Summary
Ex vivo hel-organ avbildning är en snabb metod för att bestämma de relativa koncentrationerna av fluorescensmärkta föreningar inom och mellan vävnader eller behandlingsgrupper. Omvänt, kvantitativ fluorescens histologi, medan mer arbetsintensiv, möjliggör kvantifiering av de absoluta vävnadsnivåer av märkta molekyler.
Abstract
Fluorescerande märkningen är en väletablerad process för att undersöka vad som händer med märkta molekyler under olika experimentella betingelser både in vitro och in vivo. Fluorescerande prober är speciellt användbara vid bestämning av biologiska fördelningen av administrerade stora molekyler, där tillsatsen av en liten molekyl fluorescerande markör är osannolikt att påverka kinetiken eller bio-fördelning av föreningen. Ett antal olika metoder finns för att undersöka biologisk distribution som varierar betydligt i mängden ansträngning som krävs och huruvida de resulterande mätningarna är helt kvantitativa, men med användning av flera olika metoder i samband kan tillhandahålla ett snabbt och effektivt system för att analysera bio-fördelningar.
Ex vivo hel-organavbildnings är en metod som kan användas för att snabbt jämföra de relativa koncentrationerna av fluorescerande molekyler inom vävnader och mellan flera olika typer av vävnader eller behandlingsgrupper. Använda en avbildning platform för levande djur eller hela organavbildning, fluorescens inom intakta vävnader kan bestämmas utan ytterligare bearbetning, vilket sparar tid och arbete, samtidigt som en korrekt bild av den totala biologiska distribution. Denna process är idealisk i experiment som försöker att bestämma vävnadsspecificiteten av en förening eller för jämförelse av multipla olika föreningar. Kvantitativ vävnads histologi å andra sidan kräver omfattande ytterligare behandling av vävnader i syfte att skapa ett kvantitativt mått på de märkta föreningarna. Att exakt bedöma bio-distribution måste alla vävnader av intresse skivas, skannas och analyseras i förhållande till standardkurvor för att göra jämförelser mellan vävnader eller grupper. Kvantitativ vävnads histologi är den gyllene standarden för att bestämma absoluta föreningskoncentrationer i vävnader.
Här beskriver vi hur båda metoderna kan användas tillsammans på ett effektivt sätt för att bedöma förmågan hos olika administrationsmetoder and sammansatta modifieringar för att rikta och leverera fluorescerande molekyler till det centrala nervsystemet 1.
Introduction
Fluorescensmärkning är en lätt utnyttjas och effektiv metod för bestämning av bio-fördelning av föreningar, med användning av en serie anordningar, som är gemensam för många laboratorier. Fluoroforer är allmänt tillgängliga, relativt billiga, och finns i en mängd olika våglängder, så att flera märkta molekyler kan användas samtidigt utan interferens. De flesta fluoroforer har en rad kemiska för konjugering till olika reaktiva grupper på målföreningar, och processen för konjugering är i allmänhet enkelt för de flesta typer av reaktiva ställen. Dessutom, den utrustning som krävs för mätningarna av fluorescensmärkta föreningar är vanliga i många laboratorier. Fluorescerande mikroskop, kameror och glida skannrar kan alla användas i olika sammanhang, vilket gör användningen av fluorescensmärkning hög tillgänglighet. Fluorescerande markörer används ofta för att bestämma bio-distribution och kinetik av föreningar både in vivo och ex vivo med levande bildenheter, t.ex. IVIS Spectrum Imager och genom kvantitativ vävnads histologi 2,3.
Användningen av ex vivo hela organ avbildning med levande bildenheter har ökat över tiden på grund av sin användarvänlighet och förmåga att snabbt skapa en korrekt jämförelse av de relativa koncentrationerna av märkta föreningar utan att kräva ytterligare bearbetning av tissues4. Men medan ex vivo hela organavbildning kan möjliggöra enkel analys och jämförelse, det genererar inte ett kvantitativt mått på absoluta föreningskoncentrationer inom en vävnad. Detta beror på att ljusspridande effekt inom intakta organ. Eftersom ljusspridning (och, i mindre utsträckning, absorbans) varierar beroende på vävnadens storlek och densitet, kan hel-organavbildningsskatta vävnadsnivåer i stora eller täta organ. Att formulera lämpliga normer för mätning absolut koncentration är också svårt eftersom man måste efterlikna tjocklekoch densiteten hos varje enskilt organ. Å andra sidan, är hela organavbildnings en snabb metod för att få de relativa vävnadsnivåer av en agent, och det är idealiskt för att jämföra den relativa biologiska fördelningen av flera relaterade molekyler (såsom i läkemedelsmålsökande studier). En alternativ strategi är att utnyttja kvantitativ fluorescens histologi, en teknik som härrör från metod för kvantitativ autoradiografi, för att erhålla absoluta vävnadsnivåer av ett testmedel 5,6. Snarare än att placera en hel djur eller organ i en föreställa enhet kräver kvantitativ vävnad histologi att varje vävnad skivas, monterades på objektglas, skannade och analyseras individuellt. Standarder av testmedlet framställs och skivade vid samma tjocklek som samplar organ. Genom att skära alla organ och standarder till samma tjocklek, är variationen på grund av ljusspridning eller absorption elimineras, och vävnadsfluorescensintensitet kan passa med standardkurvan för att bestämma absolut concentransonera. Även om denna metod, när det görs på rätt sätt, är kvantitativt, är det också arbetsintensiv och lätt misshandlat. Med tanke på den mer komplexa karaktär kvantitativ histologi och kraftigt ökade kostnader för arbetskraft jämfört med hela organavbildning, blir det värt att undersöka var varje process är mest praktiskt att använda när man undersöker den biologiska fördelningen av fluorescerande föreningar. Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av hur dessa metoder kan användas tillsammans för att på ett effektivt sätt jämföra den biologiska fördelningen av rodamin-märkt Elastin liknande polypeptid (ELP), med eller utan tillsats av de SynB1 eller Tat cellpenetrerande peptider, via intranasal (IN) och intravenösa (IV) administrationssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: All användning av djur i detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Mississippi Medical Center.
1. Behandling av djur och vävnader
- Administration och offer
- Söva djuren med användning av 3% isofluran under 5 min och kontrollera djupet av anestesi genom att observera frånvaron av toe-nypa reflex. Applicera veterinär salva till ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Väg djuret och pipettera en 50 mg / kg dos av antingen rodamin-märkt ELP, SynB1-ELP, eller Tat-ELP in i en 1,5-ml rör. Spara 100 mikroliter av de administrerade märkta föreningar för formulering av standardkurvor i senare steg.
Obs: Det är viktigt att standarder göras från samma parti märkt protein administreras till djur för att undvika skillnader på grund av variationen i fluorescerande märkningseffektiviteten. För att kunna ta bort bakgrunds fluoresscens från senare fluorescensmätningar, måste ett obehandlat djur offras med användning av samma metoder / reagens som de behandlade djuren. - Administrera en IV-injektion som tidigare beskrivits 1 med användning av antingen svansvenen eller lårbensvenen (som nås via en 1-cm snitt i ljumsken). För smärtlindring, om att göra en ljumske snitt, administrera karprofen subkutant vid en dos av 5 mg / kg, och tillämpa Sensorcain till snittet platsen innan stängning med ett sår klipp. Att administrera via intranasal (IN) route, placera djuret i ryggläge.
- Med hjälp av en 2-mikroliter pipett upprätta en en-mikroliter droppe märkt förening. Skjut korthet djurets huvud från anestesi kragen för att tillåta åtkomst till näsborrarna.
- Placera spetsen av pipetten till öppnandet av en enda Nare och långsamt tryck in kolven, vilket gör att droppen rinner utmed Nare in i näshålan. Upprepa varje 1 minut, omväxlande näsborrarna varje droppe tills full dos är adbetjänade.
Obs: Maxvolymen administreras via får inte överstiga 10 - 15 mikroliter för möss. - Låt djuren i ryggläge under narkos under 10 minuter efter den slutliga administreringen innan du flyttar dem var i en enskild bur.
Obs: Lämna inte djur utan uppsikt tills de har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. - 1 timme efter administrering, åter söva djuren som tidigare och offra dem via transcardial perfusion med användning av PBS (210,0 mg / L KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / L NaCl, 726 mg / L Na 2 HPO 4 .7H H2O) vid 10 ml / min under totalt 20 ml.
Notera: den perfusion av djuren på offret för att ta bort allt blod från vävnaderna krävs för att bestämma de extravaskulära koncentrationer av de märkta föreningarna. Perfusion reagenser kan leda till ändringar i bakgrundsfluorescens och bör hållas konsekvent. Metoden offer bör vara förenligainom grupper. Olika metoder för offer kan resultera i olika nivåer av blod i kärlsystemet, ändra bakgrunds fluorescens vävnaderna.
- Insamling av vävnader
- Förbered PBS såsom beskrivits ovan för att skölja bort vävnaderna.
Obs: Om en annan buffert användes som perfusionsvätskan, skölj vävnader i samma buffert. - Avlägsna hjärta, lungor, mage, lever, mjälte och njurar genom enkel dissektion. skölj hastigt i PBS innan lab våtservetter att klappa torrt eller transportera bort fukt och placera vävnaderna på bildmattan.
- Halshugga musen och ta upp i skallen med ben fräsar eller rongeurs. Använd pincett, försiktigt bort hjärnan, hålla lukt glödlampor intakt. Skölj, torka och placera den på den medföljande avbildningsmattan.
- För att ta bort ryggmärgen via snabb utstötning 7, fylla en 10-ml spruta med PBS och bifoga en avtrubbade 18-nål.
Obs: 18 gauge passarden vuxna spinalkanalen hos många mus linjer. Den erforderliga diameter kommer att variera med djurets storlek. - Placera djuret i liggande position, se till att öppnandet av ryggradskanalen vid halshuggning webbplats renskuren och fri från blod.
- Bort huden från hela ryggraden. Med vassa ben kärare eller sax, skär genom ryggraden i ländryggen avsnittet direkt rostralt till höfterna.
- skölj hastigt den med PBS för att visualisera ryggradskanalen. Försiktigt in nålen i ryggmärgskanalen.
Obs: Nålen ska kännas ombonad och kan kräva några långsamma rullande fram och tillbaka under införande. Bör nålen känns lösa, kan en mer rostralt snitt göras eller en nål med större diameter kan behövas. - Med hjälp av tummen och pekfingret, anbringa tryck på ryggraden runt den införda nålen. Tryck kolven med måttlig och konstant tryck. Ryggmärgen kommer mata intakt ut rostralt öppningen i ryggradenkolumn.
Obs! Fullständigt avlägsnande, sköljning och torkning av alla större organ kan rimligen fyllas i 5-7 minuter. Denna korta tid förhindrar behovet av lång lagring i PBS, vilket kan resultera i överdriven exponering för ljus och urlakningen av märkta proteiner från vävnaden.
- Förbered PBS såsom beskrivits ovan för att skölja bort vävnaderna.
2. Hela organ Ex vivo fluorescens avbildning
- avbildnings Parametrar
- Starta bilden förvärvet programvara. I det nedre högra hörnet av förvärvet kontrollpanelen, klicka på "initiera".
- Under "imaging läge" välj "fluorescerande" kryssrutan. Under "exponeringstid" välj "AUTO".
- Under "binning" välj "små" och ställ in F / Stopp för två.
- Välj 535 nm excitation och 580 nm emissionsfilter.
Obs: Detta kommer att variera beroende på den etikett som används. - Välj "Field of View B" och ställ in Target höjd till 0,3 cm.
Notera: Detta kommer att variera beroende på de vävnader som skall avbildas. - När temperaturindikatorn lyser grönt (vilket innebär att maskinen är fullständigt initierad), placera vävnaderna på den medföljande svart bakgrund matta, se till att vävnaderna är helt separerade från varandra. Placera mattan i kameran, se till att alla vävnader är inom det markerade området nätet. Större och icke-homogena vävnader, såsom hela levern, bör läggas ut för att minska överlappningen av de lober.
Notera: Vävnader kan arrangeras tillsammans i en enda grupp, så att en bild för att rymma en enda djur eller alla vävnader av en liknande typ. Detta gör analys och organisation lättare senare. Om stora skillnader i fluorescensintensitet är närvarande bland olika vävnader, är det bäst att bilden dem individuellt eller som grupper av samma vävnadstyp, som ett enda exponeringstiden inte kan vara perfekt för alla vävnads intensiteter. - Klicka på "Hämta".
- Efter bildbehandling, ta bort vävnaderna omedelbart och lagra eller frysa dem för kvantitativ histologi, som beskrivs i steg 4.
3. Standarder och bildbehandling
- standarder
- I PBS, skapa två-faldiga seriespädningar av varje protein som används vid behandling av djuren, med början vid den ursprungliga koncentrationen, med totalt 15 utspädningar.
Obs: Koncentrationsintervallet bör syfta till att omfatta de förväntade vävnadskoncentrationerna och kan kräva ytterligare utspädningar av det ursprungliga provet, beroende på utgångskoncentrationen. - Pipettera 100 mikroliter av varje standard i varje brunn i en svart 96-brunnars platta. Inkluderar en brunn av rent PBS för att få ett mått på bakgrundsfluorescens.
- Bild standarder med samma parametrar som används för vävnads avbildning.
- I bilden förvärvet programvara "verktygspaletten" under "ROI Verktyg" välj "Region of Interest (ROI) "Cirkel och dra ROI runt en brunn. Uppfattat ROI till alla andra fyllda brunnarna och klicka på "mäta ROI."
- Subtrahera värdet i genomsnitt strålningsutbytet av den rena PBS från värdena för de övriga standarder; detta tar bort den bakgrundsfluorescens. Rita värdena mot den kända koncentrationen på ett spridningsdiagram.
Obs: Den resulterande ekvationen för den linjära trendlinjen kan sedan användas för att beräkna den relativa fluorescensvärdet.
- I PBS, skapa två-faldiga seriespädningar av varje protein som används vid behandling av djuren, med början vid den ursprungliga koncentrationen, med totalt 15 utspädningar.
- Bildbehandling
- I bilden förvärvet programvara, väljer Freeform ROI verktyget och rita ROI runt vart och ett av de individuella vävnaderna. Klicka på "åtgärd."
- Med de resulterande genomsnittliga strålande mätningar effektivitet, subtrahera de uppmätta värdena från obehandlade djur för varje vävnadstyp och rita dessa värden på den tidigare skapade standardkurvan.
Obs: De resulterande relativa fluorescensvärden ger en snabb och korrekt ögonblicksbild avbiodistributionen av den märkta föreningen.
4. Kvantitativ Tissue Histologi
- Beredning och frysning av vävnader för skivning
- Skapa eller köpa behållare av tillräcklig storlek för att frysa de valda vävnader och kryostat som ska användas. Omslags aluminiumfolie runt en lämplig storlek och format föremål fungerar bra.
- Förbereda en blandning av isopropanol och torris genom att fylla hälften av en 500-ml bägare med torris och tillsats av ~ 350 ml isopropanol så att det finns tillräckligt med vätska ovanför torris för att delvis dränka frysbehållaren.
Notera: Flytande kväve resulterar ofta i brott på den optimala skärtemperaturen föreningen (oktober), och inbäddade vävnader och bör undvikas. - Fyll frysbehållaren delvis med oktober, se till att det inte finns några bubblor. Om det finns bubblor, arbeta bubblorna ut ur lösningen med hjälp av pincett eller liknande redskap.
- Ta bort vävnadenfrån PBS och torka det ordentligt, antingen genom att försiktigt klappa den med en lab torka eller genom att trycka kanterna på känsliga vävnader till ett labb torka och låta vätskan sugas bort.
- Placera vävnaden försiktigt i oktober i frysbehållaren, se inte införa bubblor under vävnaden. När vävnaden är på plats, tillsätt oktober tills vävnaden är helt täckt.
- Dränka frysbehållaren så mycket som är möjligt utan att tillåta isopropanol för att komma i kontakt med den exponerade oktober inuti behållaren. Tillåt 30 - 90 s (eller potentiellt mer för större vävnader) för oktober och vävnad att frysa helt innan lagring vid -80 ° C under så lång tid som behövs.
- Beredning av standarder för skivning.
- Förbereda och på lämpligt sätt märka 1 ml-engångssprutor genom att avlägsna änden av cylindern, så att hela längden av sprutan är en diameter. Detta gör det möjligt den frusna cylindern som skall tryckas ut senare.
- Ossing oktober, skapa en 15-stegs två-faldig serieutspädning av administrerade föreningar, såsom gjordes med PBS som tidigare, men med en slutlig resulterande volymen av en ml. Inkludera ett prov av ren oktober för att avlägsna bakgrundsfluorescensvärdena.
- Viskositet oktober gör adekvat blandning svårt. Vänd rören och låta oktober att helt lösa innan vända igen. Upprepa detta 10 - 20 gånger för att säkerställa en enhetlig blandning. Förvara standardlösningar vid 4 ° C och bort från ljus under blandning.
- Efter blandning, återigen framställa en blandning av isopropanol och torris, som tidigare.
Notera: Flytande kväve kan också användas i stället för isopropanol / torris blandningen, förutsatt sprutorna avlägsnas snabbt efter det att de har fryst fast ämne. - Rita oktober standarden i sprutan, var noga med att införa så få bubblor som möjligt. Efter utarbetandet av oktober lösning omedelbart doppa sprutan direkt i isopropanol och låt lösningen att frysa heltinne i sprutan i 10 - 20 s. Lagra sprutorna vid -80 ° C under så länge som krävs.
- Kapning av vävnader och standarder
- Placera båda vävnader och standarder -20 ° C och tillräckligt med tid för alla prover att komma till temperatur.
Obs: Den ideala skärtemperaturen sjunker i allmänhet runt -10 ° C intervall för de flesta vävnader, men det i slutändan beror på vävnad storlek och fetthalt och måste förfinas empiriskt. - Med hjälp av en kryostat, skär vävnader i 20-im tjocka skivor och montera dem på objektglas, som tidigare beskrivits 8. Förvara bilderna vid -20 ° C och hålla dem borta från ljus så mycket som möjligt under skärning och tills skanningen.
Obs: Det är viktigt här att sektionerna som skall mätas på lämpligt sätt fördelade över hela tjockleken av vävnaden. - För att montera de normer på kryostat chucken, ta sprutan från frysen och värma utanför för 3 - 5 s efter holding den i handen. Tryck in kolven tills ett kort avsnitt (~ 1 cm) i oktober cylindern är utanför sprutan.
- Med användning av ett rakblad, skär genom cylindern och placera den resulterande cylindersektionen vinkelrätt på chucken, med användning av oktober för att hålla den på plats. Denna konfiguration bör resultera i väldefinierade cirklar skärs.
- Skiva cylindrarna vid 20 | j, m, att placera en skiva från varje utspädning till en enda bild, så att en glid representerar hela standardkurvan. Lagra objektglasen vid -20 ° C tills redo för skanning.
- Placera båda vävnader och standarder -20 ° C och tillräckligt med tid för alla prover att komma till temperatur.
- Skanning och kvantifiering
- Starta skannings array programvara och klicka på "543 laser" för att börja laserstartprocedur. Vänta 15 minuter för lasern redo.
- När lasern är redo, ta bort bilderna från -20 ° C och flytta dem in i en stor, ljusskyddat behållaren att komma till temperatur och torka i 3 minuter. Detta kommer att förhindra att fukt byggs upp i slide scanner.
- Ladda glida in glid uttaget på diascanner. Klicka på "Scan" och välj "kör lätt scan."
- Ställ in skanningsupplösningen till 50 um.
- Välj den första "Use" kryssrutan under "fluorofor" och välj "TRITC." Ställ in PMT Gain till 80%.
Obs: Dessa inställningar varierar beroende på fluoroforen och koncentrationen av de märkta molekylerna. - På vänster sida, se till att skanningsområdet omfattar hela bilden. Klicka på "Start".
- Efter skanning, välj "fil" och välj "spara som" och sedan spara bilden som en .tif.
Obs: Slides av vävnader och normer ska genomsökas på samma inställningar. - Fyll de resulterande bilderna i ImageJ och välj ROI runt vävnaderna och standarder. Under fliken "analysera", välj "set mätningar" och välj "betyder grå värde." Klicka220; åtgärd ".
Obs: Liksom med den tidigare tekniken, måste bakgrundsfluorescens subtraheras från alla mätvärden. - Rita genomsnittsvärdena gråvärde från normerna mot den kända koncentrationen för att skapa en standardkurva.
Notera: De resulterande mätningarna från vävnaderna ska medelvärdet beräknas inom varje vävnad och plottas på den standardkurva för att bestämma koncentrationen i vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uppgifterna nedan beskriver leverans av tre föreningar: a drug delivery vektor kallas ELP och två versioner av ELP modifierad med cellpenetrerande peptider (SynB1-ELP och Tat-ELP) 9. Samtliga tre föreningar märktes med tetrametylrodamin-5-maleimid och levereras via två administrationsvägar (IN och IV). Målet med dessa försök var att bestämma vilken förening och administrationsvägen skulle resultera i den bästa penetrationen in i det centrala nervsystemet (CNS) 3.
Figur 1A visar representativa ex vivo bilder av organ från de behandlade djuren hela organ. Värme karta overlay visar fluorescensnivån i strålningsutbytet i vävnaderna. Genom att dra ROI runt de individuella vävnader och genom att plotta dessa värden på deras motsvarande standardkurva är standardiserade fluorescensvärden som visas i figur 1B genereras. Den standardiserade fluorescence-värden kan sedan användas för noggranna jämförelser av de relativa koncentrationerna av de olika föreningarna. Dessa data beskriva både effekten av ELP ändring på penetrationen i specifika vävnader, liksom effekten av administreringssätt på varje förening korrekt. Med dessa resultat är det genast klart att ELP leverans via IN administration är den mest effektiva kombinationen att nå CNS.
Även om dessa resultat att avgöra den bästa penetrerande förening och leveranssätt, att de inte beskriva den faktiska koncentrationen eller regional lokalisering av föreningar inom CNS. Kvantitativ histologi är därför idealisk för att slutföra beskrivningen av biologiska fördelningen av dessa föreningar, eftersom det möjliggör kvantitativa mätningar av de utvalda områden i hjärnan. Figur 2A visar ett representativt segment från ELP IN-behandlade djur, och figur 2B beskriver kvantifieringen av ROI separera denlukt glödlampor, halvklot, och lillhjärnan. Från dessa data är det klart att medan ELP administration av rutten kan resultera i höga CNS koncentrationer gör det här främst i lukt glödlampor och lillhjärnan. Omvänt, ELP levererade IV har lägre totala koncentrationer, men det är jämnt fördelade över hela hjärnan. Beroende på målet av dessa administrerade föreningar och risken för effekter i andra organ, kan antingen i eller intravenös administrering vara ett bättre val. Detta kunde inte slutföras utan tillsats av den kvantitativa histologi. Tekniskt, kunde kvantitativ histologi har använts i alla vävnader i varje grupp, men genom att använda båda metoderna tillsammans, var en hel del tid och arbete sparas medan den fortfarande resulterar i samma slutsats.
Figur 1: Ex Vivo Hela organ FluorescenceMätningar. A) Bilderna från ELP-gruppen. Värmekartskalan sattes som strålningsutbytet. B) Genomsnittlig strålande effektivitetsvärden som erhållits från skapandet av ROI kring de enskilda vävnader som analyserades på en standardkurva för att generera de standardiserade fluorescensvärden som används för jämförelse av bio-distributioner. Felstaplar representerar SEM. Skalstreck = 5 mm. (Ändrad från McGowan et al;. Drug Design, utveckling och terapi, 2016) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantitativa Tissue Histologi Mätningar. A) representativ bild av ELP IN- eller IV-behandlade djur som skapas genom skärning hjärnor 20 um tjock, montering av skivor on diabilder, och sedan skanna dessa bilder med hjälp av en fluorescens glida scanner. B) Medelvärden erhållna från skapandet av ROI runt luktbulben, halvklot, och lillhjärnan, mätt som den genomsnittliga grå värde och anpassas till en standardkurva för att generera mätningar ug / ml koncentration. Felstaplar representerar SEM. Skalstreck = 5 mm. (Ändrad från McGowan et al;. Drug Design, utveckling och terapi, 2016) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan ex vivo hela organavbildning är i allmänhet okomplicerad, kan ansluta sig till några grundläggande begrepp och tekniker förbättra mätnoggrannheten bio-distributions. Korta våglängder av ljus erfarenhet en hög grad av spridning och absorbansen i de flesta vävnader, vilket avsevärt påverkar redskaps av de kortvåglängds fluoroforer. Dessa fluoroforer har begränsad användning i djupvävnadsstudier, men de har använts effektivt i experiment tittar på ytan vävnader eller i ögat. Omvänt, långa våglängder av ljus genomgår betydligt mindre spridning och absorption, vilket resulterar i större genomslag och mer korrekta resultat med tjockare vävnader 10. Fluoroforer som faller i det bortre röda och nära infraröda (NIR) området (excitation ~ 600 nm) av spektrumet vanligen väljs för hela djur eller större vävnader. För experiment med användning av dessa långvåglängds fluoroforer, auto-fluorescens av särskild tisstämmer eller material är sannolikt en nyckelfråga. Till exempel, är gallan inuti gallblåsan hos gnagare höggradigt auto-fluorescent vid våglängder i 500-600 nm-området. Eftersom detta kan kraftigt skev levervärden, är det ofta bäst att ta bort gallblåsan före avbildning. Alternativt, om den intakta levern och gallblåsan krävs, att välja en fluorofor med en exciteringsvåglängd vid mycket långt änden av spektrumet kan begränsa inverkan av gallan auto-fluorescens. Dessutom har många av de vanligaste gnagare chows innehåller orenad alfalfa, som fluorescerar starkt under mitten och långt-intervall av spektrumet. Om de valda etiketterna faller inom dessa våglängder och mag-tarmkanalen ska avbildas, är en förändring i diet sannolikt det bästa alternativet.
Medan levande bildsystem är utformade för att exakt mäta tjocka vävnader, med icke-homogena och särskilt tjocka vävnader (t.ex. hela råttlever), mer noggranna mätningar kan oftasv erhållas genom att sprida vävnaden ut, så att loberna i levern överlappa så lite som möjligt. Också, i de fall där vävnader har en höggradigt sned fördelning av märkta molekyler, avbildning från flera sidor av vävnaden och medelvärdesbildning av dessa mätningar kan öka noggrannheten. I slutändan de typer av vävnad som skall avbildas, bör den automatiska fluorescens av material i samband med dessa vävnader, och den potentiella fördelningen av administrerade märkta molekylerna övervägas noga för att välja en fluorofor med lämpliga excitations- och emissionsvåglängder som begränsar interferens så mycket som möjligt.
När du utför kvantitativ vävnad histologi, finns det flera viktiga detaljer att tänka på. För att resultatet ska bli korrekt måste skivor tas hela vävnad eller region som skall analyseras. Detta innebär att dessa vävnader inte kommer att vara tillgängliga för andra processer. Det kan vara möjligt att fastställa och fläck efterscanning, men det är normalt bäst att låta skivorna torka något innan de tas i skannern, vilket kan påverka framtida färgning. På samma sätt kommer avsökningen att orsaka en viss nivå av fotoblekning, vilket minskar den potentiella signalen i efterföljande processer. För nedströms mikroskopi applikationer, är överlägsna sektioner typiskt uppnås genom fastställande av vävnader och jämvikta dem i en sackaroslösning innan snittning. Dock är denna process bäst undvikas i ovan kvantitativ histologi protokollet på grund av effekterna av fixering och / eller lång sackaros suger på fluorescensintensitet. Dessutom, beroende på mängden av signal närvarande kan skivor uppleva fotoblekning om de utsätts för även låga nivåer av omgivande ljus. Att hålla bilderna kall och bort från ljus kommer att avsevärt förbättra noggrannheten i de resulterande mätningarna. Sammantaget kan noggrann hantering och beredning drastiskt förbättra slutresultatet.
Det finns en mängd andrametoder som används för att studera biologiska fördelningen och farmakokinetik administrerade makromolekyler som varierar kraftigt i tekniska svårigheter, genomströmning, noggrannhet, och den utrustning som krävs 11. Kvantitativa immun och bioaktivitetsanalyser kan både vara tekniskt komplicerat och kräver antikroppar eller reagens som är specifika för de administrerade molekylerna, lägga betydligt till kostnaden och arbetskraft. Flera metoder baserade på radioisotop märkning har använts tidigare, med varierande noggrannhet, men integrationen av radioisotoper till makromolekyler, liksom insamling av uppgifter själv, kan kräva betydande förberedelser och kan ofta göra vävnader helt oanvändbar för vidare analyser 12. Slutligen kan andra metoder visat sig vara effektiva, inklusive positronemissionstomografi och masspektrometri, typiskt är förhindrade helt enkelt på grund av brist av den nödvändiga utrustningen. Protokollet som beskrivs ovan använder två metoder i samband för att effektivt bestämma the bio-distribution av märkta molekyler i en snabb, kostnadseffektiv, korrekt, och lättillgängligt sätt på grund av regelbunden availably av den nödvändiga utrustningen.
Denna metod användes för att generera de data som ovan, identifierar den bästa vektorn och administreringssätt för leverans av märkta molekyler till CNS. Utifrån de uppgifter ex vivo, ELP administreras och ELP administreras IV identifierades för ytterligare karakterisering via kvantitativ vävnad histologi. Kvantitativ vävnads histologi förutsättning då koncentrationen av märkta molekyler i specifika regioner i CNS, vilket gör att slutsatser dras. De två metoderna tillsammans representerar ett snabbt och effektivt sätt att utföra en detaljerad undersökning av den biologiska distributionen av flera specifika föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g., tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
