Summary
Dit protocol demonstreert het isoleren van muizen eiland en zaait op een decellularized steiger. Steigergesteunde eilandjes werden getransplanteerd in het epididymale vetpaneel van streptozotocine (STZ) geïnduceerde diabetische muizen. Islets overleefden op de transplantatieplaats en reverseerde de hyperglycemische conditie.
Abstract
Isletransplantatie is klinisch bewezen effectief te zijn bij het behandelen van type 1 diabetes. De huidige intrahepatische transplantatiestrategie kan echter acute volledige bloedreacties veroorzaken en resulteren in slechte eilandengroei. Hier rapporteren we een robuuste protocol voor de transplantatie van eilandjes op de extrahepatische transplantatieplaats - het epididymale vetpaneel (EFP) - in een diabetische muismodel. Een protocol om eilandjes te isoleren en te zuiveren bij hoge opbrengsten van C57BL / 6J muizen wordt beschreven, evenals een transplantatiemethode die wordt uitgevoerd door zaaimolen op een gedecellulariseerde steiger (DCS) en implanteren ze op de EFP plaats in syngeneuze C57BL / 6J muizen gesmolten diabetische Door streptozotocine. Het DCS-transplantaat dat 500 eilandjes bevat, reverseerde de hyperglycemische conditie binnen 10 dagen, terwijl de vrije holmen zonder DCS minstens 30 dagen nodig hadden. De normoglykemie werd gedurende maximaal 3 maanden gehandhaafd totdat het transplantaat werd geëxplanteerd. Concluderend verhoogde DCS de engraftment van eilandjes in tHij extrahepatische site van de EFP, die gemakkelijk kan worden opgehaald en mogelijk een reproduceerbaar en nuttig platform biedt voor het onderzoeken van de steigermaterialen, evenals andere transplantatieparameters die nodig zijn voor een succesvolle inplanting van het eiland.
Introduction
Type 1 diabetes mellitus (T1D) is een auto-immuun endocriene aandoening waarbij ercellen door het immuunsysteem worden geablateerd, waardoor patiënten afhankelijk zijn van de injectie van exogeen insuline gedurende hun hele leven. Het protocol van Edmonton vertegenwoordigt een mijlpaal in klinische studies van eilandtransplantatie; Holen werden door de portale ader ingebracht en op de intrahepatische plaats 1 getransplanteerd. Echter, twee grote obstakels-onvoldoende bronnen van donor eilandjes en slechte eilandengroei-voorkomen het grote succes van de eilandtransplantatie 2 . Meestal moeten er eilandjes van drie cadaverische donoren worden verzameld om de hyperglycemische conditie van één patiënt om te keren; Dit komt door de lage opbrengst van isolatieprocedures van het eiland en het eilandverlies na transplantatie. In het bijzonder, hoewel de na-transplantatie-holmen in zuurstofrijk bloed werden gebad, veroorzaakte het directe contact met bloed vaak de onmiddellijke bloedgemedieerde inflammaTory reaction (IBMIR), die het acute verlies van de eilandjes zou kunnen veroorzaken. Op de lange termijn wordt gedacht dat het geleidelijke verlies van eilandjes bij patiënten de daling van de omzettingssnelheid bij diabetes in de klinische groepen vertoont, die in het eerste jaar 90% zou kunnen bedragen en tot 30% en 10% bij 2 en 5 kunnen dalen Jaar na transplantatie respectievelijk 3 .
Isletransplantatie bij extrahepatische plaatsen is een aantrekkelijke strategie om het directe contact van eilandjes met bloed te verminderen, terwijl de transplantaties beperkt zijn tot meer definieerbare locaties in vergelijking met intrahepatische infusie. In de afgelopen jaren zijn studies uitgevoerd in de niercapsule, oog-, spier-, vetkussens en subcutane ruimtes, waardoor de holen op deze sites kunnen overleven en functioneren om normoglykemie 4 te herstellen. Daarnaast zijn de eilandjes op deze plaatsen retrievable, waardoor het mogelijk is voor biopsie of zelfs voor verdere vervangingsprocedures. Extrahepatic sHet toont daarom een groot potentieel voor klinische transplantatie 5 .
Biomaterialen gebaseerde steigers zijn intensief onderzocht voor celtransplantatie en weefselkunde. Drie-dimensionale (3D) steigers bevatten gewoonlijk poreuze structuren en kunnen dienen als cellulaire templates om ruimtelijke structuur / organisatie van cellen te genereren of als reservoirs om de gecontroleerde afgifte van bioactieve signalen te verschaffen. Steigers zijn ook vervaardigd uit polymere materialen, zoals poly (glycolide-L-lactide) 6 , poly (dimethylsiloxaan) 7 en thermoplastisch poly (urethaan) 8 , om transplantatiehallen in de EFP te verplaatsen. In vergelijking met de directe transplantatie van eilandjes bleek het gebruik van steigers het verlies van het eiland te verminderen door het voorkomen van lekkage van eilandjes in de intraperitoneale holte 9 , 10 , die mechanische bescherming en moduWaardoor de lokale ontstekingsreactie plaatsvindt. De steigers kunnen aldus worden ontwikkeld om de inplanting van het eiland op de transplantatieplaatsen 7 te bevorderen .
In deze studie willen we een paradigma van eilandtransplantatie in de EFP tonen, uitgevoerd in muizenmodellen met behulp van een DCS. Steigers die afkomstig zijn van extracellulaire matrices hebben de afgelopen jaren veel interesse aangetrokken door de superieure biocompatibiliteit en meer natuurlijke poreuze structuren in vergelijking met synthetische producten. Hier beschrijven we een robuuste isolatieprotocol om pancreatische holmen bij hoge opbrengsten van C57BL / 6J muizen te verkrijgen. DCS's die van het boviene pericardium werden verwerkt werden vervolgens met holen geplant, en de transplantaten werden geëxplanteerd naar het EFP in syngeneuze diabetische modellen. Normoglykemie in muizen werd binnen 10 dagen bereikt en werd gedurende maximaal 100 dagen bewaard tot de verwijdering van de transplantaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de Peking University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, IACUC nr. COE-LuoY-1).
1. Islet Isolation
- Bereiding van reagentia en apparatuur.
- Reconstitute collagenase P poeder (2 U / mg) in HBSS om een oplossing van 5 mg / ml te maken en filter het door een 0,22 μm filter om de bacteriën te verwijderen. Bereid 0,6 ml-aliquotoplossingen van collagenase P in 15 ml kegelbuizen op en berg bij -20 ° C.
OPMERKING: Tijdens gebruik wordt elke portie verdund met HBSS om 6 ml werkoplossingen te geven met een eindconcentratie van 0,5 mg / ml, of 1 U / ml (genoeg voor het behandelen van 3 muizen). De werkoplossing wordt binnen 1 uur op ijs gehouden voor direct gebruik. De werkoplossing mag niet worden hersteld of opnieuw bevroren voor extra gebruik. - Bereid neutraliseringsoplossing door FBS (2,5%) en P / S (1%) in HBSS toe te voegen; Houd de oplossing op ijs. Bereid 60 ml neutraliseringsoplossing voor op drieT 6 muizen.
- Voeg voor het eilandkweekmedium D-glucose (7 mM), FBS (10%) en P / S (1%) toe aan RPMI 1640 medium.
- Autoclaaf de operatie instrumenten bij 115 ° C gedurende 30 min en 15 psi druk.
- Reconstitute collagenase P poeder (2 U / mg) in HBSS om een oplossing van 5 mg / ml te maken en filter het door een 0,22 μm filter om de bacteriën te verwijderen. Bereid 0,6 ml-aliquotoplossingen van collagenase P in 15 ml kegelbuizen op en berg bij -20 ° C.
- Inflatie van de alvleesklier.
- Bereid 12 ml collagenase werkoplossing voor, zoals gespecificeerd in stap 1.1.1, voor 6 muizen (12 weken oud). Vul de 10 ml spuit met 9 ml werkoplossing en verbind de spuit aan de 27 G intraveneuze naald. Bewaar de spuit op ijs en gebruik de oplossing binnen 1 uur.
- Euthanize de muis door cervicale dislocatie. Plaats de muis in de rugpositie op een papieren handdoek, met de staart naar de bediener gericht. Spuit het hele lichaam met 70% ethanol, waardoor het volledig nat wordt.
- Maak een V-snede, vanaf het genitale gebied en uitstrekken tot het diafragma, met behulp van dissectie scharen en tang. Vouw de huid over de borst om de buikholte volledig te onthullen.
- verhuizingDe darm aan de rechterkant van de muis en de pancreas en de gemeenschappelijke galweg blootstellen. Grijp het duodenum zorgvuldig met tang en trek het tot de galgweg strak is ( Figuur 1A -1 en A-2 ).
- Vind de portale ader en galweg die leidt naar de lever. Klem de portale ader en galweg met een microscopische hemostatische klem.
OPMERKING: De klem voorkomt te veel bloeden en het binnendringen van de collagenase in de lever. - Terwijl u de darm nog steeds vasthoudt met de tang, vind u de plaats van de ampulla die de galweg en het duodenum verbindt. Plaats de 27G-intraveneuze naald in de gemeenschappelijke galdoorn via de ampulla ( Figuur 1B -1 en B-2 ).
- Dispense ongeveer 200 μL collagenase werkoplossing om na te gaan of de canulatie helemaal door de galweg is. Als de collageenoplossing de leiding begint te vullen ( 1 en C2 ), de naald is in het lumen van de buis; Klem het kanalsegment dat de naald bevat met behulp van een arteriële hemostatische klem en geef de rest van de 2 ml oplossing langzaam en constant binnen 1 minuut ( Figuur 2A -1 , A-2 en B-1 ).
OPMERKING: als het weefsel rondom het kanaal begint te bloeien ( Figuur 2B -2 ), heeft de naald door de wand van de galgweg gepakt, waardoor het nodig is om de naald te verplaatsen en opnieuw te proberen de galgweg te kunnen opnieuw kuilen. Evenzo, als het duodenum begint te bloeien ( Figuur 2C -1 en C-2 ), moet de arteriële hemostatische klem worden aangepast en de galkanaal opnieuw gecanuleerd. Aangezien de collageenoplossing de pancreas opvult, komt het weefsel bij het duodenum eerst op, gevolgd door het regioN bij de pancreasstaart. De perfusie van de alvleesklierstaart (de miltlap) is belangrijk om de opbrengst van het eiland te maximaliseren. - Na de volledige inflatie van de alvleesklier ( Figuur 2C -1 ), duw de darm aan de linkerkant van de muis en verwijder de pancreas door te beginnen bij de dalende dikke darm. Gebruik de tang om de darm op te heffen en te scheiden van de pancreas met een ander tang. Ga door de buikpijn te verwijderen totdat deze los van de bovenkant van de buik zit. Trek tenslotte de pancreas uit de buik en snijd het vrij van de resterende milt.
OPMERKING: De volledige scheiding moet snel uitgevoerd worden, aangezien de spijsvertering tijdens het verwijderingsproces doorloopt. - Plaats de pancreas in een lege 15 ml kegelbuis en laat het op ijs. Herhaal de bovenstaande procedure voor de resterende muizen. Alle alvleesklier moet verder worden verwerkt binnen 1 uur door direct na stap 1.3 te voorkomen om oververdichting door collagenase P te voorkomen. </ Li>
Figuur 1: Foto's die de kanulatie van de galweg en de perfusie van de alvleesklier met collageenoplossingen tonen. ( A1 ) Het duodenum trekken tot de galgweg strak is. (Ampulla: het driehoekige, melkachtige gebied op het buikvliesoppervlak; galbuis: de koordachtige melkstructuur op het oppervlak). ( B1 ) De naald in de galweg van de ampulla inbrengen. ( C1 ) De pancreas opblazen met de injectie van enzym. ( A2, B2 en C2 ) Cartoonbeelden van respectievelijk de procedures in A1, B1 en C1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Problemen oplossen voor de cannulatie. ( A1 ) De naaldpunt in het lumen van de galgweg geplaatst. ( A2 ) De leiding gevuld met enzymoplossingen. ( B1 ) De naald wordt in het lumen van het galgkanaal ingevoegd en de leiding gevuld met een blauwe kleurstof. ( B2 ) Door onnauwkeurige cannulatie is de naald onder de galweg, en na het afgifte van de blauwe kleur wordt alleen een opgeblazen capsule waargenomen. ( C1 ) Een succesvolle canulatie blijkt uit de verstoring van de alvleesklier. ( C2 ) Door onjuist klemmen komt blauwe kleurstof in het duodenum en veroorzaakt verdikking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- <Sterk> Spijsvertering en zuivering van eilandjes.
- Incubeer de conische buizen die de perfuse pancreas bij 37 ° C gedurende 17 minuten bevatten.
OPMERKING: De incubatietijd kan variëren met de leeftijd en de soort van het dier. - Beëindig de spijsvertering door 7 ml neutralisatieoplossing toe te voegen en de buizen op ijs zetten.
- Dissociate het weefsel door de buizen krachtig te schudden ( bijv. 20 keer in 10 s) totdat fijne weefseldeeltjes zijn verkregen.
OPMERKING: De opbrengst van het eiland zal laag zijn als de pancreas niet helemaal loskomt. - Filter de verteerde weefselmonsters door 0,5 mm gaas om eventuele niet-verteerde weefselbrokken te verwijderen. Verzamel de holle suspensies in een nieuwe 50 ml conische buis.
- Centrifugeer de buizen gedurende 3 minuten bij 230 xg en 4 ° C en giet het supernatant zorgvuldig af, zonder de weefselpellets te storen.
- Resuspendeer de pellets van 3 muizen in 4 ml polysucrose dichtheidsgradiënt door zachtjes of pDe vering een paar keer op en neer zetten. Pijp 4 ml HBSS langzaam aan de zijkant van de buis naar de top van de polysucroseoplossingen.
OPMERKING: De twee oplossingen moeten goed gescheiden lagen zijn met een scherpe interface.
OPMERKING: De toevoeging van HBSS dient zorgvuldig uitgevoerd te worden, zonder de polysucrose dichtheidsgradiënt aan de onderkant te verstoren. - Centrifugeer de suspensie gedurende 20 minuten bij 900 xg en 4 ° C door een zeer langzame versnellingsnelheid te selecteren. Beëindig de centrifugatie zonder rem.
OPMERKING: Dit is een stap om de eilandjes te zuiveren van de exocriene cellen, waarbij de meeste eilandjes migreren naar de interface tussen de lagen polysucrose en HBSS en de meeste exocriene cellen die zich aan de onderkant vestigen. - Verwijder het geheel van de 8 ml supernatantoplossingen met behulp van een 15-pipet met grote boring. Pas de oplossingen door een omgekeerde 70 μm filter.
OPMERKING: De holen worden verder gezuiverd en door de zeef bewaard, terwijl de exocriene cellenZal door het filter gaan.
Let op: de polysucorse dichtheidsgradiënt is cel-giftig; De filtratie helpt de eilandjes om de polysucrose te ontdoen. - Pipet 2 ml koude neutralisatieoplossing in een 35 mm Petri-schotel. Omkeer de celzijdel rechts omhoog, doop het oppervlak in, houd de holmen in de oplossing en schud zachtjes om de holen los te laten.
- Hand-pick de eilandjes onder een microscoop met een 20-liter pipet met een witte tip.
OPMERKING: De holen zijn geelachtige compacte celaggregaten ( Figuur 3A ), terwijl het vervuilende exocrine weefsel of cellen een zwarte en losse structuur hebben onder de dissectiemicroscoop. - Wordt ongeveer 200 eilandjes in een 35 mm schaal met 2 mL cultuurmedium en incubeer bij 37 ° C per voorzien van 5% CO2 gedurende 12 uur incubator.
OPMERKING: In het algemeen kunnen 150-300 eilandjes worden geoogst uit een 12-week oude C57BL / 6J muis. Islets zijn geneigd om aggregaten te vormen tijdens de cultuur,En de grote eilandjes (> 300 μm) zijn gevoelig voor centrale necrose ( figuur 1B , inset). Schud de ophanging goed om de eilanden gelijkmatig in de schotel te verdelen en om de klumping te verminderen.
- Incubeer de conische buizen die de perfuse pancreas bij 37 ° C gedurende 17 minuten bevatten.
2. Islet Cultuur op de Steiger
OPMERKING: DCS heeft een porositeit van ongeveer 79%, een dikte van ongeveer 0,6 mm en een poriegrootte van 12 tot 300 μm.
- Knip de steigers in 7 mm schijven, week ze in 70% ethanol en was ze met HBSS. Plaats de steigers in de 24-putjes weefselkweekinzetten.
OPMERKING: Wanneer er nieuwe eilanden worden hersteld na een nachtcultuur, lijken de eilandjes helder en strak, met gladde randen ( figuur 3B ). - Wissel de schotel af en haal de holen uit het midden van de schotel met een 20 μL pipet met een witte punt. Breng de holtes over aan de steigers (250 holmen / steiger) met een pipet en voeg 2 ml kweekmedium toe aande bron. Cultuur de eilandjes gedurende 12 uur voor transplantatie.
3. Islets Transplantatie op de EFP Site
- Diabetes inductie in ontvanger muizen.
- Plaats C57BL / 6J muizen (meer dan 10 weken oud) in een frisse kooi met watertoevoer, maar geen voedsel. Snel de muizen gedurende 10 uur voor de inductie van diabetes.
- Bereid bufferoplossingen met pH-waarden van 4,2-4,5 door 0,1 M citroenzuur met 0,1 M natriumcitraat te mengen. Los de STZ (10 mg / ml) op in de vers bereide buffer en steriliseer de oplossing door het door een 0,22 μm filter te passeren.
OPMERKING: STZ is lichtgevoelig en verliest de activiteit binnen 10 minuten; Bereid eerst de verse STZ oplossing voor injectie. - Spuit elke muis intraperitoneaal met STZ in bij een dosis van 140-150 mg / kg voor elke C57BL / 6J muis.
OPMERKING: De dosering varieert afhankelijk van de leeftijd en de soort van het dier. Het is aan te bevelen een kleinschalige doseringsoptimalisatie te uitvoerenSt voor de gegeven soort voor het formele experiment starten. - Verzamel het staartvene bloed en controleer de bloedglucose met een glucosemeter op dag 2, 3 en 4 post-STZ injectie.
OPMERKING: Wanneer de dieren over twee opeenvolgende dagen hyperglycemische (niet-fastende bloedglucose> 16,7 mM) zijn, zijn ze klaar voor eilandtransplantatie.
- Transplantatie van eilandjes naar de EFP site.
- Verdoof de muizen met pentobarbital intraperitoneaal (50 mg / kg). Plaats de muis in de rugpositie op een papieren handdoek, met de staart naar de bediener gericht. Scheer de buik uitgebreid om de bont van de snijkant te verwijderen. Tape de vier ledematen omlaag en doe de huid helemaal af met alternerende alcohol en iodoforekleuren worden cirkelvormig verplaatst om de snijplaats te steriliseren. Drapeer de muis met een steriele draperie, waarbij alleen toegang tot het snijgebied mogelijk is. Maak een 7 mm snede door de buikwand in deMiddenlijn, dicht bij het geslachtsgebied.
OPMERKING: Alle instrumenten die tijdens de operatie worden gebruikt, inclusief handschoenen, moeten steriel zijn. - Grijp het EFP van de buikholte voorzichtig en verwijder deze met behulp van tang. Verspreid de EFP op bevochtigd steriel gaas. Plaats de steiger bevattende holtes op de EFP en vouw de EFP om de transplantatie te wikkelen. Beveilig het directe contact tussen de holmen en EFP door de EFP te suturen met absorbeerbare 6-0 sutures. Vet het oppervlak van de EFP met steriele zoutoplossing met behulp van een ontwaterde katoenen pootje om te voorkomen dat de EFP uitdroogt.
- Plaats de EFP voorzichtig terug in de buikholte. Sluit de insnijding door de buikwand te suturen en de dermale laag te klemmen met wondklemmen.
- Injecteer buprenorfine (0,1 mg / kg) subcutaan als een pijnstillend middel.
- Injecteer 1 ml zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen.
- Plaats de muis in een kooi op een verwarmingsblok totdat de muis terugkeert van verdoving.
- Controleer de non-fasting glucose leVels twee dagen later door bloed van de staart ader te verzamelen. Bij het ophalen van het transplantaat, herhaal de bovenstaande transplantatieprocedures, trek de EFP voorzichtig uit, gebruik 3-0 suture om het uiteinde van het vetpaneel naast de epididymis te ligeren, de bloedvaten te verduisteren, het EFP-transplant te verkennen en te bewaren voor de histologie .
OPMERKING: Het exploreren van de eilandjes dient de ontvangende muizen hyperglycemische weer binnen 3 dagen te verlenen, waarbij de functie van het transplantaat bevestigd wordt.
- Verdoof de muizen met pentobarbital intraperitoneaal (50 mg / kg). Plaats de muis in de rugpositie op een papieren handdoek, met de staart naar de bediener gericht. Scheer de buik uitgebreid om de bont van de snijkant te verwijderen. Tape de vier ledematen omlaag en doe de huid helemaal af met alternerende alcohol en iodoforekleuren worden cirkelvormig verplaatst om de snijplaats te steriliseren. Drapeer de muis met een steriele draperie, waarbij alleen toegang tot het snijgebied mogelijk is. Maak een 7 mm snede door de buikwand in deMiddenlijn, dicht bij het geslachtsgebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze klemmethode, uitgevoerd met behulp van een microscopische hemostatische klem, is eenvoudig en tijdbesparend in vergelijking met de hechtingsligatietechniek. Het duurt ongeveer 4 uur om ongeveer 1200 eilandjes van 6 muizen te isoleren en te zuiveren. De vers geïsoleerde eilandjes hadden doorgaans een ruwe periferie onder een optische microscoop ( Figuur 3A ). Zodra de eilandjes uit het isolatieproces werden hersteld, keken ze helder en strak uit en kregen ze een glad oppervlak. Echter, de stressvolle isolatie kan nog steeds celdood veroorzaken, waardoor de cellen van de eilandoppervlakken worden gesleept, en ongezonde eilandjes bevatten vaak een donkere necrotische kern ( Figuur 3B ). We hebben de diameters van 945 eilandjes van 5 muizen gemeten; De berekende gemiddelde diameter van de eilandjes was 130,42 ± 41,75 μm ( figuur 3C ).
Om ontvanger immuun te vermijden Afwijzing, hebben we zngeneen transplantatie uitgevoerd in C57BL / 6J muizen. Typisch werden 500 holen geladen DCS getransplanteerd naar de plaats van de EFP en de hyperglycemie omgedraaid binnen 10 dagen, vergeleken met de 30 dagen waargenomen in de vrije eilandgroep. De normoglykemie werd gedurende ongeveer 100 dagen gehandhaafd, tot het ophalen van de transplantaten ( Figuur 3D ). De geladen eilandjes waren gelijkmatig verspreid over DCS en onder de EFP. De eilandbeladen DCS kan ook makkelijk worden behandeld met tang ( Figuur 3E en 3F ). De histologische studie toonde aan dat de gelijkmatig verdeelde holmen revascularized en omringd werden door het EFP weefsel en de DCS na transplantatie gedurende 60 dagen ( Figuur 3G ). De immunostaining van insuline bevestigde verder de succesvolle engraftment van de holmen ( Figuur 3H ).
Xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 54995 / 54995fig3.jpg "/>
Figuur 3: Transplantatie van steigers met steiger aan de EFP-site. ( A ) Representatieve afbeelding van verse eilandjes geïsoleerd van muizen. ( B ) Islets werden gekweekt voor 12 uur, met dode cellen die van het eilandoppervlak sloughing. Inset: ongezonde eilandjes hebben een donkere, necrotische kern. ( C ) Grootte verdeling van 945 eilandjes van 5 muizen. ( D ) Niet-vastend bloedglucosegehalte van de diabetische muizen getransplanteerd met DCS-gesteunde eilandjes en vrije eilandjes. De zwarte pijl geeft aan dat het transplantaat op dit tijdstip is opgehaald. ( E ) Foto die de overdracht van eilandbeladen steiger toont op het oppervlak van een verspreid EFP weefsel. ( F ) Representatief fase contrast beeld van de eilandbeladen DCS. Inset: optische afbeelding van de DCS, in de hand gehouden door pincet. ( G ) Representatieve histologische H & E afbeelding van deGetransplanteerde eilandjes, omringd door DCS en EFP, na 60 dagen. ( H ) Immunostaining van de DCS-gesteunde eilandjes, explanted na 60 dagen. Schaalstaven = 150 μm (A, B), 100 μm (F), 500 μm (G) en 25 μm (H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pancreas perfusie en spijsverteringstijd zijn twee belangrijke parameters die de opbrengst en kwaliteit van het eiland beïnvloeden. Moskalewski meldde voor het eerst het gebruik van een ruw collageenmengsel om gesneden marsvinpancreas 11 te verteren. Lacy et al. Meldde de injectie van enzymen in het buisstelsel om de pancreas te perfectioneren, wat de opbrengst van het eiland aanzienlijk verhoogde 12 . De ductale perfusie van het enzym zorgt voor maximale blootstelling aan het buikvliesoppervlak aan het enzym, wat resulteert in een meer homogene vertering en een grotere afgifte van intacte holmen in vergelijking met het verteren van gemalen pancreas 13 . In onze ervaring waren de succesvolle cannulatie van de galweg en de perfusie van de hele alvleesklier voorwaarde voor hoge eilandopbrengsten. Dit komt doordat de pancreasstaart (splenic lob) eigenlijk de meeste eilanden bevat in vergelijking met het alvleesklierweefsel in de buurt van het duodenum. Er zijn twee manieren om te cannuleren De galbuis die in de literatuur wordt gerapporteerd: i) de naald in de buurt van de leverplaats plaatst terwijl de entree van het enzym in het duodenum 13 , 14 wordt geblokkeerd en ii) de naald in de buurt van het duodenum wordt ingebracht, terwijl de toevoer van enzym in de Lever 15 . Hier hebben we de laatste techniek aangenomen, die de naald niet nodig heeft of de muis moet verplaatsen. Een goed opgeleide onderzoeker kan de canulatie van 10 muizen binnen 40 minuten uitvoeren bij het volgen van ons protocol. De spijsverteringstijd voor de alvleesklier is afhankelijk van de leeftijd en de soorten van de muizen. Oververteerde pancreas produceert kleine eilandjes en onderverteerde pancreas hebben acinarcellen aan de holen verbonden. Het is daarom belangrijk om de spijsverteringstijd te optimaliseren om hoge opbrengsten van gezonde eilandjes te verkrijgen.
STZ is een antibioticumverbinding die bètacellen specifiek vernietigt en binnen 3 dagen diabetes bij muizen veroorzaaktSs = "xref"> 16. De dosering varieert met de specifieke muisstamme en leeftijd en moet worden bepaald door voor-experimenten. Naar ons weten, hebben C57BL / 6J muizen een lagere dosis STZ nodig dan Balb / C muizen. Een overdosis van STZ zou ernstige hyperglycemie veroorzaken en leiden tot de dood van de dieren binnen een week, terwijl een onvoldoende STZ dosis de incidentiepercentage van diabetes vermindert.
EFP's zijn zeer gewasculariseerde weefsels en gemakkelijk toegankelijk voor operatie door middel van minimaal invasieve procedures. De transplantatie van eilandjes naar EFP is over het algemeen eenvoudiger en veiliger in vergelijking met de niercapsule, een andere algemeen gemelde site voor oletransplantatie in muismodellen. In het bijzonder is de nier een essentieel orgaan en is het gevoelig om te behandelen; De transplantatie van eilandjes kan falen of de dieren kunnen de operatie niet overleven 4 . De EFP's in muizen zijn ook vergelijkbaar met de omentale zak in mensen. De transplantatie studie in EFP kan ons niet alleen vergemakkelijkenBegrijpen van de vereiste weefselomgeving voor overleving / functie van het eiland, maar ook de basis leggen voor de ontwikkeling van klinische transplantatieprocedures 17 .
De DCS die in deze studie werd gebruikt, werd afgeleid van runderpericardium en werd voornamelijk gemaakt van collageen. De gedecellulariseerde materialen laten geen immunogeniciteit zien en mogen alleen lichte ontstekingsreacties in vivo 18 veroorzaken . Als er in de poriën van de DCS zaadjes werden geplant, boden de steiger mechanische bescherming en verhinderden de holle eilanden elkaar te bundelen, wat kan leiden tot de necrose van de holen. De DCS-steiger die de holen bevat, kan direct met behulp van tang gebruikt worden, waardoor de transplantatie gemakkelijk kan worden overgebracht. Inbedding van de steigers binnen de EFP verminderde ook de lekkage van eilandjes in het peritoneum, in tegenstelling tot in de vrije holen zonder een steiger 8 getransplanteerd. Daarom levert de DCS distincT voordelen voor eilandtransplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Wei Zhang van Guanhao Biotech bedanken voor het leveren van de decellularized steigers. We bedanken Xiao-hong Peng voor de goede discussies. Dit onderzoek werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Project No.31322021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
