Summary
Detta protokoll demonstrerar murinisolisolering och sådd på en decellulariserad byggnadsställning. Ställstödda öar transplanterades i den epididymala fettkudden av streptozotocin (STZ) -inducerade diabetiska möss. Islets överlevde vid transplantationsstället och reverserade hyperglykemiska tillståndet.
Abstract
Isletransplantation har kliniskt visat sig vara effektiv vid behandling av typ 1-diabetes. Den nuvarande intrahepatiska transplantationsstrategin kan emellertid medföra akuta helblodsreaktioner och resultera i dålig engagemang av öl. Här rapporterar vi ett robust protokoll för transplantation av öar på den extrahepatiska transplantationsstället - den epididymala fettkudden (EFP) - i en diabetisk musmodell. Ett protokoll för isolering och renning av öar med höga utbyten från C57BL / 6J möss beskrivs, såväl som en transplantationsmetod som utförs genom såddöppningar på en decellulariserad ställning (DCS) och implanterar dem vid EFP-stället i syngeniska C57BL / 6J möss gjorda diabetiker Av streptozotocin. DCS-transplantatet innehållande 500 öar reverserade det hyperglykemiska tillståndet inom 10 dagar, medan de fria öarna utan DCS krävde minst 30 dagar. Normoglykemi upprätthölls i upp till 3 månader tills transplantatet eksplanterades. Sammanfattningsvis ökade DCS engagemanget av öar i tHan extrahepatiska platsen för EFP, som lätt kan hämtas och kan ge en reproducerbar och användbar plattform för undersökning av byggnadsmaterialet, liksom andra transplantationsparametrar som krävs för en framgångsrik islet-ingrepp.
Introduction
Typ 1 diabetes mellitus (T1D) är en autoimmun endokrin störning där isceller ableras av immunsystemet, vilket gör patienterna beroende av injektion av exogent insulin under hela sitt liv. Edmonton-protokollet utgör en milstolpe i kliniska studier av öletransplantation; Öar infunderades genom portvenen och transplanterades på den intrahepatiska platsen 1 . Dock är två stora hinder - otillräckliga källor till donoröar och fattig öl-engagemang - förhindra den stora framgången med öletransplantationen 2 . Vanligtvis måste holmar samlas in från tre kadaveriska givare för att reversera det hyperglykemiska tillståndet hos en patient; Detta beror på det låga utbytet av isoleringsprocedurer och ölförlusten efter transplantation. I synnerhet, även om post-transplantationsöarna badades i syrerikt blod, framkallade den direkta kontakten med blod ofta det ögonblickliga blodmedierade inflammaTory-reaktion (IBMIR), vilket kan orsaka den akuta förlusten av öarna. På lång sikt anses det att den gradvisa förlusten av öar hos patienter stod för minskningen av diabetesomvandlingshastigheter i de kliniska grupperna, vilket kan nå 90% under det första året och minskat till 30% och 10% med 2 och 5 År efter transplantation respektive 3 .
Isletransplantation på extrahepatiska ställen har varit en attraktiv strategi för att minska direktkontakt av öar med blod samtidigt som transplantationerna begränsas till mer definierbara platser jämfört med intrahepatisk infusion. Studier har utförts i njurkapsel-, ögon-, muskel-, fettkuddar och subkutana utrymmen under de senaste åren, vilket visar att öar på dessa platser kan överleva och fungera för att återställa normoglykemi 4 . Dessutom är öarna på dessa platser återvinningsbara, vilket gör det möjligt för biopsi eller till och med för ytterligare ersättningsförfaranden. Extrahepatic sDet visar därför stor potential för klinisk transplantation 5 .
Biomaterialbaserade byggnadsställningar har undersökts intensivt för celltransplantation och vävnadsteknik. Tredimensionella (3D) byggnadsställningar innehåller vanligtvis porösa strukturer och kan fungera som cellulära mallar för att generera rumslig struktur / organisering av celler eller som reservoarer för att ge det kontrollerade frigivandet av bioaktiva signaler. Ställen har också tillverkats av polymera material, såsom poly (glykolid-L-laktid) 6 , poly (dimetylsiloxan) 7 och termoplastisk poly (uretan) 8 , till transplantationsöar i EFP. Jämfört med den direkta transplanteringen av öar befanns användning av byggnadsställningar minska minskningen av islet genom att förhindra läckage av öar i den intraperitoneala kaviteten 9 , 10 , vilket gav mekaniskt skydd och moduLating den lokala inflammatoriska reaktionen. Byggnadsställena kan sålunda utvecklas för att befrämja islet-ingrepp vid transplantationsställena 7 .
I denna studie avser vi att visa ett paradigm för öletransplantation i EFP, utförd i mössmodeller med hjälp av en DCS. Byggnadsställningar som härrör från extracellulära matriser har drabbat stort intresse de senaste åren tack vare överlägsen biokompatibilitet och mer naturliga porösa strukturer jämfört med syntetiska produkter. Här beskriver vi ett robust isolationsprotokoll för att erhålla pankreatiska öar med höga utbyten från C57BL / 6J möss. DCSs bearbetade från bovin perikardium såddes sedan med öar och transplantaten transplanterades till EFP i syngeniska diabetiska modeller. Normoglykemi hos möss uppnåddes inom 10 dagar och bibehölls i upp till 100 dagar tills borttagning av transplantaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment godkändes av Peking University Institutionella djurvård och användningskommitté (IACUC, IACUC nr. COE-LuoY-1).
1. Islet Isolation
- Beredning av reagenser och utrustning.
- Rekonstituera kollagenas P-pulver (2 U / mg) i HBSS för att göra en 5 mg / ml lösning och filtrera den genom ett 0,22 μm filter för att ta bort bakterierna. Bered 0,6 ml alikvotlösningar av kollagenas P i 15 ml koniska rör och förvara vid -20 ° C.
OBS: Under användning späds varje alikvot med HBSS för att ge 6 ml arbetslösningar med slutliga koncentrationer av 0,5 mg / ml eller 1 U / ml (tillräckligt för att behandla 3 möss). Arbetslösningen hålls på is för omedelbar användning inom 1 h. Arbetslösningen ska inte återställas eller återfrysas för ytterligare användning. - Förbered neutraliseringslösningen genom att tillsätta FBS (2,5%) och P / S (1%) i HBSS; Håll lösningen på is. Bered 60 ml neutraliseringslösning till treaT 6 möss.
- För ölkulturmediet tillsätt D-glukos (7 mM), FBS (10%) och P / S (1%) till RPMI 1640-medium.
- Autoklavera operationsinstrumentet vid 115 ° C under 30 minuter och 15 psi tryck.
- Rekonstituera kollagenas P-pulver (2 U / mg) i HBSS för att göra en 5 mg / ml lösning och filtrera den genom ett 0,22 μm filter för att ta bort bakterierna. Bered 0,6 ml alikvotlösningar av kollagenas P i 15 ml koniska rör och förvara vid -20 ° C.
- Inflammation i bukspottkörteln.
- Förbered 12 ml kollagenasarbetslösning, som specificerats i steg 1.1.1, för 6 möss (12 veckor gamla). Fyll 10 ml sprutan med 9 ml arbetslösning och anslut sprutan till 27 G intravenös nål. Förvara sprutan på is och använd lösningen inom 1 h.
- Euthanize musen genom cervikal dislokation. Placera musen i viloläge på en pappershandduk, med svansen som pekar mot operatören. Spraya hela kroppen med 70% etanol, vilket gör den helt våt.
- Gör ett V-snitt, som börjar från genitalområdet och sträcker sig till membranet, med hjälp av dissektionssax och pincett. Vikta huden över bröstkorgen för att fullständigt avslöja bukhålan.
- FlyttaTarmen till höger om musen och exponerar bukspottkörteln och vanliga gallgången. Ta tag i duodenum försiktigt med tång och dra det tills gallgången är spänd ( Figur 1A -1 och A-2 ).
- Hitta portalvenen och gallgången som leder till levern. Kläm portvenen och gallkanalen med en mikroskopisk hemostatisk klämma.
OBSERVERA: Klämningen förhindrar överdriven blödning och inmatning av kollagenas i levern. - Medan du fortfarande håller tarmarna med tången, hitta platsen för ampullen som förbinder gallgången och duodenum. Sätt in 27G-intravenös nål i den gemensamma gallkanalen genom ampullen ( Figur 1B -1 och B-2 ).
- Dispense ca 200 μL kollagenas arbetslösning för att kontrollera om kanyleringen är hela vägen genom gallgången. Om kollagenaslösningen börjar fylla kanalen ( 1 och C2 ), nålen ligger i kanalens lumen; Kläm fast kanalsegmentet som innehåller nålen med hjälp av en hemostatisk klammer och dra resten av 2 ml lösningen långsamt och konstant i 1 minut ( Figur 2A -1 , A-2 och B-1 ).
OBS: Om vävnaden som omger kanalen börjar blåsas upp ( Figur 2B -2 ) har nålen pekat genom gallrörets vägg, vilket gör det nödvändigt att placera nålen igen och försök att kanylera gallröret igen. På liknande sätt, om duodenum börjar blåsa upp ( Figur 2C -1 och C-2 ), måste den arterie hemostatiska klämman justeras och gallkanalen omkanyleras. När kollagenaslösningen fyller upp bukspottkörteln uppblåses vävnaden nära duodenum först, följt av regionenN nära bukspottskörteln. Perfusionen av bukspottskörteln (mjältloben) är viktig för att maximera ölutbytet. - Efter den fullständiga inflationen i bukspottkörteln ( Figur 2C -1 ), tryck tarmen till vänster på musen och ta bort bukspottkörteln genom att börja vid den nedåtgående kolon. Använd tången för att lyfta tarmen och separera den från bukspottkörteln med ett annat par tångar. Fortsätt att ta bort bukspottkörteln tills den är fäst från toppen av magen. Slutligen lyfta bukspottkörteln ur buken och skära den fritt från resterande mjälte.
OBS: Hela separationen ska utföras snabbt, eftersom matsmältningen fortsätter under avlägsnandet. - Placera bukspottkörteln i ett tomt 15-ml koniskt rör och lämna det på is. Upprepa ovanstående procedur för de återstående mössen. Alla bukspottkörteln bör behandlas vidare inom 1 h genom att snabbt följa steg 1.3 för att förhindra överdjupning med kollagenas P. </ Li>
Figur 1: Fotografier som visar kanylkanalens kanylering och bukspottkörtelns perfusion med kollagenaslösningar. ( A1 ) Dra duodenum tills gallgången är spänd. (Ampulla: den triangulära, mjölkiga ytan på duodenums yta, gallgång: den sladdliknande mjölkstrukturen på ytan). ( B1 ) Sätter in nålen i gallkanalen från ampullen. ( C1 ) Inflammation i bukspottkörteln med injektion av enzym. ( A2, B2 och C2 ) Tecknade bilder av de förfaranden som visas i A1, B1 respektive C1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Felsökning för kanyleringen. ( A1 ) Nålspetsen införs i gallrörets lumen. ( A2 ) Kanalen fylld med enzymlösningar. ( B1 ) Nålen infördes i gallrörets lumen och kanalen fylld med ett blått färgämne. ( B2 ) På grund av olämplig kanylering är nålen under gallgången och endast en uppblåst kapsel observeras efter att den blåfärgade dosen har avgivits. ( C1 ) En framgångsrik kanylering framgår av distansionen av bukspottkörteln. ( C2 ) På grund av olämplig klämning, kommer blå färg in i duodenum och orsakar distans. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- <Stark> Digestion och rening av öar.
- Inkubera de koniska rören som innehåller perfusionerad pankreas vid 37 ° C i 17 minuter.
OBS: Inkubationstiden kan variera med djurens ålder och art. - Avsluta matsmältningen genom att tillsätta 7 ml neutraliseringslösning och sätta rören på is.
- Dissociate vävnaden genom att skaka rören kraftigt (t ex 20 gånger i 10 s) tills fina vävnadspartiklar erhålls.
OBS: Ölutbytet blir lågt om bukspottkörteln inte dissocierar helt. - Filtrera de digererade vävnadsproverna genom 0,5 mm trådnät för att avlägsna eventuella icke-smältvävnadsbitar. Samla ölsuspensionerna i ett nytt 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera rören i 3 minuter vid 230 xg och 4 ° C och häll supernatanten försiktigt, utan att störa vävnadspelletsna.
- Resuspendera pelletsen från 3 möss i 4 ml polysukroseldensitetsgradient genom att vortexa försiktigt eller pIpetting suspensionen upp och ner några gånger. Långsamt pipetterar 4 ml HBSS längs rörets sida till toppen av polysukroslösningarna.
OBS! De två lösningarna ska vara välskilda skikt med ett skarpt gränssnitt.
ANMÄRKNING: Tillägg av HBSS bör utföras med försiktighet utan att störa polysukroseldensitetsgradienten längst ner. - Centrifugera suspensionen under 20 minuter vid 900 xg och 4 ° C genom att välja en mycket långsam accelerationshastighet. Avsluta centrifugeringen utan broms.
OBS! Det här är ett steg för att rena öarna från exocrina celler, med de flesta öarna som migrerar till gränssnittet mellan skikten av polysukros och HBSS och de flesta exocrina celler som sätter sig i botten. - Ta bort hela 8 mL-supernatantlösningen med en 15 ml pipett med stor borrning. Passera lösningarna genom en inverterad 70 μm sil.
OBS: Öarna kommer att renas ytterligare och behållas av silen, medan de exokrina cellernaKommer att passera genom filtret.
Varning: Polysucorse densitetsgradienten är celltoxisk; Filtreringen kommer att hjälpa holmarna att bli av med polysukrosen. - Pipettera 2 ml kall neutral neutraliseringslösning i en 35 mm petriskål. Vänd cellsidan höger uppåt, doppa ytan som håller hallen i lösningen och skaka försiktigt för att lossa öarna.
- Handplocka öarna under ett mikroskop med en 20-liters pipett med en vit spets.
OBS: Öarna är gulaktiga, kompakta cellaggregat ( Figur 3A ), medan den förorenande exokrina vävnaden eller cellerna har en svart och lös struktur under dissekeringsmikroskopet. - Placera ca 200 cellöar i en 35-mm skål med 2 ml odlingsmedium och inkubera vid 37 ° C i en inkubator som medföljer 5% CO2 under 12 timmar.
OBS! Vanligtvis kan 150-300 öar skördas från en 12-veckors gammal C57BL / 6J-mus. Islets är benägna att bilda aggregat under kultur,Och de stora öarna (> 300 μm) är mottagliga för centralnekros ( Figur 1B , inset). Skaka suspensionen väl för att jämnt fördela öarna i disken och för att minska klumpningen.
- Inkubera de koniska rören som innehåller perfusionerad pankreas vid 37 ° C i 17 minuter.
2. Islet Culture on the Scaffold
OBS: DCS har en porositet av ca 79%, en tjocklek av ca 0,6 mm och en porstorlek som sträcker sig från 12 till 300 pm.
- Skär byggnadsställningarna i 7 mm skivor, dra dem i 70% etanol och tvätta dem med HBSS. Placera ställningarna i 24-brunns vävnadsodlingsinsatser.
OBSERVERA: När friska öar återvinns efter övernattning, ser islen ljust och tätt ut, med jämna gränser ( Figur 3B ). - Virvla runt maträtten och samla hällen från mitten av maträtten med en 20 μL pipett med en vit spets. Överför öarna till byggnadsställena (250 öar / byggnadsställningar) med hjälp av en pipett och tillsätt 2 ml odlingsmedium tillbrunnen. Kultur öarna i 12 timmar före transplantation.
3. Islets Transplantation på EFP Site
- Diabetes induktion hos mottagande möss.
- Placera C57BL / 6J möss (mer än 10 veckor gamla) i en ny bur med vattenförsörjning men ingen mat. Snabb musen i 10 timmar före induktion av diabetes.
- Beredda buffertlösningar med pH-värden på 4,2-4,5 genom att blanda 0,1 M citronsyra med 0,1 M natriumcitrat. Lös upp STZ (10 mg / ml) i den färskberedda bufferten och sterilisera lösningen genom att passera den genom ett 0,22 μm filter.
OBS: STZ är ljuskänslig och förlorar aktivitet inom 10 minuter; Förbered alltid den fria STZ-lösningen precis före injektionen. - Injicera varje mus intraperitonealt med STZ i en dos av 140-150 mg / kg för varje C57BL / 6J-mus.
OBS: Dosen varierar beroende på djurets ålder och art. Det rekommenderas att utföra en liten dosoptimeringsteknikSt för den givna arten innan det formella experimentet påbörjas. - Samla svansvinsblodet och kontrollera blodsockret med en glukosmätare på dag 2, 3 och 4 efter STZ-injektionen.
OBS! När djuren är hyperglykemiska (icke-fastande blodglukos> 16,7 mM) på två på varandra följande dagar är de redo för öletransplantation.
- Transplantation av öar till EFP-platsen.
- Bedöva mössen med pentobarbital levererad intraperitonealt (50 mg / kg). Placera musen i viloläge på en pappershandduk, med svansen som pekar mot operatören. Raka buken i stor utsträckning för att ta bort pälsen från omkring snittet. Tape ner de fyra extremiteterna och vattna huden fullständigt med alternerande alkohol och iodofordukar rördes cirkulärt för att sterilisera snittet. Drapa musen med en steril drapering, som bara tillåter åtkomst till snittområdet. Gör ett 7 mm snitt genom peritonealväggen iMittlinje, nära genitalområdet.
OBS! Alla instrument som används under operationen, inklusive handskar, bör vara sterila. - Ta försiktigt och ta bort EFP från bukhålan med hjälp av pincett. Sprid EFP på fuktig steril gasbindning. Placera ställningen som innehåller holmar på EFP och vika EFP för att fälla in transplantationen. Säkra den direkta kontakten mellan holmarna och EFP genom att sutra EFP med absorberbara 6-0 suturer. Våt ytan av EFP med steril saltlösning med en genomvattnad bomullspinne för att förhindra att EFP torkar ut.
- Placera EFP försiktigt i bukhålan. Stäng snittet genom att suturera bukväggen och klämma det dermala skiktet med sårklämmor.
- Injicera buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant som smärtstillande medel.
- Injicera 1 ml saltlösning subkutant för att förhindra uttorkning.
- Placera musen i en bur på en värmepanna tills musen återhämtar sig från anestesi.
- Kontrollera den icke-fastande glukoslekenVältar två dagar senare genom att samla blod från svansvenen. Om du hämtar transplantatet, upprepa ovanstående transplantationsprocedurer, dra försiktigt ut EFP, använd 3-0 sutur för att ligera änden av fettkudden intill epididymis, ockludera blodkärlen, explodera EFP-transplantatet och bevara den för histologi .
OBS: Exploring av öarna bör göra mottagaren möss hyperglykemisk igen inom 3 dagar, vilket bekräftar graftens funktion.
- Bedöva mössen med pentobarbital levererad intraperitonealt (50 mg / kg). Placera musen i viloläge på en pappershandduk, med svansen som pekar mot operatören. Raka buken i stor utsträckning för att ta bort pälsen från omkring snittet. Tape ner de fyra extremiteterna och vattna huden fullständigt med alternerande alkohol och iodofordukar rördes cirkulärt för att sterilisera snittet. Drapa musen med en steril drapering, som bara tillåter åtkomst till snittområdet. Gör ett 7 mm snitt genom peritonealväggen iMittlinje, nära genitalområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår spännmetod, utförd med hjälp av en mikroskopisk hemostatisk klämma, är okomplicerad och tidsbesparande jämfört med suturligeringstekniken. Det tog ungefär 4 timmar att isolera och rena omkring 1200 öar från 6 möss. De nyligen isolerade öarna hade typiskt en grov periferi under ett optiskt mikroskop ( figur 3A ). När isleten återhämtade sig från isoleringsprocessen såg de ljusa och täta ut och fick en jämn yta. Den stressiga isoleringen kan emellertid fortfarande inducera celldöd, vilket resulterar i att cellerna släpper sig från isytorna, och ohälsosamma öar innehöll ofta en mörk nekrotisk kärna ( Figur 3B ). Vi mätta diametrarna på 945 öar från 5 möss; Den beräknade medelhåldiametern var 130,42 ± 41,75 μm ( Figur 3C ).
För att undvika mottagare immunitet Avvisning, utförde vi syngenisk transplantation i C57BL / 6J möss. Typiskt transplanterades 500 islaster DCS transplantat till platsen för EFP och reverserade hyperglykemien inom 10 dagar, jämfört med de 30 dagarna som observerades i den fria isletgruppen. Normoglykemien bibehölls i ca 100 dagar, tills hämning av transplantaten ( Figur 3D ). De laddade öarna fördelades jämnt på DCS och omfattas av EFP. Den östbelastade DCS kan också enkelt hanteras med tangor ( Figur 3E och 3F ). Den histologiska studien visade att de jämnt fördelade öarna revaskulariserades och omgivits av EFP-vävnaden och DCS efter transplantation under 60 dagar ( Figur 3G ). Immunförstärkningen av insulin bekräftade vidare framgångsrik engraftment av öarna ( Figur 3H ).
Xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 54995 / 54995fig3.jpg "/>
Figur 3: Transplantation av byggnadsställda öar till EFP-webbplatsen. ( A ) Representativ bild av färska öar isolerade från möss. ( B ) Islets odlades i 12 h, med döda celler som sloughing utanför ölytan. Inset: ohälsosamma öar har en mörk, nekrotisk kärna. ( C ) Storleksfördelning av 945 öar från 5 möss. ( D ) Non-fastande blodglukosnivå hos diabetiska möss transplanterade med DCS-stödda öar och fria öar. Den svarta pilen indikerar att transplantatet hämtades vid denna tidpunkt. ( E ) Fotografi som visar överföringen av ölbelastad byggnadsställning på ytan av en spridad EFP-vävnad. ( F ) Representativ faskontrastbild av det isletbelastade DCS. Inset: optisk bild av DCS, hållen av tangar. ( G ) Representativ histologisk H & E bild avTransplanterade öar, omgivna av DCS och EFP, efter 60 dagar. ( H ) Immunostaining av de DCS-stödda öarna, explanted efter 60 dagar. Skalstänger = 150 | im (A, B), 100 | im (F), 500 | im (G) och 25 | im (H). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bukspottkörtelperfusion och matsmältningstid är två viktiga parametrar som påverkar hålutbytet och kvaliteten. Moskalewski rapporterade först användningen av en rå kollagenasblandning för att smälta malet marsvinpankreas 11 . Lacy et al. Rapporterade injektionen av enzymer i kanalsystemet för att perfekta bukspottkörteln, vilket kraftigt ökade utbytet 12 . Den duktala perfusionen av enzym möjliggör maximal exponering av bukspottkörtelns yta till enzymet, vilket resulterar i en mer homogen matsmältning och en större frisättning av intakta holar jämfört med att smälta malet bukspottkörtel 13 . Enligt vår erfarenhet var den framgångsrika kanyleringen av gallkanalen och perfusionen av hela bukspottkörteln förutsättningar för höga ölutbyten. Detta beror på att bukspottskörteln (mjölkloben) faktiskt innehåller de flesta öarna jämfört med bukspottskörtelvävnaden nära duodenum. Det finns två sätt att cannulera Gallgången som rapporteras i litteraturen: i) infogning av nålen nära leverplatsen och blockering av enzymets inträde i tolvfingertarmarna 13 , 14 och ii) infogning av nålen nära tolvfingertarmen medan enzymet går in i Lever 15 . Här antog vi den senare tekniken, som inte behöver böja nålen eller ompositionera musen. En välutbildad forskare kan utföra kanyleringen av 10 möss inom 40 minuter när vi följer vårt protokoll. Spjälkningstiden för bukspottkörteln varierar med musens ålder och art. Överdjälvad bukspottkörtel producerar små öar och underförtvivlad bukspottkörtel har acinarceller fästade vid öarna. Det är därför viktigt att optimera digestionstiden för att få höga utbyten av friska öar.
STZ är en antibiotikumförening som specifikt förstör beta-celler och inducerar diabetes i möss inom tre dagarSs = "xref"> 16. Doseringen varierar med den specifika musstammen och åldern och bör bestämmas genom för-experiment. Vi vet att C57BL / 6J-möss kräver en lägre dos av STZ än Balb / C-möss. En överdos av STZ skulle orsaka allvarlig hyperglykemi och leda till djuren hos djuren inom en vecka, medan en otillräcklig STZ-dos sänker diabetesfrekvensen.
EFPs är mycket vaskuläriserade vävnader och är lättillgängliga för kirurgi genom minimalt invasiva förfaranden. Transplantationen av öar till EFP är i allmänhet mer lättillgänglig och säkrare jämfört med njurkapseln, en annan allmänt rapporterad plats för öletransplantation i musmodeller. Njuren är särskilt ett viktigt organ och är känsligt att hantera; Transplantationen av öar kan misslyckas eller djuren får inte överleva operationen 4 . EFP: erna i möss liknar också omentalpåsen hos människor. Transplantationsstudien i EFP kan inte bara underlätta vårFörståelse av förutsättning för vävnadsmiljö för öns överlevnad / funktion, men också lägga grunden för att utveckla kliniska transplantationsförfaranden 17 .
Den DCS som användes i denna studie härleddes från bovin perikardium och tillverkades huvudsakligen av kollagen. De decellulariserade materialen kan inte visa immunogenicitet och kan endast inducera milda inflammatoriska responser in vivo 18 . När holmarna såddes i porerna i DCS-systemet, erbjöd byggnadsstället mekaniskt skydd och förhindrade hålen att klumpa ihop, vilket kan leda till nekrosens nekros. DCS-ställningen innehållande öarna kunde hanteras direkt med hjälp av tångar, vilket möjliggör transplantationens enkla överföring. Inbäddning av byggnadsställningarna inom EFP minskade också läckage av öar i bukhinnan, till skillnad från i de fria öarna transplanterade utan en byggnadsställning 8 . Därför tillhandahåller DCS distincT fördelar för öletransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Wei Zhang från Guanhao Biotech för att tillhandahålla decellulariserade byggnadsställningar. Vi tackar Xiao-hong Peng för de hjälpsamma diskussionerna. Denna forskning finansierades ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (Projekt nr.31322021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
