Summary
이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.
Abstract
이 렛 이식은 제 1 형 당뇨병 치료에 효과적이라는 것이 임상 적으로 입증되었습니다. 그러나 현재의 간 이식 전략은 급성 전혈 반응을 일으켜 가난한 췌도 이식을 일으킬 수 있습니다. 여기, 우리는 당뇨병 마우스 모델에서 epididymal fat pad (EFP)와 같은 간외 이식 부위에서 랑게르한스 섬 이식을위한 강력한 프로토콜을보고합니다. C57BL / 6J 마우스에서 고 수율로 islet을 분리하고 정제하는 프로토콜과 decellularized scaffold (DCS)에 랑게르한스 섬을 뿌리고 당뇨병을 유발 한 동종 C57BL / 6J 마우스의 EFP 사이트에 이식하는 방법을 설명합니다 스트렙토 조 토신. 500 개의 랑게르한스를 함유 한 DCS 그래프트는 10 일 이내에 고혈당 상태를 역전 시켰으며, DCS가없는 자유로운 랑슐은 적어도 30 일을 필요로했다. 정상 혈당은 이식편이 외과 될 때까지 최대 3 개월 동안 유지되었다. 결론적으로, DCS는 섬의 생육을 tEFP의 extrahepatic site는 쉽게 추출 할 수 있으며 인공 지지체의 성공적인 생존을 위해 필요한 다른 이식 매개 변수뿐만 아니라 발판 재료를 조사하기위한 재현 가능하고 유용한 플랫폼을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
제 1 형 당뇨병 (T1D)은 췌도 세포가 면역계에 의해 제거되어 환자가 평생 동안 외인성 인슐린 주사에 의존하게하는자가 면역 내분비 장애입니다. 에드먼턴 프로토콜은 췌도 이식에 대한 임상 연구에서 획기적인 사건입니다. islets은 문맥을 통해 주입하고 intrahepatic 사이트 1에 이식했다. 그러나 기증자 섬의 부적절한 공급원과 빈약 한 섬나기 생식의 두 가지 주요 장애물은 섬 이주의 넓은 성공을 방해합니다 2 . 일반적으로 한 환자의 고혈당 상태를 되돌리기 위해 3 개의 사체 기증자에게서 섬을 수집해야합니다. 이것은 췌도 단리 절차의 낮은 수확량과 이식 후 췌도 소실로 인한 것입니다. 특히, 이식 후 랑게르한스 섬이 산소가 풍부한 혈액에서 목욕되었지만, 혈액과의 직접적인 접촉은 종종 즉시 혈액 매개 염증을 일으켰다독소의 심각한 손실을 초래할 수있는 IBMIR 반응 (IBMIR). 장기적으로 환자의 점심 손실이 임상 그룹에서 당뇨병 역전 률의 감소를 가져 왔으며 첫 해에는 90 %에 도달 할 수 있었고 2, 5 분의 30 %와 10 %로 감소했다고 생각됩니다 년 이식 후 각각 3 .
간외 부위에서의 이식편 이식은 간내 주입과 비교하여 이식 부위를보다 명확한 위치로 제한하면서 독소와 혈액의 직접 접촉을 줄이는 매력적인 전략이었다. 지난 몇 년 동안 신장 캡슐, 눈, 근육, 지방 패드 및 피하 공간에서 연구가 진행되어 이러한 부위의 섬이 살아남아 정상적인 혈당을 회복시킬 수 있음을 보여줍니다 4 . 또한이 부위의 섬은 검색이 가능하므로 생체 검사 또는 추가 교체 절차가 가능합니다. 외 이식그러므로 ites는 임상 이식 5에 대한 큰 가능성을 보여줍니다.
생체 재료 기반 인공 지지체 (scaffolds)는 세포 이식 및 조직 공학에 대해 집중적으로 연구되어왔다. 3 차원 (3D) 스캐 폴드는 일반적으로 다공성 구조를 포함하며 세포의 공간 구조 / 조직을 생성하기위한 세포 주형 또는 생체 활성 단서의 제어 된 방출을 제공하는 저장소로서 작용할 수있다. 스캐 폴드는 또한 EFP에서 이식하기 위해 폴리 (글리콜 라이드 -L- 락 티드) 6 , 폴리 (디메틸 실록산) 7 및 열가소성 폴리 우레탄 8 과 같은 고분자 재료로 제조되었습니다. 아일렛의 직접 이식에 비해, 지지체의 사용이 기계적 보호 모듈화를 제공 복막 캐비티 (9), (10)에 섬의 누설을 방지하여 섬 손실을 줄이는 것으로 밝혀졌다국소 염증 반응을 일으킨다. 공사장 공중 발판 따라서 이식 사이트 7에서 섬의 생착을 촉진하기 위해 개발 될 수있다.
이 연구에서는 DCS를 이용한 마우스 모델에서 실시한 EFP에서 췌도 이식의 패러다임을 입증하고자합니다. 세포 외 기질에서 유래 된 골격은 합성물에 비해 우수한 생체 적합성과보다 자연적인 다공성 구조로 인해 최근에 큰 관심을 끌고있다. 여기, 우리는 C57BL / 6J 생쥐에서 높은 수율로 췌장 islets을 얻기 위해 강력한 격리 프로토콜을 설명합니다. 소 심낭에서 처리 된 DCS에 랑게르한스 섬을 뿌리고 이식편을 동종 당뇨병 모델에서 EFP에 이식 하였다. 쥐에서 정상 혈당증은 10 일 이내에 달성되었고 이식 물 제거까지 100 일까지 유지되었다.
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Protocol
모든 실험은 북경 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC, IACUC no. COE-LuoY-1)의 승인을 받았습니다.
1. 섬 격리
- 시약 및 장비 준비.
- HBSS에서 콜라게나 제 P 분말 (2 U / mg)을 재구성하여 5 mg / mL 용액을 만들고 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 박테리아를 제거하십시오. -20 ML에서 15 ML 원추형 튜브 및 저장에 콜라게나 제 P의 0.6 ML - 나누어지는 솔루션을 준비합니다.
참고 : 사용하는 동안 각 분액을 HBSS로 희석하여 최종 농도 0.5 mg / mL 또는 1 U / mL (3 마리 치료에 충분)의 6-mL 작업 용액을 얻습니다. 작업 용액을 얼음에 담아 1 시간 이내에 즉시 사용할 수 있습니다. 작업 솔루션을 추가 사용을 위해 복원하거나 다시 고정하지 마십시오. - HBSS에 FBS (2.5 %)와 P / S (1 %)를 첨가하여 중화 용액을 준비한다. 얼음에 솔루션을 유지. 트라 아에 중화 액 60 mL를 넣는다.t 6 마우스.
- 랑게르한스 배양 배지에 D- 포도당 (7 mM), FBS (10 %) 및 P / S (1 %)를 RPMI 1640 배지에 넣는다.
- 115 ° C에서 30 분간 15 psi의 압력으로 수술기구를 오토 클레이브하십시오.
- HBSS에서 콜라게나 제 P 분말 (2 U / mg)을 재구성하여 5 mg / mL 용액을 만들고 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 박테리아를 제거하십시오. -20 ML에서 15 ML 원추형 튜브 및 저장에 콜라게나 제 P의 0.6 ML - 나누어지는 솔루션을 준비합니다.
- 췌장의 인플레이션.
- 6 마리 생쥐 (12 주령)에 대해 1.1.1 단계에 명시된대로 콜라게나 제 작동 용액 12mL를 준비합니다. 9 ML의 작업 솔루션 10 ML 주사기를 채우고 27 G 정맥 주사 바늘에 주사기를 연결합니다. 얼음에 주사기를 보관하고 1 시간 이내에 용액을 사용하십시오.
- 자궁 경관 탈구로 안락사하십시오. 꼬리가 작업자를 향하게하여 마우스를 종이 타월에 누운 상태로 놓습니다. 70 % 에탄올로 몸 전체를 살포하여 완전히 젖게하십시오.
- 생식기 부위에서 시작하여 횡격막까지 확장하는 절개 가위 및 포셉을 사용하여 V 절개를하십시오. 복강을 완전히 드러내 기 위해 가슴에 피부를 접 힙니다.
- 움직임창자의 오른쪽에 장 및 췌장과 일반적인 담관을 노출. 겸자로 조심스럽게 십이지장을 잡고 담즙 덕트가 팽팽해질 때까지 당깁니다 ( 그림 1A -1 및 A - 2 ).
- 간으로 이어지는 문맥과 담관을 찾으십시오. 현미경 지혈 클램프로 문맥과 담관을 고정시킵니다.
참고 : 클램핑은 과도한 출혈과 콜라게나 제의 간으로의 침입을 방지합니다. - 겸자로 장을 잡고있는 상태에서 담관과 십이지장을 연결하는 팽대부의 위치를 찾습니다. 27G 정맥 주사 바늘을 ampulla ( 그림 1B -1 과 B - 2 )를 통해 일반적인 담즙 덕트에 삽입합니다.
- 캐뉼라가 담즙 덕트를 통해 모든 방법입니다 확인 콜라겐 분해 효소 작업 솔루션 약 200 μL를 분배. 콜라게나 제 용액이 덕트를 채우기 시작하면 (
1 과 C2 ), 바늘은 덕트의 내강에있다. 동맥 지혈 클램프를 사용하여 바늘이 들어있는 덕트 세그먼트를 클램프하고 1 분 이내에 느리고 일정한 속도로 용액 2 mL 나머지를 분배합니다 ( 그림 2A -1 , A-2 및 B-1 ).
참고 : 덕트를 감싸는 조직이 팽창하기 시작하면 ( 그림 2B -2 ) 바늘이 담관의 벽을 관통하여 바늘의 위치를 변경하고 담관을 다시 삽관해야합니다. 마찬가지로, 십이지장이 팽창하기 시작하면 ( 그림 2C -1 과 C-2 ), 동맥 지혈 클램프를 조정하고 담관을 다시 삽관해야합니다. 콜라게나 제 용액이 췌장을 채우면 십이지장 근처의 조직이 먼저 부풀어 오르고,이어서 지방이 팽창합니다췌장 꼬리 근처의 n. 췌장 꼬리 (맹장)의 관류는 췌도 수율을 최대화하는 데 중요합니다. - 췌장이 완전히 팽창 된 후 ( 그림 2C -1 ), 장의 왼쪽으로 장을 밀어 내리고 결장에서 시작하여 췌장을 제거합니다. 포셉을 사용하여 창자를 들어 올리고 다른 포셉 한 쌍으로 췌장과 분리하십시오. 췌장이 윗부분에서 떼어 낼 때까지 췌장을 제거하십시오. 마지막으로 췌장을 복부에서 들어 올려 나머지 비장에서 잘라냅니다.
참고 : 제거 과정에서 소화가 계속되므로 전체 분리를 신속하게 수행해야합니다. - 빈 15 ML 원뿔 튜브에 췌장을 놓고 얼음에 둡니다. 나머지 마우스에 대해 위의 절차를 반복합니다. 모든 췌장은 콜라게나 제 P에 의한 과다 소화를 예방하기 위해 즉시 1.3 단계를 따라 1 시간 이내에 추가로 처리해야합니다./ li>
그림 1 : 콜라겐 분해 효소 용액으로 담관의 삽관과 췌장 관류를 보여주는 사진. ( A1 ) 담즙 덕트가 팽팽해질 때까지 십이지장을 당깁니다. (팽창 : 십이지장 표면의 삼각형, 유백색 영역, 담관 : 표면의 끈 같은 유백색 구조). ( B1 ) ampulla에서 담즙 덕트에 바늘을 삽입. ( C1 ) 효소 주입으로 췌장을 팽창시킨다. ( A2, B2 및 C2 ) 각각 A1, B1 및 C1에 표시된 절차의 카툰 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 캐 뉼레이션의 문제 해결. ( A1 ) 담관의 담관에 삽입 된 바늘 끝. ( A2 ) 효소 용액으로 채워진 덕트. ( B1 ) 담즙 관의 내강에 삽입 된 바늘과 청색 염료가 채워진 덕트. ( B2 ) 부적절한 주사로 인해 바늘은 담관 아래에 있으며 파란색 염료를 투여 한 후에는 팽창 된 캡슐 만 관찰됩니다. ( C1 ) 성공적인 췌장 삽입술은 췌장의 팽창에 의해 입증됩니다. ( C2 ) 부적절한 클램핑으로 인해 파란색 염료가 십이지장에 들어가 팽창을 일으 킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- <> 소화 및 섬의 정화.
- 37 분 37 ° C에서 perfusion 췌장을 포함하는 원뿔 튜브를 품어.
참고 : 잠복기는 동물의 나이와 종에 따라 다를 수 있습니다. - 중화 용액 7 mL를 넣고 얼음에 튜브를 넣어 소화를 종결시킨다.
- 미세 조직 입자가 얻어 질 때까지 격렬히 튜브를 흔들어 조직을 떼어냅니다 ( 예 : 10 초에 20 번).
참고 : 췌장이 완전히 분리되지 않으면 섬의 수확량이 낮습니다. - 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거하기 위해 0.5mm 와이어 메쉬를 통해 소화 조직 샘플을 필터링합니다. 새 50 ML 원추형 튜브에서 섬 서스펜션을 수집합니다.
- 230Xg 및 4 ° C에서 3 분 동안 튜브를 원심 분리하고 조직 펠렛을 방해하지 않고 조심스럽게 상청액을 붓는다.
- 부드럽게 또는 p를 vortexing하여 4mL의 polysucrose 밀도 구배에 3 마리 생쥐에서 알약을 Resuspend서스펜션을 위아래로 몇 번 움직이지. 천천히 polysucrose 솔루션의 상단에 튜브의 측면 아래로 4 ML HBSS 피펫.
참고 : 두 솔루션은 잘 분리 된 레이어가 있어야하며 뚜렷한 인터페이스가 있어야합니다.
참고 : HBSS의 첨가는 바닥의 폴리 숙 크로즈 밀도 구배를 방해하지 않고 조심스럽게 수행되어야합니다. - 매우 느린 가속도를 선택하여 900 xg 및 4 ° C에서 20 분 동안 현탁액을 원심 분리하십시오. 브레이크없이 원심 분리를 종료하십시오.
참고 : 이것은 exocrine 세포에서 섬을 정제하는 단계입니다. 대부분의 섬은 polysucrose와 HBSS 층 사이의 인터페이스로 이동하며 대부분의 외분비 세포는 바닥에 정착합니다. - 대형 구멍 15 ML 피펫을 사용하여 8 ML 상등액의 전체를 제거합니다. 거꾸로 된 70-μm 스트레이너로 용액을 통과시킵니다.
NOTE : 랑카르는 스트레이너에 의해 더 정제되고 유지되는 반면, 외분비 세포필터를 통과합니다.
주의 : polysucorse 밀도 구배는 세포 독성입니다; 여과는 섬이 폴리 삭스를 없애는 데 도움이 될 것입니다. - 차가운 중화 용액 2 mL를 35 mm 페트리 접시에 넣으십시오. 셀 스트레이너를 오른쪽으로 뒤집은 다음 표면을 용액에 담그고 용액을 부드럽게 흔들어 독도를 놓습니다.
- 흰색 팁이 달린 20 μL 피펫을 사용하여 현미경으로 섬을 손으로 선택하십시오.
참고 : 독소는 노란 컴팩트 세포 응집체 ( 그림 3A )이며, 오염 exocrine 조직이나 세포는 해부 현미경 아래에 검은 색과 느슨한 구조를 가지고 있습니다. - 배양 배지 2 mL가 들어있는 35 mm 접시에 약 200 개의 독도를 놓고 37 ℃에서 5 시간 동안 5 % CO 2가 공급 된 배양기에서 배양하십시오.
참고 : 일반적으로 150-300 islets는 12 주 된 C57BL / 6J 마우스 하나에서 수확 할 수 있습니다. 아일렛은 배양 중에 응집체를 형성하는 경향이 있으며,큰 섬 (> 300 μm)은 중추 괴사에 민감합니다 ( 그림 1B , 삽입). 현탁액을 잘 흔들어서 아일렛을 접시에 골고루 분산시키고 응집을 줄이십시오.
- 37 분 37 ° C에서 perfusion 췌장을 포함하는 원뿔 튜브를 품어.
2. 비계의 섬 문화
참고 : DCS는 약 79 %의 다공성, 약 0.6mm의 두께 및 12 ~ 300μm 범위의 기공 크기를 지니고 있습니다.
- 비계를 7mm 디스크로 자르고 70 % 에탄올에 담근 다음 HBSS로 씻어냅니다. 24 잘 조직 문화 삽입에 비계를 놓습니다.
참고 : 밤새 배양 한 후 신선한 섬이 회복되면 섬은 매끄럽고 경계가 밝고 단단합니다 ( 그림 3B ). - 소용돌이 치는 접시와 백색 팁으로 20 μL 피펫을 사용하여 접시의 중심에서 독도를 수집하십시오. 피펫을 사용하여 독도를 발판 (250도 / 스캐 폴드)에 옮기고 2 mL의 배양 배지를우물. 이식 12 시간 전에 독도를 배양하십시오.
3. EFP 사이트에서이 렛 이식
- 수혜자 마우스에서의 당뇨병 유발.
- C57BL / 6J 생쥐 (10 주 이상)를 식수가없는 새장에 넣으십시오. 당뇨병의 유도 10 시간 전에 마우스를 빨리.
- 0.1 M 시트르산과 0.1 M 시트르산 나트륨을 혼합하여 4.2-4.5의 pH 값을 갖는 완충 용액을 준비한다. 새로 준비한 버퍼에 STZ (10 MG / ML)를 용해시키고 0.22 μm의 필터를 통과시켜 용액을 멸균시킨다.
참고 : STZ는 빛에 민감하며 10 분 이내에 활동을 잃습니다. 주입 직전에 항상 신선한 STZ 용액을 준비하십시오. - 각 C57BL / 6J 마우스에 대해 140-150 mg / kg의 용량으로 STZ를 복강 내 주사합니다.
참고 : 복용량은 동물의 나이와 종에 따라 다릅니다. 소규모의 용량 최적화를 수행하는 것이 좋습니다성충 실험을 시작하기 전에 - 꼬리 정맥혈을 모으고 STZ 주입 후 2, 3, 4 일에 혈당 측정기로 혈당을 모니터하십시오.
참고 : 동물이 2 일 연속으로 고혈당증 (비 공복 혈당> 16.7 mM)을하면 췌도 이식 준비가됩니다.
- Islet을 EFP 사이트로 이식.
- 복강 내 (50mg / kg) 전달 pentobarbital와 마우스를 마취. 꼬리가 작업자를 향하게하여 마우스를 종이 타월에 누운 상태로 놓습니다. 절개 부위 주위에서 모피를 제거하기 위해 복부를 광범위하게 면도하십시오. 4 개의 팔다리를 테이프로 감싼 다음 절개 부위를 살균하기 위해 순환 방식으로 이동하는 알코올과 요오드 포어 잎사귀로 피부를 완전히 닦아냅니다. 마우스를 멸균 드레이프로 감싸고 절개 부위 만 접근하십시오. 복막 벽을 통해 7 mm 절개를정중선, 성기 주변.
참고 : 장갑을 포함하여 수술 중에 사용되는 모든기구는 멸균해야합니다. - 부드럽게 잡고 포셉을 사용하여 복강에서 EFP를 제거합니다. 젖은 멸균 거즈 위에서 EFP를 퍼뜨립니다. EFP에 섬을 포함하는 발판을 놓고 EFP를 접어 이식 물을 포장하십시오. 흡수 가능한 6-0 봉합사로 EFP를 봉합하여 독도와 EFP 사이의 직접 접촉을 확보하십시오. 젖은 면봉을 사용하여 멸균 식염수로 EFP의 표면을 적셔 EFP가 마르지 않도록하십시오.
- 부드럽게 EFP를 복강에 다시 놓습니다. 복막 벽을 봉합하고 피부 레이어를 상처 클립으로 클램핑하여 절개를 닫습니다.
- 진통제로 buprenorphine (0.1 mg / kg)을 피하 주사하십시오.
- 탈수를 방지하기 위해 생리 식염수 1 mL를 피하 주사하십시오.
- 마우스가 마취에서 회복 될 때까지 가열 패드에 새장에 마우스를 놓습니다.
- 비 공복 혈당 검사꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 이틀 후에 발병시켰다. 이식편을 검색하는 경우 위의 이식 절차를 반복하고 부드럽게 EFP를 꺼내고 3-0 봉합사를 사용하여 부고환에 인접한 지방 패드의 끝을 연결하고 혈관을 막은 다음 EFP 이식편을 절개 한 다음 조직학을 위해 보존합니다 .
참고 : 독소를 explanting은 이식의 기능을 확인, 3 일 이내에 다시 hyperglycemic받는 마우스를 렌더링해야합니다.
- 복강 내 (50mg / kg) 전달 pentobarbital와 마우스를 마취. 꼬리가 작업자를 향하게하여 마우스를 종이 타월에 누운 상태로 놓습니다. 절개 부위 주위에서 모피를 제거하기 위해 복부를 광범위하게 면도하십시오. 4 개의 팔다리를 테이프로 감싼 다음 절개 부위를 살균하기 위해 순환 방식으로 이동하는 알코올과 요오드 포어 잎사귀로 피부를 완전히 닦아냅니다. 마우스를 멸균 드레이프로 감싸고 절개 부위 만 접근하십시오. 복막 벽을 통해 7 mm 절개를정중선, 성기 주변.
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Representative Results
현미경 지혈 클램프를 사용하여 수행 한 우리의 클램핑 방법은 봉합 결합 기술에 비해 간단하고 시간을 절약합니다. 6 마리의 쥐에서 1,200 개의 독도를 분리 및 정제하는 데 대략 4 시간이 걸렸습니다. 새롭게 단리 된 섬은 일반적으로 광학 현미경 ( 그림 3A ) 아래에 거친 주변을 가지고 있습니다. 섬이 격리 과정에서 회복되면 밝고 단단한 표정을 짓고 매끄러운 표면을 얻습니다. 그러나, 스트레스가 많은 격리는 여전히 세포 사멸을 유도하여 섬 표면의 세포를 박살낼 수 있으며, 건강에 해로운 섬은 종종 어두운 괴사 코어를 포함합니다 ( 그림 3B ). 우리는 5 마리의 마우스로부터 945 개의 랑게르한스 섬의 직경을 측정했다. 계산 된 평균 섬 랑 직경은 130.42 ± 41.75 ㎛ ( 도 3C )였다.
수령인의 면역을 피하려면 우리는 C57BL / 6J 마우스에서 동종 이식 수술을 시행했다. 일반적으로 EFP 부위에 500 개의 랑게르한스 DCS를 이식하여 프리 아일렛 그룹에서 관찰 된 30 일과 비교하여 10 일 이내에 고혈당을 역전시켰다. 정상 혈당치는 이식편을 회수 할 때까지 약 100 일 동안 유지되었습니다 ( 그림 3D ). 적재 된 랑게르한스섬은 DCS에 골고루 퍼지고 EFP에 의해 덮였다. islet-laden DCS는 또한 포셉을 사용하여 쉽게 처리 할 수 있습니다 ( 그림 3E 및 3F ). 조직 학적 연구에 따르면 60 일 동안 이식 한 후 EFP 조직과 DCS에 의해 고르게 분포 된 섬 세포가 혈관 재순환되고 둘러싸인 것으로 나타났습니다 ( 그림 3G ). 인슐린의 면역 염색은 섬의 성공적인 생착을 확인했다 ( 그림 3H ).
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그림 3 : EFP 사이트에 스캐 폴드 지원 랑게르한스 섬의 이식. ( A ) 쥐에서 분리 된 신선한 섬의 대표 그림. ( B ) Islets는 12 시간 동안 배양되었고, 죽은 세포는 섬 표면에서 떨어져 나왔다. 삽입 : 건강에 해로운 독도에는 암흑 괴사 성 코어가 있습니다. ( C ) 5 마우스에서 945 섬의 크기 분포. ( D ) DCS가 지원 된 랑게르한스 섬 (islet)과 자유 섬 (free islets)을 이식 한 당뇨병 쥐의 비 공복 혈당 수치. 검은 색 화살표는이 시점에서 이식편이 회수되었음을 나타냅니다. ( E ) 확산 EFP 조직의 표면에 랑게르한 발판의 전달을 보여주는 사진. ( F ) 랑게르한스 DCS의 대표적인 위상차 이미지. 인 세트 : 집게에 의해 개최 DCS의 광학 그림. ( G ) 대표 histological H 조 & 전자 이미지60 일 후에 DCS와 EFP로 둘러싸인 이식 된 섬. ( H ) DCS-지지 된 랑게르한스 섬의 면역 염색은 60 일 후에 체외 이식되었다. 스케일 바 = 150 μm (A, B), 100 μm (F), 500 μm (G) 및 25 μm (H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
췌장 관류 및 소화 시간은 랑게르한 수확량 및 품질에 영향을 미치는 두 가지 주요 매개 변수입니다. Moskalewski 먼저 다진 기니 돼지 췌장 11 소화 조게나 혼합물의 사용을보고 하였다. Lacy et al. 크게 섬 (12)을 수득 증가 췌장을 관류하는 덕트 시스템에 효소 주입을보고 하였다. 효소의 도관 관류보다 균일 소화 췌장 13 다진 소화에 비해 본래 큰 아일렛의 분리의 결과로, 췌장 효소 표면적의 최대 노출을 허용한다. 우리의 경험에서 담관의 성공적인 삽입과 전체 췌장의 재관류는 높은 랑게르한 수확량을위한 전제 조건이었다. 이것은 췌장의 꼬리 (맹장)가 실제로 십이지장에 가까운 췌장 조직에 비해 대부분의 섬을 포함하기 때문입니다. cannulate에는 두 가지 방법이 있습니다. 문헌에보고 된 담즙 관 : i) 효소가 십이지장 내로 침투하는 것을 막는 동안 간 부위에 바늘을 삽입하고 13 ) 14 ) 효소의 진입을 차단하면서 십이지장 가까이에 바늘을 삽입한다. 간 15 . 여기에서는 후자의 기술을 채택했는데 바늘을 구부리거나 마우스를 재 위치시킬 필요가 없습니다. 잘 훈련 된 연구원은 우리의 프로토콜을 따르는 경우 40 분 이내에 10 마리의 생쥐의 삽관을 수행 할 수 있습니다. 췌장의 소화 시간은 생쥐의 나이와 종에 따라 다릅니다. 과소 소화 췌장은 작은 섬을 생산하고 소화가되지 않은 췌장은 섬세포에 연결된 아세 나셀 세포를 가지고 있습니다. 따라서 건강한 독도의 높은 수확량을 얻기 위해 소화 시간을 최적화하는 것이 중요합니다.
STZ는 3 일 이내에 베타 세포를 특이 적으로 파괴하고 생쥐에서 당뇨병을 유발하는 항생 물질입니다ss = "xref"> 16. 복용량은 특정 마우스의 변형 및 연령에 따라 다르며 사전 실험을 통해 결정해야합니다. 우리의 지식으로 볼 때, C57BL / 6J 마우스는 Balb / C 마우스보다 적은 양의 STZ를 필요로합니다. STZ의 과다 복용은 심한 고혈당증을 일으키고 일주일 이내에 동물의 죽음을 초래할 수 있으며, 부적절한 STZ 투여는 당뇨병 발병률을 낮 춥니 다.
EFP는 고도로 혈관을 형성 한 조직이며 최소 침습적 절차를 통해 수술에 편리하게 접근 할 수 있습니다. EFP 로의 랑게르한스 이식은 일반적으로 쥐 모델에서 췌도 이식을위한 또 다른보고 된 사이트 인 신장 캡슐에 비해 더 쉽고 안전합니다. 특히, 신장은 필수 장기이며 취급하기에 섬세합니다. 독도의 이식이 실패하거나 동물이 수술에서 생존하지 못할 수 있습니다 4 . 생쥐의 EFPs도 인간의 omental 주머니와 유사합니다. EFP에서의 이식 연구는 우리의췌도 생존 / 기능에 대한 필수 조직 환경에 대한 이해뿐만 아니라 임상 이식 절차 개발을위한 토대 마련 17 .
이 연구에서 사용 된 DCS는 소 심낭에서 유래되었으며 주로 콜라겐으로 만들어졌다. 탈 셀화 된 물질은 면역 원성을 나타내지 않을 수 있으며 생체 내 에서만 경미한 염증 반응 을 유도 할 수 있습니다 18 . DCS의 구멍 안에 섬이 뿌려지면 비계는 기계적 보호를 제공하고 섬들이 서로 응집되는 것을 막아 섬의 괴사를 일으킬 수 있습니다. 독소를 포함하는 DCS 발판은 포셉을 사용하여 직접 처리 할 수 있으므로 이식편을 쉽게 옮길 수 있습니다. EFP 내에 골격 매립 또한 지지체 8 이식없이 자유 아일렛 달리 복막 내로 아일렛의 누설을 감소시켰다. 따라서 DCS는 distinc을 제공합니다.췌도 이식에 유리합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 Guellhao Biotech의 Wei Zhang에게 탈 세포 골격을 제공 해준 것에 감사드립니다. 우리는 도움이되는 토론을 위해 X홍 펭에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 자연 과학 재단 (Project No.31322021)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
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