Introduction
Die Mitochondrien sind klassisch als zelluläre Kraftwerk beschrieben, da sie die Haupt Sitze der Energieproduktion in differenzierten Zellen sind. Darüber hinaus spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, Wärmeerzeugung, Lipid - Modifikation, Calcium und Redoxhomöostase, die Orchestrierung von Zellsignalprozesse, etc 1. Mitochondria auch eine aktive Rolle bei der Induktion von Zelltod 2, sowie in der Zellzyklusregulation 3 spielen. Solche Multifunktionalität ergeben sich folgende grundlegende Fragen: a) Wie Mitochondrien führen alle diese Funktionen gleichzeitig und b) gibt es spezifische mitochondriale Pools oder Subzonen, die für verschiedene Funktionen spezialisiert sind? In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass die multifunktionale Mitochondrien in ihrer Form, Größe und Struktur innerhalb einzelner Zellen und dass die Beharrungsform der Mitochondrien variieren zwischen Zelltypen können dynamisch sind zu beachten. Jahrzehnte der Forschung aus verschiedenen LaborOratorien legen nahe , dass die Änderung der mitochondrialen Form, Größe und Struktur, die kollektiv mitochondrialen Dynamik genannt, entscheidend ist 4,5,6 verschiedenen mitochondrialen Funktionen aufrechtzuerhalten. Diese Ergebnisse heben die Möglichkeit, dass die Mitochondrien ihre Multifunktionalität, die aufgrund ihrer strukturellen Dynamik erreichen kann.
Umfangreiche Anstrengungen unternommen werden, die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung zu verstehen. Die Dynamik der mitochondrialen Struktur wird durch ihre Fähigkeit zu unterziehen Spaltung und Fusion Ereignisse miteinander in erster Linie beibehalten. Fission von großen Mitochondrien wandelt sie in kleinere mitochondrialen Elemente, während Fusion zwischen zwei kleineren Mitochondrien führt diese in ein größeres mitochondrialen Element 7. Außerdem kann transient Fusion von zwei Mitochondrien auftreten, um die Vermischung von deren Inhalt zu ermöglichen. Die Spaltung und Fusion Ereignisse der inneren und der äußeren mitochondrialen Membranen werden sorgfältig durch spec geregeltific setzt von Proteinen. Die Kernspaltung Maschinen ist dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) aus, der aus dem Cytosol in die Mitochondrien durch seine Wechselwirkung mit bestimmten bona fide mitochondriale Proteine (zB Fis1 oder MFF1) eingestellt wird, während DRP1 Funktion auch reguliert werden kann durch andere Proteine auf der mitochondrialen Oberfläche 4. Obwohl DRP1 auf der äußeren Membran arbeitet, beeinflussen seine Spaltung Fähigkeiten, um die innere Membran als auch. Die Orchestrierung der Spaltung von äußeren und inneren Mitochondrienmembranen ist nicht gut verstanden. Auf der anderen Seite, die Fusion der inneren Membran wird im Kern durch die Aktivitäten der opA1 geregelt, während mitofusins die Fusion der äußeren Membran 5 regieren. Der Rest der entgegen Spaltung und Fusion Ereignisse der Mitochondrien diktieren die Steady-State-mitochondriale Form in einer Zelle. Zum Beispiel würde Unterdrückung der mitochondrialen Spaltung in vollständig und ohne Widerstand Fusion, während die Überaktivität der Mitochondrienl Spaltung würde zu einer Fragmentierung der Mitochondrien 3 führen.
Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung geht es vor allem zwei komplementäre Ansätze: a) Analyse der zellulären und organismischen Phänotypen nach genetischen Manipulation von mitochondrialen Spaltung / Fusionsproteine und b) die direkte Beurteilung der mitochondrialen Struktur und Funktion. Es ist bemerkenswert, dass genetische Analysen nicht immer die direkte Funktionalität des Moleküls an der Hand (in diesem Fall die mitochondriale Spaltung / Fusionsproteine) kann sich herausstellen, wie die Phänotypen aufgrund Nebenwirkungen auftreten können. Daher ist es von größter Bedeutung, Werkzeuge zu entwickeln und zu verwenden, um direkt mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen. Bei der Beurteilung der mitochondrialen Struktur beinhaltet verschiedene Mikroskopie-Tools. Die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen fortgeschritten ist stark, die Studien der mitochondrialen Dynamik, da die mitochondriale Dynamik überwacht werden können, sowohl qualitativ als auch quantitathungsweise die entsprechenden Fluoreszenzmikroskopie Werkzeuge und Techniken unter Verwendung von 8. Die Fluoreszenzmikroskopie-basierte Werkzeuge wurden mitochondriale Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila melanogaster Gewebe zu studieren entwickelt, die Aufklärung der Bedeutung der mitochondrialen Dynamik in vivo 9. Diese und verwandte Verfahren werden hier beschrieben, mit dem Ziel , mitochondriale Struktur studieren und Funktion in der Drosophila Ovars.
Das Drosophila Ovar besteht aus Keimbahn und somatischen Abstammungslinien, die von ihren jeweiligen adulten Stammzellen entstehen , die 10,11 in der Germarium befinden. Sechzehn - Syncytial - Keimzellen (GCs) durch somatische Follikelzellen eingekapselt erhalten (FCs) einzelne Ei Kammern zu bilden , die aus dem Germarium (Abbildung 1) entstehen. Eines der 16 GCs eine Eizelle zu werden erhalten begangen, und die restlichen 15 GCs in Nährzellen entwickeln, die das Wachstum der Eizelle Kammer unterstützen, Die Reifung der Eizelle zu erleichtern, bevor sie verlegt wird. Die Mehrzahl der FCs laufen 9 Runden von Mitosen, bevor sie den mitotischen Zellzyklus verlassen terminal mit in einer strukturierten Epithelzellschicht unterscheiden, bestehend aus vorderen Follikelzellen (AFCs) posterior Follikelzellen (PFCs) und Hauptkörperzellen (MBCs) . Die aufeinander folgenden Ei Kammern sind durch Stengel Zellen verbunden, die Zellen unterschieden, die auch von den FCs früh in der Entwicklung ableiten. Mitochondriale Form durch die DRP1 mitochondrialen Spalt Protein reguliert wird im Prozess der Differenzierung während der normalen Entwicklung des Drosophila ovarian FC Schicht 9,12 beteiligt. Die Verfahren , die in diesen Studien verwendet , um die Beteiligung von DRP1 in Drosophila Follikel Zellschicht Entwicklung zu identifizieren , werden hier beschrieben.
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Protocol
1. Herstellung von Drosophila (die Werkzeuge erforderlich sind , die in 2A dargestellt)
- Für jede der beschriebenen Versuche, sammeln Drosophila (bei Raumtemperatur gehalten, oder 25 ° C) innerhalb von 5 Tagen nach dem Schlüpfen und legen Sie sie in einem Fläschchen mit 5 gefüllt - 7 ml Drosophila Lebensmittel (siehe Materialien Tabelle), mit nicht mehr als 25 in jedem Fläschchen fliegt; pflegen eine weiblich: männlich Verhältnis von 2: 1.
- Streuen Sie eine kleine Menge granuliert Hefe Drosophila Eierproduktion zu stimulieren. Führen Sie experimentelle Manipulation innerhalb von 2 - 4 Tage.
2. Dissection von Drosophila Ovarien (die Werkzeuge erforderlich sind , die in 2A dargestellt)
- Warm Insekten Sezieren Medium (siehe Materialien Tabelle) auf Raumtemperatur, 25 ° C. Füllen Sie drei Vertiefungen einer acht gut Glas Sezieren Schale, mit 200 & mgr; l Medium in jeder Vertiefung.
- Anesthetize Drosophila mit CO
- Während durch das Okular des Präpariermikroskop suchen, den Thorax aus dem Bauch mit zwei Paaren von Zange durchtrennen. Mit Hilfe der Zange, übertragen sorgfältig die Bäuche auf den zweiten und der Schale.
- Verwenden Sie eine Zange den Bauch am hinteren Ende zu halten, und langsam die Ovarien herausschieben (zusammen mit den anderen Bauchinhalt) mit dem anderen Paar der Zange. Sollte dieser Versuch fehlschlägt, entfernen Sie vorsichtig die Bauch Exoskelett durch die Zange in die vordere Ende Einsetzen der Ovarien zu lösen.
- Mit Hilfe der Zange, halten eine individuelle Ovar durch die undurchsichtigen hinteren Ende (dh die Dotter gefüllt, im Spätstadium Eier) und vorsichtig auf die dritte und der Schale bewegenfür necken es für Live-Mikroskopie (Schritt 3) oder zur Fixierung zu verarbeiten Immunofärbung (Schritt 7) auszuführen.
- Sie vorsichtig die Schutzhülle necken aus um die Ovarien zum vorderen Ende jedes Ovar eine Hänselei Nadel leicht aus dem hinteren fegt, während sie von dem hinteren Ende mit einer Pinzette zu halten.
HINWEIS: Um eine Beschädigung während necken, biegen Sie die Nadelspitze und zoomen auf jedem Ovar durch eine Erhöhung der Vergrößerung des Mikroskops (2A) zu minimieren. Necken sollten wirksam genug sein, um die Hülle zu durchbrechen, aber es sollte auch sorgfältig die Integrität der Ovariolen zu bewahren erfolgen.
3. Vorbereitung für das Live-Gewebe-Mikroskopie
HINWEIS: Die Werkzeuge erforderlich sind , die in 2A dargestellt ist .
- Vor Präparation Drosophila, bereiten polyL-Lysine beschichtete Kammern. Zu diesem Zweck legen Sie zwei 20-ul Tropfen polyL-Lysin (0,1 mg / ml) auf der coverglass (14 mm, Nr 0) aus einem Glasboden-Petrischale (35 mm) in einem angemessenen Abstand voneinander, um das Verschmelzen der Tropfen zu verhindern. Luft trocknen die Platten für 1 h bei 37 ºC und die Ränder des weißen polyL-Lysine Film auf der Unterseite der Platte mit einer löschbaren Marker markieren.
HINWEIS: Die polyL-Lysine beschichteten Kammern können für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden. Wenn eine vorher beschichtete Kammer mit, bringen Sie es auf Raumtemperatur vor der Drosophila Präparation beginnen. - Festlegen der Abtastparameter auf dem konfokalen Mikroskop, um sicherzustellen, daß die Probe unmittelbar nach der Beendigung der Dissektion und Befestigungs abgebildet werden kann, wie weiter unten.
- Legen Sie eine seziert und stichelte Ovar (nach Schritt 2 und gefärbt, falls erforderlich, folgenden Schritt 5) auf einer markierten polyL-Lysine-beschichteten Bereich und die Ausbreitung der Ovar mit der Hänselei Nadel, um die Ovariolen trennen. Legen Sie eine 10-ul Tropfen Insekten Sezieren Medium auf dem Ovar, um sicherzustellen, t zu deckener ganze polyL-Lysine-beschichtete Fläche. Decken Sie die Petrischale.
- Sofort durchführen Konfokalmikroskopie der montierten Probe bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Nur eine Drosophila sollte zu einem Zeitpunkt präpariert, verarbeitet und dargestellt werden. Auch Mikroskopie sollte nicht bei 37 ° C durchgeführt werden, die eine Hitzeschock - Umgebung für die Drosophila Gewebe nachahmen.
4. Fluoreszenz-Verlust in den Photobleaching (FLIP) Assay zur Beurteilung Mitochondrial Matrix Kontinuität
HINWEIS: Die mitochondriale Matrix Kontinuität in einer fusionierten mitochondriale Struktur wird nach der vollständigen Verschmelzung der eine Progression durch die Zwischenschritte folgende mitochondrialen inneren und äußeren Membranen hergestellt. Spaltung von Mitochondrien kann die gleichen Schritte , aber in der umgekehrten Richtung (3A) folgen. FLIP ist eine Zeitraffer-Mikroskopie-basierten semi-quantitatives Verfahren, das verwendet werden kann mitochondrialen Matrix Kontinuität in der zur Beurteilungfinal geschmolzenen Zustand von ex vivo Mitochondrien (Schritte 3 und 4 in 3A) in lebenden Drosophila Ovarien 9. Der FLIP - Assay wird als eine kleine Region von Interesse (ROI) der Mitochondrien durchgeführt ein fluoreszierendes Molekül in der mitochondrialen Matrix zum Ausdruck , die in regelmäßigen Abständen (FLIP ROI in 3A) gebleicht wird. Als Ergebnis kann jede umgebende mitochondrialen Region , die mit der FLIP ROI (experimental ROI in 3A) kontinuierlich ist wird Signal durch den Austausch von Molekülen in der kontinuierlichen mitochondrialen Matrix verlieren. Die FLIP - Experimente hier gezeigt , sind auf transgene Drosophila exprimiert mitoYFP, durchgeführt , die die mitochondriale Targeting - Sequenz der menschlichen Cytochrom - Oxidase - Untereinheit VIII mit YFP markiert enthält es der mitochondrialen Matrix in einer frei diffundierbare Form abzuzielen. Ein ähnliches Experiment kann auch mit dem Mito pUASP-Mito-GFP-Transgens durchgeführt werden, wie zuvor berichtet <sup> 9. Ein ähnliches Protokoll kann FLIP mit einer Sonde zur mitochondrialen Intermembranraum gezielt eingesetzt werden , um die Kontinuität zu erfassen , die aus der Fusion der äußeren , nicht jedoch aus der inneren Mitochondrienmembranen (Schritt 2 in Figur 3A).
- Öffnen Sie die Bildaufnahme - Software auf dem konfokalen Mikroskop und legen Sie die entsprechenden Scan - Parameter in der "Erwerb" Tab (Tabelle 1). Überprüfen Sie die "Zeitreihe", "Bleaching" und "Regionen" Boxen, die einzelnen Registerkarten zu öffnen. Legen Sie die entsprechenden Akquisitionsparameterwerte in jedem Register (Tabelle 1).
HINWEIS: Die Pinhole offen gelassen werden sollte, da dieses Experiment ausgelegt Gesamtsignal aus dem gesamten mitochondrialen Population in einzelnen Zellen zu überwachen. - Verwenden Sie das Okular, um schnell das Feld von Interesse im montierten lebendes Gewebe lokalisieren.
Hinweis: Um die Ovariolen auswählen, die auf dem Glas-bottome gut verteilt sindd Gericht, da die konfokale Mikroskopie kann nicht auf schwimmendem Ovariolen durchgeführt werden. - Klicken Sie auf "leben" ein Live-Bild des ausgewählten Interessengebiet zu erwerben. Klicken Sie auf "Stop" Live-Scan zu stoppen.
- Falls erforderlich, stellen Sie die Aufnahmeparameter so, dass die erfasste Fluoreszenzsignal unterhalb der Sättigungspegel ist (durch das Fehlen von roten Pixeln angezeigt, wenn die Option "Bereichsanzeige" aktiviert ist), mit dem Hintergrund definiert als durch die Einstellung der Offset-Werte gesetzt.
- Zeichnen Sie einen kleinen ROI der Bezier Zeichenwerkzeug aus der "Regions" Registerkarte mit der Photobleaching Zone auf dem Bild von Live-Scan erworben abgrenzen.
HINWEIS: Die Größe des ROI sollte etwa 20 - 50% des gesamten fluoreszierenden mitochondrialen Signal innerhalb der Zelle. - Führen Sie die Bildaufnahme durch einen Klick auf "Experiment starten."
- Quantifizierung der Fluoreszenzintensität unter Verwendung der proprietären oder Open-Source - Software (siehe MaterialienTabelle). Notieren Sie sich die mittlere Signal von der ROI bei denen das repetitive Bleichausgerichtet ist (FLIP); die ROIs wo Bleichen wurde in der gleichen Zelle (experimentell) nicht durchgeführt worden ist; der ROI aus einer anderen ungebleichten Zelle im gleichen Sichtfeld für die Gesamt Bleichen während des Versuchszeitraums (Bleaching) bewertet werden; und der ROI auf den Hintergrundbereich (Hintergrund). Subtrahieren Sie die mittlere Hintergrundsignal aus dem Mittelwert Signal in der anderen ROIs erhalten. Normalisieren das Fluoreszenzsignal mit dem anfänglichen Vorbleiche Signal für die jeweilige Zelle.
- Zeichnen Sie die normalisierten Daten jedes Standard Plotten Software.
5. Live-Färbung mit fluoreszierenden Farbstoffen Mitochondrial
HINWEIS: Steady-State - mitochondriale Struktur und das Potenzial kann mit Farbstoffen bewertet werden , die spezifisch in die Mitochondrien in lebenden Zellen und Gewebe integrieren. Live - Drosophila Ovarien können ex vivo mit fluoreszierenden mitochondrialen gefärbt werdenFlecken, die Mitochondrien zu visualisieren, mitochondriale reaktive Sauerstoffspezies (Mito-ROS) Produktion, und zur Beurteilung der mitochondrialen Potential pro Masseneinheit zu beurteilen. Dies kann durch Co-Färbung mit der mitochondrialen potentiometrische Farbstoff Tetramethylrhodamin ethylester (TMRE) und einem kompatiblen Live mitochondrialen stain , die die mitochondriale Masse (siehe Materialien Tabelle für die spezifischen Farbstoffe) durchgeführt werden.
- Verdünnen Sie die Lager der Flecken in warmen Insekt Sezieren Medium auf die endgültigen Arbeitskonzentrationen: mitochondriale Färbung, 250 nM; TMRE, 50 nM; und Mito-ROS-Färbung, 5 uM.
- Nach Präparation und necken die Ovarien folgenden Schritt 2, legen Sie die Ovarien in 200 ul einer bestimmten Farblösung in eine Vertiefung einer Dissektion Gericht. Inkubieren sie 10 Minuten lang mit dem durch eine geeignete Feld abgedeckt Teller mit Alufolie umwickelt zum Schutz vor Licht. Waschen Sie die gefärbten Ovarien durch sie vorsichtig mit einer Pinzette in 3 aufeinanderfolgenden Vertiefungen bewegen mit deg Medium ohne Flecken.
- Für die gleichzeitige Färbung mit TMRE und dem kompatiblen Gesamt mitochondrialen Fleck, folgen Sie dem obigen Protokoll zuerst mit TMRE und dann sofort mit der gesamten mitochondrialen Fleck (ohne Waschschritte dazwischen) zu färben.
- Montieren Sie die Ovarien auf einem polyL-Lysine beschichteten Glasbodenschale nach Schritt 3 und die Vorbereitungen für die konfokale Mikroskopie mit den entsprechenden Scan - Parameter (Tabelle 1), folgende Schritte 4,2-4,4.
HINWEIS: Das Signal von der eingebauten Farbstoffe hielt nicht bei dem Versuch , die gefärbten Proben zu montieren Medium bei der Montage. - Überprüfen Sie die Z-sectioning Feld die Registerkarte zu öffnen. Drehen Sie den Fokus Rad in Richtung der Unterseite der Probe, während sie Live-abgetastet wird, und klicken Sie auf "Set zuerst" die unterste Z-Abschnitt zu definieren. Machen Sie dasselbe, während der Fokus-Rad in Richtung der anderen Richtung bewegt den obersten Abschnitt zu definieren.
- Führen Sie die Bildaufnahme durch einen Klick auf "Experiment starten."
- Quantifizieren den Hintergrund korrigierten Fluoreszenzintensität aus den ROIs für das Hintergrundsignal und den einzelnen Zellen (wie in Schritt 4.7) und die Daten zu zeichnen jede Plotten Software.
6. Erzeugung von DRP1 Null Mosaiken
HINWEIS: Die hier verwendete klonalen Strategie stellt das grün fluoreszierende Protein (GFP) -negativen DRP1 null Klone im Hintergrund eines GFP-positive, phänotypisch Wildtyp - Hintergrund , die genotypisch heterozygot für die DRP1 Nullmutation 9 ist. Hitzeschock-induzierte Flippase-Flippase Erkennungsziel (FLP-FRT) vermittelter ortsspezifische mitotische Rekombination erzeugt homozygot Klone des funktionell null drpKG03815 Allel. Der Genotyp von Drosophila die DRP1 Mutante trägt , ist drpKG03815 FRT40A / CYO, während der Genotyp des Hitzeschock-induzierte FLP (hsFLP) und UbiGFP klonalen Marker ist hsflp trägt; Ubiquitin nls-GFP (UbiGFP) FRT 40A / Cyo. Der Genotyp des sewählten Nachkommen der Kreuzung zwischen den oben genannten Genotypen ist hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.
- Synchronisieren Sie die Drosophila für virgin Sammlung , indem sie in neue Fläschchen mit frischen Lebensmitteln alle 2 bis 3 Tagen zu bewegen. Überwachen Sie die pupariating Fläschchen täglich um Schwellen jungfräulichen Weibchen zu sammeln.
- Sammeln Sie mit roten Augen, lockiges-Flügel jungfräulichen Weibchen aus dem mutierten Genotyp DRP1 täglich, einmal morgens und einmal abends, und legen Sie sie in einem separaten Fläschchen. Parallel dazu sammeln männlichen Drosophila mit dunkelroten Augen und gerade Flügel hsflp und UbiGFP innerhalb von 5 Tagen nach dem Schlüpfen tragen.
- Richten Sie ein Kreuz, indem die Männchen zu den jungfräulichen Weibchen mit einem weiblich: männlich Verhältnis von 2: 1.
- Streuen Sie eine kleine Menge granuliert Hefe Eierproduktion zu stimulieren.
HINWEIS: Sie vorsichtig die Drosophila in ein frisches Fläschchen Medien alle 2 bis 3 Tage zu navigieren , um die Menge an Nachkommen erhöhen und Fläschchen Crowding zu reduzieren. - Einesthetize, sortieren und sammeln gerade geflügelte, mit roten Augen weiblichen Nachkommen, die innerhalb von 5 Tagen nach dem Schlüpfen.
- Für den Hitzeschock, legen Sie die gesammelten Drosophila in leere Fläschchen mit einer kleinen Menge von granulierten Hefe und einem kleinen, weichen Wischtuch (die Feuchtigkeit während der Hitzeschock zu absorbieren). Legen Sie das Fläschchen mit der Drosophila in einem Wasserbad bei 38 ° C für 1 h, um in erster Linie Follikel - Zell - Klone erzeugen, und bei 37 ° C für 1 h zweimal täglich (so dass mindestens 5 h zwischen den zwei Wärmeschocks) für zwei aufeinanderfolgende Tage , sowohl Keimbahn und Follikel-Zellklone generieren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass das Fläschchen vollständig im Wasser bis zur Höhe des Steckers eingetaucht ist. - Der Hitzeschock kann die Drosophila unbeweglich machen. Lassen Sie die Hitzeschock Drosophila für 1 h bei Raumtemperatur zu erholen , wenn sie wieder mobil werden.
- Fügen Sie die Männer zurück auf die Weibchen im gleichen Verhältnis wie im Kreuz, und bewegen Sie sie an die frische Fläschchen mit medium bestreut mit einer geringen Menge an granulierter Hefe. Pflegen Sie die Drosophila mindestens 5 Tage.
- Präparieren Sie die Ovarien als notwendig für eine Live-oder Fest Experiment.
HINWEIS: Ovarien vom parentalen Drosophila exprimiert UbiGFP isoliert sollten als negative Kontrollen verwendet werden , um die effiziente Induktion der GFP-negativen Klonen durch den Hitzeschock zu bestätigen.
7. Co-Immunfärbung für Cyclin E und Mitochondria
HINWEIS: Drosophila Cyclin E (dCyclinE) zu erfassen, haben wir ein kommerziell erhalten Antikörper , der spezifisch gegen dCyclinE 9 verwendet haben (siehe Materialien Tabelle). Als mitochondrialen Marker verwendeten wir einen Antikörper gegen ATP-B (a - Untereinheit der mitochondrialen ATP - Synthase - Komplex) 9.
- Warm 4% Paraformaldehyd (PFA) auf Raumtemperatur, 25 ° C. Vorsicht! Paraformaldehyd ist giftig.
HINWEIS: Nach dem Öffnendie Ampulle, sollte PFA innerhalb von 7 Tagen bei 4 ° C und verwendet, gespeichert werden. Dies liegt daran, die Lagerung von PFA Oxidation zu Methanol erlauben kann, die dramatisch mitochondrialen Membranen während der Fixierung verändern würde, auch dann vor, wenn in Spuren. - Unmittelbar nach der Präparation, fixieren die seziert Ovarien, indem sie in 200 ml frisches PFA in eine Vertiefung einer Glas Sezieren Schale (ohne teasing) platzieren. Halten Sie die Schale in einem Abzug für 15 min. Waschen der festen Ovarien durch sie sorgfältig mit der Zange in 3 aufeinanderfolgenden Vertiefungen mit jeweils 200 & mgr; l 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu bewegen.
HINWEIS: Der Versuch abgebrochen hier werden kann , und die Proben können bei 4 ºC für 1 Tag belassen werden. - Necken die Ovarien gründlicher in PBS (ähnlich 2,6 Schritt A) vorsichtig die Schutz faserige Hülle zu entfernen, die durch den Zugang Antigen-Antikörper behindern.
- Permeabilisieren die aufgezogen Ovarien indem man sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 & mgr; l frisch 0 gemacht platzieren.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) und Inkubation für 30 min, während bei 25 Umdrehungen pro Minute zu schaukeln.
HINWEIS: Während der rocking, legen die Rohre an die Schaukelbewegung parallel; Platzieren sie das Gewebe senkrecht erlauben kann auf die Kappe der Rohre zu halten, so dass in Gewebeverlust zur Folge hat. - Um die PBS-TX entfernen, legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Rack das Gewebe zu ermöglichen, an der Unterseite der Rohre zu beruhigen. Überprüfen Sie sie visuell und die Röhrchen klopfen, falls erforderlich, alle schwimmenden Gewebe zu bringen, bis auf den Boden. Absaugen die Lösung von oben vorsichtig und achten Sie darauf, dass das Gewebe an der Unterseite der Rohre ungestört bleibt.
- Blockieren die Ovarien durch Zugabe von 200 ul 2% Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in 0,5% PBS-TX, und Inkubieren auf der Wippe bei Raumtemperatur für 1 h. Entfernen Sie die Blockierungsmittel für Schritt folgende 7.5.
- Hinzufügen primäre Antikörper in 200 & mgr; l frischem Blockierungsmittel: anti-rabbit dCyclinE Antikörper (1: 100) und anti-Maus-ATP-B-Antikörper(1: 100). Inkubieren Sie das Gewebe an der Wippe für 2 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Ovarien mit PBS-TX 3 mal für jeweils 15 min, nach Schritt 7.5.
- Fügen Sie 200 ul der entsprechenden Sekundärantikörper in frischem PBS-TX: anti-Maus-Cy3 (1: 1000) und Anti-Kaninchen-Cy5 (1: 500). Inkubieren an der Wippe für 1 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Ovarien mit PBS-TX 3 mal für jeweils 15 min, nach Schritt 7.5.
- Um die DNA-Fleck, fügen Hoechst (1: 1000 Verdünnung) auf die endgültige PBS-TX zu waschen.
- Schließlich das Gewebe in 500 ul 1x PBS verlassen.
- Mit einer 1-ml-Mikropipette, entfernen Sie die immunogefärbten Ovarien aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in eine frische und einer Glas Sezieren Schale mit 200 ul PBS.
- Einen Tropfen Glycerol-basierten Mounting Medium auf einem Glasobjektträger und fügen die immunogefärbten Ovarien einzeln an der Befestigungsmedium.
HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass die Ovarien in der Tat auf die Montagemedium übertragen werden. Andernfalls s zu tuno wird auf Gewebeverlust führen. - Während durch das Aufschneiden Mikroskop, zupfen vorsichtig die transparente Ovariolen (jüngere Stufen) von den undurchsichtigen reifen Eikammern die Hänselei Nadel, während die undurchsichtigen Bereich des Ovars mit der Zange zu halten. Entfernen Sie die reife Eizelle Kammern aus dem Eindeckmedium.
- Legen Sie ein Deckglas (22 mm, No. 1) auf der Folie und drücken Sie leicht, um sicherzustellen, dass die Montagemedium gleichmäßig unter verteilt wird.
HINWEIS: Durch Drücken auf das Deckglas sorgt auch für die richtige Ausrichtung des Gewebes entlang der Abdeckglas. kann so optimal auf Sie dies nicht erlauben, die kleineren Stufen in der Montagemedium zu schweben, zu verhindern optimale Mikroskopie von diesen Geweben. - Der Luft trocknen die Proben für 15 min und die Ränder des Deckglas vorsichtig mit Nagellack.
- Führen Konfokalmikroskopie gemäß experimentellen Bedarf (Tabelle 1).
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Representative Results
Die beschriebenen Verfahren können mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen in lebenden und fixierten Drosophila Ovarien (2B) verwendet werden. einige Beispiele für die erwarteten Ergebnisse, die mit den beschriebenen Verfahren werden zur Verfügung gestellt.
Dissektion der Drosophila Ovar: Wenn weiter seziert, sollten die abgetrennten Bäuche (3B) aus dem gesamten Drosophila (3A) lösen Sie die Bauch - Inhalte, einschließlich 2 Ovarien von jedem einzelnen Drosophila. Die intakten Ovarien erscheinen als ovale, weißen Strukturen (Pfeile in Figur 3C und D) , die idealerweise aneinander durch den Eileiter Stiel befestigt bleiben soll. Die Ovariolen in jedem Ovar sollte durch die faserige Hülle (# in vergrößerten Teil von 3C) zusammengehalten werden, die b entfernt wirdy vorsichtig teasing (dicker Pfeil in Figur 3D; * eine schlecht stichelte Ovar mit abgesetzter Ovariolen angibt) , um die Ovariolen für die Färbung und Mikroskopie zu belichten. Die freigesetzten Ovarien mit Eileiter Stiele während der Freisetzung der Bauchinhalt zerrissen kann auch verwendet werden, sofern sie nicht in anderer Weise beschädigt. Beschädigte Ovarien (* in 3C) und andere Bauchinhalt (Pfeilspitze in 3C) muss verworfen werden.
Live - Mikroskopie der Ovarien Drosophila: Hier zeigen wir die FLIP - Technik und das Laden von mitochondrialen strukturellen und funktionellen Farbstoffen in Drosophila Ovarien.
Die FLIP - Technik, die zuvor mitochondrialen Kontinuität in den Drosophila Follikelzellen 9 zur Beurteilung angewendet, wurde in den ovarian Nährzellen transgener Drosophila hier demonstriert (4A) sind. FLIP gezielt auf eine der mitochondrialen Wolken im Zusammenhang mit den Nährzellen führt zu einer mehr als 50% Verlust des Fluoreszenzsignals von den blauen und weißen ROIs den roten FLIP ROI innerhalb von 200 s (4B und C) umgibt; das Signal von dem grünen ROI wird für die Hintergrundkorrektur verwendet. Das Fluoreszenzsignal aus dem gelben ROI in den anderen untargeted Nährzellen bleibt während dieser Zeitspanne konstant, was bedeutet , minimale Gesamtbleich während des Zeitverlaufs des Experiments (4B und C). Auch hierzu finden Sie Video 1. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Mitochondrienin Nährzellen haben ihre äußeren und inneren Membranen verschmolzen, beispielhaft in den Schritten 3 und 4 (4A), während die Mitochondrien in den Schritten 1 und 2 werden keinen Verlust an Fluoreszenz in diesem Zeitrahmen zu zeigen , erwartet.
Es wurde zuvor gezeigt , daß eine semi-quantitative Messung der mitochondrialen Potential pro Einheit mitochondrialen Masse kann durch Co-Färbung mit dem Farbstoff potentiometrische TMRE und der Gesamt mitochondrialen stain beurteilt werden , die 13 Masse mitochondrialen widerspiegelt. Hier wurde die gleiche Technik verwendet , um die Beurteilung der Mitochondrienpotential pro Einheitsmasse in lebenden Drosophila Ovarialgewebe zu demonstrieren. Konfokale Mikroskopie lebender Drosophila Ovarien gefärbt mit TMRE zeigt eine Abnahme des Signals mit der Tiefe des Gewebes (5A). Dieser Verlust an Fluoreszenzsignal durch Streuung in größeren Gewebetiefe zur Erhöhung soll mit jeder Art von fluorop aufzutretenHore mit einem bestimmten Arbeitsabstand des verwendeten Objektivs. Daher ist es wichtig, die maximale Tiefe des Gewebes zu erkennen, in dem das Fluorophor während lebendem Gewebe-Bildgebung detektiert werden. Zum Beispiel leben Drosophila Ovarien mit der gesamten mitochondrialen Färbung gefärbt (Mito) kann in einem Bereich von 20 um von dem Deckglas, während die maximale bebilderbaren Tiefe nimmt mit zunehmender Eikammer Größe (Abbildung unter Verwendung der beschriebenen Mikroskopaufbau (Tabelle 1) abgebildet werden , 5B). Die optimierte Mikroskopeinstellungen für die mitochondriale Flecken erkennen positive Signale in den entsprechenden Detektionskanäle, während die Einstellungen unangemessene Signalübersprechen oder Fluorophore Quer Anregung expectedly minimal erkannt zu untersuchen , oder kein Signal (6A). Co-Färbung von TMRE mit der gesamten mitochondrialen Fleck kann sowohl für die qualitative verwendet werden (6B) und quantitative (6C und D </ strong>) Beurteilungen der mitochondrialen Potential pro Masseneinheit in lebenden Drosophila Ovarien. Zum Beispiel a) zeigt eine qualitative Analyse , dass die Drosophila Germarium höhere mitochondrialen Potential aufweist pro Einheitsmasse in Stufe 2b , wo die somatische Follikelzellen entstanden sind , die Keimbahnzellen (Pfeilspitzen in 6B) und b) semi-quantitative Analysen zu verkapseln demonstrieren der Unterschied in der mitochondrialen Potential pro Masseneinheit zwischen (Dehnung) AFCs und den MBC, wie aus einer Stufe 9 Eikammer (6C) analysiert. Beachten Sie, dass die Quantifizierung wurde von zwei unterschiedlichen optischen Scheiben für AFCs und MBCs durchgeführt wurde, in Abhängigkeit von ihrer Fokusebene. Die Verwendung der Mito-ROS - Sonde, die 14 in Drosophila erfolgreich eingesetzt wurde , wird in Live - Drosophila Eierstockepithel Follikel Zellschichten gezeigt, bei denen eine funktionelle null Klone der mitochondrialen Spaltung Protein Drp1were eingeführt. Die meisten, but nicht alle, der Live - GFP-negativen erhöhter Färbung null Follikel Zellklone zeigen DRP1 für Mito-ROS (7A und B). Man beachte, daß obwohl ein deutlicher mitochondrialen Signal nicht in diesem Gewebe nachgewiesen werden konnten, kann die Konzentration der Mito-ROS-Färbung in der Kernregion in den erweiterten post-mitotischen Follikelzellen erkannt werden konnte, die erheblich größer als die mitotische Follikelzellen sind (* in Figur 7C). Dies kann aufgrund der Wechselwirkung von Kern DNA auf , und der Leuchtstoffoxidationsprodukt des Mito-ROS Farbstoff, der ein Derivat von Ethidium 15 ist.
Der Nachweis von mitochondrialen Cyclin E in festen Drosophila Eierstockfollikels Zellen: Es wurde vor kurzem gezeigt , dass Mitochondrien in den Zellzyklus - Molekül Cyclin E , indem sie es auf die mitochondriale Oberfläche in Säugetierzellen zu rekrutieren und die Follikel Zellschicht Drosophila regulieren
Abbildung 1. Die Entwicklung der Drosophila Ei Chambers. Cartoon Darstellung eines Drosophila Ovariole bestehend aus einer Kette von der Entwicklung Eikammern, die jeweils aus einer Eizelle und den Nährzellen (Keimbahn) eingekapselt durch die Follikel Zellschicht (somatischen). Die Eikammern entwickeln sich aus der Germarium und entwickeln durch die Stufen, wo die mitotische Follikelzellen post-mitotischen werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Versuchsplan und Vorbereitung. (A) Werkzeuge in den verwendeten Methoden beschrieben: A. Fly Fläschchen; B. Insekten Sezieren Medium; C. Paraformaldehyd; D. Fly Pinsel; E. Sezieren Gericht; F. Deckglas; G. Mikrozentrifugenröhrchen. H. Glasbodenschale; I. Objektträger aus Glas; J. 1000-ul-Mikro; K. 200-ul-Mikro; L. 2,5-ul-Mikro; M. Teasing Nadel mit einer gebogenen Spitze (Spitze wird vergrößert); N. Dick Zange; O. Thin Pinzette. (B) ein Ablaufdiagramm , schematische Darstellung der beschriebenen Verfahren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Dissection von Drosophila Ovarien. (A) narkotisierten ganze Drosophila. (B) Severed Drosophila Bäuche mit oder ohne (*) der Bauchinhalt. (C) freigegeben Drosophila Bauchinhalt, einschließlich der Ovarien (Pfeile und *) und andere Inhalte(Pfeilspitzen); Vergrößerung des geschachtelt Region auf der rechten Seite markieren die vordere (Ant) und posterioren (Post) Enden des Paares von Ovarien des Eileiters Stiel gehalten, wo die Ovariolen durch die faserige Hülle (#) gehalten werden. (D) Teased Drosophila Ovar (dicker Pfeil markiert gehänselt angemessen und * schlecht gehänselt Markierung) im Vergleich zu unteased Eierstock- (dünner Pfeil). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Lebende-Gewebe FLIP Assay. (A) Schematische Darstellung der Schritte der mitochondrialen fission / Fusion, die durch eine entsprechende mitochondrialen Kontinuitätstest getestet werden kann , die FLIP - Verfahren; in diesem Fall ermöglicht ein Mito-YFP-Sonde in der mitochondrialen Matrix für die-Abschätzungent der mitochondrialen Matrix Kontinuität. (B) Zeitraffer-ex vivo - Mikroskopie eines lebenden transgenen Kammer Drosophila Ei ausdrücken Mito-YFP; nur ausgewählte Zeitpunkte (t) gezeigt. Siehe Video 1 für alle Zeitpunkte. (C) Die Quantifizierung des fluoreszierenden Signals von der jeweiligen farbigen ROIs in (B) werden nach der Hintergrundkorrektur und Normalisierung ausgedrückt. Die Pfeilspitzen zeigen die reiterative Photobleaching Zeitpunkten, wohingegen das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ereignissen Bleich die Erholungszeit ist. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. Die Bilder wurden mit den Parametern in Tabelle 1 beschrieben , gewonnen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Live - Mitochondrial Die Färbung und Mikroskopie der Drosophila Ovariole. (A) Einzelne optische Scheiben eines lebenden Drosophila Ovariole mit TMRE gefärbt; Das Bild wurde mit den Parametern in Tabelle 1 beschrieben , gewonnen. Z bedeutet aus dem Deckglas in um den Abstand. (B) Ein Live Drosophila Ovariole mit der gesamten mitochondrialen stain (Mito) geladen. Die XZ Bild der roten Linie in der XY-Bild dargestellt ist, wobei B die unten und T ist die Oberseite des aufgenommenen Bildes. Der Abstand vom Boden bis zur blauen Linie 20 um. Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. Das konfokale Bilder wurden mit den Parametern in Tabelle 1 beschrieben , gewonnen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fild 6. Co-Färbung von lebenden Drosophila Ovariolen mit TMRE und die gesamte mitochondriale Stain. (A) Einzel optische Scheibe eines lebenden Drosophila Ovariole co-gefärbt mit TMRE und die gesamte mitochondriale Färbung (Mito); * Zeigt ein experimentelles Artefakt in der Diskussion Abschnitt beschrieben. (B) Der maximale Intensitätsprojektion von 3 aufeinander folgenden optischen Schichten der Germarium in (A); Pfeilspitzen zeigen den Bereich, wo die TMRE Fluoreszenz erhöht wird. (C) Einzel optische Scheibe post-mitotischen Eikammer co-gefärbt mit TMRE und die gesamte mitochondriale Fleck. Die oberen und unteren Platten zeigen die Fokusebene für AFCs und GBZ sind. (D) Box - Plot zeigt mittlere Fluoreszenzintensität von TMRE und die gesamte mitochondriale Fleck quantifiziert aus einzelnen AFCs und GBZ in den boxed Regionen in (C). Die Whisker des Box-Plots zeigen die Maximal- und Minimalwerte für jede Gruppe, die Ausreißer auszuschließen.
Abbildung 7. Die Färbung der Live DRP1 Null Mosaic Drosophila Ovariolen mit dem Mito-ROS - Farbstoff. (A) Einzel optische Scheibe Ovariolen mit dem Mito-ROS Farbstoff gefärbt. (B) Maximum-Intensitätsprojektion von zwei aufeinanderfolgenden optischen Scheiben eines einzelnen Eikammer mit Follikel - Zellen in der Mitotic Bühne mit dem Mito-ROS Farbstoff gefärbt. (C) Einzel optische Scheibe eines einzelnen Eikammer mit Follikel - Zellen in der post-mitotischen Phase gefärbt mit dem Mito-ROS - Farbstoff; * Zeigt ein Kernsignal. Der Mangel an UbiGFP markiert die DRP1 null Klone. Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. Das konfokale Bilder wurden mit den Parametern in Tabelle 1 beschrieben , gewonnen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Co-Immunfärbung von Fest DRP1 Null Mosaic Drosophila Ovariolen mit dCyclinE und ATP-B - Antikörper. (A) Maximum-Intensitätsprojektion von 3 aufeinander folgenden optischen Scheiben von Co-immunhistochemisch Germarium. (B) Maximum-Intensitätsprojektion von 3 aufeinander folgenden optischen Scheiben von Co-immunosenthaltenen post-mitotischen MBC. Die Umrisse kennzeichnen die UbiGFP negative DRP1 null Klone. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. Das konfokale Bilder wurden mit den Parametern in Tabelle 1 beschrieben , gewonnen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9. Beispiele für mögliche Schäden und Artefakte. (A) Germarium von UbiGFP exprimierenden Ovariole fixiert und mit dem DNA - Farbstoff Hoechst zeigt ungebührliche Lücken (*). (B) Egg Kammer UbiGFP-exprimierenden Ovariole fixiert und mit dem DNA - Farbstoff Hoechst zeigt Scharten / Tränen (*). (C) Live Ovariole mit UbiGFP negativen DRP1 null Klone gefärbt mit dem Mito-ROS Farbstoff eine deformierte Kammer (*) und ein beschädigtes Ei Kammer zeigt, so dass teilweise Anfärbung der Keimbahn (**); # Bezeichnet eine möglicherweise reale Fleck einer unbeschädigten Eikammer in der gleichen Ovariole. (D) Live Ovariole mit dem Mito-ROS gefärbten Farbstoff eine Gesamt beschädigte Kammer mit intensiven artifactual Färbung der Keimbahn zeigt. * Zeigt Schaden induzierte Ovariolen mit einem Verlust von UbiGFP Signal abgeflacht, so was zu artifactual GFP-negativen Klone geben. Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. Das konfokale Bilder wurden mit den Parametern in Tabelle 1 beschrieben , gewonnen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Video 1. Live-Gewebe FLIP Assay. Der komplette zeitliche Verlauf der Photobleaching-basierten FLIP - Assay beschrieben in Abbildung 5..com / files / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download bereit.)
Tabelle 1: Konfokalmikroskop Einstellungen für den Erwerb der präsentierten Vertreter Bilder. Bitte klicken Sie hier Tabelle 1 zu sehen (Rechtsklick zum Download bereit .)
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Discussion
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls
Photobleaching: Vermeidung unzumutbarer Photobleichens fluoreszierenden Proben ist unbedingt erforderlich, um eine effiziente Durchführung der konfokalen Mikroskopie. Daher wird die Zeitproben durch das Okular zu lokalisieren oder Bildaufnahmeparameter über den Live-Abtastmodus eingestellt sollte Photobleichens minimiert werden minimiert.
Gewebeschäden: Da Mitochondrien betrachtet sind die Sensoren der zellulären Gesundheit zu sein, ist es äußerst wichtig , um sicherzustellen , dass die physiologisch relevanten erhaltenen Daten , die die beschriebenen Methoden sind und spiegeln nicht die unangemessenen durch die Verfahrens Präparation der Drosophila Ovarien verursacht wurden. Die Präparation sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, sondern auch bei extremer Vorsicht zu Gewebeschäden zu minimieren. Die durchschnittliche Zeit für die Präparation und Necken von 5 Drosophila Ovarien ist 5 bis 7 min (in der Hands). Anstrengung muss Eikammern zeigt beschädigtes Gewebe zu identifizieren ergriffen werden, die aus den Analysen ausgeschlossen werden. Gewebeschäden durch Dissektion kann unnötige Lücken enthalten (* in 9A, wie durch das Fehlen des Signals identifiziert), Kerben / Tränen (* in Figur 9B gezeigt ist , wie durch das Fehlen des Signals identifiziert) oder Deformation der Eikammern (* in Figur 9C). Allerdings sollten sorgfältig ausgewertet werden jede sinnvolle Kammer Verformung aus der experimentellen Manipulation entstehen. Obwohl kein Deckglas auf dem lebenden Gewebe in dem Protokoll beschrieben, Abflachen der Ovariolen verwendet wird , kann mit unangemessenen Druck auftreten auf das Gewebe aufgebracht wird, während das Necken oder Befestigungs (* in 9D). Die Abflachung der Ovariolen hat mit festen Proben beobachtet, nicht da beschrieben das Protokoll die Fixierung von Gewebe unmittelbar nach der Sektion beinhaltet, mit teasing danach auftritt. Jede isoliert Eikammer ohne Unterschrift des aforementioned Schaden kann als normal angesehen werden. Mechanische Schäden durch Dissektion was möglicherweise auch zum Verlust der GFP führen, wodurch man falsch GFP-negativen Klone 16 und kann auch zu einer verbesserten Farbstoff Einarbeitung führen. Da die Keimbahnzellen innerhalb der Eikammern Wohnsitz sind normalerweise nicht durchlässig für den lebenden mitochondrialen Farbstoffen (6 und 7), die verbesserte mitochondriale Anfärbung der Drosophila Keimbahn - Zellen können sich aus einer Erhöhung der Permeabilität der beschädigten / sterbenden Gewebe; Ein solcher Artefakt mit dem Mito-ROS - Farbstoff (** in 9C und die gesamte Ovariole in 9D), sowie mit anderen lebenden mitochondrialen Flecken (nicht gezeigt) auftritt. Der Verlust von UbiGFP in 9D (*) könnte auch von Schäden führen, die die Abflachung der Eikammern verursacht. Obwohl andere Eikammern in der beschädigten Ovariole kann authentisch bleiben und frei (# in 9C Artefakt
Zeitempfindlichkeit: Im Fall von Lebend ex vivo Mikroskopie, sollten die Daten innerhalb von 15 min von Gewebebefestigungs erhalten werden; Andernfalls können die Versuchsergebnisse von Veränderungen der Physiologie der anschließenden Tod des Gewebes durch berührt. Manchmal, abhängig von der Laserleistung und andere Abtastparameter, die 10 & mgr; l Befestigungsmedium kann schneller verdunsten als 15 min. Die Detektion des mitochondrialen Cyclin E-Pool durch Co-Immunfärbung erfordert die Minimierung der Dissektion Zeit (wahrscheinlich aufgrund der vorübergehenden Natur des mitochondrial Cyclin E - Pool, der durch aktive mitochondriale Atmung 12) gehalten wird. Ein nennens mitochondrialen Cyclin E-Pool wurde auch nicht mit Permeabilisierung mal weniger als 30 min beobachtet.
FLIP: Die Bewegung von jedem Ei Kammer unter Prüfung während der FLIP Zeitverlauf zu artifactual Analysen führen können und somit ausgeschlossen werden müssen. Die Verwendung von Live-mitochondriale Farbstoffe oder TMRE nicht in einem FLIP-Experiment zu empfehlen, da Einbau des fremden Farbstoff die mitochondriale Kontinuität verändern können und damit zu artifiziellen Ergebnissen führen.
Drosophila Kreuzung Strategie: Das Kreuz reziprok zu dem hier beschriebenen (wo Männer die DRP1 mutierten Allel verwendet werden) nicht nachgibt viele Nachkommen, wahrscheinlich aufgrund einer nicht identifizierten Auswirkungen DRP1 Repression in den heterozygoten männlichen Eltern.
Interpretation von klonalen Daten: Jedes GF-negativen Klone in den Kontroll Ovarien nachgewiesenisoliert aus dem elterlichen Drosophila UbiGFP exprimieren artifactual falsch-negative Klone zeigen würde, wahrscheinlich aufgrund von GFP Verlust durch Beschädigung während der Präparation 16 verursacht erzeugt. Nichtsdestoweniger sollte die Anzahl der GFP-negativen Klonen in der Hitzeschock Nachkommen der Kreuzung deutlich höher als alle falsch-negative Klone in den Kontrollen gesehen. Die Klone in der Follikel Zellschicht Drosophila erzeugt durch die beschriebene mitotische Rekombination basierende Strategie aus den mitotischen Follikel Stammzellen entstehen (Zellklone stammen) oder aus den mitotischen nicht Stamm Follikelzellen (transient Klone). Für Stammzellklone, sollten die experimentellen Analysen nur 10 Tage nach der Hitzeschock durchgeführt werden, wenn die Eikammern mit den transienten Klone bereits gelegt worden sind. Für transiente Klone sollten die Analysen innerhalb von 6 Tagen nach dem Hitzeschock, mit den Follikel Zellklone der Ovariolen ohne Follikel Zellklon in der Germarium durchgeführt werden.
Änderungen und Fehlerbehebung
Während mitochondrialen Potential pro Masseneinheit der Bewertung der beschriebenen Verfahren, hat eine von der Mikroskopoptik oder mitochondriale Farbstoffkombinationen ergeben bewusst potentielle Artefakte zu sein. Jede Region ein geschwächtes Signal aus dem gesamten mitochondrialen Fleck zeigt und einen vergleichsweise erhöhten TMRE Signal (5A, *) aufgrund Fluoreszenz - Resonanzenergietransfer entstehen können (FRET) zwischen den Farbstoffen 8 oder aufgrund von unterschiedlichen optischen Eigenschaften des roten (TMRE) und grün (insgesamt mitochondrialen Farbstoff) Leuchtstoffröhren, eine feste Pinholegröße in den Erwerb Setup gegeben. Die FRET-bezogene Artefakt könnte durch eine Verringerung der Farbstoffkonzentrationen vermieden werden, wenn möglich, während quantitative Analysen auf Projektionen von 2 durchgeführt werden kann - 3 aufeinanderfolgende optische Scheiben, die optische Artefakt zu vermeiden. Auch, wenn ein Fluoreszenzsignal in dem Übersprechen und Queranregungs detektiertKanäle, müssen die Laser und Detektoreinstellungen das Signal in diesen Kanälen zu minimieren nachjustiert werden, die das Fluoreszenzsignal in den optimalen Kanäle zu reduzieren, wie auch zu erwarten ist.
Laser-induzierte beschädigte aus dem iterativen Photobleichens kann mitochondriale Fragmentierung verursachen und somit die mitochondriale Diskontinuität führen, einen erfolgreichen FLIP zu verhindern. Verdacht Fragmentierung der Mitochondrien während der Ausführung des Flip-Protokoll kann durch Erfassen höher aufgelöste Bilder mit einem reduzierten Pinhole (und Verbesserung der Detektorverstärkung) identifiziert werden. Wenn die Fragmentierung der Mitochondrien sichtbar während der Ausführung des Flip-Protokoll, die Leistung des Bleich Laser muss reduziert werden und / oder das Intervall zwischen aufeinanderfolgenden Bleichmittel muß erhöht werden bemerkt wird. Wenn es insgesamt Bleich ist , muß während des Zeitverlaufs des Experiments FLIP (Signal aus dem gelben ROI in 3B und C), wobei die Scanning - Laser auf einen Wert nachjustiert werdendass ermöglicht minimale oder gar keine Gesamtphotobleaching.
Um das Potenzial Artefakt aufgrund einer Schädigung induzierten Verlust von GFP, GFP-positive Klone vermeiden können mit der MARCM Strategie eingeführt werden, nach dem beschriebenen Hitzeschock-Protokoll. Hier wird die entsprechende Drosophila für das Kreuz verwendet werden soll jungfräulichen weiblichen drpKG03815 FRT40A / CYO X männlich Gal80 FRT 40A / Cyo; Wanne-Gal4, UAS-CD8GFP / TM6 9. Die Geradflügel Nachkommen sollten für Klon Generation verwendet werden, unter Verwendung von Hitzeschock (wie in Schritt 6 beschrieben).
Einschränkungen der Technik
A) Während die Follikel Zellen auf der Oberfläche der lebenden Drosophila Eikammern beinhalten die mitochondriale Färbung Farbstoffe mit Wohnsitz versagen die Keimbahnzellen im Ei Kammer zu tun; die Keimbahn der jüngeren Stadien Fleck schwach (5 und 6). B) Die Live - ex vivo tissue - Mikroskopie muss von einzelnen Drosophila, ein zu einer Zeit isoliert auf Ovarien innerhalb von 15 Minuten nach Beendigung der Färbung durchgeführt werden. Da Versuchsgruppen und am selben Tag abzubildenden verarbeitet werden sollen, getroffen , um die Gesamtzeit statistisch signifikante Daten von lebendem Gewebe ex vivo Mikroskopie von verschiedenen Versuchsgruppen zu erhalten , ist einigermaßen länger als diejenigen , die aus festen Geweben gewonnen. C) Wir haben festgestellt , dass das Mito-ROS - Färbung in der ex vivo Drosophila Gewebe nicht sehr stabil war, wahrscheinlich aufgrund der vorübergehenden Natur des ROS Analyt es erkennt , 17,15, welche die fehlende Erkennung des Signals von allen DRP1 zugrunde liegen kann null-Klone. Jedoch kann jede biologische Relevanz der Variabilität in Mito-ROS Färbung in den DRP1 null Zellen / Klone können nicht weiter ausgeschlossen und müssen untersucht werden. Beachten Sie, dass das positive Signal von der Mito-ROS Fleck kann nicht nur verbesserte Superoxid widerspiegeln, sondern auch die erhöhte mitochondriale oder Cellular oxidativen Umgebung 15. D) Die gesamte mitochondriale stain kann nicht für die GFP-negative oder positive GFP-klonale Experimenten verwendet werden, da das Fluoreszenzspektrum dieses mitochondrialen Fleck und GFP nicht zu unterscheiden sind. E) Das FLIP - Experiment entworfen , um die mitochondriale Matrix Kontinuität Assay würde die Bildaufnahme mit einem offenen Lochblende erfordern, die die Auflösung der mitochondrialen Strukturen umfasst.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung Studium ist von entscheidender Bedeutung für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der Mitochondrien-Funktionalität. Da deutlich mitochondriale Defekte zu verschiedenen Krankheiten beitragen, einschließlich Diabetes, Krebs, Parkinson-Krankheit, ein detailliertes Verständnis der mitochondrialen Vorgehensweise hält das Versprechen von Facilităţing die Entwicklung der Mitochondrien gerichtete therapeutische Strategien. Lebendzell-Mikroskopie ist ein unverzichtbares Werkzeug, um die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung für das Studium. Jedoch wurden in isolierten Zellen den meisten dieser Studien beschränkt. Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion wurde erweitert , 9 Drosophila Gewebe in einem ex vivo - Setup zu leben. Das beschriebene Protokoll dieser und verwandter Studien werden in lebenden Drosophila Ovarien zu einem Verständnis der mitochondrialen Struktur und Funktion führen, ex vivo, ein Verständnis der Mitochondrien in einer physiologischen Kontext zu ermöglichen. Diese ex vivo Ansatz hat signifikante Vorteile gegenüber in vitro Studien, da die Regelung der metabolischen und energetischen Eigenschaften der Mitochondrien in einer gegebenen Zelle auf die Nährstoffverfügbarkeit und entsprechende Signalisierung im physiologischen Kontext der Zellen stark abhängig ist.
Genetic manipulation of mitochondrial Struktur durch die mitochondrialen Protein Spaltungs DRP1 reprimierenden dereguliert den Zellzyklus - Modulator Cyclin E und wirkt sich auf die Entwicklung der Drosophila Ovarialfollikel Zellschicht 9,12. Hier enthält das Protokoll eine Beschreibung, wie die Einführung funktionell null Klone von DRP1 in den Drosophila Ovarien die mitochondriale Struktur-Funktions - Beziehung zu studieren. Ein neuer Pool von mitochondrialen Cyclin E auf Säugerzellen, wie auch die Drosophila Follikelzellen Schicht 12 erfolgreich erkannt wurde, die wahrscheinlich die gemeldete Cyclin E Regulation durch Mitochondrien zugrunde 18. Hier zeigt das Manuskript ein Verfahren zum Nachweis des neuartigen mitochondrialen Cyclin E - Pool durch Co-Immunfärbung festen Drosophila Ovarien für dCyclinE und einem mitochondrialen Marker (ATP-B).
Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering
Da tHut Drosophila melanogaster eine leistungsfähige genetische Modellsystem ist, sind unsere beschriebenen Methoden erwartet wesentlich zum Verständnis der genetischen Grundlage der mitochondrialen Struktur-Funktions - Beziehung in Gesundheit und Krankheit beitragen. Drosophila wurde führende die genetischen Wechselwirkungen herauszukitzeln tumorigenesis 19 weit verbreitet. Die Fähigkeit der Erzeugung von Klonen in der epithelialen Zellschicht Follikel Drosophila ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkung von Mitochondrien und Onkogenen oder Tumorsuppressoren in einzelnen tumorigenen Klone in eine in vivo und ex vivo - Setup. Die beschriebenen Verfahren können aus geeigneten mutanten Drosophila isoliert die Regulation der mitochondrialen Struktur-Funktions - Beziehung auf Ovarien zu studieren verwendet werden. Die beschriebenen Verfahren kann weiterhin die direkten Auswirkungen verschiedener Nähr- und Wachstumsfaktor zu studieren erweitert werden Signalisierung auf die mitochondriale Struktur und Funktion durch die exogenous Zugabe der entsprechenden Nährstoffe und / oder Wachstumsfaktoren in der ex vivo Abbildungsmedium. Die beschriebenen Verfahren können in geeigneter Weise in anderen isolierten Drosophila Gewebe modifiziert und verwendet werden, wie die Larven Imaginalscheiben, die weit verbreitet verwendet wurden Signaltransduktionswege in Krankheiten wie Krebs 20,21 zu studieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
