Introduction
분화 된 세포들은 에너지 생산의 주요 시트이기 때문에 미토콘드리아 고전 셀룰러 최강으로 설명한다. 또한, 미토콘드리아 대사 발열 지질 변형, 칼슘 환원 항상성에 중요한 역할 셀 시그널링 프로세스 편성 등 일을 담당한다. 미토콘드리아는 활성 세포 사멸이 유도의 역할뿐만 아니라, 세포주기 조절 3을한다. 이러한 멀티 기능은 다음과 같은 근본적인 질문을 제기한다 : a) 방법 미토콘드리아 동시에 모든 기능을 수행하고 독특한 기능에 전문화되어 특정 미토콘드리아 풀 또는 서브 존의 b)가 무엇입니까? 이러한 맥락에서, 상기 다기능 미토콘드리아 개별 셀 내에서의 형상, 크기 및 구조를 동적 있음과 미토콘드리아의 정상 모양 세포 유형에 따라 다를 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 여러 실험실에서 연구의 수십 년oratories는 미토콘드리아의 모양, 크기, 구조, 총칭 미토콘드리아 역학의 변화는 다양한 미토콘드리아 기능 4,5,6을 유지하기위한 중요하는 것이 좋습니다. 이러한 연구 결과는 미토콘드리아가 구조적 역 동성 덕분에 자신의 멀티 기능을 수행 할 수있는 가능성을 올립니다.
광범위한 노력은 미토콘드리아의 구조 - 기능 관계를 이해하기 진행되고있다. 미토콘드리아 구조의 동력은 주로 서로 분열 및 융합 이벤트를 받아야하는 능력에 의해 유지된다. 두 개의 작은 미토콘드리아 사이의 융합이 큰 미토콘드리아 요소 (7)로 병합하는 동안 큰 미토콘드리아의 분열은 작은 미토콘드리아 요소로 변환합니다. 또한,이 미토콘드리아의 과도 융합은 그 내용의 혼합을 허용하도록 발생할 수 있습니다. 내부 및 외부 미토콘드리아 막의 분열 및 융합 이벤트는 조심스럽게 사양이 적용됩니다IFIC는 단백질로 설정합니다. 핵심 분열 기계는 Drp1 기능도에 의해 조절 될 수있는 반면, 어떤 선의의 미토콘드리아 단백질 (예를 들어, Fis1 또는 Mff1)과의 상호 작용에 의해 미토콘드리아에 세포질에서 모집한다 dynamin 관련 단백질 1 (Drp1)로 구성되어있다 미토콘드리아면 (4)에 다른 단백질. Drp1은 외막에서 작동되지만, 그 분열 능력뿐만 아니라 내막 영향을 미친다. 외부 및 내부 미토콘드리아 막의 분열의 오케스트레이션은 잘 이해되지 않습니다. mitofusins는 외부 막 (5)의 융합을 제어하면서 한편, 내막의 융합은 OPA1의 활동에 의해 코어에 적용된다. 미토콘드리아의 반작용 핵분열 융합 이벤트의 균형은 셀의 정상 미토콘드리아 형상을 지시. 예를 들어, 미토콘드리아 분열의 억압은 완전하고 반대가 융합 될 것이다 미토콘드리아의 이상 활동하면서리터의 분열은 미토콘드리아 3의 분열을 초래할 것입니다.
미토콘드리아 구조 - 기능 관계의 연구는 주로 무료 두 접근법을 포함한다 : a) 미토콘드리아 분열 / 융합 단백질의 유전자 조작 후에 세포 및 생명체의 표현형 분석 b) 미토콘드리아의 구조와 기능을 직접 평가. 이 표현형은 차 효과로 인해 발생할 수있는 유전 적 분석은 항상 (이 경우, 미토콘드리아 분열 / 융합 단백질)의 손에서 분자의 직접적인 기능을 표시하지 않을 수 있음은 주목할 만하다. 따라서, 개발 및 직접 미토콘드리아 구조 및 기능을 연구하기위한 도구를 사용하는 것은 아주 중요하다. 미토콘드리아 구조의 상관 평가 현미경 각종 도구를 포함한다. 미토콘드리아 동성이 양 성적 및 quantitat 모니터링 할 수 있기 때문에 생균의 형광 현미경의 사용은 크게 미토콘드리아 역학 연구를 진행했다적절한 형광 현미경 툴과 기술을 사용하여 8 ively. 형광 현미경 기반 도구 생체 9 미토콘드리아 동력의 중요성을 해명 라이브 고정 초파리 조직에서 미토콘드리아의 구조 및 기능을 연구하기 위해 개발되었다. 이들 및 관련 방법은 초파리의 난소에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 목표로, 여기에 설명되어 있습니다.
초파리의 난소는 germarium 10, 11에있는 각각의 성체 줄기 세포에서 발생하는 생식 세포와 체세포 계보로 구성되어 있습니다. 여섯 포체 배아 세포 GCS ()는 germarium (도 1)로부터 나오는 개별 계란 챔버를 형성하는 체세포 여포 세포 (FCS)에 의해 캡슐화 얻는다. 16 GC를 하나의 난자되고 커밋 얻고, 나머지 15은 GC를 난자 챔버의 성장을 지원 간호사 세포로 발달,이 마련되기 전에 난자의 성숙을 촉진. 그들은 말단 전방 여포 세포 (AFCS) 후방 여포 세포 (PFC를) 및 본체 세포 구성된 패터닝 상피 세포층으로 분화하는 유사 분열 세포주기를 종료하기 전에 FCS의 대부분은 유사 분열의 분할 9 원을 겪는다 (MBCS) . 연속 달걀 챔버는 초기 개발에서의 FC에서 파생 된 세포를 분화 줄기 세포에 의해 연결되어있다. 미토콘드리아 분열 단백질 Drp1 의해 조절 미토콘드리아 형상 적극적 초파리 난소 FC 층 9,12- 정상적인 발달 동안 분화 과정에 관여한다. 초파리 여포 세포층 개발 Drp1의 관련을 식별하기 위해이 연구에서 사용되는 방법이 여기에 설명된다.
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Protocol
초파리의 1. 준비 (그림 2A에 묘사되어 필요한 도구)
- 설명 실험의 경우, 초파리를 수집 우화 5 일 이내 (상온, 25 ºC로 유지), 5로 채워진 유리 병에 배치 - 더 이상 25 이상으로, 7 mL의 초파리의 음식 (재료 표 참조) 각 유리 병에 파리; 이 남성 비율 : 여성을 유지 하나.
- 초파리 산란율을 자극하는 과립 효모 소량 뿌린다. 4 일 - (2) 내에 실험 조작을 수행합니다.
초파리의 난소 2. 해부 (그림 2A에 묘사되어 필요한 도구)
- 따뜻한 곤충 해부 매체, 실내 온도 25 ° C를 (재료 표 참조). 여덟 잘 유리 해부 요리의 세 개의 우물을 작성, 각 매체의 200 μL 잘.
- CO와 초파리를 마취
- 해부 현미경의 접안 렌즈를 통해보고 있지만, 포셉 두 쌍을 사용하여 복부에서 가슴을 절단. 집게를 사용하여 조심스럽게 접시의 제 2 웰에 복부를 전송합니다.
- 포셉의 다른 쌍 (다른 복부 내용과 함께) 난소를 밀어 천천히 후방 끝의 복부를 개최 포셉 한 쌍을 사용합니다. 이 시도가 실패 할 경우,주의 깊게 난소를 해제 앞쪽 끝 부분에 집게를 삽입하여 복부 외골격을 제거합니다.
- 집게를 사용하면 (즉, 노른자 가득, 늦게 단계 계란), 불투명 후방 말까지 개별 난소를 잡고 접시의 세 번째 우물을주의 깊게 이동라이브 현미경 (3 단계)을 위해 그것을 처리하기 위해 괴롭 히고 또는 면역 염색 (7 단계)를 수행하기 위해 고정.
- 조심스럽게 포셉 한 쌍의 후방 끝을 잡고있는 동안 각 난소의 앞쪽 끝으로 후방에서 가볍게 놀리는 바늘을 청소하여 난소 주위에서 보호 덮개를 애타게.
참고 : 놀리는 동안 피해를 최소화 바늘 끝을 구부려 현미경 (그림 2A)의 배율을 증가시켜 각각의 난소를 확대합니다. 놀림은 시스 중단 할 정도로 효과적이어야하지만, 또한 신중 ovarioles의 무결성을 유지하기 위해 수행되어야한다.
라이브 조직 현미경 3. 준비
참고 : 그림 2A에 묘사되어 필요한 도구를 제공합니다.
- 초파리 해부하기 전에 polyL - 라이신 코팅 챔버를 준비합니다. 이를 위해, covergl에 polyL 리진 (0.1 ㎎ / ㎖)을 20 μL 두 방울을 배치엉덩이 방울의 병합을 방지하기 위하여 서로로부터 적당한 거리에 바닥이 유리 페트리 접시 (35mm)의 (14mm, 0 번). 37 ºC에서 1 시간 동안 플레이트를 공기 - 건조 소거 마커 플레이트의 밑면에 흰색 polyL 라이신 막의 가장자리를 표시한다.
참고 : polyL - 라이신 코팅 챔버는 일주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이전 코팅 챔버를 사용하는 경우, 초파리 절개를 시작하기 전에 실온으로 가져. - 샘플은 다음과 같이, 해부 및 장착 완료 후 즉시 이미징 될 수 있는지 확인하기 위해 공 초점 현미경 스캐닝 매개 변수를 설정합니다.
- 하나의 해부 및 난소 조롱 (다음 2 단계와 5 단계에 따라 필요한 경우, 염색)을 표시 polyL - 라이신 코팅 된 지역에 배치하고 ovarioles를 분리하기 위해 놀리는 바늘로 난소를 확산. t을 포함해야하고, 난소의 상단에 곤충 해부 매체의 10 μL 드롭 배치그 전체 영역 polyL 라이신 코팅. 페트리 접시를 커버.
- 즉시 실온에서 장착 시료의 공 초점 현미경을 수행한다.
주 : 하나 초파리는 절개 가공하고, 동시에 촬상한다. 또한, 현미경은 초파리 조직에 대한 열 쇼크 환경을 모방 한 것이다 37 ℃에서 수행 될 것이다.
광표백 (FLIP) 분석 4. 형광 손실 미토콘드리아 매트릭스의 연속성을 평가하는
참고 : 융합 미토콘드리아 구조 미토콘드리아 매트릭스 연속성 중간 단계를 통해 진행을 다음과 미토콘드리아 내부 및 외부 세포막의 완전한 융합 후 설정됩니다. 미토콘드리아의 분열은 동일한 단계를 수행하지만, 반대 방향으로 (그림 3A) 할 수 있습니다. FLIP는 미토콘드리아 매트릭스 연속성을 평가하기 위해 사용될 수있는 타임 랩스 현미경 계 반 정량 방법라이브 초파리의 난소 9 생체 미토콘드리아의 최종 용융 상태 (그림 3a에 3, 4 단계). 플립 분석은 일정한 간격 (그림 3A에서 플립 ROI)에 광 퇴색되는 미토콘드리아 매트릭스에서 형광 분자를 발현하는 미토콘드리아의 관심 (ROI)의 작은 영역으로 수행된다. 그 결과, (그림 3A에서 실험 ROI) 플립 ROI 연속 어떤 주변 미토콘드리아 영역으로 인해 연속 미토콘드리아 매트릭스 분자의 교환에 신호를 잃게됩니다. 여기에 보여 플립 실험은 자유롭게 확산 형태로 미토콘드리아 매트릭스를 대상으로 YFP 태그 인간 시토크롬 산화 효소 VIII 서브 유닛의 미토콘드리아 타겟팅 시퀀스를 포함 mitoYFP를 발현하는 형질 전환 초파리에서 수행됩니다. 이전에보고 된 유사한 실험은 또한, 미토 pUASP 미토-GFP 형질 전환 유전자로 수행 될 수있다 <SUP> 9. 유사한 FLIP 프로토콜은 외부의 융합에 기인하는 도통을 감지 할 수 있도록 미토콘드리아 층간 막 공간 표적 프로브로 이용 될 수 있지만,하지 내부 미토콘드리아 막 (도 3a의 단계 2).이
- 공 초점 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 열고 "취득"탭 (표 1)에서 적절한 검색 매개 변수를 설정합니다. 각각의 탭을 열고 "시간 시리즈", "표백"및 "지역"확인란을 선택합니다. 각 탭 (표 1)에 해당하는 획득 매개 변수 값을 넣는다.
참고 :이 실험은 개별 셀의 전체 미토콘드리아 인구에서 전체 신호를 모니터하도록 설계로 핀홀이 개방되어야한다. - 신속하게 장착 살아있는 조직에서 관심있는 분야를 찾기 위해 접안 렌즈를 사용합니다.
참고 : 잘 유리 bottome에 확산되는 ovarioles를 선택D 요리, 이후 공 초점 현미경 부동 ovarioles을 수행 할 수 없습니다. - "라이브"를 클릭하여 관심있는 선택한 필드의 라이브 영상을 획득한다. 클릭 라이브 검색을 중지하려면 "중지".
- 필요하다면, 오프셋 값을 조정함으로써 설정 같이 정의 배경 (이하 "범위 표시기"옵션을 선택하면 적색 화소의 유무에 의해 표시된) 상기 검출 된 형광 신호는 포화 수준 이하가되도록 상기 취득 파라미터를 조정한다.
- 라이브 스캔에 의해 획득 된 이미지에 광표백 영역을 구별하기 위해 "지역"탭에서 베 지어 그리기 도구를 사용하여 작은 투자 수익 (ROI)을 그립니다.
참고 : ROI의 크기는 약 20해야 - 셀 내 총 형광 미토콘드리아 신호의 50 %. - 클릭하여 이미지 수집을 수행합니다 "실험을 시작합니다."
- 자료를 참조하십시오 (형광 강도 독점 또는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 정량화표). 반복 표백 대상으로 투자 수익 (ROI)에서 평균 신호 (FLIP)을 기록; 표백은 동일한 셀에서 실시되지 않은 로아 (실험); 보기 같은 분야의 다른 표백 세포에서 투자 수익 (ROI), 실험 기간 (표백) 동안 전체 표백을 평가; 백그라운드 영역 (백그라운드)의 ROI. 다른 로아의 평균 신호로부터 구한 평균 배경 신호를 뺀다. 각 셀에 대한 초기 사전 표백제 신호, 형광 신호를 정규화.
- 플로팅 표준 소프트웨어를 사용하여 정규화 된 데이터를 플롯.
형광 미토콘드리아 염료 5. 라이브 염색
노트 : 정상 상태 미토콘드리아 구조 전위 특별히 생균 및 조직의 미토콘드리아에 통합 염료를 사용하여 평가 될 수있다. 라이브 초파리의 난소는 형광 미토콘드리아와 생체 염색 할 수있다얼룩 (미토 ROS) 생산 미토콘드리아 활성 산소 종을 평가하기 위해, 미토콘드리아를 시각화하고, 단위 질량 당 미토콘드리아 잠재력을 평가. 이것은 미토콘드리아 전위차 염료 테트라 메틸 에틸 에스테르 (TMRE)과 미토콘드리아의 질량을 나타내는 호환 라이브 미토콘드리아 얼룩 공동 염색에 의해 달성 될 수있다 (구체적인 염료 재료 표 참조).
- 최종 작업 농도 매체를 해부 따뜻한 곤충의 얼룩의 주식 희석 : 미토콘드리아 얼룩, 250 nm의; TMRE, 50 nM의; 및 미토 ROS 얼룩, 5 μM.
- 해부 및 2 단계 다음의 난소를 괴롭 히고 후, 해부 접시의 우물에서 특정 염색 액 200 μL에 난소를 놓습니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸서 적절한 상자에 의해 커버되는 접시 10 분 동안이를 부화. containin 3 연속 우물에 집게로 조심스럽게 이동하여 염색 난소을 씻으십시오얼룩없이 g 매체.
- TMRE와 호환 전체 미토콘드리아 얼룩과 공동 염색의 경우, (그 사이의 모든 세척 단계없이) 전체 미토콘드리아 얼룩 즉시 첫 번째 TMRE와 다음 염색 할 수있는 위의 프로토콜을 따르십시오.
- 다음하는 polyL - 라이신 코팅 유리 바닥 접시 다음과 같은 3 단계의 난소를 탑재하고 적절한 검색 매개 변수 (표 1)와 공 초점 현미경 준비는 4.2-4.4 단계를 반복합니다.
주 : 매체를 장착에 스테인드 샘플을 장착 할 때 통합 된 염료로부터의 신호가 지속되지 않았다. - 탭을 열 수있는 Z-절편 확인란을 선택합니다. 이 라이브 스캔하는 동안 시료의 아래쪽을 향해 초점 휠을 돌려 맨 아래 Z-섹션을 정의하기 위해 "먼저 설정"을 클릭합니다. 최상위 부분을 정의하기 위해 다른 방향으로 포커스 휠을 이동하면서 동일한 기능을 수행.
- 클릭하여 이미지 수집을 수행합니다 "실험을 시작합니다."
- (단계 4.7에서와 같이) 배경 신호에 대한 ROI 영역 및 각 셀에서 백그라운드 보정 된 형광 강도를 정량화하는 묘화 소프트웨어를 사용하여 데이터를 플롯.
Drp1 널 모자이크의 6 세대
참고 : 여기에 사용 된 클론 전략은 Drp1 널 (null) 돌연변이 9 유전자형 이형 인 GFP 양성, 표현형 야생형 배경의 배경에 녹색 형광 단백질 (GFP) - 제외 어 Drp1 널 (null) 클론을 소개합니다. 열 충격에 의한 flippase - flippase 인식 대상 (FLP-FRT) - 매개 사이트 별 유사 분열 재조합는 기능적으로 널 drpKG03815 대립 유전자의 동형 접합 클론을 생성합니다. Drp1 돌연변이를 들고 초파리의 유전자형은 drpKG03815 FRT40A / CYO 인 열 충격에 의한 FLP (hsFLP) 및 UbiGFP 클론 마커 hsflp이다 운반 유전자형 반면, 유비퀴틴 NLS-GFP (UbiGFP) FRT의 40A / CYO. 선생의 유전자형위의 유전자형 사이의 십자가의 택된 자손 hsFLP / +입니다; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.
- 신선한 음식의 새로운 유리 병 매 2 ~ 3 일에 이동하여 처녀 수집을 위해 초파리를 동기화합니다. 신흥 처녀 암컷을 수집하기 위해 매일 pupariating 튜브를 모니터링합니다.
- 저녁에 한번 아침에 한번, 매일 Drp1 돌연변이 유전자형에서 붉은 눈, 곱슬 날개 처녀 여성을 수집하고 별도의 유리 병에 배치합니다. 병렬로, 남성 초파리는 어두운 붉은 눈과 우화 5 일 이내에 hsflp 및 UbiGFP를 들고 직선 날개를 수집합니다.
- (2) 남성 비율 : 여성과 처녀 암컷에 수컷을 추가하여 십자가를 설정 한.
- 계란의 생산을 자극하는 과립 효모 소량 뿌린다.
주 : 조심 자손의 양을 증가시키는 매 2 ~ 3 일 미디어의 새로운 바이알 초파리를 이동 바이알 밀집을 감소. - esthetize, 정렬 및 수집 직선 날개, 우화 5 일 이내에 빨간색 여성 자손.
- 열 충격 (열 쇼크 동안 흡습) 닦아 부드러운 과립 효모 소량의 작은 빈 튜브에 수집 된 초파리를 배치했다. 주로 모낭 세포 클론을 생성하기 위해, 1 시간 동안 38 ºC에서 물을 욕조에 초파리와 유리 병을 놓고 두 번 1 시간 37 ºC 하루에 2 일 연속 (2 열 충격 사이에 적어도 5 시간을 허용) , 생식 세포와 모낭 세포 클론을 모두 생성합니다.
참고 : 유리 병이 완전히 플러그의 수준으로 물 위로에 빠져들되어 있는지 확인합니다. - 열 충격은 초파리 움직이지를 할 수 있습니다. 그들은 다시 이동 될 때 열 충격 초파리 실온에서 1 시간 동안 회복 할 수있다.
- 십자가에서와 동일한 비율로 여성에 다시 남성을 추가하고 mediu 신선한 튜브로 이동m은 과립 효모의 소량 뿌려. 적어도 5 일 동안 초파리를 유지한다.
- 라이브 또는 고정 실험을 위해 필요에 따라 난소를 해부하다.
참고 : 부모의 초파리 표현 UbiGFP에서 분리 된 난소는 열 충격에 의한 GFP 음성 클론의 효율적인 유도를 확인하기 위해 음성 대조군으로 사용되어야한다.
7. 사이클린 E와 미토콘드리아에 대한 공동-면역 염색
참고 : 초파리 사이클린 E (dCyclinE)를 검출하기 위해, 우리는 구체적으로 dCyclinE (9)에 대해 제기 시중에서 얻은 항체를 사용했다 (자료 표 참조). 미토콘드리아 마커로서, 우리는 ATP-B에 대한 항체 (미토콘드리아 ATP 합성 효소 복합체의 서브 유닛)를 구 사용.
- 따뜻한 4 % 파라 포름 알데히드 실온 (PFA), 25 ° C. 주의! 파라 포름 알데히드는 독성이있다.
참고 : 개방 후앰플은, PFA는 4 ° C에 저장하고 7 일 이내에 사용되어야한다. PFA 저장 극적 정착시 미토콘드리아 막을 변화시키는 메탄올을 산화 할 수 있기 때문에이 경우에도, 미량으로 존재한다. - 즉시 절개 후 (놀리는없이) 유리 해부 요리의 잘 신선한 PFA 200 μL에 배치하여 해부 난소를 해결. 15 분 동안 흄 후드에서 요리를 유지합니다. 3 연속 우물에 집게로 조심스럽게 이동 1X 인산염 완충 식염수 각각 포함 200 μL (PBS)에 의해 고정 난소을 씻으십시오.
주 : 여기에서 실험을 중지 할 수 있고, 샘플을 1 일 4 ºC에서 방치 될 수있다. - 조심스럽게 항체에 의한 항원 액세스를 방해 할 수있는 보호 섬유 피복을 제거하기 위해 (비슷한 2.6 단계합니다) PBS에 더 철저 난소를 애타게.
- 0 만든 갓의 500 μL와의 microfuge 튜브에 배치하여 조롱 난소를 Permeabilize 하시려면.25 rpm으로 흔들 동안 5 % PBS - 트리톤 - X100 (PBS-TX)와 30 분 동안 그것을 품어.
참고 : 요동 동안, 튜브가 요동 운동에 평행하게 배치; 따라서 조직 손실의 결과로, 조직 관의 뚜껑에 충실 할 수있다 수직으로 그들을 배치. - PBS를-TX를 제거하려면 조직은 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 랙에의 microfuge 튜브를 배치합니다. 필요한 경우 아래로 아래로 부동 조직을 가지고, 시각적으로 검사하고 튜브를 누릅니다. 관의 아래쪽의 조직이 흐트러 유지 확인한 위에서주의 용액 대기음.
- 0.5 % TX-PBS에 용해 된 2 % 소 혈청 알부민의 200 μL (BSA)을 첨가하여 난소를 차단하고 실온에서 1 시간 동안 로커에 부화. 단계 7.5에 따라 차단 에이전트를 제거합니다.
- 신선한 블로킹 제 200 μL에 일차 항체를 추가 항 - 토끼 dCyclinE 항체 (1 : 100) 및 항 - 마우스 ATP-B 항체(1 : 100). 실온에서 2 시간 동안 로커의 조직을 인큐베이션.
- 단계 7.5 다음, 15 분 각각 PBS-TX로 3 회 난소을 씻으십시오.
- 신선한 PBS-TX의 적절한 이차 항체의 200 μL를 추가 항 - 마우스 - CY3 (1 : 1000) 및 항 - 토끼 - CY5 (1 : 500). 실온에서 1 시간 동안 로커에서 인큐베이션.
- 단계 7.5 다음, 15 분 각각 PBS-TX로 3 회 난소을 씻으십시오.
- 최종 PBS-TX 세척 행 (1,000 희석 1) DNA를 염색하기, 훽스트 (Hoechst)를 추가합니다.
- 마지막으로, 1X PBS 500 μL에 조직을 둡니다.
- 1 mL의 마이크로 피펫을 사용하여 PBS 200 μL를 포함하는 유리 접시 해부 신선한 웰에 미세 원심 분리 튜브로부터의 면역 염색의 난소를 제거한다.
- 유리 슬라이드에 글리세롤 기반 설치 매체의 한 방울을 추가하고 설치 매체에 하나를 사용하여 면역 염색 난소 하나를 추가합니다.
참고 : 난소가 실제로 설치 매체에 전송되어 있는지 확인하십시오. 의 작업을 수행 실패오 조직의 손실로 이어질 것입니다. - 해부 현미경을 통해 찾고 있지만, 부드럽게 집게로 난소의 불투명 한 부분을 누른 상태에서 괴롭 히고 바늘을 사용하여 불투명 성숙한 계란 챔버에서 투명 ovarioles (이하 단계)을 뽑아. 설치 매체에서 성숙한 난자 챔버를 제거합니다.
- 설치 매체가 균일하게 아래에 확산 될 수 있도록 슬라이드 가볍게 누르십시오에 커브 글라스 (22mm, 1 위)을 놓습니다.
주 : 커브 글라스에 누르면 또한 커브 글라스 따라 조직의 적절한 정렬을 보장합니다. 그래서 최적의 수행 실패하면 그 조직의 최적의 현미경을 방지, 작은 단계는 설치 매체에 부유 할 수있다. - 15 분 동안 샘플을 공기 - 건조 조심스럽게 매니큐어와 커브 글라스의 가장자리를 밀봉.
- 실험의 필요성 (표 1)에 따라 공 초점 현미경을 수행합니다.
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Representative Results
설명 된 방법은 실시간 고정 초파리 난소 (도 2B)에서 미토콘드리아의 구조 및 기능을 연구하는데 사용될 수있다. 기술 된 방법으로 얻은 예상 결과의 예이 개시된다.
초파리 난소 절제술 : 상기 해부하면 전체 초파리 (도 3A)에서 절단 복부 (도 3b)은 각각의 초파리 2 난소 포함 복부 내용물을 방출한다. 그대로 난소는 이상적으로 oviductal 줄기를 통해 서로에 부착 된 상태를 유지한다 타원형 모양의 흰색 구조 (그림 3C와 D의 화살표)로 나타납니다. 각각의 난소에서 ovarioles는 b를 제거한다 (그림 3C의 확대 부분에 #) 섬유 피복에 의해 함께 개최한다Y주의 괴롭 히고 (그림 3D 두꺼운 화살표, 분리 ovarioles와 심하게 조롱 난소를 나타내는 *이) 염색 및 현미경에 대한 ovarioles를 노출합니다. 복부 내용의 발표 중에 찢어 oviductal 줄기 방출 된 난소는 또한, 사용 그들이 그렇지 않으면 손상되지 제공 할 수있다. 손상된 난소는 (*도 3c에) 및 기타 복부 내용 (그림 3C에서 화살촉) 폐기해야합니다.
초파리의 난소의 라이브 현미경 : 여기, 우리는 FLIP 기술과 초파리의 난소에서 미토콘드리아의 구조 및 기능 염료의 로딩을 보여줍니다.
플립 기술 이전 초파리 여포 세포 9 미토콘드리아 연속성을 평가하기 위해 적용 형질 초파리의 난소 세포 간호사 여기 입증되었다 (그림 4A)과 연속성에있는 경우 플립 투자 수익 (ROI)에 반복 광표백 간헐적 회복 기간을 포함하는 플립 프로토콜은 주변 지역뿐만 아니라, 플립 ROI에서 신호의 손실을 할 수 있습니다. 플립 간호사 셀과 연관된 미토콘드리아 구름 중 하나 (200)들 (도 4b 및 C) 내의 적색 FLIP의 ROI를 둘러싸는 청색과 흰색의 ROI에서 형광 신호의 50 % 이상 손실을 일으켜 타겟; 녹색 ROI로부터의 신호가 백그라운드 보정을 위해 사용된다. 다른 불특정 간호사 세포 옐로우 ROI에서 형광 신호는 실험 (도 4b, 및 C)의 시간 경과시 최소 전체 표백을 나타내는,이 기간에 걸쳐 일정하게 유지된다. 또한,이 결과는 미토콘드리아을 나타냅니다 비디오 1을 참조하십시오1 단계와 2 단계에서 미토콘드리아가이 시간 프레임에서 형광의 손실을 것으로 예상되지 않는 동안 간호사의 세포는 3 단계와 4 단계 (도 4a)에 예시 자신의 외부 및 내부 세포막을 융합했다.
단위당 미토콘드리아 전위 미토콘드리아 질량의 반 정량적 측정이 전위차 염료 TMRE 미토콘드리아 13 질량 반영 전체 미토콘드리아 얼룩 공동 염색에 의해 평가 될 수 있다는 것이 이미 설명되었다. 여기서, 동일한 기술은 실시간 초파리 난소 조직의 단위 질량 당 미토콘드리아 전위의 평가를 보여주기 위해 사용되었다. TMRE 물들 라이브 초파리 난소 공 촛점 현미경 조직 (도 5a)의 깊이와 신호의 감소를 보여준다. 때문에 큰 조직 깊이에서 산란을 증가시키는 형광 신호의이 손실은 fluorop 모든 종류의 발생할 것으로 예상된다사용 목적의 지정된 작동 거리와 호어. 따라서, 형광 물질은 살아있는 조직을 촬상 중에 검출 할 수있는 조직 내에서의 최대 깊이를 구별하는 것이 중요하다. 최대 메징 깊이 (계란 챔버의 크기가 증가하여도 감소하면서, 예를 들어, 커버 슬립 내지 20 ㎛의 범위 내에서 설명 현미경 설정 (표 1)를 사용하여 묘화 될 수있는 전체 미토콘드리아 얼룩 (미토)로 염색 초파리 난소 라이브 5B). 설정이 부당한 신호 혼선 또는 형광 크로스 여진 것으로 예상되는 최소 검출되지 않거나 신호 (도 6a)을 조사하는 동안 미토콘드리아 오염의 최적화 현미경 설정은 적절한 검출 채널에서 양성 신호를 검출한다. 전체 미토콘드리아 얼룩 TMRE의 공동 염색 질적 (그림 6B) 및 정량 (그림 6C와 D <모두 사용할 수 있습니다/ 라이브 초파리의 난소에서 단위 질량 당 미토콘드리아 가능성 강한>) 평가. 예를 들어, a) 정성 분석 초파리 germarium는 체세포 모낭 세포가도 6b의 배아 세포 (화살표 머리를 캡슐화 제기 한 단계 (b)의 단위 중량 당 높은 미토콘드리아 전위를 나타낸다) 및 b) 반 정량적 분석은 입증 것을 증명 스테이지 9 계란 챔버 (그림 6C)에서 분석으로 (스트레칭) AFCS와 MBCS 사이의 단위 질량 당 미토콘드리아 전위의 차이. 정량의 초점이 자신의 평면에 따라, AFCS 및 MBCS에 대한 2 개의 다른 광학 조각에서 수행 된 있습니다. 성공적 초파리 (14)에 사용 된 미토 ROS 프로브의 사용은 미토콘드리아 분열 단백질의 기능적 널 클론 Drp1were 도입 라이브 초파리 난소 여포 세포 층에서 입증된다. 대부분 BUt 모든 라이브 GFP 음성 Drp1 널 여포 세포 클론의 미토 ROS (그림 7a 및 B)에 대한 높은 염색을 나타낸다. * (별개의 미토콘드리아 신호가이 조직에서 검출되지 않을 수 있지만, 미토-ROS 얼룩의 농도가 유사 분열 여포 세포보다 훨씬 큰 고급 후 유사 분열 여포 세포에서 핵 영역에서 검출 될 수 있습니다 도 7C에서). 이는 핵 DNA와 티듐 (15)의 유도체 인 미토 ROS 염료, 형광 산화 생성물의 상호 작용이 발생할 수있다.
고정 초파리 난포 세포에서 미토콘드리아 사이클린 E의 검출 : 최근 미토콘드리아는 포유 동물 세포 내의 미토콘드리아 표면 초파리 여포 세포 층으로 채용하여 세포주기 분자 사이클린 E를 조절할 수 있음을 입증 한
초파리 계란 챔버 그림 1. 개발. 만화 현상 달걀 챔버 체인 난자 및 모낭 세포 층 (체세포)에 의해 캡슐화 간호사 세포 (생식 세포)로 구성된 각 이루어진 초파리 ovariole 묘사. 계란 챔버는 germarium에서 개발하고 유사 분열 여포 세포는 이후 유사 분열 될 단계를 통해 개발할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 실험 계획 및 준비. 방법에 사용되는 (A) 도구 설명 : A. 플라이 바이알; B. 곤충 매체를 해부; C. 파라 포름 알데히드; D. 플라이 브러시; E.는 요리를 해부; F. 커버 유리; G.의 microfuge 튜브. H. 접시 유리는 바닥; I. 유리 슬라이드; J. 1,000 μL의 마이크로 피펫; K. 200 μL의 마이크로 피펫; L. 2.5 μL의 마이크로 피펫; M.는 (팁이 확대됩니다) 구부러진 끝 바늘을 괴 롭 히; N. 두꺼운 집게; O. 얇은 포셉. (B)은 플로우 차트의 개략도에 기재된 방법을 나타내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
초파리의 난소 그림 3. 해부. (A) 전체 마취 초파리. (B)는 잘린 초파리 또는 복부 내용물 (*)없이 복부. (C) 난소 (화살표와 *) 등의 내용을 포함하여, 초파리에게 복부 내용을 출시(화살촉); 전방 (개미)과 후방 (포스트)를 강조 오른쪽에있는 박스 영역의 확대는 ovarioles가 섬유 시스 (#)가 보유하고있는 oviductal 줄기, 보유 난소의 쌍의 끝납니다. (D) unteased 난소 (가는 화살표)에 비해 조롱 초파리의 난소 (두꺼운 화살표가 적절하게 표시 조롱과 *이 심하게 조롱 마킹). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 라이브 조직 플립 분석. (A)에 FLIP 방법을 사용하여 적합한 미토콘드리아 연속성 분석에 의해 분석 될 수 미토콘드리아 분열 / 융합하는 단계를 나타내는 개략도; 이 경우, 미토콘드리아 매트릭스에서 미토 YFP 프로브는 assessm 허용미토콘드리아 매트릭스 연속성 천만에. (B) 전 미토 YFP을 표현하는 라이브 형질 전환 초파리 달걀 챔버의 생체 현미경 시간 경과; 만 선택 시점 (t)가 표시됩니다. 모든 시간 점 비디오 1 참조. (B)의 각 컬러의 ROI에서 형광 신호 (C) 정량은 배경 보정 후의 정규화 표현된다. 두 개의 연속적인 표백 이벤트 간의 시간 간격이 복구 시간 인 반면에 화살촉은 반복적 인 광표백 시점을 나타낸다. 스케일 바 : 10 μm의. 이미지는 표 1에 기재된 파라미터를 획득 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 라이브 미토콘드리아리터 염색과 초파리 Ovariole의 현미경. (A) TMRE로 염색 라이브 초파리 ovariole 개별 광학 조각; 이미지는 표 1에 기재된 파라미터를 획득 하였다. Z는 μm의 커버 슬립에서의 거리를 나타낸다. (B) 라이브 초파리는 ovariole 전체 미토콘드리아 얼룩 (미토)로드. XY로 이미지에서 적색 라인의 XZ 이미지 B 바닥이고 T는 취득 된 화상의 위쪽이고, 도시된다. 파란색 라인 아래에서의 거리가 20 μm의입니다. 스케일 바 : 20 μm의. 공 촛점 이미지는 표 1에 기재된 파라미터를 획득 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에프라이브 TMRE와 초파리 Ovarioles 및 전체 미토콘드리아 얼룩의 igure 6. 공동 염색. (A) 라이브 초파리 ovariole TMRE 및 전체 미토콘드리아 얼룩 (미토)와 공동 염색의 단일 광학 조각; * 토론 섹션에 설명 된 실험적인 이슈를 나타냅니다. (B) (A)에서 germarium 3 연속 광학 슬라이스의 최대 강도의 돌출부; 화살촉은 TMRE 형광이 증가 영역을 나타냅니다. (C) 후 유사 분열 계란 챔버의 단일 광학 슬라이스 TMRE 및 전체 미토콘드리아 얼룩 공동는 염색. 상단과 하단 패널은 각각 AFCS 및 MBCS에 대한 포커스의 평면을 보여줍니다. TMRE의 평균 형광 강도와 (C)의 박스 영역에서 개별 AFCS 및 MBCS에서 정량화 전체 미토콘드리아 얼룩을 보여주는 (D) 박스 플롯. 박스 플롯의 휘스커는 특이점을 제외하고, 각 그룹에 대한 최대 값 및 최소값을 나타낸다.
미토-ROS 염료와 라이브 Drp1 널 모자이크 초파리 Ovarioles 그림 7. 염색. (A) 미토-ROS 염료로 염색 ovarioles의 단일 광학 조각. (B) 미토의 여포 세포와 개별 계란 챔버의 2 연속 광학 조각의 최대 강도 투사틱 단계는 미토 ROS 염료로 염색. (C) 미토-ROS 염료로 염색 후 유사 분열 단계에서 모낭 세포와 개별 계란 챔버의 단일 광학 조각; * 핵 신호를 나타냅니다. UbiGFP의 부족은 Drp1 널 복제본을 표시한다. 스케일 바 : 20 μm의. 공 촛점 이미지는 표 1에 기재된 파라미터를 획득 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
dCyclinE 및 ATP-B 항체와 고정 Drp1 널 모자이크 초파리 Ovarioles 그림 8. 공동 면역 염색. (A) 공동 면역 염색 germarium의 3 연속 광학 조각의 최대 강도 투사. (B) 공동 immunos의 3 연속 광학 조각의 최대 강도 투사이후 유사 분열 MBCS을 tained. 윤곽은 UbiGFP 음성 Drp1 널 (null) 클론을 구별. 스케일 바 : 10 μm의. 공 촛점 이미지는 표 1에 기재된 파라미터를 획득 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
손상 위험과 유물 9. 예를 그림. 의 (A) Germarium ovariole 고정 및 과도한 갭 (*)를 나타내는 DNA 염료의 Hoechst 염색 UbiGFP이 발현. ovariole가 고정 닉스 / 눈물 (*)를 나타내는 DNA 염료의 Hoechst 염색 UbiGFP가 발현의 (B) 계란 챔버. (C) 변형 된 챔버 (*)를 표시하는 미토 ROS 염료로 염색 UbiGFP 음성 Drp1 널 클론 ovariole 라이브 및 손상된 계란 챔버 부분 허용 배아 (**)의 염색; # 동일한 ovariole에 손상 달걀 챔버의 아마도 실제 염색을 나타낸다. (D)는 ovariole 생식 계열의 강렬한 인공적인 염색 전체 손상 챔버를 보여주는 염색 미토-ROS로 염색 라이브. * 손상을 유발 따라서 인공적인 GFP 음수가 클론에 상승을 제공 UbiGFP 신호의 손실 ovarioles를 평평하게 나타냅니다. 스케일 바 : 20 μm의. 공 촛점 이미지는 표 1에 기재된 파라미터를 획득 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1. 라이브 조직 플립 분석. 광표백 기반 FLIP 분석의 전체 시간 과정은 그림 5에 설명..COM / 파일 / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "대상 ="_ 빈 ">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)
표 1 : 발표 대표적인 이미지의 취득을위한 공 초점 현미경 설정. 표 1. 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)
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Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
광표백 : 형광 샘플의 과도한 광표백을 방지하는 효율적인 공 초점 현미경을 수행에 절대적으로 필요하다. 따라서 접안 렌즈를 통해 샘플을 찾기 위해 또는 라이브 스캐닝 모드를 통해 영상 획득 파라미터를 설정하는 데 사용되는 시간은 광표백을 최소화하기 위해 최소화되어야한다.
조직 손상 : 미토콘드리아는 세포의 상태의 센서들로 간주되기 때문에,이 기술 된 방법을 사용하여 얻은 데이터가 생리 학적 관련성 및 초파리 난소 절차 박리로 인한 과도한 손상을 반영하지 않도록하는 것이 매우 중요하다. 해부는 가능한 한 빨리 수행 할뿐만 아니라 조직 손상을 최소화하는 극단적 인 예방 조치와 함께해야합니다. 5 초파리의 난소의 해부와 놀림의 평균 시간은 우리의 손에 (7 분에 5에스). 노력은 분석에서 제외한다 손상된 조직을 나타내는 달걀 챔버를 식별주의해야한다. 박리에 의한 조직 손상 과도한 간극을 포함 할 수있다 (*도 9a에있어서, 신호의 부족에 의해 식별 된) 닉스 / 눈물 (*도 9b에있어서, 상기 신호의 부재에 의해 식별 됨) 계란 챔버 또는 변형 (* 도 9c에서). 그러나, 실험 조작에서 발생하는 의미있는 챔버의 변형은주의 깊게 평가되어야한다. 더 커버 슬립이 ovarioles의 평탄화 설명 프로토콜에서 라이브 조직의 상단에 사용되지 않지만 괴롭 히고 또는 (그림 9D에 *) 설치하는 동안 조직에 적용 과도한 압력이 발생할 수 있습니다. 기술 된 프로토콜을 괴롭 히고 그 후 발생과 즉시 절개 후 조직의 고정을 포함하기 때문에 ovarioles의 평탄화는 고정 샘플 관찰되지 않았습니다. aforementione의 서명없이 고립 된 계란 챔버D 손상은 정상으로 간주 될 수있다. 잠재적 절개로 인한 기계 손상은 또한 거짓 GFP 음성 클론 (16)를 산출, GFP의 손실을 초래할 수 있으며, 또한 강화 된 염료의 결합을 야기 할 수 있습니다. 계란 챔버 내부에 존재하는 배아 세포가 살아있는 미토콘드리아 염료 (도 6 및도 7), 초파리 배아 세포의 향상된 미토콘드리아 염색 손상된 / 죽어가는 조직의 투자율의 증가에 기인 할 수있다 정상적으로 투과성 아님을 감안; 이러한 인공물 (그림 9C에서 **도 9D에서 전체 ovariole) 미토-ROS 염료 발생뿐만 아니라 다른 라이브 미토콘드리아 얼룩 등 (도시하지 않음). 그림 9D (*)에서 UbiGFP의 손실은 또한 계란 챔버의 평탄화 원인이 손상 될 수 있습니다. 손상된 ovariole 다른 계란 챔버 정통 남아도 9c 무료 (# 아티팩트 수 있지만
시차 감도 : 살아있는 생체 현미경의 경우에는, 데이터를 조직 마운팅 후 15 분 이내에 수득한다; 그렇지 않으면, 실험 결과로 인해 조직의 계속되는 죽음 생리 변화에 의해 영향을받을 수있다. 때때로, 레이저 파워 등의 스캔 파라미터에 따라 장착 매체의 10 μL를 15 분보다 더 빨리 증발있다. 동시 면역에 의한 미토콘드리아 사이클린 E 풀 검출 인해 mitochond의 과도 특성 박리 시간 (가능성의 최소화를 요구활성 미토콘드리아 호흡 (12)에 의해 유지되는 리얼 사이클린 E 풀). 상당한 미토콘드리아 사이클린 E 풀은 30 분 미만 permeabilization 타임이 관찰되지 않았다.
플립 시간 코스 중 시험에서 어떤 계란 챔버의 움직임은 인공적인 분석으로 이어질 수 있으므로 제외해야합니다 FLIP. 외국 염료의 결합은 미토콘드리아의 연속성을 변경하고, 따라서 인공적인 결과를 가져올 수 있기 때문에 모든 라이브 미토콘드리아 염료 또는 TMRE의 사용은, 플립 실험에서 사용하지 않는 것이 좋습니다.
초파리 횡단 전략 : 인해 이형 남성 부모의 Drp1의 억압의 알 수없는 충격 가능성이 많은 자손을 얻을하지 않습니다합니다 (Drp1 돌연변이 대립 유전자를 운반하는 남성이 사용된다) 여기에 설명 된 것과 십자가 상호.
클론 데이터의 해석 : 제어 난소에서 검출 된 모든 GF-부정적인 클론가능성이 해부 (16) 중 손상에 의한 GFP 손실로 인해 생성 된 인공적인 위음성 클론을 나타냅니다 UbiGFP을 표현하는 부모 초파리에서입니다. 그럼에도 불구하고, 상호의 가열 충격 자손에서 GFP 음성 클론의 수는 대조군에서 보이는 모든 위음성 클론보다 훨씬 더 높아야한다. 설명 유사 분열 재조합 기반 전략에 의해 초파리 모낭 세포 층에서 생성 된 클론 (세포 클론 줄기) 유사 분열 모낭 줄기 세포에서 발생 또는 수있는 유사 분열이 아닌 줄기 뿌리 세포 (일시적 복제)에서. 과도 클론 계란 챔버가 이미 배치 된 경우 줄기 세포 클론, 실험적 분석은, 10 일 열 쇼크 후에 수행한다. 과도 클론의 분석은 어느 germarium 여포 세포 클론 않고 ovarioles의 모낭 세포 클론, 열 쇼크 후 6 일 내에 수행되어야한다.
수정 및 문제 해결
설명 된 방법을 사용하여 단위 질량 당 미토콘드리아의 잠재력을 평가하는 동안, 하나는 현미경 광학 또는 미토콘드리아 염료 조합에서 발생하는 잠재적 인 유물을 알고 있어야한다. 전체 미토콘드리아 오염으로부터 약화 된 신호는 비교적 높은 TMRE 신호 (도 5a, *)를 나타내는 상관 영역으로 인해 8 의한 적색의 다양한 광학 특성의 염료와 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 발생할 수있다 (TMRE) 인수 설정에서 고정 된 핀홀 크기 지정과 녹색 (전체 미토콘드리아 염료) 형광등. 광 인공물을 피할 연속 3 광학 슬라이스 - 정량적 분석은 (2)의 돌출부에 대해 수행 할 수있는 반면, FRET 관련된 이슈는, 가능하면, 염료의 농도를 감소시킴으로써 방지 될 수있다. 또한 형광 신호는 크로스 토크 및 크로스 여기에서 검출되면채널은, 레이저 및 검출기의 설정뿐만 아니라 최적의 채널에서 형광 신호가 감소 할 것으로 예상되는 다음 채널의 신호를 최소화하도록 재조정한다.
레이저 유도 반복적 인 광표백에서 손상이 미토콘드리아 분열의 원인이되므로 성공적인 FLIP을 방지 미토콘드리아 불연속의 원인이 될 수 있습니다. 플립 프로토콜의 실행 중에 미토콘드리아 의심 단편화가 감소 핀홀으로 높은 해상도의 이미지를 획득하는 (그리고 검출기 이득을 향상)에 의해 식별 될 수있다. 미토콘드리아의 단편화가 가시적 FLIP 프로토콜을 실행하는 동안 발견되면, 표백 레이저의 파워를 감소시켜야 및 / 또는 연속 표백제의 간격이 증가되어야한다. 전체 표백 플립 실험 (도 3b 및 C의 황색 ROI의 신호)의 시간 중에 존재하는 경우, 주사 레이저 레벨로 재조정해야그 최소한의 또는 전혀 전체 광표백 수 있습니다.
GFP 인한 손상 유도 손실에 대한 잠재적 이슈를 방지하기 위해, GFP 양성 클론 기재된 열 쇼크 프로토콜을 따르는 MARCM 전략을 사용하여 도입 할 수있다. 여기서, 해당 초파리 십자가에 사용될 버진 여성 drpKG03815 FRT40A / CYO X 남성 Gal80 FRT 40A / CYO이고; 욕조-GAL4, UAS-CD8GFP / TM6 9. (단계 6에 기술 된 바와 같이) 직선형 날개 자손은 열 쇼크를 사용하여 클론 생성을 위해 사용되어야한다.
기술의 한계
라이브 초파리 알 챔버의 표면 상에 존재하는 모낭 세포가 미토콘드리아 염색 염료를 포함하지만 A), 계란 챔버 내부의 배아 세포가 그렇게하지; 젊은 단계의 배아는 (도 5 및 6) 약하게 염색. B) 라이브 생체 tissu전자 현미경 한번에 개별 초파리 번 분리 난소에서 염색 완료 후 15 분 내에 수행되어야한다. 실험군 처리와 같은 날에, 촬영해야하기 때문에, 총 시간은 다양한 실험 그룹에서 살아있는 생체 조직을 현미경에서 통계적으로 유의 한 데이터를 얻기 위해 취해진 비교적 긴 고정 된 조직에 의한 것보다 길다. C) 우리는 미토 ROS 얼룩 때문에 모든 Drp1에서 신호의 검출 부족의 기초가 될 수 ROS의 과도 특성은 17,15 감지 분석에 가능성은 생체 초파리 조직에서 매우 안정적 아니라고 지적 null의 클론. 그러나, 널 Drp1 세포 미토 ROS 염색의 변동의 생물학적 관련성 / 클론을 배제 할 수없고 상기 조사되어야한다. 미토-ROS 얼룩에서 긍정적 인 신호가 바로 강화 된 슈퍼 옥사이드뿐만 아니라 강화 된 미토콘드리아 또는 cellul을 반영하지 않을 수 있습니다아칸소 산화 환경 15. 이 미토콘드리아 얼룩 및 GFP의 형광 스펙트럼이 구별되기 때문에 D) 전체 미토콘드리아 얼룩은 GFP 음성 또는 GFP 양성 클론 실험에 사용될 수 없다. E) 미토콘드리아 구조의 해상도를 포함 오픈 핀홀와 영상 획득을 필요로 미토콘드리아 매트릭스 연속성을 분석하기위한 플립 실험.
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
미토콘드리아 구조 - 기능 관계를 학습하는 미토콘드리아 기능의 조절 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해 중요하다. 미토콘드리아 결함이 크게 당뇨병, 암, 파킨슨 병, 등 다양한 질환에 기여하기 때문에 미토콘드리아 작업 방식에 대한 자세한 이해는 facilitati의 약속을 보유하고미토콘드리아 관한 치료 전략의 개발 겨. 라이브 셀 현미경은 미토콘드리아의 구조 - 기능 관계를 연구하기위한 필수 도구입니다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 분리 된 세포에 한정되어왔다. 미토콘드리아의 구조와 기능에 대한 연구는 생체 설치 9 초파리 조직을 살고 확장되었습니다. 이것과 관련된 연구의 설명 프로토콜 생리 맥락에서 미토콘드리아의 이해를 허용 생체 라이브 초파리 난소에서 미토콘드리아의 구조 및 기능의 이해를 초래할 것이다. 주어진 셀의 대사 및 미토콘드리아의 에너지 특성의 조절은 세포의 생리 컨텍스트 영양소 가용성과 적절한 시그널링시에 크게 의존하기 때문에 이러한 생체 외 방법은 시험 관내 연구에 비해 상당한 장점을 갖는다.
마일의 유전자 조작미토콘드리아 분열 단백질 Drp1 억압하여 tochondrial 구조는 세포주기 조절제 사이클린 E를 deregulates 및 초파리 난포 세포층 9,12-의 발달에 영향을 미친다. 여기에서, 프로토콜은 미토콘드리아의 구조 - 기능 관계를 연구하기 위해 초파리의 난소에서 Drp1의 기능 널 (null) 클론을 소개하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다. 포유 동물 세포에서 미토콘드리아 사이클린 E의 신규 풀뿐만 아니라 초파리 여포 세포 층 (12)은 성공 가능성이 미토콘드리아 (18)에 의해보고 된 사이클린 E 조절의 기초가되는 검출되었다. 여기서, 원고 dCyclinE 및 미토콘드리아 마커 (ATP-B)에 대한 공동 면역 고정 초파리 난소 신규 미토콘드리아 사이클린 E 풀을 검출하는 방법을 설명한다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
주어진 t모자 초파리 melanogaster의 강력한 유전자 모델 시스템으로, 우리의 기술 방법은 건강과 질병에서 미토콘드리아의 구조 - 기능 관계의 유전 적 기초의 이해에 크게 기여할 것으로 예상된다. 초파리는 광범위하게 종양 (19)로 이어지는 유전 적 상호 작용을 애타게하는 데 사용되었습니다. 초파리 상피 여포 세포 층에서 클론의 생성의 기능은 생체 내 및 생체 설정에서 개별 종양 클론의 미토콘드리아와 암 유전자 또는 종양 억제의 상호 작용에 대한 연구를 할 수 있습니다. 설명 된 방법은 적절한 돌연변이 초파리로부터 분리 난소의 미토콘드리아 구조 - 기능 관계의 조정을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 설명 된 방법은 상기 exog 통하여 미토콘드리아 구조 및 기능에 다양한 시그널링 영양과 성장 인자의 직접적인 영향을 연구하기 위해 확장 될 수있다생체 외 이미징 매체에 적절한 영양소 및 / 또는 성장 인자를 첨가 enous. 설명 된 방법을 적절히 변형 널리 암 (20, 21)과 같은 질환에서의 신호 전달 경로를 연구하는 데 사용 된 유생 가상적인 디스크, 등의 다른 절연 초파리 조직에서 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
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