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Bioengineering

मधुमेह चूहों की एपिडीडिमल फैट पैड में आईलेट्स का स्कैफोल्ड-समर्थित प्रत्यारोपण

Published: July 23, 2017 doi: 10.3791/54995
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Peking University, 2Institute of Molecular Medicine, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल मरीन आइलेट अलगाव को दर्शाता है और एक डिकेलरीकृत स्कैफोल्ड पर सीडिंग करता है। स्कैफोल्ड-समर्थित आइलेट्स को स्ट्रेप्टोज़ोटोकिन (एसटीजेड) से प्रेरित मधुमेह चूहों के एपिडिडीमल वसा पैड में प्रत्यारोपित किया गया था। आइलेट्स ट्रांसप्लांटेशन साइट पर बचे और हाइपरग्लेसेमिक हालत को उलट कर दिया।

Abstract

आइलेट प्रत्यारोपण प्रकार 1 मधुमेह के इलाज में प्रभावी साबित हुआ है। हालांकि, वर्तमान इंट्राहेपेटिक प्रत्यारोपण रणनीति में अत्यधिक संपूर्ण रक्त प्रतिक्रियाएं आ सकती हैं और नतीजे खराब आइलेट इंग्रीमेंटमेंट में हो सकते हैं। यहां, हम असाध्य प्रत्यारोपण स्थल पर आइलेट के प्रत्यारोपण के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं- एपिडिडीमल वेट पैड (ईएफपी) - एक मधुमेह के माउस मॉडल में। सी 57 बीएल / 6 जे चूहों से उच्च पैदावार में आइसलेट और शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, साथ ही एक डिकेलरीकृत पाड़ (डीसीएस) पर सीडिंग आइलेट के द्वारा प्रत्यारोपण विधि के रूप में किया गया है और उन्हें सिनेजेनिक सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में ईएफपी साइट पर प्रत्यारोपित मधुमेह स्ट्रेप्टोज़ोटोकिन द्वारा 500 ईस्टलेट वाले डीसीएस ग्राफ्ट को 10 दिनों के भीतर हाइपरग्लैलेसिमिक स्थिति को उलट कर दिया गया था, जबकि डीसीएस के बिना मुफ्त islets को कम से कम 30 दिनों की आवश्यकता थी। भ्रष्टाचार का विश्लेषण किए जाने तक मानमोलाइसीमिया को 3 माह तक बनाए रखा गया था। निष्कर्ष में, डीसीएस ने टी के इग्रेटमेंट को टी में बढ़ा दियावह ईएफपी की ऊर्ध्वाधर साइट है, जिसे आसानी से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और मचान सामग्री की जांच के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उपयोगी मंच प्रदान कर सकता है, साथ ही साथ एक सफल आइलेट engraftment के लिए आवश्यक अन्य प्रत्यारोपण मापदंडों।

Introduction

टाइप 1 डायबिटीज मेलेिटस (टी 1 डी) एक ऑटोइम्यून एंडोक्राइन डिसऑर्डर है जिसमें आइलेट कोशिकाओं को प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा पृथक किया जाता है, जो रोगियों को अपने पूरे जीवन के लिए बहिर्जात इंसुलिन के इंजेक्शन पर निर्भर करता है। एडमोंटन प्रोटोकॉल आईलेट प्रत्यारोपण के नैदानिक ​​अध्ययनों में एक मील का पत्थर का प्रतिनिधित्व करता है; आइलेटों को पोर्टल शिरा के माध्यम से सम्मिलित किया गया था और इंटरेहेपेटिक साइट 1 पर ट्रांसप्लांट किया गया था। हालांकि, दो मुख्य बाधाएं- दाता islets के अपर्याप्त स्रोत और गरीब आइलेट engraftment- आइलेट प्रत्यारोपण 2 की व्यापक सफलता को रोकने। आमतौर पर, एक मरीज की हाइपरग्लिलेसिमिक स्थिति को बदलने के लिए तीन शवदायिक दाताओं से आइसलेट को इकट्ठा करने की आवश्यकता होती है; यह आइलेट अलगाव प्रक्रियाओं की कम उपज और प्रत्यारोपण के बाद आइलेट का नुकसान होने के कारण है। विशेष रूप से, हालांकि प्रत्यारोपण के बाद के ऑक्सीजनों को ऑक्सीजन युक्त रक्त में नहाया गया था, खून के साथ सीधे संपर्क में अक्सर तत्काल खून-मध्यस्थता में सूजन पैदा होती थीटॉररी रिएक्शन (आईबीआईआईआर), जिसके कारण आइलेट्स का तीव्र नुकसान हो सकता है। लंबे समय में, यह माना जाता है कि रोगियों में आइलेटों का क्रमिक नुकसान नैदानिक ​​समूहों में मधुमेह उत्क्रमण दर की गिरावट के हिसाब से होता है, जो पहले वर्ष में 90% तक पहुंच सकता था और 2 और 5 तक 30% और 10% की गिरावट आई साल के बाद ट्रांसप्लांटेशन, क्रमशः 3

अतिसार स्थलों पर आइलेट प्रत्यारोपण एक आकर्षक रणनीति रही है जो रक्त के साथ आइसलेट के सीधे संपर्क को कम करने के लिए किया जाता है जबकि ट्रांस्प्लांट्स को अंतराहिक आशय के मुकाबले अधिक निश्चित स्थानों पर रखा जाता है। पिछले कुछ वर्षों में गुर्दा कैप्सूल, आंख, मांसपेशियों, वसा पैड, और चमड़े के नीचे के स्थानों में अध्ययन किया गया है, यह दर्शाते हुए कि इन साइटों पर आइटेल्स जीवित रहने में सक्षम है और सामान्य तौर पर मानोगेलेसीमिया 4 को बहाल कर रहा है। इसके अलावा, इन साइटों पर आइलेट्स पुनः प्राप्त करने योग्य हैं, जिससे बायोप्सी या फिर प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं के लिए संभव है। एक्स्ट्राहेपेटिक एसइसलिए यह चिकित्सीय प्रत्यारोपण 5 के लिए महान क्षमता का प्रदर्शन करती है।

सेल प्रत्यारोपण और ऊतक इंजीनियरिंग के लिए जैव सामग्री-आधारित स्कॉफल्ड को तीव्रता से जांच की गई है। थ्री-आयामी (3 डी) स्कॉफल्ड में आमतौर पर झरझरा संरचनाएं होती हैं और सेल्युलर टेम्प्लेट के रूप में सेवा प्रदान कर सकती हैं ताकि स्थानिक संरचना / कोशिकाओं का निर्माण हो या जलाशयों के रूप में बायोएक्टिव संकेतों को नियंत्रित किया जा सके। ईफपी में टोपटाइल इस्टेट्स के लिए, स्कॉफॉल्ड्स को पोलीमरिक सामग्रियों से बना दिया गया है, जैसे पाली (ग्लाइकोलाइड-एल-लैक्टिड) 6 , पॉली (डायमिथाइलसिलोक्सैन) 7 और थर्माप्लास्टिक पॉली (urethane) 8 । आइलेटों के प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण की तुलना में, स्कॉफॉल्ड्स का उपयोग इन्टेरेटेिटोनियल गुहा 9 , 10 में आईटालेटों के रिसाव को रोकने के द्वारा आइलेट नुकसान को कम करने के लिए पाया गया, जिसमें यांत्रिक संरक्षण और माउडस्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया लैटिंग प्रत्यारोपण साइटों 7 पर आइलेट engraftment को बढ़ावा देने के लिए स्कॉल्फोल्ड इस प्रकार विकसित किए जा सकते हैं।

इस अध्ययन में, हम ईएफपी में आइलेट प्रत्यारोपण के एक प्रतिमान का प्रदर्शन करना चाहते हैं, जो डीसीएस का इस्तेमाल करते हुए चूहों के मॉडल में किया जाता है। सिंथेटिक उत्पादों की तुलना में बेहतर बायोकोपेटेबिलबिलिटी और अधिक प्राकृतिक झरझरा संरचनाओं के कारण हाल के वर्षों में बाह्य मैट्रिक्स से प्राप्त स्कॉफल्ड ने बहुत रुचि दिखाई है। यहां, हम सी 57 बीएल / 6 जे चूहों से उच्च पैदावार में अग्नाशयी आइसलेट प्राप्त करने के लिए एक मजबूत अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। गोजाइन पेरीकार्डियम से संसाधित डीसीएस को तब आइलेट्स के साथ बीजगणित किया गया, और ग्रंथों को एसईजीएनिक मधुमेह के मॉडल में ईएफपी में ट्रांसप्लांट किया गया। चूहों में नॉर्मोग्लाइसीमिया 10 दिनों के भीतर प्राप्त किया गया था और गिफ्ट को हटाने तक, 100 दिनों तक बनाए रखा गया था।

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Protocol

सभी प्रयोगों को पेकिंग यूनिवर्सिटी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी, आईएसीयूसी नं। सीओई-लुओए-1) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. आइलेट अलगाव

  1. अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी
    1. एचबीएसएस में पुनः संयोजित कोलेजनज़ पा पाउडर (2 यू / एमजी) 5 मिलीग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए और बैक्टीरिया को निकालने के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करें। 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में कोलेजनज़ पी के 0.6 एमएल-अलियोकस समाधान तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: उपयोग के दौरान, प्रत्येक विभाज्य को एचबीएसएस से पतला किया जाता है, जिसमें 0.5 मिलीग्राम / एमएल या 1 यू / एमएल (3 चूहों के इलाज के लिए पर्याप्त) के अंतिम सांद्रता के साथ 6-एमएल कामकाज समाधान प्रदान किया जाता है। काम के समाधान 1 घंटे के भीतर तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर रखा जाता है। अतिरिक्त उपयोग के लिए कार्यशील समाधान बहाल नहीं किया जाना चाहिए या पुन: जमी नहीं होना चाहिए।
    2. एचबीएसएस में एफबीएस (2.5%) और पी / एस (1%) को जोड़कर निराकरण समाधान तैयार करें; बर्फ पर समाधान रखें ट्रेआ के लिए 60 एमएल का निषेचन समाधान तैयार करेंटी 6 चूहों
    3. आइलेट संस्कृति माध्यम के लिए, डीपी-ग्लूकोस (7 मिमी), एफबीएस (10%) और पी / एस (1%) को आरपीएमआई 1640 मध्यम जोड़ें।
    4. 30 मिनट और दबाव के 15 साई के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर सर्जरी उपकरणों को आटोक्लेव करें।
  2. अग्न्याशय का मुद्रास्फीति।
    1. 6 एमआईएस (12 सप्ताह पुराने) के लिए चरण 1.1.1 में निर्दिष्ट के रूप में 12 एमएल कोलेजनेश कामकाजी समाधान तैयार करें। 10 एमएल सिरिंज को 9 एमएल के काम के समाधान के साथ भरें और सिरिंज को 27 जी अंतःशिरा सुई से जोड़ दें। बर्फ पर सिरिंज को स्टोर करें और 1 घंटे के भीतर समाधान का उपयोग करें।
    2. ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को स्तुत करना। ऑपरेटर की ओर इशारा करते पूंछ के साथ, एक कागज तौलिया पर लापरवाही स्थिति में माउस रखें। 70% इथेनॉल के साथ पूरे शरीर को स्प्रे करें, जिससे यह पूरी तरह से गीला हो।
    3. विच्छेदन कैंची और संदंश का उपयोग करते हुए, जननांग क्षेत्र से शुरू होने और डायाफ्राम तक विस्तार करने वाली वी-चीरा बनाएं। पेट की गुहा प्रकट करने के लिए छाती पर त्वचा को मोड़ो।
    4. चालमाउस के दाहिनी ओर आंत्र और अग्न्याशय और आम पित्त वाहिनी का पर्दाफाश। संदंश के साथ सावधानी से ग्रहणी को पकड़ें और उसे खींच जब तक पित्त नली तना हुआ है (चित्रा 1 ए -1 और ए -2)।
    5. जिगर में अग्रणी पोर्टल शिरा और पित्त नली खोजें। सूक्ष्म हीस्टाटिक क्लैंप के साथ पोर्टल शिरा और पित्त नलिका को दबाना।
      नोट: क्लैंपिंग अत्यधिक खून बह रहा है और योनि में कोलेजेनेस की प्रविष्टि को रोकता है।
    6. जबकि अभी भी संदंश के साथ आंत को पकड़ कर रहे हैं, पित्त नली और डुओडायम को जोड़ते हुए औपिला का स्थान ढूंढिए। Ampola ( चित्रा -1 बी -1 और बी -2 ) के माध्यम से सामान्य पित्त नलिका में 27 जी अंतःशिरा सुई डालें।
    7. कोलेजनेश काम करने के समाधान के बारे में 200 μL का निपटारा करने के लिए यह जांचें कि कैन्युलेशन पित्त नली के माध्यम से सभी तरह से है। Collagenase समाधान नल भरने के लिए शुरू होता है ( 1 सी -1 और सी 2 ), सुई नलिका के लुमेन में है; 1 मिनट ( चित्रा 2 ए -1 , ए -2 , और बी -1 ) के भीतर एक धीमी और स्थिर दर पर समाधान के 2 एमएल के बाकी हिस्सों में एक धमनी के हेस्टैटिक क्लैंप का उपयोग करके सुई युक्त डक्ट सेगमेंट को क्लैंप करें।
      नोट: यदि वाहिनी के आस-पास के ऊतक को फुलाते हुए ( चित्रा 2 बी -2 ) शुरू होता है, तो सुई ने पित्त नली की दीवार के माध्यम से पोक किया है, जिससे सुई को फिर से बदलने और पित्त नलिका को फिर से फेराने की कोशिश करनी पड़ती है। इसी प्रकार, यदि ग्रहणी की मात्रा बढ़ जाती है ( चित्रा 2 सी -1 और सी -2 ), तो धमनी हेमोस्टैटिक क्लैंप को समायोजित करने की आवश्यकता है और पित्त नली को फिर से cannulated। जैसे कि कोलेजनज़ सॉल्यूशन अग्न्याशय को भर देता है, ग्रहणी के निकट ऊतक पहली बार फुलाते हैं, इसके बाद रेजीओअग्नाशय पूंछ के निकट n अग्नाशय पूंछ (splenic लोब) के छिड़काव आइलेट उपज को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    8. अग्न्याशय ( चित्रा 2 सी -1 ) की पूरी मुद्रास्फीति के बाद, आंत्र को बाईं तरफ माउस की बाईं ओर धक्का दे और अवरोही बृहदान्त्र से शुरू करके अग्न्याशय हटा दें। आंत्र को उठाने के लिए संदंश का प्रयोग करें और अग्न्याशय से दूसरे संदंश के साथ इसे अलग करें। अग्न्याशय को हटाने के लिए जारी रखें जब तक कि यह पेट के शीर्ष से अन्तर्हित न हो। अंत में, पेट के बाहर अग्न्याशय उठाएं और शेष तिल्ली से इसे काट लें
      नोट: पूरी जुदाई को जल्दी से किया जाना चाहिए, क्योंकि पाचन हटाने की प्रक्रिया के दौरान जारी रहता है।
    9. एक खाली 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में अग्न्याशय रखें और इसे बर्फ पर छोड़ दें शेष चूहों के लिए उपरोक्त प्रक्रिया को दोहराएं। सभी अग्न्याशय को चरण 1 के तुरंत बाद 1 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए ताकि कोलेजनज़ पी। द्वारा अधिक पाचन को रोकने के लिए </ Li>

आकृति 1
चित्रा 1: पित्त नली के नहर और collagenase समाधान के साथ अग्न्याशय के छिड़काव दिखा फोटो। ( ए 1 ) पित्त नलिका तना हुआ है जब तक ग्रहणी खींच। (आंफुला: ग्रहणी की सतह पर त्रिकोणीय, दूधिया क्षेत्र; पित्त नली: सतह पर कॉर्ड की तरह दूधिया संरचना)। ( बी 1 ) ampulla से पित्त नली में सुई डालने ( सी 1 ) एंजाइम के इंजेक्शन के साथ अग्न्याशय बढ़ाना। ( ए 2, बी 2 और सी 2 ) क्रमशः ए 1, बी 1, और सी 1 में दिखाए गए प्रक्रियाओं की कार्टून छवियां। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 2: कनन्यूलेशन के लिए समस्या निवारण ( ए 1 ) पित्त नलिका के लुमेन में सुई की टिप डाली गई ( ए 2 ) एंजाइम समाधान से भरा वाहिनी ( बी 1 ) पित्त नली के लुमेन में सुई डाली जाती है, और एक नीली रंग से भरा वाहिनी। ( बी 2 ) अनुचित cannulation के कारण, सुई पित्त नली के नीचे है, और केवल एक फुलाया कैप्सूल नीले रंग के वितरण के बाद मनाया जाता है। ( सी 1 ) एक सफल कैनुलेशन का पता चल रहा है कि अग्न्याशय के वितरण से ( सी 2 ) अनुचित क्लैंपिंग के कारण, नीले रंग डाईडेनम में प्रवेश करता है और फैलता का कारण बनता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

  1. <मजबूत> पित्ताशय और islets का शुद्धि
    1. 17 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर perfused पैनक्रेन युक्त शंक्वाकार ट्यूब सेते हैं
      नोट: ऊष्मायन समय जानवर की आयु और प्रजातियों के साथ भिन्न हो सकता है।
    2. निषेचन समाधान के 7 एमएल को जोड़ने और बर्फ पर ट्यूब डालकर पाचन को समाप्त करें।
    3. ठीक ऊतक के कणों को प्राप्त होने तक ट्यूबों को जोरदार ( जैसे 10 एस में 20 गुना) मिलाकर ऊतक को अलग करना।
      नोट: फास्ट्रीनिया पूरी तरह से अलग करने में विफल रहता है, तो आइलेट उपज कम हो जाएगा।
    4. पचा हुआ ऊतक के नमूनों को 0.5 मिमी तार जाल के माध्यम से किसी भी गैर-पचाने वाले ऊतक विखंडू को हटाने के लिए फ़िल्टर करें। एक नए 50-एमएल शंक्वाकार ट्यूब में आइलेट निलंबन ले लीजिए।
    5. 230 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ट्यूबों को अपकेंद्रित्र और ऊतक छर्रों को परेशान किए बिना, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद कर दें।
    6. नरम या पी द्वारा भंवर द्वारा 4 एमएल के पॉलिसुकोस घनत्व ढाल में 3 चूहों से छर्रों को फिर से फिर से बाटेंनिलंबन को ऊपर और नीचे कुछ समय में आना। पॉलिसीकोज़ समाधान के शीर्ष पर ट्यूब की तरफ एचबीएसएस के 4 एमएल की धीरे-धीरे पिपेट करें।
      नोट: दो समाधान एक तेज इंटरफ़ेस के साथ अच्छी तरह से अलग परतें होने चाहिए।
      नोट: नीचे की ओर पॉलिसुकोस घनत्व ढाल को परेशान किए बिना, एचबीएसएस के अलावा देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।
    7. एक बहुत धीमी गति त्वरण दर का चयन करके 900 xg और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र। ब्रेक के साथ सेंटीफ्यूगेशन समाप्त करें
      नोट: पॉलिसेकोज़ और एचबीएसएस की परतों और तल पर बसने वाले सबसे एक्क्रोबेन कोशिकाओं के बीच अंतरफलक के लिए माइग्रेट करने वाले अधिकांश आइलेट्स, एक्सोक्राइन कोशिकाओं से आइलेट्स को शुद्ध करने के लिए यह एक कदम है।
    8. एक बड़े बोर 15 एमएल पिपेट का उपयोग करके 8-एमएल सतह पर तैरने वाले समाधानों को पूरी तरह निकालें। एक औंधा 70-माइक्रोन झरनी के माध्यम से समाधान पास करें
      नोट: आइलेट्स को और अधिक शुद्ध किया जाएगा और स्ट्रेनर द्वारा बनाए रखा जाएगा, जबकि एक्सोक्राइन कोशिकाएंफिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं
      सावधानी: पॉलिसुकोर्स घनत्व ढाल सेल-विषाक्त है; निस्पंदन, पॉलिसेकोज़ से छुटकारा पाने के लिए आइलेट को मदद करेगा।
    9. 35 मिमी पेट्री डिश में पिपेट 2 मिलीलीटर ठंड निराकरण समाधान। सेल झरनी सही साइड-अप को बदल दें, समाधान में आइलेट को बनाए रखने की सतह को डुबकी, और धीरे से आइलेट्स को छोड़ने के लिए हिलाएं।
    10. एक सफेद टिप के साथ एक 20-μL विंदुक का उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे आइलेट को हाथ में लें।
      नोट: आइलेट्स पीले, कॉम्पैक्ट सेल समुच्चय ( चित्रा 3 ए ) हैं, जबकि दूषित एक्सोक्राइन ऊतक या कोशिका विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक ब्लैकिश और ढीली संरचना है।
    11. 2 मील की संस्कृति माध्यम के साथ 35 मिमी के डिब्बे में लगभग 200 आइलेट रखें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के लिए 12 घंटे के साथ उपलब्ध करायें।
      नोट: आमतौर पर एक 12-हफ्ते-पुराने C57BL / 6J माउस से 150-300 आइलेट काटा जा सकता है आइलेट संस्कृति के दौरान समुच्चय बनाने की संभावना है,और बड़े आइलेट (> 300 माइक्रोन) केंद्रीय परिगलन ( चित्रा 1 बी , इनसेट) के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। पकवान में आइलेट को समान रूप से वितरित करने के लिए निलंबन अच्छी तरह से हिलाएं और क्लम्पिंग को कम करें।

2. पाड़ पर आइलेट कल्चर

नोट: डीसीएस में करीब 79% की मोटाई, 0.6 मिलीमीटर की मोटाई, और 12 से 300 माइक्रोन तक की ताकना का आकार।

  1. स्कैफोल्ड को 7-एमएम डिस्क में काट लें, उन्हें 70% इथेनॉल में भिगो दें, और उन्हें एचबीएसएस के साथ धो लें। 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर आवेषण में स्कॉफॉल्ड्स रखें।
    नोट: जब रातोंरात संस्कृति के बाद ताजा आइलेट बरामद किए जाते हैं, तो आइलेट चिकनी सीमाओं ( चित्रा 3 बी ) के साथ उज्ज्वल और तंग दिखाई देते हैं।
  2. पकवान भंवर और एक सफेद टिप के साथ एक 20 μL विंदुक का उपयोग डिश के केंद्र से islets इकट्ठा। पट्टियों का उपयोग करके स्कॉफॉल्ड्स (250 आइलेट / पाड़) के लिए आइलेट्स को ट्रांसफर करें और 2 एमएल का संस्कृति माध्यम जोड़ेंअच्छी तरह से। ट्रांसप्लांटेशन से पहले 12 घंटे के लिए संस्कृतियाँ

3. ईएफपी साइट पर आइलेट प्रत्यारोपण

  1. प्राप्तकर्ता चूहों में मधुमेह का प्रेरण
    1. पानी की आपूर्ति के साथ एक ताजा पिंजरे में C57BL / 6J चूहों (10 सप्ताह से अधिक पुराने) रखें, लेकिन कोई भी भोजन नहीं। मधुमेह को शामिल करने से पहले 10 घंटे के लिए चूहों को फास्ट करें।
    2. 0.1 एम सोडियम साइट्रेट के साथ 0.1 एम साइट्रिक एसिड मिलाकर 4.2-4.5 के पीएच मानों के साथ बफर समाधान तैयार करें। ताजा तैयार बफर में एसटीजेड (10 मिलीग्राम / एमएल) भंग करें और इसे 0.22 माइक्रूटर फिल्टर के माध्यम से उत्परिवर्तित करके बाधा डालें।
      नोट: एसटीजेड प्रकाश संवेदनशील है और 10 मिनट के भीतर गतिविधि खो देता है; हमेशा इंजेक्शन से पहले ताजा एसटीजेड समाधान तैयार करें।
    3. प्रत्येक C57BL / 6J माउस के लिए 140-150 मिलीग्राम / किलोग्राम की खुराक पर एसटीजेड के साथ प्रत्येक माउस को इंजेक्षन करें।
      नोट: खुराक जानवर की उम्र और प्रजातियों के आधार पर भिन्न होता है। यह एक लघु-स्तरीय खुराक ऑप्टिमाइज़ेशन ते करने के लिए सिफारिश की जाती हैऔपचारिक प्रयोग शुरू करने से पहले दी गई प्रजातियों के लिए सेंट।
    4. पूंछ नस रक्त को ले लीजिए और दिन 2, 3 और 4 पोस्ट-एसटीजेड इंजेक्शन पर ग्लूकोज मीटर के साथ रक्त ग्लूकोज की निगरानी करें।
      नोट: जब जानवरों को लगातार दो दिनों में हाइपरग्लेसैमिक (गैर-उपवास रक्त शर्करा> 16.7 मिमी) होता है, तो वे आइलेट प्रत्यारोपण के लिए तैयार होते हैं।
  2. ईएफपी साइट के लिए आइलेटों के प्रत्यारोपण।
    1. पैंटोबैरबिटल के साथ चूहों को एनेस्थेटेज़ किया गया (50 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्राप्टरिटोनियल दिया गया। ऑपरेटर की ओर इशारा करते पूंछ के साथ, एक कागज तौलिया पर लापरवाही स्थिति में माउस रखें। चीरा के चारों ओर फर हटाने के लिए बड़े पैमाने पर पेट को दाढ़ी। चार अंगों के नीचे टेप करें और त्वचा को पूरी तरह से अल्कोहल और आइडोफोर पोंछे के साथ एक चक्करदार ढंग से ले जाया जाता है ताकि चीरा साइट को बाधित हो। एक बाँझ कपड़े के साथ माउस को तराजू, केवल चीरा क्षेत्र तक पहुंच की अनुमति देता है। में पेरिटोनियल दीवार के माध्यम से एक 7 मिमी चीरा बनाओजननांग क्षेत्र के करीब, मिडलाइन
      नोट: दस्ताने सहित सर्जरी के दौरान इस्तेमाल किए गए सभी उपकरणों को बाँझ होना चाहिए।
    2. संदंश का उपयोग करके उदर गुहा से ईएफपी को धीरे से पकड़कर हटा दें गीला बाँझ धुंध पर ईएफपी फैलाएं। ईएफ़पी पर पाड़ युक्त आइलेट रखें और ट्रांसप्लांट को लपेटने के लिए ईएफपी को गुना करें। अवशोषित 6-0 टाचों के साथ ईएफपी को सुखाकर आईटल और ईएफपी के बीच सीधे संपर्क सुरक्षित करें। ईएफपी को बाहर सुखाने से रोकने के लिए एक लथपथ कपास झाड़ू का उपयोग करके बाँझ खारा के साथ ईएफपी की सतह को गीला करें।
    3. उदर गुहा में धीरे से ईएफपी वापस रखें पेरिटोनियल दीवार को सुखा कर और घाव क्लिप के साथ त्वचीय परत को क्लैंप करके चीरा को बंद करें।
    4. एग्लेजेसिक के रूप में बुपरनोरफ़िन (0.1 मिग्रा / किग्रा) उपमाक्षी इंजेक्शन
    5. निर्जलीकरण को रोकने के लिए 1 एमएल का खारा तलवार से इंजेक्शन करें।
    6. माउस को पिंजरे में एक हीटिंग पैड पर रखें जब तक माउस संज्ञाहरण से ठीक नहीं हो जाए।
    7. गैर उपवास ग्लूकोज ले की जाँच करेंदो दिन बाद पूंछ नस से रक्त इकट्ठा करके। यदि भ्रष्टाचार को पुन: प्राप्त करना, उपरोक्त ट्रांसप्लेन्शन प्रक्रियाओं को दोहराएं, धीरे से ईएफपी बाहर निकालें, एपिडीडिमिस के आस-पास वसा पैड के अंत में फिसलने के लिए 3-0 सीवन का उपयोग करें, रक्त वाहिकाओं को रोकें, ईपीपी भ्रष्टाचार का स्पष्टीकरण करें, और ऊतक विज्ञान के लिए इसे संरक्षित करें ।
      नोट: आइलेट्स को स्पष्ट करना, प्राप्तकर्ता चूहों को हाइपरग्लिसेमिक को 3 दिनों के भीतर फिर से देना चाहिए, भ्रष्टाचार के कार्य की पुष्टि करना।

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Representative Results

हमारे क्लैम्पिंग विधि, एक सूक्ष्म हीस्टास्टीक क्लैंप का उपयोग करते हुए, सिवनी लघाई तकनीक के मुकाबले सरल और समय-बचत होती है। इसे 6 चूहों से लगभग 1,200 आइलेटों को अलग करने और शुद्ध करने के लिए करीब 4 घंटे लगा। ताजा पृथक आइलेटों में आमतौर पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप ( चित्रा 3 ए ) के तहत किसी न किसी परिधि का होता था। एक बार अलगाव की प्रक्रिया से आइसलेट्स पुनर्प्राप्त हो जाने के बाद, वे उज्ज्वल और तंग दिखते थे और चिकनी सतह को हासिल कर लिया था। हालांकि, तनावपूर्ण अलगाव अभी भी कोशिका मृत्यु को उत्पन्न कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आइलेट सतहों से कोशिकाओं के स्लेविंग में कमी होती है, और अस्वास्थ्यकर आइलेट्स में अक्सर एक अंधेरे नेक्रोटिक कोर होता है ( चित्रा 3 बी )। हमने 5 चूहों से 945 आइलेट के व्यास को मापा; गणना मतलब आइलेट व्यास 130.42 ± 41.75 माइक्रोन ( चित्रा -3 सी ) था।

प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा से बचने के लिए अस्वीकृति, हमने सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में syngeneic प्रत्यारोपण किया। आमतौर पर, 500 ईस्टलेट लादेन वाले डीसीएस को ईएफपी की साइट पर ट्रांसप्लांट किया गया था और फ्री आइलेट समूह में मनाए गए 30 दिनों की तुलना में 10 दिनों के भीतर हाइपरग्लेसेमिया को उलट दिया गया था। नैट्रोग्लैलेसीमिया को लगभग 100 दिनों तक बनाए रखा गया था, जब तक कि ग्राफ्ट ( चित्रा 3 डी ) की पुनर्प्राप्ति नहीं हुई। भरी हुई आइलेट डीसीएस पर समान रूप से फैला हुआ था और ईएफपी द्वारा कवर किया गया था। आइसलेट से लदी हुई डीसीएस को संदंश ( चित्रा 3 ई और 3 एफ ) का इस्तेमाल आसानी से किया जा सकता है। हिस्टोलॉजिकल अध्ययन से पता चला है कि समान रूप से वितरित आइलेटों को पुनर्जन्मित किया गया और 60 दिन ( चित्रा 3 जी ) के प्रत्यारोपण के बाद ईएफपी ऊतक और डीसीएस से घिरा हुआ था। इंसुलिन के प्रतिरक्षण के कारण आगे की टापू ( चित्रा 3 एच ) के सफल इंग्रीमेंटमेंट की पुष्टि की गई।

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चित्रा 3: ईपीपी साइट पर मचान समर्थित आइलेटों के प्रत्यारोपण। ( ए ) चूहों से अलग ताजा आइलेटों की प्रतिनिधि तस्वीर ( बी ) 12 घंटे के लिए सुसंस्कृत इस्त्री, मृत कोशिकाओं के साथ आइलेट सतह बंद sloughing। इनसेट: अस्वास्थ्यकर आइलेटों में एक अंधेरे, नेक्रोटिक कोर है ( सी ) 5 चूहों से 945 आइलेट्स का आकार वितरण। ( डी ) गैर-उपवास वाले रक्त शर्करा का स्तर, डीसीएस समर्थित आइलेटों और मुक्त आइलेटों के साथ प्रत्यारोपित मधुमेह चूहों का स्तर। काला तीर इंगित करता है कि इस समय भ्रष्टाचार को पुनः प्राप्त किया गया था। ( ई ) फैल EFP ऊतक की सतह पर आइलेट-लड स्कैफोल्ड के हस्तांतरण को दर्शाती तस्वीर। ( एफ ) आईलेट-लादेन डीसीएस के प्रतिनिधि चरण की विपरीत छवि इनसेट: संदंश द्वारा आयोजित डीसीएस की ऑप्टिकल तस्वीर। ( जी ) प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल एच एंड ई की छवि60 दिनों के बाद, डीसीएस और ईएफपी से घिरे प्रत्यारोपित आइलेट। ( एच ) डीसीएस समर्थित आइलेट्स का प्रतिरक्षण, 60 दिन बाद पता चला। स्केल सलाखों = 150 माइक्रोन (ए, बी), 100 माइक्रोन (एफ), 500 माइक्रोन (जी), और 25 माइक्रोन (एच)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

अग्नाशय छिड़काव और पाचन समय दो मुख्य पैरामीटर हैं जो आइलेट उपज और गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं। मोस्केलवेस्की ने पहली बार एक कच्चे कोलेजनज मिश्रण का उपयोग कीमा बनाया हुआ गिनी पिग अग्न्याशय 11 को पचाने के लिए बताया लेसी एट अल पाचन तंत्र को छेड़ने के लिए नली प्रणाली में एंजाइमों के इंजेक्शन की सूचना दी, जिससे आइलेट उपज 12 में वृद्धि हुई। एंजाइम के डक्टल छिड़काव अग्नाशयी सतह क्षेत्र के अधिक से अधिक एंजाइम के लिए जोखिम की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप एक अधिक सजातीय पाचन और पकाते हुए कीमा बनाया हुआ पाचनवाही 13 की तुलना में अक्षत islets के अधिक से अधिक रिहाई के परिणामस्वरूप। हमारे अनुभव में, पित्त नली और पूरे अग्न्याशय के छिड़काव का सफल संलयन उच्च आइलेट पैदावार के लिए आवश्यक शर्तें थे। इसका कारण यह है कि अग्नाशयी पूंछ (splenic lobe) वास्तव में दांतों के करीब अग्नाशय के ऊतकों के मुकाबले सबसे अधिक आइलेट्स शामिल हैं वहाँ दो तरीके cannulate हैं पित्त नली को साहित्य में सूचित किया जाता है: i) लिवर साइट के करीब की सुई डालने के दौरान, ड्यूडीनम 13 , 14 और ii) में एंजाइम के प्रवेश को अवरुद्ध करते हुए डुओइडनियम के करीब की सुई डालने के दौरान एंजाइम के प्रवेश को अवरुद्ध करते समय जिगर 15 यहां, हमने बाद की तकनीक को अपनाया, जिसके लिए सुई झुकने या माउस को दोबारा लगाने की आवश्यकता नहीं होती। एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित शोधकर्ता 10 मिनट के भीतर अपनी प्रोटोकॉल का अनुसरण करते हुए 40 मिनट के भीतर कैन्युलेशन कर सकता है। अग्न्याशय के लिए पाचन समय चूहों की उम्र और प्रजातियों के साथ बदलता रहता है। ओवर-पचाने वाली अग्न्याशय छोटे आइलेट का उत्पादन करती है और अंडर-पचाने वाली अग्न्याशय में आइलेट से जुड़ी एसिनास कोशिकाएं होती हैं। इसलिए स्वस्थ आइलेट्स की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए पाचन समय को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है।

एसटीजेड एक एंटीबायोटिक यौगिक है जो विशेष रूप से बीटा कोशिकाओं को नष्ट कर देता है और 3 दिनों के भीतर चूहों में मधुमेह लाती हैSs = "xref"> 16 खुराक विशिष्ट माउस तनाव और उम्र के साथ बदलता रहता है और पूर्व प्रयोगों द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। हमारे ज्ञान के लिए, सी 57 बीएल / 6 जे चूहों को बाल्ब / सी चूहों की तुलना में एसटीजेड की कम खुराक की आवश्यकता होती है। एसटीजेड की एक अधिक मात्रा में गंभीर हाइपरग्लेसेमिया का कारण होगा और एक हफ्ते के भीतर जानवरों की मौत हो जाएगी, जबकि एक अपर्याप्त एसटीजेड खुराक ने मधुमेह के प्रभाव की दर को कम किया है।

EFPs अत्यधिक ऊतकित ऊतक होते हैं और आसानी से न्यूनतम आक्रामक प्रक्रियाओं के माध्यम से सर्जरी के लिए सुलभ हैं। ईएफपी के लिए आइलेट्स का प्रत्यारोपण आम तौर पर गुर्दा कैप्सूल की तुलना में अधिक सहज और सुरक्षित है, माउस मॉडल में आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक अन्य सामान्यतः रिपोर्ट किया गया साइट। विशेष रूप से, गुर्दा एक आवश्यक अंग है और संभाल करने के लिए नाजुक है; टापू का प्रत्यारोपण असफल हो सकता है या जानवरों सर्जरी 4 जीवित नहीं हो सकता है। चूहों में EFPs मनुष्यों में ओमेनल पाउच के समान भी हैं ईएफपी में प्रत्यारोपण अध्ययन न केवल हमारी सुविधा प्रदान कर सकता हैआइलेट अस्तित्व / समारोह के लिए शर्त ऊतक वातावरण की समझ, लेकिन यह भी नैदानिक प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं 17 के विकास के लिए नींव रखना।

इस अध्ययन में इस्तेमाल डीसीएस बोवाइन पेरिकार्डियम से निकला था और मुख्य रूप से कोलेजन से बना था। Decellularized सामग्री immunogenicity नहीं दिखा सकते हैं और केवल vivo 18 में हल्के भड़काऊ प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है। डीसीएस के छिद्रों के भीतर जब आइलेटों को सीधा किया गया, तो स्कैफोल्ड ने यांत्रिक संरक्षण की पेशकश की और आइलेट्स को एक साथ घूमने से रोक दिया, जिससे आइलेट्स के नेक्रोसिस हो सकते थे। आईसीटीएस युक्त डीसीएस पाड़ को सीधे संदंश का उपयोग कर संभाला जा सकता है, जिससे प्रत्यारोपण के सहज हस्तांतरण की अनुमति मिल सकती है। ईएफपी के भीतर स्कॉफॉल्ड्स को जोड़ना ने पेरिटोनियम में आईलेट्स के रिसाव को कम कर दिया था, जो बिना मचान के 8 के बिना प्रत्यारोपित फ्री आईलेट्स में था। इसलिए, DCS distinc प्रदान करता हैआईलेट प्रत्यारोपण के लिए फायदे

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों decanularized scaffolds प्रदान करने के लिए Guanhao बायोटेक से वेई झांग शुक्रिया अदा करना चाहेंगे। उपयोगी चर्चाओं के लिए हम जिओ-हांग पेंग का धन्यवाद करते हैं यह शोध आर्थिक रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (परियोजना सं .3322021) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting scissor Ningbo Medical
Forceps Ningbo Medical
0.5 mm diameter wire mesh Ningbo Medical
70 μm cell strainer Falcon 352350
Artery hemostatic clamp Ningbo Medical
Microscopic hemostatic clamp Ningbo Medical
Hemostatic forceps Ningbo Medical
Absorbable 6-0 PGLA sutures  JINHUAN With needle
Wound clip Ningbo Medical
Cotton swab Ningbo Medical
Gauze Ningbo Medical
Sterile drapes Ningbo Medical
10mL syringe JINGHUAN
1 mL syringe JINGHUAN
27G intravenous needle JINGHUAN 0.45x15 RWSB
1.5 mL Eppendorf tube Axygen
15mL conical tube Corning 430791
50mL conical tube Corning 430829
35mm Non-treated  Peri-dishes Corning 430588
Transwell Corning 3422
0.22 μm filter Pall PN4612
10 mL serological pipet Corning 4488
Pipet filler S1 Thermo Scientific 9501
Pipette (2-20μL) Axygen AP-20 AXYPETTM
Dissecting microscope Olympus SZ61
Centrifuge Eppendorf 5810R
Hank’s balanced salt solution  Gibco C14175500CP
Collagenase P Roche COLLP-RO
Histopaque 1077 Sigma 10771
RPMI 1640 Gibco 11879-20
FBS Gibco 16000-044
D-glucose Gibco A24940-01
Glucose meter Roche ACCU-CHEK
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Streptozotocin Sigma V900890 VetecTM
Chloral hydrate J&K C0073
Sodium citrate Sigma 71497
Citric acid Sigma C2404
Iodophors Ningbo Medical
C57BL/6J, 10-12 weeks old VitalRiver Beijing, China
Decellularized scaffold Guanhao Biotec 131102 Guangzhou, China

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 125 आइलेट अलगाव पाड़ प्रत्यारोपण एपिडिडाइमल वसा पैड मूरीन मधुमेह
मधुमेह चूहों की एपिडीडिमल फैट पैड में आईलेट्स का स्कैफोल्ड-समर्थित प्रत्यारोपण
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Wang, K., Wang, X., Han, C. s.,… More

Wang, K., Wang, X., Han, C. s., Chen, L. y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (125), e54995, doi:10.3791/54995 (2017).

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