Summary
Denne protokollen demonstrerer isolering av murin øl og såing på en decellularisert stillas. Stillasstøttede øyer ble transplantert i den epididymale fettpute av streptozotocin (STZ) -inducerte diabetiske mus. Islets overlevde på transplantasjonsstedet og reverserte den hyperglykemiske tilstanden.
Abstract
Isletransplantasjon har blitt klinisk bevist å være effektiv ved behandling av type 1 diabetes. Imidlertid kan den nåværende intrahepatiske transplantasjonsstrategien medføre akutte helblodsreaksjoner og resultere i dårlig øyelegging. Her rapporterer vi en robust protokoll for transplantasjon av øyer på det ekstrahepatiske transplantasjonsstedet - den epididymale fettputen (EFP) - i en diabetisk musemodell. En protokoll for isolering og rensing av øyer med høye utbytter fra C57BL / 6J-mus er beskrevet, så vel som en transplantasjonsmetode utført ved seeding-øyer på en decellularisert stillas (DCS) og implanterer dem på EFP-stedet i syngene C57BL / 6J mus-gjengede diabetiker Av streptozotocin. DCS-transplantatet som inneholdt 500 øyer reverserte den hyperglykemiske tilstanden innen 10 dager, mens de frie øyene uten DCS krevde minst 30 dager. Normoglykemi ble opprettholdt i opptil 3 måneder til graftet ble eksplantert. I konklusjonen økte DCS engraftment of islets into tHan ekstrahepatiske nettsted av EFP, som lett kunne hentes, og kan gi en reproduserbar og nyttig plattform for å undersøke stillasmaterialene, samt andre transplantasjonsparametere som kreves for en vellykket holning.
Introduction
Type 1 diabetes mellitus (T1D) er en autoimmun endokrin lidelse der øketsceller ablateres av immunsystemet, noe som gjør at pasientene er avhengige av injeksjon av eksogent insulin for hele livet. Edmonton-protokollen representerer en milepæl i kliniske studier av øletransplantasjon; Øyer ble infundert gjennom portalvenen og transplantert på det intrahepatiske område 1 . Imidlertid hindrer to hovedhinder - utilstrekkelige kilder til donorøyler og fattig øyekraft - den store suksessen til øletransplantasjonen 2 . Vanligvis må øyer samles fra tre cadaveric donorer for å reversere den hyperglykemiske tilstanden til en pasient; Dette skyldes det lave utbyttet av isolasjonsprosedyrer og øktapet etter transplantasjon. Spesielt, selv om post-transplantasjonsøyene ble badet i oksygenrikt blod, fremkalte direkte kontakt med blod ofte det øyeblikkelige blodmedierte inflammaTory reaksjon (IBMIR), som kan forårsake akutt tap av øyene. På lang sikt er det antatt at gradvis tap av øyer hos pasienter sto for nedgang i diabetesomslag i de kliniske gruppene, som kunne nå 90% i det første året og falt til 30% og 10% med 2 og 5 År etter transplantasjon, henholdsvis 3 .
Isletransplantasjon på ekstrahepatiske steder har vært en attraktiv strategi for å redusere direkte kontakt med øyer med blod mens de begrenser transplantasjonene til mer definerbare steder sammenlignet med intrahepatisk infusjon. Studier har blitt utført i nyrekapsel, øye, muskler, fettputer og subkutane rom de siste årene, og viser at øyer på disse områdene er i stand til å overleve og fungere for å gjenopprette normoglykemi 4 . I tillegg er øyene på disse områdene gjenvinnbare, noe som gjør det mulig for biopsi eller til og med for ytterligere utskiftingsprosedyrer. Ekstrahepatisk sDet viser derfor stort potensial for klinisk transplantasjon 5 .
Biomaterialbaserte stillaser har blitt intensivt undersøkt for celletransplantasjon og vevsteknikk. Tredimensjonale (3D) stillas inneholder vanligvis porøse strukturer og kan tjene som mobilmaler for å generere romlig struktur / organisering av celler eller som reservoarer for å gi kontrollert frigivelse av bioaktive signaler. Stillaser har også blitt fremstilt fra polymere materialer, slik som poly (glykolid-L-laktid) 6 , poly (dimetylsiloksan) 7 og termoplastisk poly (uretan) 8 , til transplantasjonsøyer i EFP. Sammenlignet med direkte transplantasjon av øyer ble bruken av stillas funnet å redusere øktapet ved å forhindre lekkasje av øyer i det intraperitoneale hulrom 9 , 10 , som gir mekanisk beskyttelse og moduLating den lokale inflammatoriske reaksjonen. Stillasene kan således bli utviklet for å fremme islet-inngrep på transplantasjonsstedene 7 .
I denne studien har vi tenkt å demonstrere et paradigme for øktransplantasjon i EFP, utført i musmodeller ved hjelp av en DCS. Stillaser avledet fra ekstracellulære matriser har tiltrukket stor interesse de siste årene på grunn av den overlegne biokompatibiliteten og mer naturlige porøse strukturer sammenlignet med syntetiske produkter. Her beskriver vi en robust isolasjonsprotokoll for å oppnå pankreasøyler med høye utbytter fra C57BL / 6J-mus. DCSer behandlet fra bovin perikardiet ble deretter sådd med øyer, og transplantatene ble transplantert til EFP i syngene diabetiske modeller. Normoglykemi hos mus ble oppnådd innen 10 dager og ble opprettholdt i opptil 100 dager, til fjerning av transplantatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble godkjent av Peking University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, IACUC nr. COE-LuoY-1).
1. Islet Isolation
- Fremstilling av reagenser og utstyr.
- Rekonstituer kollagenase P-pulver (2 U / mg) i HBSS for å lage en 5 mg / ml løsning og filtrer den gjennom et 0,22 μm filter for å fjerne bakteriene. Tilbered 0,6 ml alikvotoppløsninger av kollagenase P i 15 ml koniske rør og lagre ved -20 ° C.
MERK: Under bruk fortynnes hver alikvot med HBSS for å gi 6 ml arbeidsløsninger med endelige konsentrasjoner på 0,5 mg / ml eller 1 U / ml (nok til å behandle 3 mus). Arbeidsløsningen holdes på is til umiddelbar bruk innen 1 time. Arbeidsoppløsningen bør ikke gjenopprettes eller gjenfryses for ytterligere bruk. - Forbered nøytraliseringsløsning ved å legge til FBS (2,5%) og P / S (1%) i HBSS; Hold løsningen på isen. Tilbered 60 ml nøytraliseringsløsning til treaT 6 mus.
- For ølkulturmediet, tilsatt D-glukose (7 mM), FBS (10%) og P / S (1%) til RPMI 1640 medium.
- Autoklaver operasjonsinstrumentene ved 115 ° C i 30 minutter og 15 psi trykk.
- Rekonstituer kollagenase P-pulver (2 U / mg) i HBSS for å lage en 5 mg / ml løsning og filtrer den gjennom et 0,22 μm filter for å fjerne bakteriene. Tilbered 0,6 ml alikvotoppløsninger av kollagenase P i 15 ml koniske rør og lagre ved -20 ° C.
- Inflasjon av bukspyttkjertelen.
- Klargjør 12 ml kollagenase-arbeidsløsning, som spesifisert i trinn 1.1.1, for 6 mus (12 uker gamle). Fyll 10 ml sprøyten med 9 ml arbeidsoppløsning og koble sprøyten til 27 G intravenøs nål. Oppbevar sprøyten på is og bruk løsningen innen 1 time.
- Euthanize musen ved cervikal dislokasjon. Plasser musen i hvilestilling på et papirhåndkle, med halen som peker mot operatøren. Spray hele kroppen med 70% etanol, slik at den blir helt våt.
- Gjør et V-snitt, starter fra kjønnsområdet og strekker seg til membranen, ved hjelp av disseksjonssaks og tau. Brett huden over brystet for å fullstendig avsløre bukhulen.
- Bevege segTarmen til høyre side av musen og eksponerer bukspyttkjertelen og vanlig galdekanal. Ta tak i duodenum forsiktig med tau og trekk det til galdekanalen er stramt ( Figur 1A -1 og A-2 ).
- Finn portalens og gallekanalen som fører til leveren. Klem portåre og gallekanal med en mikroskopisk hemostatisk klemme.
MERK: Klemmen forhindrer overdreven blødning og innføring av kollagenasen i leveren. - Mens du fortsatt holder tarmene med tangen, finner du plasseringen av ampulla som forbinder gallekanalen og tolvfingertarmen. Sett 27G intravenøs nål i den vanlige galdekanalen gjennom ampulla ( Figur 1B -1 og B-2 ).
- Dispense ca 200 μl kollagenase arbeidsløsning for å sjekke om kanyleringen er helt gjennom gallekanalen. Hvis kollagenaseoppløsningen begynner å fylle kanalen ( 1 og C2 ), nålen er i kanalens lumen; Klemme kanalsegmentet som inneholder nålen ved hjelp av en hemostatisk klemme og dispensere resten av 2 ml oppløsningen med en langsom og konstant hastighet innen 1 min ( figur 2A -1 , A-2 og B-1 ).
MERK: Hvis vevet rundt kanalen begynner å blåses opp ( figur 2B -2 ), har nålen stakk gjennom gallekanalveggen, noe som gjør det nødvendig å plassere nålen og prøve å kanylere gallekanalen igjen. På samme måte, hvis duodenum begynner å blåse opp ( Figur 2C -1 og C-2 ), må den arterielle hemostatiske klemmen justeres og gallekanalen re-kanyleres. Når kollagenaseoppløsningen fyller opp bukspyttkjertelen, blåses vevet nær tolvfingre først etterfulgt av regionenN nær bukspyttkjertelen. Perfusjonen av bukspyttkjertelen halen (miltkroppen) er viktig for å maksimere økets utbytte. - Etter fullstendig oppblåsning av bukspyttkjertelen ( Figur 2C -1 ), trykk tarmen til venstre på musen og fjern bukspyttkjertelen ved å starte ved synkende kolon. Bruk tangen til å løfte tarmen og skille den fra bukspyttkjertelen med et annet par tinger. Fortsett å fjerne bukspyttkjertelen til den ikke er festet fra toppen av magen. Til slutt løft bukspyttkjertelen ut av magen og kutt den fri fra den resterende milten.
MERK: Hele separasjonen skal utføres raskt, da fordøyelsen fortsetter under fjerningsprosessen. - Plasser bukspyttkjertelen i et tomt 15 ml konisk rør og legg det på is. Gjenta prosedyren ovenfor for de resterende musene. Alle bukspyttkjertelen bør behandles ytterligere innen 1 time ved å følge trinn 1.3 for å forhindre over fordøyelse med kollagenase P. </ Li>
Figur 1: Fotografier som viser kanyleringen av galdekanalen og perfusjonen av bukspyttkjertelen med kollagenase-oppløsninger. ( A1 ) Trekker duodenum til galdekanalen er stram. (Ampulla: det trekantede, melkeområdet på overflaten av tolvfingertarmen, galdekanal: den snorlignende melkestrukturen på overflaten). ( B1 ) Setter nålen inn i galdekanalen fra ampullen. ( C1 ) Oppblåst i bukspyttkjertelen med injeksjon av enzym. ( A2, B2 og C2 ) Tegneseriebilder av prosedyrene vist i henholdsvis A1, B1 og C1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Feilsøking for kanyleringen. ( A1 ) Nålespissen satt inn i lumen på gallekanalen. ( A2 ) Kanalen fylt med enzymløsninger. ( B1 ) Nålen satt inn i galdekanalens lumen og kanalen fylt med et blått fargestoff. ( B2 ) På grunn av uhensiktsmessig kanylering er nålen under gallekanalen, og bare en oppblåst kapsel observeres etter at den blå fargestoffet er dispensert. ( C1 ) En vellykket cannulasjon er påvist ved distansjon av bukspyttkjertelen. ( C2 ) På grunn av uheldig klemming, kommer blå fargestoff inn i tolvfingertarmen og forårsaker distansering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- <Sterk> Fordøyelse og rensing av øyer.
- Inkubér de koniske rørene som inneholder perfusert pankreas ved 37 ° C i 17 minutter.
MERK: Inkubasjonstiden kan variere med alder og arter av dyret. - Avslutt fordøyelsen ved å tilsette 7 ml nøytraliseringsløsning og plasser rørene på is.
- Dissociate vevet ved å riste rørene kraftig ( f.eks. 20 ganger i 10 s) til det blir oppnådd fine vevspartikler.
MERK: Ølutbyttet vil være lavt hvis bukspyttkjertelen ikke klarer å dissociere helt. - Filtrer de fordøyede vevsprøvene gjennom 0,5 mm trådnettet for å fjerne eventuelle ikke fordøyede vevbiter. Samle øyesuspensjonene i et nytt 50 ml konisk rør.
- Sentrifuger rørene i 3 minutter ved 230 xg og 4 ° C og hell supernatanten forsiktig ut, uten å forstyrre vevspellets.
- Resuspender pelletsene fra 3 mus i 4 ml polysukrose tetthetgradient ved å vortexe forsiktig eller pIpetting opphenget opp og ned noen ganger. Tørk pipet 4 ml HBSS sakte ned langs røret til toppen av polysukrose-oppløsningen.
MERK: De to løsningene skal være godt separerte lag med et skarpt grensesnitt.
MERK: Tilsetning av HBSS bør utføres med forsiktighet, uten å forstyrre polysukrose tetthetgradienten nederst. - Sentrifuger suspensjonen i 20 minutter ved 900 xg og 4 ° C ved å velge en meget sakte akselerasjonshastighet. Avslutt sentrifugeringen uten brems.
MERK: Dette er et skritt for å rense øyene fra eksokrine celler, med de fleste av øyene som migrerer til grensesnittet mellom lagene av polysukrose og HBSS og de fleste eksokrine celler settes ned i bunnen. - Fjern hele 8 ml supernatantløsninger ved å bruke en 15 ml pipette med stor boring. Pass opp løsningene gjennom en omvendt 70 μm filter.
MERK: Øyene vil bli ytterligere renset og beholdt av silen, mens eksokrine cellerVil passere gjennom filteret.
Forsiktig: Polysukorøsensitetsgradienten er celle-giftig; Filtreringen vil hjelpe øyene bli kvitt polysukrose. - Pipetter 2 ml kald nøytraliseringsløsning i en 35 mm petriskål. Inverter cellefilteret rett opp, dyp overflaten som holder øyene i løsningen, og skyll forsiktig for å frigjøre øyene.
- Håndplukk øyene under et mikroskop ved hjelp av en 20-liters pipette med et hvitt tips.
MERK: Øyene er gulaktige, kompakte celleaggregater ( Figur 3A ), mens det forurensende eksokrine vev eller celler har en sort og løs struktur under disseksjonsmikroskopet. - Sett ca. 200 øyer i en 35 mm skål med 2 ml kulturmedium og inkuberes ved 37 ° C i en inkubator forsynt med 5% CO2 i 12 timer.
MERK: Vanligvis kan 150-300 holmer høstes fra en 12-ukers C57BL / 6J-mus. Isletene er tilbøyelige til å danne aggregater under kultur,Og de store øyer (> 300 μm) er utsatt for sentrale nekrose ( figur 1B , innsett). Rist opp suspensjonsbrønnen for jevnt fordelt øyene i parabolen og for å redusere klumping.
- Inkubér de koniske rørene som inneholder perfusert pankreas ved 37 ° C i 17 minutter.
2. Islet Culture on the Scaffold
MERK: DCS har en porøsitet på rundt 79%, en tykkelse på ca. 0,6 mm og en porestørrelse som strekker seg fra 12 til 300 μm.
- Klipp stillasene i 7 mm-disker, suge dem i 70% etanol, og vask dem med HBSS. Plasser stillasene i 24-brønn vevskulturinnsatsene.
MERK: Når friske øyer blir gjenopprettet etter overnattingskultur, ser øyene lyse og tette ut, med glatte grenser ( Figur 3B ). - Vri fatet og samle øyene fra midten av fatet ved hjelp av en 20 μL pipette med en hvit spiss. Overfør øyene til stillasene (250 holmer / stillas) ved hjelp av en pipette og tilsett 2 ml kulturmedium tilbrønnen. Kultur øyene i 12 timer før transplantasjon.
3. Islets Transplantation på EFP Site
- Diabetesinduksjon hos mottakermus.
- Plasser C57BL / 6J mus (mer enn 10 uker gamle) i et friskt bur med vannforsyning, men ingen mat. Rask musene i 10 timer før induksjon av diabetes.
- Forbered bufferløsninger med pH-verdier på 4,2-4,5 ved å blande 0,1 M sitronsyre med 0,1 M natriumcitrat. Oppløs STZ (10 mg / ml) i den nyfremstilte bufferen og steriliser løsningen ved å passere den gjennom et 0,22 μm filter.
MERK: STZ er lysfølsom og mister aktivitet innen 10 minutter; Forbered alltid den friske STZ-løsningen rett før injeksjon. - Injiser hver mus intraperitonealt med STZ i en dose på 140-150 mg / kg for hver C57BL / 6J mus.
MERK: Dosen varierer avhengig av alder og arter av dyret. Det anbefales å utføre en liten dose optimalisering teSt for den givne arten før du starter det formelle eksperimentet. - Samle halevenen blod og monitor blodglukosen med en glukose meter på dagene 2, 3 og 4 post-STZ injeksjon.
MERK: Når dyrene er hyperglykemiske (ikke-fastende blodsukker> 16,7 mM) i to påfølgende dager, er de klare for øktransplantasjon.
- Transplantasjon av øyer til EFP-stedet.
- Bedøv musene med pentobarbital levert intraperitonealt (50 mg / kg). Plasser musen i hvilestilling på et papirhåndkle, med halen som peker mot operatøren. Barber abdomen i stor grad for å fjerne pelsen fra rundt snittet. Tape ned de fire lemmer og swab huden helt med vekslende alkohol og iodophor-våtservietter beveget seg på en sirkulær måte for å sterilisere snittet. Drape musen med en steril drap, som bare tillater tilgang til snittområdet. Lag en 7 mm snitt gjennom bukhinneveggen iMidtlinje, nær kjønnsområdet.
MERK: Alle instrumenter som brukes under operasjonen, inkludert hansker, bør være sterile. - Ta forsiktig og fjern EFP fra bukhulen ved hjelp av tang. Spred EFP på fuktet sterilt gassbind. Plasser stillaset som inneholder holmer på EFP og brett EFP for å pakke transplantatet. Sikre den direkte kontakten mellom øyene og EFP ved å sutere EFP med absorberbare 6-0 suturer. Våt overflaten av EFP med steril saltløsning med en fuktig bomullspinne for å forhindre at EFP tørker ut.
- Sett forsiktig EFP tilbake i bukhulen. Lukk snittet ved å sutere peritonealvegget og klemme det dermale laget med sårklemmer.
- Injiser buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant som et smertestillende middel.
- Injiser 1 ml saltvann subkutant for å forhindre dehydrering.
- Plasser musen i et bur på en varmepute til musen gjenoppretter fra anestesi.
- Kontroller ikke-fastende glukose leVelger to dager senere ved å samle blod fra halevenen. Hvis du henter graftet, gjenta transplantasjonsprosedyrene, trekk forsiktig EFP, bruk 3-0 sutur for å ligere slutten av fettputen ved siden av epididymis, okkluder blodkarene, eksplodere EFP-graftet og bevare det for histologi .
MERK: Exploring the islets bør gjøre mottakeren mus hyperglykemisk igjen innen 3 dager, bekrefter graftens funksjon.
- Bedøv musene med pentobarbital levert intraperitonealt (50 mg / kg). Plasser musen i hvilestilling på et papirhåndkle, med halen som peker mot operatøren. Barber abdomen i stor grad for å fjerne pelsen fra rundt snittet. Tape ned de fire lemmer og swab huden helt med vekslende alkohol og iodophor-våtservietter beveget seg på en sirkulær måte for å sterilisere snittet. Drape musen med en steril drap, som bare tillater tilgang til snittområdet. Lag en 7 mm snitt gjennom bukhinneveggen iMidtlinje, nær kjønnsområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår klemmetode, utført ved hjelp av en mikroskopisk hemostatisk klemme, er rett og tidsbesparende sammenlignet med suturligasjonsteknikken. Det tok omtrent 4 timer å isolere og rense ca. 1200 øyer fra 6 mus. De ferske isolerte øyene hadde typisk en grov periferi under et optisk mikroskop ( figur 3A ). Når øyene ble gjenopprettet fra isolasjonsprosessen, så de seg lyse og tette og kjøpte en jevn overflate. Imidlertid kan den stressende isolasjonen fremkalle celledød, noe som resulterer i sloughing av celler fra øyets overflater, og usunne øyer inneholdt ofte en mørk nekrotisk kjerne ( figur 3B ). Vi målte diametrene på 945 holmer fra 5 mus; Den beregnede gjennomsnittlige øldiameteren var 130,42 ± 41,75 μm ( figur 3C ).
For å unngå mottakerens immunforsvar Avvisning, utførte vi syngene transplantasjoner i C57BL / 6J mus. Vanligvis ble 500 øyer lastet DCS transplantert til stedet for EFP og reversert hyperglykemien innen 10 dager sammenlignet med de 30 dagene observert i den frie øyegruppen. Normoglykemien ble opprettholdt i ca. 100 dager, til gjenvinning av transplantatene ( Figur 3D ). De lastede øyene ble jevnt fordelt på DCS og dekket av EFP. Den ølbelastede DCS kan også enkelt håndteres ved hjelp av tang ( figur 3E og 3F ). Den histologiske studien viste at de jevnt fordelte øyene ble revaskularisert og omgitt av EFP-vevet og DCS etter transplantasjon i 60 dager ( Figur 3G ). Immunfargingen av insulin bekreftet videre den vellykkede engraftment av øyene ( Figur 3H ).
Xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 54995 / 54995fig3.jpg "/>
Figur 3: Transplantasjon av stillas-støttede øyer til EFP-stedet. ( A ) Representativt bilde av friske øyer isolert fra mus. ( B ) Islets kultivert i 12 timer, med døde celler som sloughing off islet overflaten. Inset: usunne øyer har en mørk, nekrotisk kjerne. ( C ) Størrelsesfordeling av 945 øyer fra 5 mus. ( D ) Ikke-fastende blodglukosenivå av diabetemusene transplantert med DCS-støttede øyer og frie øyer. Den svarte pilen indikerer at transplantatet ble hentet på dette tidspunktet. ( E ) Fotografi som viser overføringen av ølbelastet stillas på overflaten av et spredt EFP-vev. ( F ) Representativt fasekontrastbilde av den ølbelastede DCS. Inset: Optisk bilde av DCS, holdt av tang. ( G ) Representativt histologisk H & E bilde avTransplanterte øyer, omgitt av DCS og EFP, etter 60 dager. ( H ) Immunostaining av DCS-støttede øyene, eksplantert etter 60 dager. Skalestenger = 150 μm (A, B), 100 μm (F), 500 μm (G) og 25 μm (H). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pancreas perfusjon og fordøyelsestid er to viktige parametere som påvirker øktutbytte og kvalitet. Moskalewski rapporterte først bruken av en rå kollagenaseblanding for å fordøye hakket marsvinpankreas 11 . Lacy et al. Rapporterte injeksjonen av enzymer i kanalsystemet for å perfeksere bukspyttkjertelen, noe som økte økningen 12 i stor grad . Den duale perfusjonen av enzym muliggjør maksimal eksponering av bukspyttkjertelenes overflateareal til enzymet, noe som resulterer i en mer homogen fordøyelse og en større frigjøring av intakte øyer sammenlignet med fordøyelsen av hakket bukspyttkjertel 13 . Etter vår erfaring var den vellykkede kanyleringen av galdekanalen og perfusjonen av hele bukspyttkjertelen forutsetninger for høye ølutbytter. Dette skyldes at bukspyttkjertelen (splenic lobe) faktisk inneholder de fleste øyer sammenlignet med bukspyttkjertelen i nærheten av tolvfingertarmen. Det er to måter å kannulere på Gallekanalen som rapporteres i litteraturen: i) å sette nålen nær leverstedet mens det blokkerer innføringen av enzymet i tolvfingertarmene 13 , 14 og ii) å sette nålen nær tolvfingertarmen mens det blokkerer innføringen av enzym i Lever 15 . Her vedtok vi sistnevnte teknikk, som ikke krever bøyning av nålen eller reposisjonering av musen. En velutdannet forsker kan utføre kanyleringen av 10 mus innen 40 minutter når vi følger protokollen vår. Fordøyelsestiden for bukspyttkjertelen varierer med alder og arter av musene. Over-fordøyd bukspyttkjertel produserer små øyer og under fordøyet bukspyttkjertelen har akinarceller festet til øyene. Det er derfor viktig å optimalisere fordøyelsestiden for å oppnå høye utbytter av sunne øyer.
STZ er en antibiotikumforbindelse som spesifikt ødelegger beta-celler og induserer diabetes hos mus innen 3 dagerSs = "xref"> 16. Doseringen varierer med den spesifikke musestammen og alderen og bør bestemmes av forhåndsforsøk. Vi vet at C57BL / 6J mus krever en lavere dose STZ enn Balb / C-mus. En overdose av STZ vil forårsake alvorlig hyperglykemi og føre til dyrets død innen en uke, mens en utilstrekkelig STZ dose reduserer diabetes forekomsten.
EFP er svært vascularized vev og lett tilgjengelig for kirurgi gjennom minimalt invasive prosedyrer. Transplantasjonen av øyer til EFP er generelt mer lett og tryggere sammenlignet med nyrekapselet, et annet vanlig rapportert sted for øletransplantasjon i musemodeller. Nyren er spesielt et viktig organ og er delikat å håndtere; Transplantasjonen av øyer kan mislykkes eller dyrene kan ikke overleve operasjonen 4 . EFPene i mus ligner også den omentalske posen hos mennesker. Transplantasjonsstudien i EFP kan ikke bare lette vårtForståelse av forutsetningen for vevsmiljøet for øloverlevelse / -funksjon, men legger også grunnlaget for utvikling av kliniske transplantasjonsprosedyrer 17 .
DCS anvendt i denne studien ble avledet fra bovin perikardium og ble hovedsakelig laget av kollagen. De decellulariserte materialene kan ikke vise immunogenicitet og kan bare indusere milde inflammatoriske responser in vivo 18 . Når holmer ble podet i porerne i DCS, ga stillaset mekanisk beskyttelse og forhindret øyene i å klemme sammen, noe som kunne føre til nekrose av øyene. DCS-stillaset som inneholder øyene kan håndteres direkte ved hjelp av pincet, slik at transplantasjonen enkelt kan overføres. Embedding av stillasene i EFP reduserte også lekkasjen av øyer i bukhinnen, i motsetning til de frie øyene transplantert uten stillas 8 . Derfor gir DCS distincT fordeler for øktransplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Wei Zhang fra Guanhao Biotech for å gi de decellulariserte stillasene. Vi takker Xiao-hong Peng for de nyttige diskusjonene. Denne undersøkelsen ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (Prosjekt nr.31322021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
