Introduction
המיטוכונדריה מתואר קלסי כמו תחנת הכח הסלולר, שכן הם המושבים העיקריים של ייצור אנרגיה בתאי בדיל. יתר על כן, המיטוכונדריה לשחק תפקיד קריטי במטבוליזם, דור חום, שינוי שומנים, סידן הומאוסטזיס חיזור, תזמור תהליכי איתות תא, וכו '1. המיטוכונדריה גם לשחק תפקיד פעיל האינדוקציה של מוות של תאי 2, כמו גם מחזור התא תקנה 3. רב-פונקציונלי כזו מעלה את השאלות העקרוניות הבאות: א) איך המיטוכונדריה אל לבצע את כל הפונקציות האלה בו זמנית ב) האם יש ברכות המיטוכונדריה ספציפיות או subzones כי הם מיוחדים עבור פונקציות נפרדות? בהקשר זה, חשוב לציין כי המיטוכונדריה רב התכליתית הן דינמיות הצורה, הגודל שלהם, ואת המבנה בתוך תאים בודדים וכי הצורה היציבה של המיטוכונדריה יכולה להשתנות בין סוגי תאים. עשרות שנים של מחקר ממעבדה שונהoratories מראה כי השינוי של צורת המיטוכונדריה, גודל ומבנו, דינמיקה המיטוכונדריה פנתה במשותף, הוא חיוני בשמירת פונקציות המיטוכונדריה שונה 4,5,6. ממצאים אלה מעלים את האפשרות כי המיטוכונדריה יכול להשיג רב הפונקציונלית שלהם מכוח הדינמי המבני שלהם.
מאמצים נרחבים נערכים להבין את הקשר מבנה-תפקוד המיטוכונדריה. הדינמי של מבנה המיטוכונדריה נשמר בעיקר על ידי היכולת שלהם לעבור אירועי ביקוע ואיחוי אחד עם השני. ביקוע של המיטוכונדריה גדול ממיר אותם אלמנטי המיטוכונדריה קטנים, תוך היתוך בין שני המיטוכונדריה קטן ממזג אותם לאלמנט המיטוכונדריה גדול 7. יתר על כן, היתוך חולף של שתי המיטוכונדריה עלול להתרחש כדי לאפשר הערבוב של תוכנם. אירועי הביקוע ואיחוי של ממברנות המיטוכונדריה הפנימיות וחיצוניות נשלטים בקפידה על ידי המפרטific קובע של חלבונים. מנגנון ביקוע הגרעין מורכב הקשורות dynamin חלבון 1 (Drp1), אשר גייס מן cytosol אל המיטוכונדריה ידי האינטראקציה שלה עם חלבונים המיטוכונדריה בתום לב מסוים (למשל, Fis1 או Mff1), בעוד פונקצית Drp1 יכולה גם להיות מוסדרת על ידי חלבונים אחרים על פני המיטוכונדריה 4. למרות Drp1 פועלת על הממברנה החיצונית, יכולות הביקוע שלה להשפיע על הקרום הפנימי גם כן. התזמור של הביקוע של ממברנות המיטוכונדריה חיצוניות ופנימיות אינו מובן היטב. מצד השני, פיוז'ן של הקרום הפנימי נשלט על הליבה על ידי הפעילויות של Opa1, בעוד mitofusins השולטים ההיתוך של 5-הממברנה החיצונית. יתרת אירועי הביקוע ואיחוי המנטרל של המיטוכונדריה להכתיב את צורת המיטוכונדריה היציבה בתא. לדוגמה, הדחקה של ביקוע המיטוכונדריה תביא היתוך שלם ללא התנגדות, בעוד יתר פעילות של המיטוכונדריהביקוע l יביא לפיצול של המיטוכונדריה 3.
המחקר של קשר מבנה פונקצית המיטוכונדריה כרוך בעיקר שתי גישות מחמיאות: א) מנתח של פנוטיפים הסלולר האורגניזם לאחר מניפולציה גנטית של חלבוני היתוך / ביקוע המיטוכונדריה ב) הערכות ישירות של מבנה המיטוכונדריה ותפקוד. ראוי לציין כי אנליזה גנטית לא תמיד לחשוף את הפונקציונליות הישירה של המולקולה בהישג היד (במקרה זה, חלבוני היתוך / ביקוע המיטוכונדריה), כמו פנוטיפים שעלולים להתעורר עקב השפעות משניות. לכן, זה הוא בעל חשיבות עליונה לפתח ולהשתמש בכלים כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד ישירות. כל הערכה של מבנה המיטוכונדריה כרוכה כלים מיקרוסקופיה שונים. שימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאי חיים התקדם המחקרים מאוד של דינמיקה המיטוכונדריה, מאז הדינמיות המיטוכונדריה ניתן לנטר הן מבחינה איכותיות quantitatively באמצעות כלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתאימים וטכניקות 8. כלי מיקרוסקופיה קרינה מבוססות פותחו כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד ברקמות תסיסנית חיות וקבועות, הבהרת המשמעות של הדינמיות המיטוכונדריה vivo 9. אלה ושיטות החישוב לסקר מתוארים כאן, עם המטרה של לימוד מבנה המיטוכונדריה ותפקוד בשחלה תסיסנית.
השחלה תסיסנית מורכבת שושלות בתאי מין וגם סומטיים, אשר נובעות בתאי גזע בוגרים שלהם שוכני germarium 10,11. שישה עשר בתאי הנבט סינסיציאלי (GCS) לקבל במארז ידי תאי זקיק סומטי (FCS) כדי ליצור תאי ביצה הפרט העולות מתוך germarium (איור 1). אחת מ -16 GCS לקבל מחויב להיות ביצית, ואת GCS 15 הנותר להתפתח לתאי אחות ששומרים על הגדילה של תא הביציתאת הקלת הבשלת הביצית לפני שהוא הניח. רוב FCS לעבור 9 סיבובים של חטיבות mitotic לפני שהם יציאת מחזור תא mitotic סופנים להתמיין שכבת תא אפיתל בדוגמת המורכבת תאי זקיק קדמי (AFCs), תאי זקיק אחורי (PFCs), ותאי גוף עיקריים (MBCs) . תאי הביצה הרצופים מחוברים באמצעות תאי גבעול, אשר הם מובחנים תאים נגזרים גם FCS בשלב המוקדם של התפתחות. צורת מיטוכונדריאלי מוסדרת על ידי Drp1 חלבון ביקוע המיטוכונדריה מעורב באופן פעיל בתהליך של התמיינות במהלך ההתפתחות הנורמלית של שכבת FC שחלות תסיסנית 9,12. שיטות שימוש במחקרים אלה כדי לזהות את המעורבות של Drp1 בפיתוח שכבת תאי זקיק תסיסנית מתוארות כאן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תסיסנית (הכלים הנדרשים מתוארים איור 2 א)
- עבור כל אחד הניסויים שתוארו, לאסוף תסיסנית (נשמר בטמפרטורת החדר, או 25 ºC) בתוך 5 ימים של eclosion ומניחים אותם בתוך צנצנת ובתוכה 5 - 7 מ"ל של תסיסנית מזון (ראה לוח חומרים), עם לא יותר מ 25 זבובים בכל בקבוקון; לשמור על נקבה: יחס זכר 2: 1.
- מפזר כמות קטנה של שמרים מגורענים כדי לעורר ייצור ביצים תסיסנית. בצע מניפולציה ניסויית בתוך 2 - 4 ימים.
2. Dissection של תסיסנית השחלות (הכלים הנדרשים מתוארים איור 2 א)
- חרק חם לנתח בינוני (ראה לוח חומרים) לטמפרטורת החדר, 25 ° C. מלאו שלוש בארות של המנה לנתח זכוכית שמונה היטב, עם 200 μL של מדיום בכל טוב.
- להרדים תסיסנית עם CO
- בעוד אני מסתכל דרך העינית של המיקרוסקופ לנתיחה, לנתק את החזה מהבטן באמצעות שני זוגות מלקחיים. באמצעות המלקחיים, בזהירות להעביר את הבטן אל הבאר השנייה של המנה.
- השתמש זוג אחד של מלקחיים להחזיק את הבטן בקצה האחורי, ולאט לאט לדחוף את השחלות החוצה (יחד עם תכולת בטן האחרת) עם הזוג האחר של מלקחיים. אם ניסיון זה נכשל, הסר את שלד חיצוני בטן בקפידה על ידי החדרת מלקחיים אל הקצה הקדמי כדי לשחרר את השחלות.
- באמצעות המלקחיים, להחזיק השחלה בודדת עד הסוף האחורי האטום (כלומר, מלאות חלמון, בשלב מאוחר ביצים) והעבר אותו בזהירות אל הבאר השלישית של המנהעבור מתגרה כדי שיעבדו אותו במיקרוסקופ חי (שלב 3) או לתיקון לבצע immunostaining (שלב 7).
- בזהירות להקניט את הנדן המגן מרחבי השחלות ידי גורף מחט מתגרה בקלילות מן האחורי אל הקצה הקדמי של כל השחלה כשהוא אוחז בו עד הסוף האחורי עם זוג המלקחיים.
הערה: כדי למזער את הנזק במהלך מתגרה, לכופף את קצה המחט להתמקד על כל השחלה על ידי הגדלת ההגדלה של המיקרוסקופ (איור 2 א). להקניט צריכה להיות יעיל מספיק כדי לשבור את הנדן, אבל הוא צריך גם להיעשות בזהירות כדי לשמור על השלמות של ovarioles.
3. הכנה למיקרוסקופיה Live-רקמה
הערה: הכלים הנדרשים מתוארים באיור 2A.
- לפני לנתיחה תסיסנית, להכין תאי polyL ליזין מצופה. לשם כך, הנח שתי טיפות 20 μL של polyL ליזין (0.1 מ"ג / מ"ל) על coverglהתחת (14 מ"מ, מס '0) של צלחת פטרי עם רצפת זכוכית (35 מ"מ) במרחק סביר זה מזה כדי למנוע מיזוג של טיפות. האוויר יבש הצלחות עבור h 1 ב 37 ºC ולסמן את הקצוות של סרט polyL ליזין הלבן על החלק התחתון של הצלחת עם בטוש מחיק.
הערה: תאי מצופה polyL ליזין יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. אם באמצעות תא בעבר מצופה, להביא אותו לטמפרטורת החדר לפני תחילת לנתיחה תסיסנית. - הגדר את פרמטרי סריקה על המיקרוסקופ confocal לוודא כי המדגם יכול להיות צלם מייד לאחר השלמת הניתוח ואת ההרכבה, כמפורט להלן.
- מקום אחד גזור והקניט השחלה (לאחר שלב 2 ומוכתמת, במידת הצורך, לאחר שלב 5) על אזור polyL ליזין מצופה מסומן ולהפיץ את השחלה עם המחט מתגרה להפריד את ovarioles. מניחים ירידה של 10 μL של המדיום לנתח חרקים על גבי השחלה, והקפד לכסות tהוא אזור polyL ליזין מצופה כולו. מכסים את צלחת פטרי.
- מיד לבצע מיקרוסקופיה confocal של המדגם רכוב בטמפרטורת החדר.
הערה: רק אחד תסיסנית צריך להיות גזור, מעובד, צלם בכל פעם. כמו כן, מיקרוסקופיה לא צריך להיות מבוצעת על 37 מעלות צלזיוס, אשר יהיה לחקות סביבת הלם חומה עבור רקמות תסיסנית.
4. הקרינה והפסד Photobleaching (FLIP) Assay להעריך המשכיות מטריקס מיטוכונדריאלי
הערה: משכיות מטריקס מיטוכונדריאלי במבנה המיטוכונדריה התמזג מוקם לאחר ההיתוך המוחלט של ממברנות פנימיים וחיצוניים המיטוכונדריה בעקבות התקדמות דרך שלבי ביניים. ביקוע של המיטוכונדריה עשוי חזרו על אותן הפעולות אך בכיוון ההפוך (איור 3 א). FLIP הוא מיקרוסקופיה מבוססי זמן לשגות השיטה וכמותיות, שניתן להשתמש בהם כדי להעריך המשכיות מטריקס המיטוכונדריההמדינה התמזגו הסופית של vivo לשעבר המיטוכונדריה (שלבים 3 ו -4 ב איור 3 א) בשחלות תסיסנית חי 9. את assay FLIP מתבצע כאזור קטן של עניין (ROI) של המיטוכונדריה להביע מולקולת ניאון במטריצה המיטוכונדריה כי הוא photobleached במרווחי זמן קבוע (ROI FLIP באיור 3 א). כתוצאה מכך, בכל אזור המיטוכונדריה שמסביב כי היא רציפה עם ROI FLIP (ROI ניסיוני איור 3 א) יאבד אות בשל חילופי מולקולות במטריצה המיטוכונדריה הרציפה. ניסויי FLIP הפגינו כאן מבוצעים על תסיסנית מהונדסת מבטא mitoYFP, אשר מכיל את רצף מיקוד המיטוכונדריה של למקטע השמיני אדם ציטוכרום אוקסידאז מתויג עם YFP למקד אותו המטריצה המיטוכונדריה צורת diffusible בחופשיות. ניסוי דומה יכול גם להתבצע עם transgene מיטו pUASP-מיטו-GFP, כפי שדווח בעבר <sup> 9. פרוטוקול FLIP דומה ניתן להשתמש עם בדיקה ממוקדת במרחב הבין-הקרום המיטוכונדריה להיות מסוגל לזהות את משכיות נובע ההיתוך של החיצון אך לא את הקרומים המיטוכונדריה הפנימיים (שלב 2 ב איור 3 א).
- פתח את תוכנת רכישת התמונה על מיקרוסקופ confocal וכן להגדיר את הפרמטרים הסריקה המתאים בכרטיסייה "רכישה" (טבלה 1). בדוק את "סדרות עתיות," "הלבנה", ו "קופסאות אזורים" כדי לפתוח את אחת מהכרטיסיות. מכניס את ערכי פרמטרי רכישה המתאימים בכל כרטיסייה (טבלה 1).
הערה: החריר יש להשאיר פתוח, בתור ניסוי זה נועד לפקח אות הכוללת מן האוכלוסייה המיטוכונדריה כולו בתאים בודדים. - השתמש העיני לאתר את תחומי העניין במהירות ברקמת החיה הרכובה.
הערה: בחר את ovarioles כי מפוזרים היטב על-bottome זכוכיתהמנה ד, מאז מיקרוסקופיה confocal לא יכול להתבצע על ovarioles צף. - לחץ על "לחיות" כדי לרכוש תמונה חיה של השדה הנבחר של עניין. לחץ על "עצור" כדי לעצור את הסריקה בזמן אמת.
- במידת הצורך, להתאים את הפרמטרים רכישת כך אות ניאון מזוהה הוא מתחת לרמות רוויה (מסומן על ידי בהעדר פיקסלים בצבע אדום כאשר אפשרות "מחוון טווח" מסומנת), עם רקע מוגדר כפי שנקבע על ידי התאמת ערכי לקזז.
- צייר ROI קטן באמצעות כלי ציור בזייה מהכרטיסייה "האזורים" כדי לתחום את אזור photobleaching על התמונה נרכשה על ידי סריקה בזמן אמת.
הערה: הגודל של ROI צריך להיות סביב 20 - 50% של האות הכולל פלורסנט המיטוכונדריה בתוך התא. - בצע את רכישת תמונה על ידי לחיצה על "התחל ניסוי".
- לכמת את עוצמת הקרינה באמצעות קניינית או תוכנות קוד פתוח (ראה חומריםטבלה). רשום את האות הממוצעת מן ROI שבו לבן החוזר הוא ממוקדת (FLIP); את ROIs שבו לבן לא שבוצע באותו התא (ניסיוני); ההחזר על ההשקעה מתא מולבן אחר באותו שדה הראייה, להערכת לבנה כוללת במהלך תקופת הניסוי (הלבנה); ואת ההחזר על ההשקעה על אזור הרקע (רקע). הפחת את אות רקע הממוצעת המתקבל האות הממוצעת של ROIs האחר. לנרמל את האות ניאון עם האות מראש אקונומיקה הראשונית עבור התא בהתאמה.
- מגרש את הנתונים המנורמלים באמצעות כל תוכנה והתוויית סטנדרטית.
5. מכתים חי עם צבעי מיטוכונדריאלי פלורסנט
הערה: מצב יציב מבנה המיטוכונדריה ופוטנציאל ניתן להעריך באמצעות צבעים המשלבים לתוך המיטוכונדריה במיוחד בתאים וברקמות חיים. יכול להיות מוכתם השחלות חיים תסיסנית vivo לשעבר עם המיטוכונדריה פלורסנטכתמים כדי להמחיש את המיטוכונדריה, להעריך מיני חמצן תגובתי המיטוכונדריה (Mito-ROS) ייצור, ועל מנת להעריך את פוטנציאל של המיטוכונדריה לכל המוני יחידה. ניתן להשיג זאת על ידי שיתוף מכתים עם אתיל אסתר tetramethylrhodamine לצבוע פוטנציומטרית המיטוכונדריה (TMRE) וכתם המיטוכונדריה תואם חי המייצג את מסת המיטוכונדריה (ראה לוח חומרים עבור צבעים ספציפיים).
- לדלל את המניות של כתמי חרקים חמים לנתח בינוני עד ריכוזי העבודה הסופיים: כתם המיטוכונדריה, 250 ננומטר; TMRE, 50 ננומטר; כתם Mito-ROS, 5 מיקרומטר.
- לאחר דיסקציה ולגרות השחלות לאחר שלב 2, למקם את השחלות לתוך 200 μL של כל פתרון מכתים מסוים באר צלחת לנתיחה. דגירה אותם במשך 10 דקות עם צלחת מכוסה התיבה מתאימה עטופה בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. שטוף את השחלות מוכתמות על ידי העברת אותם בזהירות עם מלקחיים לתוך 3 בארות רצופות containinבינוני גרם ללא כתם.
- עבור שיתוף מכתים עם TMRE ואת כתם המיטוכונדריה הכוללת התואם, בצע בפרוטוקול לעיל כדי להכתים ראשון עם TMRE ומייד עם כתם המיטוכונדריה הכולל (ללא כל צעדים לשטוף שביניהם).
- הר השחלות על צלחת זכוכית עם תחתית מצופה polyL-ליזין, לאחר שלב 3 ולהתכונן מיקרוסקופיה confocal עם הפרמטרים סריקה המתאים (טבלה 1), בעקבות צעדים 4.2-4.4.
הערה: האות מ הצבעים המשולבים לא החזיקה מעמד כאשר מנסה לעלות על הדגימות מוכתמות הרכבה בינונית. - סמן את התיבה חתך-Z כדי לפתוח את הכרטיסייה. סובבו את גלגל המיקוד לכיוון החלק התחתון של המדגם בזמן שהוא חי-סרק ולחץ על "הסט הראשון" כדי להגדיר את Z-סעיף התחתון. לעשות את אותו הדבר תוך כדי תנועת גלגל הפוקוס לקראת בכיוון ההפוך להגדרת הסעיף העליון.
- בצע את רכישת תמונה על ידי לחיצה על "התחל ניסוי".
- לכמת את עוצמת פלורסנט תקן רקע מן ROIs עבור אות רקע ואת התאים הבודדים (כמו בשלב 4.7) ואת עלילת הנתונים באמצעות כל תוכנה והתוויית.
דור 6. Drp1 Null פסיפסים
הערה: האסטרטגיה המשובטים משמש כאן מציגה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שיבוטים -שלילית Drp1 null ברקע של רקע GFP חיובי, phenotypically wild-type כי הוא הטרוזיגוטיים genotypically עבור המוטציה Drp1 null 9. הלם-חום הנגרמת היעד הכרה flippase-flippase (FLP-FRT) רקומבינציה mitotic אתר ספציפי בתיווך יוצר שיבוטים הומוזיגוטים של אלל drpKG03815 null מבחינה תפקודית. הגנוטיפ של תסיסנית נושאת מוטצית Drp1 הוא drpKG03815 FRT40A / ארגון נוער קתולי, ואילו גנוטיפ נושאה את חום הלם-induced FLP (hsFLP) סמן משובט UbiGFP הוא hsflp; NLS-GFP היוביקוויטין (UbiGFP) 40A FRT / ארגון הנוער הקתולי. הגנוטיפ של seצאצאי lected של ההכלאה בין גנוטיפים לעיל הוא hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.
- סנכרן את תסיסנית לאיסוף בתולה ידי העברת לתוך צלוחיות חדשות של מזון טרי כל 2 עד 3 ימים. צג צלוחיות pupariating יומי כדי לאסוף נקבות בתולה מתעוררות.
- אסוף נקבות בתולה אדומות עיניים, מתולתל-אגף לבין גנוטיפ מוטצית Drp1 כל יום, פעם בבוקר ופעם בערב, ולהכניס אותם לתוך בקבוקון נפרד. במקביל, לאסוף זכר תסיסנית בעיניים אדומות כהות וכנפיים ישר נושאת hsflp ו UbiGFP בתוך 5 ימים של eclosion.
- הגדרת צלב על ידי הוספת הזכרים והנקבות בתולה עם נקבה: יחס זכר 2: 1.
- מפזר כמות קטנה של שמרים מגורענים כדי לעורר ייצור ביצים.
הערה: בזהירות להזיז את תסיסנית בקבוקון טרי של תקשורת כל 2 עד 3 ימים כדי להגדיל את כמות צאצאים וכדי להקטין צפיפות בקבוקון. - esthetize, למיין, ולאסוף ישר כנפיים, צאצאי נקבה אדומים עיניים בתוך 5 ימים של eclosion.
- עבור הלם החום, למקם את תסיסנית שנאספה לתוך צלוחיות ריקות עם כמות קטנה של שמרים מגולענים קטנה, רך לנגב (לספוג את הלחות במהלך הלם החום). מניחים את הצנצנת עם תסיסנית באמבט מים ב 38 ºC עבור H 1, כדי ליצור שיבוטים תא זקיק בעיקר, ו ב 37 ºC עבור h 1 פעמיים ביום (המאפשר h 5 לפחות בין 2 הזעזועים חום) עבור 2 ימים רצופים , כדי ליצור בתאי מין וגם שיבוטים תא זקיק שניהם.
הערה: ודא כי הבקבוקון הוא שקוע לחלוטין בתוך המים עד לרמה של התקע. - ההלם החום עלול להפוך את נייח תסיסנית. אפשר תסיסנית חום בהלם להתאושש במשך 1 שעות בטמפרטורת החדר כאשר הם הופכים ניידים שוב.
- מוסיף את הזכרים חזרה הנקבות באותו היחס כמו הצלב, ולהעביר אותם בקבוקונים טריים עם mediuמ זרוע כמות קטנה של שמרים מגורענים. שמירה על תסיסנית במשך 5 ימים לפחות.
- לנתח את השחלות לפי צורך עבור ניסוי חי או קבוע.
הערה: השחלות מבודדות UbiGFP תסיסנית להביע וההורים נדרשות לשמש שולטים שלילי כדי לאשר את האינדוקציה היעילה של שיבוטי GFP שלילי על ידי הלם החום.
7. Co-immunostaining עבור Cyclin E ו המיטוכונדריה
הערה: כדי לזהות תסיסנית Cyclin E (dCyclinE), השתמשנו נוגדן מסחרי השיג שאותן עורר נגד dCyclinE 9 (ראה חומרי טבלה). כסמן המיטוכונדריה, השתמשנו נוגדן כנגד ATP-B (למקטע של המתחם synthase ATP במיטוכונדריה) 9.
- paraformaldehyde 4% חם (PFA) לטמפרטורת החדר, 25 ° C. זְהִירוּת! Paraformaldehyde רעיל.
הערה: לאחר פתיחהאת האמפולה, יש לאחסן PFA ב 4 ° C בשימוש בתוך 7 ימים. הסיבה לכך היא אחסון של PFA עשוי לאפשר חמצון מתנול, אשר תשנה ממברנות המיטוכונדריה דרמטי במהלך קיבעון, גם אם נוכח כמויות זעירות. - מייד לאחר דיסקציה, לתקן את השחלות הגזורות על ידי הציב 200 μL של PFA הטרי באר צלחת לנתח זכוכית (ללא התגרות). שמור את המנה במנדף במשך 15 דקות. שטוף את ההשחלות הקבועות על ידי הזזה אותם בזהירות עם המלקחיים לתוך 3 בארות רצופות, שכל אחת מהן מכיל 200 μL של בופר פוספט 1x (PBS).
הערה: הניסוי ניתן לעצור פה הדגימות ניתן שמאלה 4 ºC עבור 1 יום. - להקניט את השחלות באופן יסודי יותר ב PBS (בדומה לשלב 2.6) כדי להסיר את הנדן סיבי המגן בזהירות שעשויה לעכב גישת אנטיגן על ידי הנוגדן.
- Permeabilize השחלות הקניטו ידי הצבת בתוך שפופרת microfuge עם 500 μL של טריות 0.5% PBS-טריטון-X100 (PBS-טק) ו דגירה אותו במשך 30 דקות תוך נדנדה ב 25 סל"ד.
הערה: במהלך הנדנדה, ומקום הצינורות מקבילים לתנועת הנדנדה; הצבתי בניצב עשוי לאפשר לרקמות להיצמד הכובע של הצינורות, ובכך וכתוצאה מכך אובדן רקמות. - כדי להסיר את PBS-TX, והמקום צינורות microfuge לתוך מעמד לוודא לאפשר לרקמות להתיישב בחלק התחתון של החצוצרות. בדוק אותם באופן חזותי והקש על הצינורות, במידת צורך, כדי להביא את כל רקמות צפו עד לתחתית. לשאוב את הפתרון בזהירות מלמעלה, ולוודא כי הרקמות בחלק התחתון של הצינורות נשארות באין מפריע.
- חסום את השחלות על ידי הוספת 200 μL של אלבומין 2% שור (BSA) מומס 0.5% PBS-TX, דגירה אותו על הנדנדה בטמפרטורת החדר 1 ח. הסר את סוכן החסימה ידי ביצוע צעד 7.5.
- הוספת נוגדנים ראשוניים ב 200 μL של סוכן חסימה טרי: נוגדן נגד ארנב dCyclinE (1: 100) ו נוגדן אנטי עכבר ATP-B(1: 100). דגירת הרקמות על הנדנדה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר.
- שטפו את השחלות עם PBS-TX 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחד, לאחר שלב 7.5.
- הוספת 200 μL של נוגדנים משני המתאימים-TX PBS הטרי: CY3 אנטי עכבר (1: 1,000) ו-Cy5 נגד הארנב (1: 500). דגירה על הנדנדה 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את השחלות עם PBS-TX 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחד, לאחר שלב 7.5.
- כדי להכתים את ה- DNA, להוסיף Hoechst (1: 1,000 דילול) כדי לשטוף PBS-TX הסופי.
- לבסוף, להשאיר את הרקמה 500 μL של 1x PBS.
- שימוש micropipette 1 מ"ל, להסיר את השחלות immunostained מהצינור microfuge לבאר טריים של צלחת לנתח זכוכית המכיל 200 μL של PBS.
- הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית מבוסס גליצרול לשקופית זכוכית ומוסיף את אחד שחלות immunostained אחרות זה לפני ההרכבה הבינונית.
הערה: ודא כי השחלות אכן מועברות ההרכבה הבינונית. משנכשל לעשות so יוביל לאובדן רקמות. - בעוד אני מסתכל מבעד למיקרוסקופ לנתיחה, בעדינות לקטוף את ovarioles השקוף (שלבים צעירים) מתאי הביצית בשלה האטומים באמצעות המחט המתגרה כשהוא אוחז את החלק האטום של השחלה עם המלקחיים. הסר את תאי ביצית בשלה מן המדיום גובר.
- מניח coverglass (22 מ"מ, מס '1) בשקופית ולחץ קל על מנת להבטיח כי ההרכבה בינונית משתרע מתחת אחיד.
הערה: לחיצה על coverglass גם מבטיחה את היישור הנכון של הרקמות לאורך coverglass. אם לא תעשה זאת בצורה אופטימלית עשוי לאפשר בשלבים קטנים לצוף הרכבה בינונית, מניעת מיקרוסקופיה אופטימלית של רקמות אלה. - אוויר יבש דגימות במשך 15 דקות וסוגרים את הקצוות של coverglass בזהירות עם לק.
- בצע מיקרוסקופיה confocal לפי הצורך הניסוי (טבלה 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטות שתוארו ניתן להשתמש כדי לחקור את המבנה המיטוכונדריה ותפקוד שחלות תסיסנית חיות וקבועות (איור 2 ב). בתנאים כמה דוגמאות של תוצאות חזויות שהושגו עם השיטות שתוארו.
דיסקציה של השחלה תסיסנית: כאשר גזור נוסף, הבטן ניתקה (איור 3B) מן (איור 3 א) תסיסנית כולה צריכה לשחרר את תכולת הבטן, כולל 2 השחלות מכל תסיסנית פרט. השחלות שלמים להופיע בצורת אליפסה, מבנים לבנים (חיצים באיור 3C ו- D) שראוי ורצוי נשארים צמודים זה לזה באמצעות גבעול oviductal. Ovarioles בכל שחלה צריך להיות מוחזק ביחד על ידי הנדן הסיבי (# ב חלק מוגדל של האיור 3 ג), אשר מוסר bמתגרה זהירה y (חץ עבה באיור 3D; * מה שמעיד על שחלה ללעג עם ovarioles המנותקת) לחשוף את ovarioles מכתים במיקרוסקופ. השחלות שוחררו עם גבעולי oviductal נקרעו במהלך שחרורו של תכולת הבטן יכולות לשמש גם, בתנאי שהם אינם פגומים אחרים. כל השחלות פגומות (* באיור 3C) ואת תכולת בטן אחרת (ראש חץ ב איור 3 ג) אמורות להיות מושלכות.
מיקרוסקופיה חיה של השחלה תסיסנית: הנה, אנחנו מדגימים את הטכניקה FLIP והעמסת צבעים מבניים ותפקודיים המיטוכונדריה השחלות תסיסנית.
טכניקת FLIP, בעבר להחיל להעריך משכיות המיטוכונדריה בתאי הזקיק תסיסנית 9, הודגם כאן בתאי אחות ההשחלות של מהונדס תסיסנית (איור 4 א). FLIP ממוקד אחד העננים המיטוכונדריה קשורים תאי האחות מוביל לאובדן יותר מ -50% של אות הניאון מן ROIs כחול לבן סביב ROI FLIP האדום בתוך 200 שניות (איור 4 ב ו-ג); האות מ ROI הירוק משמשת תיקון ברקע. אות הניאון מן ROI הצהוב בתאי האחות לא הממוקדים האחרים נשארה קבועה במשך פרק זמן זה, מסמל לבן כולל מינימאלי במהלך זמן הניסוי (איור 4 ב ', ו- C). כמו כן, ראה וידאו 1. ממצא זה מעיד כי המיטוכונדריהב אחות התאים התמזגו ממברנות החיצונית והפנימית שלהם, שהודגם על שלבים 3 ו -4 (איור 4 א), תוך המיטוכונדריה בשלבים 1 ו -2 לא צפויים להראות כל הפסד של הקרינה במסגרת הזמן הזה.
זה כבר הוכיח בעבר כי מדד חצי כמותית של פוטנציאל המיטוכונדריה ליחידת מסת המיטוכונדריה ניתן להעריך על ידי שיתוף מכתים עם צבע פוטנציומטרית TMRE ואת כתם המיטוכונדריה הכולל משקף המוני המיטוכונדריה 13. הנה, באותה טכניקה ששימשה כדי להדגים את הערכת הפוטנציאל המיטוכונדריה לכל המוני היחידה רקמת השחלה חי תסיסנית. מיקרוסקופיה Confocal של שחלות תסיסנית חיות מוכתם TMRE מדגימה ירידת אות עם העומק של הרקמה (איור 5 א). הפסד זה של אות ניאון בשל הגדלת פיזור לעומק הרקמה יותר צפויה להתרחש עם כל סוג של fluorophore עם מרחק עבודה נתונה המטרה בשימוש. לכן, חשוב להבחין בעומק המקסימאלי של הרקמות שבתוכה fluorophore יכול להתגלות במהלך הדמית רקמת חיים. לדוגמה, לחיות השחלות תסיסנית מוכתם בכתם המיטוכונדריה הכוללת (Mito) ניתן הדמיה באמצעות הגדרת מיקרוסקופ תיאר (טבלה 1) בטווח של 20 מיקרומטר מן coverslip, ואילו עומק imageable מקסימלית יורדת עם הגדלת גודל תא הביצה (איור 5B). הגדרות מיקרוסקופ מותאם במיוחד הכתמים המיטוכונדריה לזהות אותות חיוביים ערוצי גילוי הולם, בעוד הגדרות לבחון כל אות מיותרת צולבות לדבר או fluorophore-עירור צלב זוהה כצפוי מינימלי או אין אות (איור 6 א). Co-מכתים של TMRE עם הכתם המיטוכונדריה הכולל יכול לשמש הן איכותי (איור 6) וכמותי (איור 6 ג ו-ד </ strong>) ערכות של פוטנציאל המיטוכונדריה לכל המוני יחידה בשחלות תסיסנית חיות. לדוגמא, א) ניתוח איכותני מוכיח כי germarium תסיסנית מפגין פוטנציאל המיטוכונדריה גבוה יותר לכל המוני יחידת 2b לשלב שבו תאי זקיק סומטיים שהתעוררו כדי לתמצת את תאי germline (ראשי חץ ב 6B איור) ו- B) וכמותיות ניתוחים להפגין פרש פוטנציאלים המיטוכונדריה לכל המוני יחידה בין (מתיחה) AFCs ואת MBCs, כפי שנותח מתוך תא ביצה בשלב 9 (איור 6 ג). ראוי לציין, כי כימות שבוצעו מ 2 פרוסות אופטיות שונות עבור AFCs ו MBCs, תלוי מטוסם של מוקד. השימוש של חללית Mito-ROS כי שמש בהצלחה תסיסנית 14 מודגם חיות שכבות תאי זקיק בשחלה תסיסנית אפיתל, שם שיבוטי null פונקציונליים של חלבון ביקוע המיטוכונדריה Drp1were הציגו. רוב, but לא כולם, של שיבוטי תא זקיק null GFP שלילי חי Drp1 להפגין מכתים גבוה עבור Mito-ROS (איור 7 א 'וב'). שים לב כי למרות אות המיטוכונדריה ברורה לא ניתן הייתה לזהות רקמה זו, ריכוז כתם Mito-ROS ניתן היה לזהות באזור הגרעיני תאי הזקיק שלאחר mitotic המתקדמים, שהם גדולים משמעותיים מאשר תאי זקיק mitotic (* באיור 7C). זו עלולה להתרחש בשל האינטראקציה של DNA הגרעין מוצר חמצון הניאון של צבע Mito-ROS, שהוא נגזר של ethidium 15.
איתור של המיטוכונדריה Cyclin E בתאי הזקיק בשחלה תסיסנית קבוע: הוכח לאחרונה כי המיטוכונדריה יכול לווסת את מולקולת מחזור התא Cyclin E ידי גיוס אותה אל פני השטח המיטוכונדריה בתאי יונקים ואת שכבת התאים זקיק תסיסנית
page = "1"> 
פיתוח באיור 1. של צ'יימברס הביצה תסיסנית. קריקטורה מתארת ovariole תסיסנית מורכב משרשר של תאי ביצה מתפתחים, כל אחד מורכב ביצית ותאי האחות (germline) הכמוסים על ידי שכבת תאי זקיק (סומטי). תאי הביצה לפתח מן germarium ולפתח דרך שלבים שבו תאי זקיק mitotic להיות-mitotic פוסט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תכנית ניסויית כנה. (א) כלים המשמשים השיטות שתוארו: בקבוקון טוס א; ב חרקים לנתח בינוני; ג Paraformaldehyde; ד טוס מברשת; א ביתור צלחת; פ כיסוי זכוכית; צינור ג microfuge. ח זכוכית בעל תחתית צלחת; I. זכוכית שקופית; ג'יי 1,000 μL micropipette; ק 200 μL micropipette; ל 2.5-μL micropipette; מ מתגרה מחט עם קצה מכופף (טיפ מוגדל); מלקחיים עבים נ; מלקחיים רזים O.. (ב) תזרים סכמטי בתרשים המייצג את השיטות שתוארו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Dissection של השחלות תסיסנית. (א) הרדים שלם תסיסנית. (ב) ניתק תסיסנית הבטן עם או בלי (*) את תכולת הבטן. (C) שנה תסיסנית תכולת הבטן, כולל השחלות (חצים *) ותכנים אחרים(ראשי חץ); גדלה של האזור התאגרף מימין המדגיש את הקדמי (נמלה) ואת אחורי (פוסט) מסתיימת של זוג השחלות שבידי גבעול oviductal, שבו ovarioles מוחזק בידי הנדן הסיבי (#). (ד) השחלה תסיסנית הקניט (חץ עבה סימון הקניטה כראוי * סימון ללעג) בהשוואה השחלה unteased (חץ דק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Assay FLIP Live-רקמה. (א) סכמטי המייצג מדרגות ביקוע המיטוכונדריה / היתוך, אשר ניתן assayed ידי assay המשכיות המיטוכונדריה המתאים בשיטת FLIP; במקרה זה, בדיקת Mito-YFP במטריצה המיטוכונדריה מאפשרת assessmאף אוזן גרון של משכיות מטריקס המיטוכונדריה. (ב) זמן לשגות לשעבר מיקרוסקופיה vivo של תא הביצה תסיסנית מהונדס חי להביע Mito-YFP; רק מועדים לפי שעון בחר (t) מוצגים. ראה וידאו 1 עבור כל נקודות הזמן. (C) כימות של אות ניאון מן ROIs בהתאמה בצבע (ב ') באים לידי ביטוי לאחר תיקון רקע ונורמליזציה. ראשי החץ להצביע על נקודות זמן photobleaching reiterative, בעוד מרווח הזמן בין שני אירועי הלבנה רצופים הוא זמן ההחלמה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. התמונות נרכשו עם הפרמטרים מתוארים בטבלת 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. המיטוכונדריה חיl מכתים מיקרוסקופי של תסיסנית Ovariole. (א) פרוסות אופטי הפרט של ovariole תסיסנית חי מוכתם TMRE; התמונה נרכשה עם הפרמטרים מתוארים בטבלת 1. Z מציין את המרחק בין coverslip ב מיקרומטר. (ב) תסיסנית חייה טיעון ovariole עם כתם המיטוכונדריה הכולל (Mito). תמונת XZ של הקו האדום בתמונת XY מוצגת, שבו B הוא התחתון ו- T הוא חלק העליון של התמונה הנרכשת. המרחק מהחלק התחתון של הקו הכחול הוא 20 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. תמונות confocal נרכשו עם הפרמטרים מתוארים בטבלת 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Figure 6. Co-מכתים של חיים תסיסנית Ovarioles עם TMRE ואת הכתם מיטוכונדריאלי בסך הכל. (א) פרוסה אופטית יחידה של תסיסנית ovariole חי שיתוף מוכתם TMRE ואת כתם המיטוכונדריה הכולל (Mito); * מציין חפץ ניסיוני כמתואר בסעיף הדיון. (ב) היטל מרבי בעוצמה של 3 פרוסות אופטי ברציפות של germarium ב (א); ראשי חץ מציינים את האזור בו נמצא קרינת TMRE היא גדלה. (C) פרוסה אופטית יחידה של תא ביצה שלאחר mitotic שיתוף מוכתם TMRE ואת כתם המיטוכונדריה הכוללת. הפנלים העליונים ותחתונים להראות המטוס של מוקד AFCs ו MBCs, בהתאמה. (ד) העלילה Box מראה עוצמת פלורסנט הממוצע של TMRE ואת הכתם המיטוכונדריה הכולל לכמת מ AFCs ו MBCs בודדים האזורים התאגרף ב (ג). הזיפים של עלילת התיבה לציין את ערכי מינימום ומקסימום עבור כל קבוצה, למעט החריגים.
איור 7. מכתים שידורים חיים Drp1 Null פסיפס תסיסנית Ovarioles עם צבע Mito-ROS. (א) פרוסה אופטית יחידה של ovarioles מוכתם לצבוע Mito-ROS. (ב) היטל מרבי בעצמה של 2 פרוסות אופטיות ברציפות של תא ביצת פרט עם תאי זקיק ב Mitoבשלב טיק מוכתם לצבוע Mito-ROS. (C) פרוסה אופטית יחידה של תא ביצת פרט עם תאי זקיק בשלב שלאחר mitotic מוכתם לצבוע Mito-ROS; * מציין אות גרעינית. חוסר UbiGFP מסמן את שיבוטי null Drp1. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. תמונות confocal נרכשו עם הפרמטרים מתוארים בטבלת 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8. Co-immunostaining של קבוע Drp1 Null פסיפס תסיסנית Ovarioles עם dCyclinE ונוגדנים ATP-B. (א) היטל מרבי בעוצמה של 3 פרוסות אופטי ברציפות של germarium שיתוף immunostained. (ב) היטל מרבי בעוצמה של 3 פרוסות אופטי ברציפות של immunos שיתוףמזרקת MBCs שלאחר mitotic. קווי המתאר לתחום את שיבוטי null Drp1 UbiGFP שליליים. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. תמונות confocal נרכשו עם הפרמטרים מתוארים בטבלת 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9. דוגמאות נזק וממצאים פוטנציאליים. (א) Germarium של UbiGFP להביע ovariole קבוע מוכתם לצבוע DNA Hoechst מראה פערים מופרזים (*). (ב) תא ביצת UbiGFP להביע ovariole קבוע מוכתם לצבוע DNA Hoechst מראה ניקס / דמעות (*). (C) גר ovariole עם UbiGFP שלילי שיבוטי null Drp1 מוכתמים לצבוע Mito-ROS מראה תא מעוות (*) וכן תא ביצה פגום, המאפשר חלק הכתמה של germline (**); # מציין כתם ואולי אמיתי של תא ביצת ניזוק באותו ovariole. (ד) גר מוכתם ovariole עם מיטו-ROS לצבוע מראה תא פגום הכולל עם מכתים artifactual אינטנסיבי של germline. * מציין נזק הנגרם בברוטליות ovarioles עם הפסד של האות UbiGFP, ובכך והוליד שיבוטים GFP שלילי artifactual. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. תמונות confocal נרכשו עם הפרמטרים מתוארים בטבלת 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
וידאו 1. Assay FLIP Live-רקמה. הקורס במשרה המלא של assay FLIP מבוסס photobleaching כמתואר באיור 5..com / קבצים / ftp_upload / 54,989 / Video1.avi "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
טבלה 1: הגדרות Confocal מיקרוסקופ עבור רכישת תמונות נציג מוצג. אנא לחץ כאן על מנת לצפות בטבלת 1. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
Photobleaching: מניעת photobleaching מופרזת של דגימות ניאון הוא הכרחי כדי ביצוע מיקרוסקופיה confocal יעיל. לכן, הזמן שלוקח לאתר דגימות דרך העינית או להגדיר פרמטרים רכישת התמונה דרך במצב סריקה בזמן אמת צריך להיות ממוזער כדי למזער photobleaching.
נזק לרקמות: מאז המיטוכונדריה נחשבים החיישנים של בריאות הסלולר, חשוב מאוד על מנת להבטיח כי הנתונים שהושגו באמצעות השיטות שתוארו רלוונטיות פיזיולוגית ואינן משקפות את הנזק שנגרם על ידי מופרזת לנתיחה פרוצדורליים של השחלות תסיסנית. דיסקציה צריכה להתבצע במהירות האפשרית, אלא גם עם אמצעי זהירות קיצוניים על מנת למזער את הנזק לרקמות. הזמן הממוצע עבור לנתיחה מתגרה 5 השחלות תסיסנית הוא 5 עד 7 דקות (ביד שלנוים). מאמץ יש לנקוט כדי לזהות תאי ביצה מראים רקמה פגועה תיכלל הניתוחים. ניזק לרקמות עקב דיסקציה עשוי לכלול פערים מופרזים (* באיור 9A, כפי שהוגדר על ידי חוסר האות), ניקס / דמעות (* באיור 9B, כפי שהוגדר על ידי חוסר האות), או עיוות של תאי הביצה (* באיור ג 9). עם זאת, כל עיוות קאמרית משמעותית נובע המניפולציה הניסויית יש להעריך בזהירות. למרות שלא coverslip משמש על גבי רקמת חיים בפרוטוקול תיאר, השטחת ovarioles עלולה להתרחש עם לחץ מיותר להחיל את הרקמה תוך מתגרה או הרכבה (* באיור 9D). השטחת ovarioles לא נצפתה עם דגימות קבועות, מאז הפרוטוקול המתואר כרוכה קביעת רקמות מייד לאחר דיסקציה, עם מתגרה המתרחשת לאחר מכן. כל תא הביצה מבודד ללא כל חתימות של aforementioneנזק D עשוי להיחשב נורמלית. נזק מכני פוטנציאל הנובע לנתיחה עשוי גם להוביל לאובדן של ה- GFP, מניב 16 שיבוטים GFP-שלילי כוזב, וגם יכול להצמיח ההתאגדות לצבוע משופרת. בהתחשב בכך תאי germline מתגוררים במבנה תאי הביצה אינם בדרך כלל חדירים צבעי המיטוכונדריה החיים (איורי 6 ו -7), מכתים המיטוכונדריה המשופר של תאי germline תסיסנית לנבוע מגידול החדיר של רקמות הפגועות / גוסס; פריט אמנות שימושית כזו מתרחשת עם צבע Mito-ROS (** באיור 9 ג 'ovariole כולו באיור 9D), כמו גם עם כתמים המיטוכונדריה חיים אחרים (לא מוצג). ההפסד של UbiGFP באיור 9D (*) יכול גם לנבוע נזק שגרם השטחת תאי ביצה. למרות תאי ביצה אחרים ovariole הניזוק יוכל להישאר אותנטיים חפצים free (# באיור 9 ג
רגישות זמן: במקרה של חי vivo לשעבר מיקרוסקופיה, את צריכים להתקבל הנתונים תוך 15 דקות של הרכבת רקמות; אחרת, עלולות להיפגע את תוצאות הניסוי על ידי שינויים של פיזיולוגיה עקב הפטירה שהתפתחה של הרקמה. לפעמים, תלוי כוח הליזר ופרמטרי סריקה אחרים, 10 μL של מדיום גובר עלולים להתאדות במוקדם מ -15 דקות. הגילוי של הבריכה Cyclin E המיטוכונדריה ידי שיתוף immunostaining דורש צמצום זמן דיסקציה (כנראה עקב אופיו הזמני של mitochondריאל Cyclin E ברכה שמתוחזק על ידי נשימה המיטוכונדריאלי פעילה 12). בריכת ניכר המיטוכונדריה Cyclin E היה גם לא ציין עם פעמים permeabilization פחות מ -30 דקות.
FLIP: התנועה של כל תא ביצה בבחינה במהלך זמן FLIP עלולה להוביל ניתוחי artifactual וכך צריך להיות מורחק. השימוש בכל צבעי המיטוכונדריה חיים או TMRE אינו מומלץ בניסוי FLIP, מאז התאגדות של צבע הזרים עלולה לשנות את רצף המיטוכונדריה ובכך להוביל לתוצאות artifactual.
מעבר אסטרטגיה תסיסנית: ההופכי צלב לזו מתוארת כאן (כשגברים נושאים את אלל מוטנטי Drp1 משמשים) לא להיכנע צאצאים רבים, כנראה עקב השפעה לא מזוהית של דיכוי Drp1 אצל הורי זכר הטרוזיגוטיים.
פרשנות של נתונים משובטים: כל שיבוטי GF-שלילי זוהו בשחלות המלאות מבודדת מן תסיסנית ההורים להביע UbiGFP יצביע שיבוטים false-negative artifactual, שנוצר כנראה עקב אובדן GFP שנגרם נזק במהלך הניתוח 16. עם זאת, מספר שיבוטים GFP-שלילי הצאצאים בהלם חום של הצלב צריך להיות גבוה משמעותית מאשר כל שיבוטים false-negative לראות בבקרה. המשובטים שנוצרו בשכבת תאי זקיק תסיסנית ידי האסטרטגיה רקומבינציה מבוסס mitotic המתואר יכולים לנבוע בתאי גזע זקיק mitotic (גזע שיבוטי תא) או מתאי זקיק mitotic שאינו הגזע (השיבוטים חולפים). עבור שיבוטי תא גזע, ניתוחי הניסוי צריכים להתבצע רק 10 ימים אחרי ההלם החום, כאשר תאי הביצה עם השיבוטים החולפים כבר הונחו. עבור שיבוטים חולפים, הניתוחים צריכים להתבצע בתוך 6 ימים לאחר הלם החום, עם שיבוטי תא זקיק של ovarioles ללא כל שיבוט תאי זקיק ב germarium.
s = "jove_content"> שינויים ופתרון בעיות
תוך הערכת פוטנציאל המיטוכונדריה לכל המוני יחידה באמצעות השיטה המתוארת, אחד צריך להיות מודע של חפצים פוטנציאליים הנובעים אופטיקה מיקרוסקופ או שילובי צבע המיטוכונדריה. בכל אזור מראה אות מוחלשת מכתם המיטוכונדריה הכולל אות TMRE גבוהה יחסית (איור 5 א, *) שעלול להתעורר עקב העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) בין הצבעים 8 או בשל תכונות אופטיות שונות של אדום (TMRE) וירוק (צבע המיטוכונדריה הכוללת) אורות ניאון, בהתחשב בגודל חריר קבוע התקנת הרכישה. את החפץ הקשורות סריג יכול להימנע על ידי הפחתת ריכוזי צבע, במידת האפשר, תוך ניתוחים כמותיים יכול להתבצע על תחזיות של 2 - 3 פרוסות אופטי ברציפות כדי למנוע את החפץ אופטי. כמו כן, אם אות ניאון מזוהה crosstalk ו-עירור צלבערוצים, הגדרות ליזר גלאי חייבות להיות וסדרה כדי למזער את האות בערוצים אלה, אשר צפוי להפחית את אות הניאון בערוצים האופטימליים גם כן.
לייזר-induced פגום מן photobleaching reiterative עלול לגרום לפיצול המיטוכונדריה ובכך לגרום רציפות המיטוכונדריה, מניעת FLIP מוצלח. פיצול של המיטוכונדריה חשוד במהלך ביצוע פרוטוקול FLIP ניתן לזהות באמצעות רכישת תמונות ברזולוציה גבוהה עם חריר מופחת (ושיפור ברווח הגלאי). אם הפיצול של המיטוכונדריה הוא הבחין בעליל במהלך ביצוע פרוטוקול FLIP, את העוצמה של הלייזר הלבנה חייב להיות מופחת ו / או המרווח בין מלבינים ברציפות חייב להיות מוגברת. אם יש לבנה הכוללת במהלך זמן ניסוי FLIP (האות מ ROI הצהוב באיור 3 ב ו- C), ליזר הסריקה חייב להיות וסדרה לרמההמאפשר מינימלית, אם בכלל photobleaching הכולל.
כדי למנוע את החפץ פוטנציאל עקב אובדן-induced נזק של GFP, שיבוטים GFP חיובי יכול להיות מוצג באמצעות אסטרטגיה MARCM, בעקבות פרוטוקול חום הלם תיאר. הנה, תסיסנית המתאימה לשמש הצלב הוא הנקבה בתולת drpKG03815 FRT40A / ארגון הנוער הקתולי X זכר Gal80 FRT 40A / ארגון נוער קתולי; גיגית-Gal4, כטב"מ-CD8GFP / TM6 9. הצאצאים ישר-כנף אמורים לשמש עבור דור שיבוט באמצעות הלם חום (כפי שמתוארים בשלב 6).
מגבלות של הטכניקה
א) בעוד תאי הזקיק המתגוררים על פני השטח של תאי הביצה תסיסנית לחיות לשלב צבעי מכתים המיטוכונדריה, תאי germline בתוך תא הביצה יצליחו לעשות זאת; germline של שלבי הצעיר להכתים חלש (איורים 5, 6). ב) חי vivo לשעבר tissuמיקרוסקופיה דואר חייבת להתבצע בתוך 15 דקות של ההשלמה מכתים על השחלות מבודדות תסיסנית בודד, אחד בכל פעם. מאז קבוצות ניסוי צריכות להיות מעובד צלמו באותו היום, את הסך כל הזמן לנקוט כדי להשיג נתונים בעלי משמעות סטטיסטית מ חייתי מיקרוסקופיה vivo לשעבר רקמות מקבוצות ניסוי שונות הוא סביר יותר מאלו שהושגו מרקמות קבועות. ג) ציינו כי הכתם Mito-ROS לא היה יציב מאוד ברקמות תסיסנית vivo לשעבר, כנראה עקב אופיו הזמני של ROS אנליטי הוא מזהה 17,15, אשר עשוי ביסוד חוסר זיהוי של אות מכל Drp1 שיבוטים null. עם זאת, כל הרלוונטיות ביולוגיות של ההשתנות מכתימות Mito-ROS בתאי null Drp1 / שיבוטים לא ניתן לשלול וצריכים לבחון אותה. ראוי לציין, כי האיתות חיוב מכתם Mito-ROS עשויה לא רק לשקף דיסמוטאז משופר אלא גם את המיטוכונדריה המשופרת או Cellulסביבת חמצוני ar 15. ד) כתם המיטוכונדריה הכולל לא יכול לשמש עבור הניסויים המשובטים GFP השלילי או GFP החיובי, שכן קשת הניאון של כתם המיטוכונדריה זה GFP הם נבדלים. E) ניסוי FLIP נועד assay משכיות מטריקס המיטוכונדריה תדרוש רכישת תמונה עם חריר פתוח שמקיף את הרזולוציה של המבנים המיטוכונדריה.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות אלטרנטיביות
בחינת קשר מבנה-תפקוד המיטוכונדריה היא קריטית עבור הבנה מעמיקה של מנגנוני הוויסות של פונקציונליות המיטוכונדריה. בגלל פגמים המיטוכונדריה לתרום משמעותית למחלות שונות, כולל סוכרת, סרטן מחלת פרקינסון, הבנה מפורטת של המודוס אופרנדי המיטוכונדריה ולפוטנציאל שלו facilitating הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות מכוון במיטוכונדריה. מיקרוסקופיה Live- תא היא כלי הכרחי ללימוד יחסי מבנה-תפקוד המיטוכונדריה. עם זאת, רוב המחקרים הללו כבר מוגבלים תאים מבודדים. המחקר של מבנה המיטוכונדריה ותפקוד הוארך לחיות רקמות לתסיסנית התקנה vivo לשעבר 9. הפרוטוקול המתואר מחקרים זה וצדדים קשורים יוביל להבנה של מבנה המיטוכונדריה ותפקוד שחלות תסיסנית חיות, vivo לשעבר, המאפשר הבנה של המיטוכונדריה בהקשר פיסיולוגי. יש גישה לשעבר vivo זה יתרונות משמעותיים על פני מחקרים במבחנה, מאז הסדרת מטבולית והמאפיינים אנרגטיים של המיטוכונדריה בתא נתון היא תלויה במידה רבה על זמינות המזין והאיתות מתאימה בהקשר הפיזיולוגי של התאים.
מניפולציה גנטית של מילמבנה tochondrial ידי הדחקת Drp1 חלבון ביקוע המיטוכונדריה deregulates אפנן תא מחזור Cyclin E ומשפיע על התפתחות שכבת התאים זקיק תסיסנית השחלות 9,12. כאן, הפרוטוקול כולל תיאור של איך להציג שיבוטים תפקודיים null של Drp1 בשחלות תסיסנית כדי ללמוד את קשר מבנה הפונקציה המיטוכונדריה. ברכת רומן של המיטוכונדריה Cyclin E על בתאי יונקים, כמו גם את שכבת תאי זקיק תסיסנית 12, זוהתה בהצלחה, אשר סביר בבסיס תקנת Cyclin E דיווחה על ידי במיטוכונדריה גיל 18. הנה, את כתב היד מדגימה שיטה לאיתור ברכת Cyclin E המיטוכונדריה רומן מאת שחלות תסיסנית קבועות שיתוף immunostaining עבור dCyclinE ועם סמן המיטוכונדריה (ATP-B).
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו
בהתחשב tכובע תסיסנית הוא מערכת מודל גנטי חזק, השיטות שתוארו שלנו צפויים לתרום משמעותית להבנת הבסיס הגנטי של הקשר מבנה פונקציה המיטוכונדריה בבריאות ובחולי. תסיסנית כבר בשימוש נרחב כדי להקניט את האינטראקציות הגנטיות מובילות tumorigenesis 19. היכולת של הדור של שיבוטים בשכבת תאי זקיק תסיסנית אפיתל מאפשרת הלימוד של האינטראקציה של מיטוכונדריה אונקוגנים או מדכאי גידולי שיבוטי tumorigenic נפרדים in vivo והתקנת vivo לשעבר. השיטות שתוארו ניתן להשתמש כדי ללמוד את הסדרת יחסי מבנה-תפקוד המיטוכונדריה על השחלות מבודדות תסיסנית מוטציה מתאימה. השיטות שתוארו ניתן להאריך עוד יותר ללמוד את ההשפעה הישירה של גורם מזין וצמיחה שונה מאותת מבנה המיטוכונדריה ותפקוד דרך exogבנוסף enous של חומרים מזינים המתאימים ו / או גורמי גדילה במדיום הדמית vivo לשעבר. השיטות שתוארו ניתן לשנות כראוי והעסיק ברקמות תסיסנית מבודדים אחרים, כמו דיסקים דמותי הזחל, אשר היו בשימוש נרחב ללמוד מסלולי העברת אותות במחלות כמו סרטן 20,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
