-homogene weefsels, zoals de lever geheel moet worden aangelegd teneinde overlap van de lobben verminderen.
Opmerking: Weefsels kunnen samen in één enkele groep, waardoor een afbeelding op een enkel dier of alle weefsels van hetzelfde type tegemoet. Dit maakt analyse en organisatie gemakkelijker later. Als grote verschillen in fluorescentie-intensiteit tussen verschillende weefsels aanwezig zijn, is het het beste om ze afzonderlijk beeld of groepen van hetzelfde weefseltype als één belichtingstijd niet ideaal voor alle weefsels intensiteit. - Klik op 'Acquire'.
- Na beeldvorming, verwijder de weefsels onmiddellijk en op te slaan of te bevriezen ze voor de kwantitatieve histologie, zoals beschreven in stap 4.
3. Normen en Beeldverwerking
- normen
- In PBS Maak tweevoudige seriële verdunningen van elk eiwit voor de behandeling van de dieren vanaf de oorspronkelijke concentratie, met een totaal van 15 verdunningen.
Opmerking: Het concentratietraject moeten gericht zijn op de verwachte weefselconcentraties omvatten kunnen extra verdunningen van de oorspronkelijke monster vereist, afhankelijk van de uitgangsconcentratie. - Pipetteer 100 ul van elke standaard in elk putje van een zwarte 96-putjesplaat. Omvatten een bron van zuiver PBS als maatstaf voor de achtergrondfluorescentie te verkrijgen.
- Afbeelding normen met dezelfde parameters voor weefsel imaging.
- In de afbeelding acquisitie software "Tool Palette" onder "ROI Tools" selecteer de "Region of Interest (ROI) "Cirkel en trek de ROI rond één goed. Kopieer dat ROI op alle andere gevulde waterputten en klik op 'meten van de ROI. "
- Trek de gemiddelde waarde stralende efficiëntie van de zuivere PBS uit de waarden van de andere normen; Dit verwijdert de achtergrondfluorescentie. Zet de waarden ten opzichte van de bekende concentratie op een scatter plot.
Opmerking: De resulterende vergelijking van de lineaire trendlijn kan dan worden gebruikt om de relatieve fluorescentie berekenen.
- In PBS Maak tweevoudige seriële verdunningen van elk eiwit voor de behandeling van de dieren vanaf de oorspronkelijke concentratie, met een totaal van 15 verdunningen.
- Afbeelding verwerken
- In de afbeelding acquisitie software, selecteert u de freeform ROI gereedschap en trek ROI rond elk van de afzonderlijke weefsels. Klik op "maatregel."
- Met de verkregen gemiddelde stralende rendementsmetingen, trekt de gemeten waarden van de onbehandelde dieren voor elk weefseltype en plotten deze waarden op de eerder gemaakte standaardcurve.
Opmerking: De resulterende relatieve fluorescentiewaarden een snelle en nauwkeurige momentopname van debiodistributie van de gemerkte verbinding.
4. Kwantitatieve Tissue Histologie
- Voorbereiding en Bevriezing van weefsels voor het snijden
- Maak of kopen containers van voldoende omvang om de gekozen weefsel bevriezen en cryostaat te gebruiken. Wrapping aluminiumfolie rond een voldoende grootte en vorm object werkt goed.
- Maak een mengsel van isopropanol en droog ijs met de helft van een 500-ml bekerglas met droog ijs en toevoegen van ~ 350 ml isopropanol zodat er voldoende vloeistof boven het droogijs bij bevriezing container gedeeltelijk onderdompelen.
Opmerking: Vloeibare stikstof vaak tot de breuk van de optimale snijtemperatuur verbinding (OCT) en ingebedde weefsels en moet worden vermeden. - Vul de bevriezing container gedeeltelijk met oktober, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Als er luchtbellen, werken de bubbels uit de oplossing met behulp van een tang of een soortgelijk implementeren.
- Verwijder het weefselvan PBS en droog het grondig, hetzij door zachtjes te deppen met een lab doekje of door het aanraken van de randen van gevoelige weefsels naar een lab te vegen en waardoor de vloeistof lont weg.
- Plaats het weefsel voorzichtig in de oktober in de bevriezing container, zodat niet te bellen te introduceren onder het weefsel. Zodra het weefsel is geplaatst, voeg oktober totdat het weefsel volledig bedekt.
- Dompel de bevriezing container zoveel mogelijk is zonder dat de isopropanol in aanraking komt met de blootgestelde oktober in de houder komen. Toestaan 30-90 s (of potentieel voor groter weefsels) voor oktober en weefsel volledig bevriest voor bewaren bij -80 ° C voor zo lang als nodig is.
- Voorbereiding van de normen voor het snijden.
- Bereiden en passend label 1 ml spuiten voor eenmalig gebruik door het verwijderen van het van de cilinder, zodat de gehele lengte van de injectiespuit een diameter. Hierdoor zal de bevroren cilinder later worden geduwd.
- Onsing oktober Maak een 15-stap tweevoudige seriële verdunning van de toegediende verbindingen, zoals met PBS werd gedaan eerder, maar met een uiteindelijk resulterende volume van 1 ml. Omvat één monster van pure oktober voor het verwijderen van de achtergrond fluorescentie waarden.
- De viscositeit van oktober maakt adequate menging moeilijk. Omkeren van de buizen en laat de oktober compleet tot rust komen voordat u deze weer omkeren. Herhaal dit 10-20 keer om een gelijkmatig mengsel te verzekeren. Houd de standaardoplossingen bij 4 ° C en tegen licht tijdens het mengen.
- Na menging nogmaals bereid een mengsel van isopropanol en droog ijs, zoals voorheen.
Opmerking: Vloeibare stikstof kan ook worden gebruikt in plaats van isopropanol / droogijs mengsel, op voorwaarde dat de injectiespuiten worden snel verwijderd nadat ze vast bevroren. - Teken de oktober norm in de spuit, en zorg ervoor dat zo weinig belletjes mogelijk in te voeren. Na het opstellen van de oktober-oplossing, direct dip de spuit direct in de isopropanol en laat de oplossing om volledig te bevriezenbinnen de spuit van 10 - 20 s. Bewaar de spuiten bij -80 ° C voor zo lang als nodig.
- Het snijden van weefsels en Normen
- Plaats beide weefsels en normen -20 ° C en voldoende tijd voor alle monsters op temperatuur te komen.
Opmerking: de ideale scherpe temperatuur daalt over het algemeen rond de -10 ° C bereik voor de meeste weefsels, maar het hangt uiteindelijk af van weefsel grootte en vetgehalte en dient empirisch te worden verfijnd. - Met behulp van een cryostaat gesneden weefsels in 20 urn dikke plakken en zet ze op objectglaasjes, zoals eerder beschreven 8. Bewaar de objectglaasjes bij -20 ° C en houd ze tegen licht zoveel mogelijk tijdens het snijden en tot het scannen.
Opmerking: Het is van belang dat de secties te meten adequaat is verdeeld door de gehele dikte van het weefsel. - Aan de normen op de cryostaat boorkop te monteren, neem de spuit uit de vriezer en warm het buiten voor 3-5 s door holding in de hand. Duw de zuiger tot een kort gedeelte (~ 1 cm) van de oktober cilinder buiten de spuit.
- Met behulp van een scheermesje, dwars door de cilinder en plaatst de resulterende cilinder sectie loodrecht op de boorkop, met behulp van oktober om het te houden op zijn plaats. Deze configuratie zou leiden tot welomschreven cirkels wordt gesneden.
- Snijd de cilinders bij 20 micrometer, het plaatsen van één snee van elke verdunning op een enkele dia, zodat één dia vertegenwoordigt de gehele standaard curve. Bewaar de objectglaasjes bij -20 ° C tot klaar voor scanning.
- Plaats beide weefsels en normen -20 ° C en voldoende tijd voor alle monsters op temperatuur te komen.
- Scannen en kwantificering
- Start de scan reeks software en klik op "543 laser" om de laser startup procedure te beginnen. Wacht 15 min voor de laser om klaar te krijgen.
- Zodra de laser klaar is, verwijdert de schuiven van -20 ° C en zet ze in een grote, licht doorlaat temperatuur komen en drogen 3 min. Hiermee wordt voorkomen dat vocht ophoping in de slide scanner.
- Plaats de dia in de dia houder op de dia scanner. Klik op "scan" en selecteer "run gemakkelijk scan."
- Stel de scanresolutie tot 50 pm.
- Selecteer het eerste vakje "Use" onder "Fluorofoor" en selecteer "TRITC." Stel de PMT Gain tot 80%.
Opmerking: Deze instellingen zijn afhankelijk van de fluorofoor en de concentratie van de gelabelde moleculen. - Aan de linkerkant, ervoor te zorgen dat de scan gebied omvat de hele dia. Klik op "Start."
- Na het scannen, kies "file" en "opslaan als" en sla het beeld als een .tif.
Let op: Slides van weefsels en normen moeten worden gescand op dezelfde instellingen. - Laad de resulterende afbeeldingen in ImageJ en selecteer ROI rond de weefsels en normen. Onder het tabblad "analyseren", selecteer "set metingen" en selecteer "betekenen grijswaarde." Klik op220; maatregel ".
Opmerking: Zoals voor het voorgaande techniek moet achtergrondfluorescentie worden afgetrokken van alle meetwaarden. - Plot van de gemiddelde grijswaarde metingen van de normen die ten opzichte van de bekende concentratie om een standaard curve te creëren.
Opmerking: De verkregen metingen van de weefsels dient in elk weefsel worden gemiddeld en uitgezet op die standaardcurve om de concentratie in het weefsel bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onderstaande gegevens beschrijven de levering van drie verbindingen: een drug-delivery vector bekend als ELP en twee versies van ELP gemodificeerd met cel penetrerende peptiden (SynB1-ELP en Tat-ELP) 9. Alle drie verbindingen werden gelabeld met tetramethylrhodamine-5-maleïmide en geleverd via twee toedieningsroutes (IN en IV). Het doel van deze experimenten was om te bepalen welke verbinding en toedieningsweg zou resulteren in de beste penetratie in het centrale zenuwstelsel (CNS) 3.
Figuur 1A toont representatieve ex vivo gehele orgaan beelden van de organen van de behandelde dieren. De warmte kaart overlay toont de fluorescentie niveaus in stralende efficiëntie binnen de weefsels. Door tekening ROI rond de afzonderlijke weefsels en plotten deze waarden op hun corresponderende standaardcurve worden gestandaardiseerd fluorescentiewaarden in figuur 1B gegenereerd. De gestandaardiseerde fluorescence waarden kunnen vervolgens worden gebruikt voor nauwkeurige vergelijkingen van de relatieve concentraties van de verschillende verbindingen. Deze gegevens nauwkeurig beschrijven beide het effect van ELP modificatie op de penetratie in specifieke weefsels, evenals het effect van toediening route op elke verbinding. Met deze resultaten is direct duidelijk dat ELP levering via IN toediening is de meest effectieve combinatie om het CZS te bereiken.
Hoewel deze resultaten helpen bij het bepalen van de beste doordringende verbinding en levering methode, doen ze niet beschrijven de feitelijke concentratie of regionale lokalisatie van verbindingen binnen het centrale zenuwstelsel. Kwantitatieve histologie is daarom ideaal te vullen de beschrijving van de biodistributie van deze verbindingen, omdat het zorgt voor kwantitatieve metingen van de geselecteerde hersengebieden. Figuur 2A toont een representatief segment van ELP in behandelde dieren en figuur 2B wordt de kwantificering van het scheiden van de ROIolfactorische bollen, hemisferen, en het cerebellum. Uit deze gegevens blijkt duidelijk dat hoewel ELP toediening via de IN route kan in hoge concentraties CNS, doet dit voornamelijk in de reukkwabben en cerebellum. Omgekeerd ELP geleverd IV heeft lagere totale concentraties, maar wordt gelijkmatig verdeeld over de hersenen. Afhankelijk van het doel van deze toegediende verbindingen en de mogelijke effecten in andere organen, kan binnen of IV toediening de betere keuze. Dit kan niet zonder de toevoeging van de kwantitatieve histologische gesloten. Technisch gezien kan kwantitatieve histologische zijn gebruikt in elk weefsel van elke groep, maar door gebruik beide methoden samen veel tijd en arbeid wordt bespaard terwijl resulteert in dezelfde conclusie.
Figuur 1: Ex Vivo Whole-orgel FluorescenceAfmetingen. A) Representatieve beelden van de ELP-groep. De hitte schaal werd ingesteld als stralend efficiency. B) Gemiddelde stralende rendementswaarden verkregen uit de creatie van ROI rond de afzonderlijke weefsels die op een standaard curve werden geanalyseerd om de genormaliseerde fluorescentie die worden gebruikt voor de vergelijking van bio-verdelingen genereren. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Schaal bar = 5 mm. (Gewijzigd van McGowan, et al;. Drug Design, Ontwikkeling, en therapie, 2016) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantitatieve Tissue Histologie Metingen. A) representatief beeld van ELP IN- of-IV behandelde dieren gemaakt door het snijden van de hersenen 20 micrometer dik, de montage van de plakjes on dia's en vervolgens het scannen van dia's die met behulp van een fluorescentie dia scanner. B) De gemiddelde waarden verkregen uit de creatie van ROI rond de bulbus olfactorius, hemisferen en cerebellum, gemeten als de gemiddelde grijswaarde en geschikt om een standaardcurve ug / ml concentratiemetingen genereren. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Schaal bar = 5 mm. (Gewijzigd van McGowan, et al;. Drug Design, Ontwikkeling, en therapie, 2016) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl ex vivo hele orgel beeldvorming is over het algemeen eenvoudig, kan de naleving van een aantal fundamentele concepten en technieken de nauwkeurigheid van bio-distributie metingen te verbeteren. Korte golflengten van lichtervaring een hoge mate van verstrooiing en absorptie in de meeste weefsels, die aanzienlijk invloed op de bruikbaarheid van de korte-golflengte fluoroforen. Deze fluoroforen hebben een beperkte toepassing in diepe weefsel studies, maar ze zijn effectief gebruikt in experimenten te kijken naar het oppervlak weefsels of in het oog. Omgekeerd lange golflengten ondergaat significant minder verstrooiing en absorptie betekent optimale penetratie en nauwkeurigere resultaten met dikkere weefsels 10. Fluoroforen die in het verre-rode en nabij-infrarood (NIR) (excitatie ~ 600 nm) van het spectrum vallen, worden gewoonlijk gekozen hele dieren of groter weefsels. Voor experimenten met deze lange-golflengte fluoroforen, de auto-fluorescentie van bepaalde tisklaagt of materialen waarschijnlijk een belangrijke overweging. Bijvoorbeeld, de gal in de galblaas van knaagdieren zeer auto-fluorescentie bij golflengten in het 500-600 nm. Omdat dit zeer lever waarden scheef, is het vaak het beste om de galblaas voorafgaand aan beeldvorming verwijderen. Een defect intacte lever en galblaas nodig kiezen van een fluorofoor met een excitatiegolflengte aan het uiteinde van het spectrum kan de invloed van de gal auto-fluorescentie beperken. Bovendien zijn veel van de gemeenschappelijke knaagdier chows bevatten ongezuiverde alfalfa, die sterk gehele midden en verre gebieden van het spectrum fluoresceert. Indien de gekozen labels binnen die golflengten vallen en het spijsverteringskanaal moet worden afgebeeld, een verandering in de voeding is waarschijnlijk de beste keuze.
Terwijl de live-imaging systemen zijn ontworpen om nauwkeurig te meten dikke weefsels, met niet-homogene en bijzonder dik weefsels (bijv hele rat levers), meer nauwkeurige metingen kunnen often worden verkregen door het weefsel uitspreiden, zodat de lobben van de lever overlappen zo weinig mogelijk. Ook wanneer weefsels een zeer scheve verdeling van gelabelde moleculen beeldvorming van meerdere kanten van het weefsel en het gemiddelde meetwaarden kan de nauwkeurigheid verhogen. Uiteindelijk is de soorten weefsel af te beelden, moet de auto-fluorescentie van het materiaal ten behoeve van deze weefsels en de potentiaalverdeling van de toegediende gelabelde moleculen zorgvuldig worden overwogen om een fluorofoor met de geschikte excitatie- en emissiegolflengte die grens kiezen interferentie zoveel mogelijk.
Bij het uitvoeren van kwantitatieve weefsel histologie, zijn er een aantal belangrijke details in gedachten te houden. Om de resultaten nauwkeurig moeten plakken het gehele weefsel of regio worden te analyseren. Dit betekent dat deze weefsels niet voor andere processen worden. Het is mogelijk te bevestigen en na kleuringscannen, maar is het meestal best om de plakken iets drogen alvorens ze in de scanner, die van invloed kunnen toekomstige kleuring. Ook zal het scannen leiden tot een zekere mate van foto-bleken, het verminderen van de potentiële signaal in de daaropvolgende processen. Voor downstream microscopie toepassingen worden superieure secties doorgaans bereikt door de vaststelling van de weefsels en in evenwicht brengen ze in een sucrose oplossing voorafgaand aan het snijden. Echter, dit proces het best vermeden bovengenoemde kwantitatieve histologie protocol door de effecten fixatie en / of lange sucrose soaks op fluorescentie intensiteit. Eveneens afhankelijk van de hoeveelheid signaal, plakken kan foto-bleking ondervinden bij blootstelling aan zelfs lage niveaus van omgevingslicht. Keeping the slides koude en weg van licht aanzienlijke verbetering van de nauwkeurigheid van de resulterende metingen. Al met al kan een zorgvuldige verwerking en bereiding een drastische verbetering van het uiteindelijke resultaat.
Er zijn verschillende anderemethoden voor het bestuderen van de biologische distributie en farmacokinetische eigenschappen van de toegediende macromoleculen die sterk variëren technische moeilijkheden, throughput, nauwkeurigheid, en uitrusting vereist 11. Kwantitatieve immunoassays en assays bioactiviteit kan zowel technisch ingewikkeld en vereisen antilichamen of reagentia specifiek voor het toegediende moleculen, aanzienlijk bijdraagt aan de kosten en arbeid. Meerdere methoden gebaseerd op radioisotoop etikettering zijn gebruikt in het verleden, met verschillende nauwkeurigheid, maar de integratie van radioisotopen macromoleculen, alsmede het verzamelen van gegevens zelf, kunnen aanzienlijke voorbereiding, en kan vaak maken weefsels onbruikbaar voor verdere analyses 12. Nog andere werkwijzen effectief gebleken, zoals positron emissie tomografie en massaspectrometrie, worden typisch alleen uitgesloten vanwege een gebrek aan de benodigde apparatuur. De hierboven beschreven protocol gebruikt twee methoden samen voor het efficiënt bepalen the biodistributie van gelabelde moleculen in een snelle, kosteneffectieve, nauwkeurig en gemakkelijk toegankelijke wijze door regelmatige availably van de benodigde apparatuur.
Deze methode werd gebruikt om de bovenstaande gegevens te genereren, om het beste vector en toedieningsweg voor de levering van gemerkte moleculen aan het CZS. Uit de ex vivo data, ELP toegediend en ELP toegediend IV werden geïdentificeerd voor verdere karakterisering via kwantitatieve weefsel histologie. Kwantitatieve weefsel histologie dan voorzien van de concentraties van gelabelde moleculen in specifieke regio's van het centrale zenuwstelsel, waardoor de definitieve conclusies worden getrokken. De twee methoden zijn samen goed voor een snelle en effectieve manier om een gedetailleerd onderzoek van de bio-distributie van meerdere specifieke verbindingen uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
