Summary
Denne protokol demonstrerer murin islet isolering og såning på en decellulariseret stillads. Stilladsunderstøttede øer blev transplanteret i den epididymiske fedtpude af streptozotocin (STZ) -inducerede diabetiske mus. Islets overlevede på transplantationsstedet og reverserede den hyperglykæmiske tilstand.
Abstract
Isletransplantation er klinisk bevist at være effektiv til behandling af type 1 diabetes. Imidlertid kan den nuværende intrahepatiske transplantationsstrategi medføre akutte helblodsreaktioner og resultere i fattig islet engraftment. Her rapporterer vi en robust protokol til transplantation af øer på det ekstrahepatiske transplantationssted - den epididymale fedtopat (EFP) - i en diabetisk musemodel. En protokol til isolering og oprensning af øer ved høje udbytter fra C57BL / 6J mus er beskrevet, såvel som en transplantationsmetode udført af seedøer på et decellulariseret stillads (DCS) og implantering dem på EFP-stedet i syngene C57BL / 6J mus-renderede diabetiske Af streptozotocin. DCS-transplantatet indeholdende 500 øer reverserede den hyperglykæmiske tilstand inden for 10 dage, mens de frie øer uden DCS krævede mindst 30 dage. Normoglykæmi blev opretholdt i op til 3 måneder, indtil graften blev eksplanteret. Som konklusion forbedrede DCS engraftment of islets into tHan ekstrahepatiske site af EFP, som let kunne hentes og muligvis tilvejebringe en reproducerbar og nyttig platform til undersøgelse af stilladsmaterialerne, såvel som andre transplantationsparametre, der kræves for en vellykket holning.
Introduction
Type 1 diabetes mellitus (T1D) er en autoimmun endokrine lidelse, hvor ølceller ablateres af immunsystemet, hvilket gør patienterne afhængige af injektion af eksogent insulin i hele deres liv. Edmonton-protokollen repræsenterer en milepæl i kliniske undersøgelser af øletransplantation; Øer blev infunderet gennem portalvenen og transplanteret på det intrahepatiske sted 1 . Imidlertid forhindrer to store hindringer - utilstrækkelige kilder til donorøer og fattig øl-indflydelse - den store succes med øletransplantationen 2 . Øer skal normalt indsamles fra tre cadaveriske donorer for at reversere den hyperglykæmiske tilstand hos en patient; Dette skyldes det lave udbytte af ølisoleringsprocedurer og øletab efter transplantation. I særdeleshed fremkaldte den direkte kontakt med blod ofte det øjeblikkelige blodmedierede inflamma, selv om post-transplantationsøerne blev badet i oxygenholdigt blod.Tory reaktion (IBMIR), hvilket kunne forårsage akut tab af øerne. På lang sigt antages det, at det gradvise tab af øer hos patienter tegnede sig for faldet i tilbagegang i diabetes i de kliniske grupper, som kunne nå 90% i det første år og faldt til 30% og 10% med 2 og 5 År efter transplantation henholdsvis 3 .
Isletransplantation på ekstrahepatiske steder har været en attraktiv strategi for at reducere direkte kontakt mellem øer med blod og begrænsning af transplantaterne til mere definerbare steder sammenlignet med intrahepatisk infusion. Undersøgelser er blevet gennemført i nyrekapsel, øje, muskler, fedtpuder og subkutane rum de seneste år, hvilket viser at øer på disse steder er i stand til at overleve og fungere for at genoprette normoglykæmi 4 . Derudover er øerne på disse steder retrievable, hvilket gør det muligt for biopsi eller endda til yderligere udskiftningsprocedurer. Extrahepatic sDet viser derfor stort potentiale for klinisk transplantation 5 .
Biomaterialebaserede stilladser er blevet undersøgt intensivt for celletransplantation og vævsteknik. Tredimensionale (3D) stilladser indeholder sædvanligvis porøse strukturer og kan tjene som cellulære skabeloner til at generere rumlig struktur / organisering af celler eller som reservoirer for at tilvejebringe den styrede frigivelse af bioaktive signaler. Stilladser er også blevet fremstillet af polymere materialer, såsom poly (glycolid-L-lactid) 6 , poly (dimethylsiloxan) 7 og termoplastisk poly (urethan) 8 til transplantationsøer i EFP. Sammenlignet med den direkte transplantation af øer viste brugen af stilladser at reducere øltab ved at forhindre lækage af øer i det intraperitoneale hulrum 9 , 10 , hvilket gav mekanisk beskyttelse og moduLating den lokale inflammatoriske reaktion. Stilladserne kan således udvikles for at fremme øl-engraftment på transplantationsstederne 7 .
I denne undersøgelse har vi til hensigt at demonstrere et paradigme af øletransplantation i EFP, udført i musmodeller ved hjælp af en DCS. Stilladser afledt af ekstracellulære matricer har tiltrukket stor interesse i de seneste år på grund af den overlegne biokompatibilitet og mere naturlige porøse strukturer sammenlignet med syntetiske produkter. Her beskriver vi en robust isolationsprotokol for at opnå pancreasøer med høje udbytter fra C57BL / 6J mus. DCS'er behandlet fra bovin perikardiet blev derefter podet med øer, og transplantaterne blev transplanteret til EFP i syngene diabetiske modeller. Normoglykæmi hos mus blev opnået inden for 10 dage og blev opretholdt i op til 100 dage indtil fjernelsen af transplantaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af Peking University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, IACUC nr. COE-LuoY-1).
1. Islet Isolation
- Fremstilling af reagenser og udstyr.
- Rekonstituer collagenase P-pulver (2 U / mg) i HBSS for at lave en 5 mg / ml opløsning og filtrer den gennem et 0,22 μm filter for at fjerne bakterierne. Forbered 0,6 ml alikvot opløsninger af collagenase P i 15 ml koniske rør og opbevar ved -20 ° C.
BEMÆRK: Under brug fortyndes hver aliquot med HBSS for at give 6 ml arbejdsløsninger med en slutkoncentration på 0,5 mg / ml eller 1 U / ml (nok til at behandle 3 mus). Arbejdsløsningen opbevares på is til øjeblikkelig brug inden for 1 time. Arbejdsløsningen bør ikke genoprettes eller genfryses til yderligere brug. - Forbered neutraliseringsopløsning ved at tilsætte FBS (2,5%) og P / S (1%) i HBSS; Hold opløsningen på is. Tilbered 60 ml neutraliseringsopløsning til treaT 6 mus.
- Til ølkulturmediet tilsættes D-glucose (7 mM), FBS (10%) og P / S (1%) til RPMI 1640 medium.
- Autoklaver kirurgiinstrumenterne ved 115 ° C i 30 minutter og 15 psi tryk.
- Rekonstituer collagenase P-pulver (2 U / mg) i HBSS for at lave en 5 mg / ml opløsning og filtrer den gennem et 0,22 μm filter for at fjerne bakterierne. Forbered 0,6 ml alikvot opløsninger af collagenase P i 15 ml koniske rør og opbevar ved -20 ° C.
- Inflammation af bugspytkirtlen.
- Klargør 12 ml kollagenasearbejdsløsning som specificeret i trin 1.1.1 for 6 mus (12 uger gamle). Fyld 10 ml sprøjten med 9 ml arbejdsopløsning og tilslut sprøjten til 27 G intravenøs nål. Opbevar sprøjten på is og brug opløsningen inden for 1 time.
- Euthanize musen ved cervikal dislokation. Placer musen i ryglæn på et papirhåndklæde, hvor halen peger mod operatøren. Sprøj hele kroppen med 70% ethanol, hvilket gør det helt vådt.
- Lav en V-snit, der starter fra kønsområdet og strækker sig til membranen ved hjælp af dissektionssaks og tang. Fold huden over brystet for helt at afsløre bukhulen.
- Bevæge sigTarmen til højre side af musen og udsætter bukspyttkjertlen og den fælles galdekanal. Grib duodenum omhyggeligt med tang og træk det, indtil galdekanalen er spændt ( figur 1A -1 og A-2 ).
- Find portalvenen og galdekanalen, der fører til leveren. Klem portåre og galdekanal med en mikroskopisk hæmostatisk klemme.
BEMÆRK: Klemmen forhindrer overdreven blødning og indføring af kollagenasen i leveren. - Mens du stadig holder tarmene med pincet, skal du finde placeringen af ampullen, der forbinder galdekanalen og tolvfingertarmen. Indsæt 27G intravenøs nål i den fælles galdekanal gennem ampullen ( figur 1B -1 og B-2 ).
- Dispense omkring 200 μL kollagenase arbejdsløsning for at kontrollere om cannulationen er helt igennem galdekanalen. Hvis kollagenaseopløsningen begynder at fylde kanalen ( 1 og C2 ), nålen er i kanalens lumen; Klemme kanalsegmentet, der indeholder nålen, ved hjælp af en arterie hæmostatisk klemme og dispensere resten af 2 ml opløsningen med en langsom og konstant hastighed inden for 1 min ( figur 2A -1 , A-2 og B-1 ).
BEMÆRK: Hvis vævet omkring kanalen begynder at blæse op ( figur 2B -2 ), har nålen steget gennem gallekanalens væg, hvilket gør det nødvendigt at genplacere nålen og forsøge at kanylere galdekanalen igen. Tilsvarende, hvis duodenum begynder at blæse op ( Figur 2C -1 og C-2 ), skal den arterie hæmostatiske klemme justeres, og galdekanalen kan omkanuleres. Når kollagenaseopløsningen fylder op i bugspytkirtlen, blæser vævet nær duodenum først efterfulgt af regionenN nær bugspytkirtlen. Perfusionen af bugspytkirtlen (miltkæben) er vigtig for at maksimere øludbyttet. - Efter den fuldstændige inflation af bugspytkirtlen ( figur 2C -1 ), skubbet tarm til venstre på musen og fjern bugspytkirtlen ved at starte ved den nedadgående kolon. Brug tangen til at løfte tarm og adskille den fra bugspytkirtlen med et andet par tænger. Fortsæt med at fjerne bugspytkirtlen, indtil den er løsgjort fra toppen af maven. Endelig løft bukspyttkjertlen ud af maven og skær den fri fra den resterende milt.
BEMÆRK: Hele adskillelsen skal udføres hurtigt, da fordøjelsen fortsætter under fjernelsen. - Placer bukspyttkjertlen i et tomt 15 ml konisk rør og lad det stå på is. Gentag ovennævnte procedure for de resterende mus. Alle bugspytkirtlen bør behandles yderligere inden for 1 time ved øjeblikkeligt at følge trin 1.3 for at forhindre overfordøjelse ved hjælp af collagenase P. </ Li>
Figur 1: Fotografier, der viser canalulationen af galdekanalen og perfusionen af bugspytkirtlen med kollagenaseopløsninger. ( A1 ) Træk i tolvfingertarmen, indtil galdekanalen er stram. (Ampulla: det trekantede, mælkeområde på overfladen af duodenum; galdekanal: den snorlignende mælkeformede struktur på overfladen). ( B1 ) Sæt nålen ind i galdekanalen fra ampullen. ( C1 ) Blæser i bugspytkirtlen med injektion af enzym. ( A2, B2 og C2 ) Tegneseriebilleder af procedurerne vist i henholdsvis A1, B1 og C1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fejlfinding til kanyleringen. ( A1 ) Nålespidsen indsat i galdekanalens lumen. ( A2 ) Kanalen fyldt med enzymopløsninger. ( B1 ) Nålen indsat i galdekanalens lumen og kanalen fyldt med et blåt farvestof. ( B2 ) På grund af uhensigtsmæssig kanylering er nålen under galdekanalen, og kun en oppustet kapsel observeres efter udgivelse af det blå farvestof. ( C1 ) En vellykket cannulation fremgår af udstødningen af bugspytkirtlen. ( C2 ) På grund af uhensigtsmæssig fastspænding kommer blå farve ind i tolvfingertarmen og forårsager distention. Klik her for at se en større version af denne figur.
- <Stærk> Fordøjelse og rensning af øer.
- Inkuber de koniske rør indeholdende perfusionspancreas ved 37 ° C i 17 minutter.
BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere med dyrets alder og arter. - Afslut fordøjelsen ved at tilføje 7 ml neutraliseringsopløsning og sæt rørene på is.
- Dissocier vævet ved at ryste rørene kraftigt ( fx 20 gange i 10 s), indtil der opnås fina vævspartikler.
BEMÆRK: Øludbyttet vil være lavt, hvis bugspytkirtlen ikke adskiller helt. - Filtrer de fordøjede vævsprøver gennem 0,5 mm trådnet for at fjerne eventuelle ikke-fordøjede vævsbiter. Saml østersuspensionerne i et nyt 50 ml konisk rør.
- Centrifuger rørene i 3 minutter ved 230 xg og 4 ° C, og hæld supernatanten forsigtigt omhyggeligt uden at forstyrre vævspellets.
- Resuspender pellets fra 3 mus i 4 ml polysucrose densitetsgradient ved vortexing forsigtigt eller pIpetting suspensionen op og ned et par gange. Sæt langsomt 4 ml HBSS ned på siden af røret til toppen af polysucroseopløsningerne.
BEMÆRK: De to løsninger skal være velafskalede lag med en skarp grænseflade.
BEMÆRK: Tilsætningen af HBSS skal udføres forsigtigt uden at forstyrre polysucrose densitetsgradienten i bunden. - Centrifug suspensionen i 20 minutter ved 900 xg og 4 ° C ved at vælge en meget langsom accelerationshastighed. Afslut centrifugeringen uden bremse.
BEMÆRK: Dette er et skridt til at rense øerne fra eksokrine celler, med de fleste af øerne migrerende til grænsefladen mellem lagene af polysucrose og HBSS og de fleste exocrine celler, der nedlægger bunden. - Fjern hele 8 mL-supernatantopløsningerne ved anvendelse af en 15 ml pipetter med stor bore. Pass opløsningerne gennem en inverteret 70 μm filter.
BEMÆRK: Øerne vil blive yderligere renset og bevaret af silen, mens de eksokrine cellerVil passere gennem filteret.
Forsigtig: Polysucorse densitetsgradienten er celle-toksisk; Filtreringen vil hjælpe øerne slippe af med polysucrose. - Pipetter 2 ml kold neutraliseringsopløsning i en 35 mm petriskål. Inverter cellefiltret med højre side op, dypp overfladen, der holder øerne i opløsningen, og skub forsigtigt for at frigive øerne.
- Håndplukk øerne under et mikroskop ved hjælp af en 20 μl pipette med et hvidt spids.
BEMÆRK: Øerne er gullige kompakte celleaggregater ( Figur 3A ), mens det forurenende eksokrine væv eller celler har en sort og løs struktur under dissekeringsmikroskopet. - Placere omkring 200 øer i en 35 mm skål med 2 ml dyrkningsmedium og inkuberes ved 37 ° C i en inkubator forsynet med 5% CO2 i 12 timer.
BEMÆRK: Normalt 150-300 holme kan høstes fra en 12-ugers C57BL / 6J mus. Islets er tilbøjelige til at danne aggregater under kultur,Og de store øer (> 300 μm) er modtagelige for centralnekrose ( figur 1B , indsats). Skud suspensionen godt for at jævnt fordele øerne i skålen og for at reducere klumpning.
- Inkuber de koniske rør indeholdende perfusionspancreas ved 37 ° C i 17 minutter.
2. Islet Culture on the Scaffold
BEMÆRK: DCS har en porøsitet på ca. 79%, en tykkelse på ca. 0,6 mm og en porestørrelse på mellem 12 og 300 μm.
- Skær stilladserne i 7 mm skiver, blød dem i 70% ethanol og vask dem med HBSS. Placer stilladserne i 24-brønds vævskulturindsatser.
BEMÆRK: Når friske holme genvindes efter overnatningskultur, vises øerne lyse og tætte, med glatte grænser ( Figur 3B ). - Skær skålen og saml øerne fra midten af parabolen ved hjælp af en 20 μL pipette med en hvid spids. Overfør øerne til stilladserne (250 holme / stillads) ved hjælp af en pipette og tilsæt 2 ml dyrkningsmedium tilbrønden. Kultur øerne i 12 timer før transplantation.
3. Islets Transplantation på EFP Site
- Diabetes induktion i modtagende mus.
- Placer C57BL / 6J mus (mere end 10 uger gamle) i et frisk bur med vandforsyning, men ingen mad. Hurtig musene i 10 timer før induktion af diabetes.
- Forbered pufferopløsninger med pH-værdier på 4,2-4,5 ved at blande 0,1 M citronsyre med 0,1 M natriumcitrat. Opløs STZ (10 mg / ml) i den frisklavede buffer og steriliser opløsningen ved at passere den gennem et 0,22 μm filter.
BEMÆRK: STZ er lysfølsom og taber aktivitet inden for 10 minutter; Forbered altid den friske STZ-løsning lige inden injektionen. - Injicér hver mus intraperitonealt med STZ i en dosis på 140-150 mg / kg for hver C57BL / 6J mus.
BEMÆRK: Dosis varierer afhængigt af dyrets alder og arter. Det anbefales at udføre en lille dosisoptimaliseringsteSt for den givne art, før du starter det formelle eksperiment. - Saml haleven blod og monitor blodglukosen med en glukosemåler på dag 2, 3 og 4 post-STZ injektion.
BEMÆRK: Når dyrene er hyperglykæmiske (ikke-fastende blodsukker> 16,7 mM) i to på hinanden følgende dage, er de klar til øletransplantation.
- Transplantation af øer til EFP-stedet.
- Bedøve musene med pentobarbital leveret intraperitonealt (50 mg / kg). Placer musen i ryglæn på et papirhåndklæde, hvor halen peger mod operatøren. Barber abdomen i vid udstrækning for at fjerne pelsen fra omkring snitstedet. Tape ned de fire lemmer og swab huden helt med skiftende alkohol og iodophorservietter bevæges cirkulært for at sterilisere snitstedet. Drape musen med en steril drapering, der kun tillader adgang til snitområdet. Lav en 7 mm snit gennem peritonealvæggen iMidline, tæt på kønsområdet.
BEMÆRK: Alle instrumenter, der anvendes under operationen, herunder handsker, skal være sterile. - Tag forsigtigt og fjern EFP fra bukhulen ved hjælp af pincet. Spred EFP på fugtet sterilt gasbind. Placer stilladserne indeholdende holme på EFP og fold EFP'en til at pakke transplantationen. Sikre den direkte kontakt mellem øerne og EFP ved at sutere EFP med absorberbare 6-0 suturer. Våd overfladen af EFP med steril saltopløsning ved hjælp af en gennemblødt bomuldspindel for at forhindre, at EFP tørrer ud.
- Sæt forsigtigt EFP tilbage i maveskavheden. Luk snittet ved at sutere peritonealvæggen og klemme det dermale lag med sårklip.
- Injicer buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutant som et smertestillende middel.
- Injicer 1 ml saltvand subkutant for at forhindre dehydrering.
- Placer musen i et bur på en varmepude, indtil musen vender tilbage fra anæstesi.
- Kontroller den ikke-faste glukose leVels to dage senere ved at samle blod fra halevenen. Hvis du henter graftet, gentag ovenstående transplantationsprocedurer, træk forsigtigt EFP, brug 3-0 sutur til at ligere slutningen af fedtpuden i nærheden af epididymis, okkluder blodkarrene, eksplodere EFP-transplantatet og bevare det for histologi .
BEMÆRK: Exploring af øerne skal gøre modtageren mus hyperglykæmisk igen inden for 3 dage, hvilket bekræfter graftens funktion.
- Bedøve musene med pentobarbital leveret intraperitonealt (50 mg / kg). Placer musen i ryglæn på et papirhåndklæde, hvor halen peger mod operatøren. Barber abdomen i vid udstrækning for at fjerne pelsen fra omkring snitstedet. Tape ned de fire lemmer og swab huden helt med skiftende alkohol og iodophorservietter bevæges cirkulært for at sterilisere snitstedet. Drape musen med en steril drapering, der kun tillader adgang til snitområdet. Lav en 7 mm snit gennem peritonealvæggen iMidline, tæt på kønsområdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores klemmetode, udført ved hjælp af en mikroskopisk hæmostatisk klemme, er ligetil og tidsbesparende sammenlignet med suturligationsteknikken. Det tog cirka 4 timer at isolere og rense omkring 1.200 holme fra 6 mus. De frisk isolerede øer havde typisk en grov periferi under et optisk mikroskop ( figur 3A ). Når øerne blev genoprettet fra isoleringsprocessen, så de lyse og stramme og fik en glat overflade. Den stressende isolation kan dog stadig fremkalde celledød, hvilket resulterer i sloughing af celler fra ølfladerne, og usunde øer indeholdt ofte en mørk nekrotisk kerne ( figur 3B ). Vi målte diametre på 945 øer fra 5 mus; Den beregnede gennemsnitlige øldiameter var 130,42 ± 41,75 μm ( figur 3C ).
For at undgå modtagers immunitet Afvisning, udførte vi syngene transplantation i C57BL / 6J mus. Typisk blev 500 øer belastet DCS transplanteret til EFP'ens sted og reverseret hyperglykæmi inden for 10 dage sammenlignet med de 30 dage, der blev observeret i den frie ølgruppe. Normoglykæmi blev opretholdt i ca. 100 dage indtil hentning af transplantaterne ( Figur 3D ). De ladede øer blev jævnt fordelt på DCS og dækket af EFP. Den ølbelastede DCS kunne også nemt håndteres med tang ( figur 3E og 3F ). Den histologiske undersøgelse viste, at de jævnt fordelte øer blev revaskulariseret og omgivet af EFP vævet og DCS efter transplantation i 60 dage ( Figur 3G ). Immunfarvningen af insulin bekræftede yderligere den vellykkede engraftment af øerne ( figur 3H ).
Xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 54995 / 54995fig3.jpg "/>
Figur 3: Transplantation af stilladsstøttede øer til EFP-stedet. ( A ) Repræsentativt billede af friske øer isoleret fra mus. ( B ) Islets dyrkes i 12 timer, med døde celler sloughing off øen overfladen. Inset: usunde holme har en mørk nekrotisk kerne. ( C ) Størrelsesfordeling af 945 øer fra 5 mus. ( D ) Ikke-fastende blodglukoseniveau af de diabetiske mus transplanteret med DCS-støttede øer og frie øer. Den sorte pil indikerer, at transplantatet blev hentet på dette tidspunkt. ( E ) Fotografi, der viser overførslen af ølbelastet stillads på overfladen af et spredt EFP væv. ( F ) Repræsentativ fasekontrastbillede af den ølbelastede DCS. Inset: Optisk billede af DCS'en, der holdes af tang. ( G ) Repræsentativt histologisk H & E billede afTransplanterede holme omgivet af DCS og EFP efter 60 dage. ( H ) Immunostaining af DCS-støttede øer, eksplanteret efter 60 dage. Skalestænger = 150 μm (A, B), 100 μm (F), 500 μm (G) og 25 μm (H). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pancreas perfusion og fordøjelsestid er to vigtige parametre, der påvirker islet udbytte og kvalitet. Moskalewski rapporterede for første gang brugen af en rå collagenaseblanding til fordøjelse af hakket marsvinpancreas 11 . Lacy et al. Rapporterede injektionen af enzymer i kanalsystemet for at perfusere bugspytkirtlen, hvilket i høj grad øgede øludbyttet 12 . Den duale perfusion af enzym muliggør maksimal eksponering af bugspytkirtlenes overfladeareal til enzymet, hvilket resulterer i en mere homogen fordøjelse og en større frigivelse af intakte holme i sammenligning med fordøjelsen af hakket pankreas 13 . I vores erfaring var den vellykkede kanylering af galdekanalen og perfusionen af hele bugspytkirtlen forudsætninger for høje øludbytter. Dette skyldes, at bugspytkirtlen (spleniclobe) faktisk indeholder de fleste af øerne sammenlignet med bugspytkirtlen i nærheden af tolvfingertarmen. Der er to måder at kannulere på Galdekanalen, der rapporteres i litteraturen: i) indsætter nålen tæt på leverstedet, mens det blokkerer enzymets indtræden i tolvfingertarmene 13 , 14 og ii) indsætter nålen tæt på tolvfingertarmen og blokerer enzymets indtræden i Lever 15 . Her vedtog vi sidstnævnte teknik, som ikke kræver at bøje nålen eller genplacere musen. En veluddannet forsker kan udføre kanyleringen af 10 mus inden for 40 minutter, når vi følger vores protokol. Fordøjelsestiden for bugspytkirtlen varierer med musens alder og arter. Overfordøjet bukspyttkjertel producerer små øer og underfordøjet bugspytkirtel har acinarceller fastgjort til øerne. Det er derfor vigtigt at optimere fordøjelsestiden for at opnå høje udbytter af sunde øer.
STZ er en antibiotikumforbindelse, der specifikt ødelægger beta celler og inducerer diabetes hos mus inden for 3 dageSs = "xref"> 16. Doseringen varierer med den specifikke musestamme og alder og bør bestemmes ved forudforsøg. Vi vidste, at C57BL / 6J mus kræver en lavere dosis STZ end Balb / C mus. En overdosis af STZ ville forårsage alvorlig hyperglykæmi og føre til dyrenes død inden for en uge, mens en utilstrækkelig STZ dosis sænker diabetesfrekvensen.
EFP'er er stærkt vaskulariserede væv og er bekvemt tilgængelige for kirurgi gennem minimalt invasive procedurer. Transplantationen af øer til EFP er generelt mere let og sikrere sammenlignet med nyrekapslen, et andet almindeligt rapporteret sted for øletransplantation i musemodeller. Nyren er især et vigtigt organ og er følsomt at håndtere; Transplantationen af øer kan mislykkes, eller dyrene må muligvis ikke overleve operationen 4 . EFP'erne i mus svarer også til den omentalske pose hos mennesker. Transplantationsundersøgelsen i EFP kan ikke kun lette voresForståelse af forudsætningen for vævsmiljøet for ødeoverlevelse / -funktion, men ligeledes grundlaget for udvikling af kliniske transplantationsprocedurer 17 .
DCS anvendt i dette studie var afledt af bovin perikardium og blev hovedsageligt lavet af collagen. De decellulariserede materialer viser muligvis ikke immunogenicitet og kan kun fremkalde milde inflammatoriske responser in vivo 18 . Når holme blev podet i porerne i DCS'en, stillede stilladset mekanisk beskyttelse og forhindrede øerne i at klumpe sammen, hvilket kunne føre til nekrose af øerne. DCS-stilladset indeholdende øerne kunne håndteres direkte ved anvendelse af tang, hvilket muliggør en let overførsel af transplantationen. Indlejring af stilladserne inden for EFP reducerede også lejningen af øer i peritoneum, i modsætning til i de frie holme transplanteret uden stillads 8 . Derfor giver DCS distincT fordele ved øletransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Wei Zhang fra Guanhao Biotech for at levere de decellulariserede stilladser. Vi takker Xiao-hong Peng for de nyttige diskussioner. Denne forskning blev finansielt støttet af National Natural Science Foundation of China (Projekt nr. 31322021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
