Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

في فيفو التحقيق من مضادات الميكروبات العلاج الضوء الأزرق للمقاومة للأدوية المتعددة baumannii الراكدة حرق العدوى عن طريق تلألؤ بيولوجي التصوير

Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/54997
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 4, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology, Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service, Brooke Army Medical Center

Abstract

حرق العدوى ما زالت أحد أهم أسباب الاعتلال والوفيات. وقد أدى تزايد ظهور (MDR) البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة إلى الفشل المتكرر من العلاج بالمضادات الحيوية التقليدية. هناك حاجة ماسة إلى علاجات بديلة لمعالجة البكتيريا MDR.

نهجا مبتكرا غير المضادات الحيوية، وقد أظهرت مضادات الميكروبات الضوء الأزرق (ABL) والفعالية واعدة ضد الالتهابات MDR. آلية عمل ABL ليست مفهومة جيدا حتى الآن. والافتراض الشائع أن تحدث بشكل طبيعي حاملات ضيائيا الذاتية في البكتيريا (على سبيل المثال، البورفيرنيات خالية من الحديد، flavins، الخ) وولع ABL، التي تنتج بدورها السامة للخلايا أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) من خلال عملية الضوئية.

وخلافا للنهج آخر يستند خفيفة مضادة للميكروبات، والعلاج الضوئي مضادات الميكروبات (aPDT)، والعلاج ABL لا يتطلب ضلوع photosensitiz خارجية المنشأإيه. وكل ما تحتاجه لتصبح نافذة المفعول هي أشعة الضوء الأزرق. وبالتالي، فهي بسيطة وغير مكلفة. المستقبلات ABL هي الضيائية الخلوية المحلية في البكتيريا، بدلا من DNA. وهكذا، ويعتقد المحمول جوا لتكون أقل من ذلك بكثير السمية الوراثية لاستضافة خلايا من (UVC) أشعة فوق البنفسجية-C، والذي يسبب مباشرة الحمض النووي من التلف في الخلايا المضيفة.

في هذه الورقة، نقدم بروتوكول لتقييم فعالية العلاج ABL للعدوى baumannii MDR الراكدة في نموذج الفأر من حروق. باستخدام سلالة إضاءة الحيوية هندسيا، كنا قادرين على مراقبة noninvasively مدى الإصابة في الوقت الحقيقي في الحيوانات الحية. هذا الأسلوب هو أيضا أداة فعالة لرصد التوزيع المكاني للالتهابات في الحيوانات.

Introduction

تواصل حرق الالتهابات، والتي كثيرا ما ذكرت بسبب الإصابات الحرارية الجلدية، ليكون أحد أهم أسباب الاعتلال والوفيات 1. إدارة التهابات الحروق تم اختراق مزيدا من تزايد ظهور المقاوم للأدوية المتعددة (MDR) سلالات بكتيرية 2 بسبب الاستخدام المكثف للمضادات الحيوية. واحد البكتيريا سالبة الجرام MDR المهمة هي baumannii الراكدة، والذي يعرف لتترافق مع جروح المعركة الأخيرة ومقاومة للمضادات الحيوية المتاحة كلها تقريبا 3. تم الإبلاغ عن وجود الأغشية الحيوية في بؤر المصاب 4 و 5 و يعتقد أن تفاقم التسامح للمضادات الحيوية ودفاع المضيف 6 و 7 و يسبب العدوى المستمرة 8 و 9. لذلك، هناك pressinز بحاجة لتطوير العلاجات البديلة. في الاستراتيجية الوطنية لمكافحة البكتيريا للمضادات الحيوية المقاوم أعلنت في الآونة الأخيرة، وقد لوحظ تطوير علاجات بديلة للمضادات الحيوية كما فعل من قبل حكومة الولايات المتحدة (10).

النهج المضادة للميكروبات المستندة الخفيفة، كما يدل على ذلك اسمها، تتطلب أشعة الضوء مع أو من دون غيرها من العوامل. وتشمل هذه الأساليب العلاج المضادة للميكروبات الضوئي (aPDT)، الأشعة فوق البنفسجية-C (UVC) التشعيع، والضوء الأزرق مضادات الميكروبات (ABL). في الدراسات السابقة، فقد أظهرت فعالية واعدة في قتل MDR سلالات بكتيرية 11 و 12 و 13. ومن بين الأساليب الثلاث التي تتخذ من الضوء، وقد اجتذب ABL اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة نظرا لخصائص مضادة للجراثيم الجوهرية من دون استخدام الضيائية 14. في comparison إلى aPDT، ABL ينطوي فقط على استخدام الضوء، في حين يتطلب aPDT مزيج من الضوء والضيائي. ولذلك، ABL هي بسيطة وغير مكلفة 14. بالمقارنة مع UVC، ويعتقد المحمول جوا لتكون أقل من ذلك بكثير السامة للخلايا والسمية الوراثية إلى الخلايا المضيفة (15).

والهدف من هذا البروتوكول هو تحقيق فعالية ABL لعلاج التهابات الحروق الناجمة عن MDR A. baumannii في نموذج الفأر. نحن نستخدم البكتيريا المسببة للأمراض إضاءة الحيوية لتطوير نماذج الماوس الجديدة من العدوى الحرق التي تسمح للمراقبة غير الغازية من عبء البكتيرية في الوقت الحقيقي. مقارنة مع الطريقة التقليدية لأخذ العينات السوائل في الجسم / الأنسجة والطلاء لاحق ومستعمرة عد 16، توفر هذه التقنية نتائج دقيقة. عملية أخذ العينات الأنسجة يمكن إدخال مصدر آخر من الخطأ التجريبي. منذ شدة استضاءة البكتيرية يتناسب خطيا إلى corresالبرك البكتيري CFU 17، يمكننا قياس مباشرة بقاء البكتيريا بعد جرعة معينة من أشعة الضوء. من خلال رصد عبء البكتيرية في الحيوانات التي تعيش تلقي العلاج الخفيفة في الوقت الحقيقي، وحركية قتل البكتيريا يمكن أن توصف باستخدام عدد أقل بكثير من الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الثقافة البكتيرية

  1. إضافة 7.5 مل من الدماغ القلب تسريب (BHI) متوسطة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. البذور خلايا A. baumannii في المتوسط BHI ثم احتضان الثقافة A. baumannii في حاضنة المدارية (37 درجة مئوية) لمدة 18 ساعة.
  2. أجهزة الطرد المركزي ثقافة الخلايا في 3500 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، ويغسل الكريات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  3. اعادة تعليق الكريات البكتيريا في برنامج تلفزيوني جديد وماصة بدقة تعليق.
  4. جمع 100 ميكرولتر من تعليق البكتيرية وجعل تخفيف 01:10 باستخدام برنامج تلفزيوني جديد.
  5. نقل التخفيف إلى 1.5 مل كفيت شبه الصغيرة وقياس الكثافة الضوئية (OD) عند طول موجي 600 نانومتر (OD 600 نانومتر).
  6. حساب OD 600 نانومتر من (مخفف) تعليق الأصلي في برنامج تلفزيوني وفقا لOD 600 نانومتر القيمة المقاسة للتخفيف وعامل التخفيف (10).
  7. ضبط عشره تعليق الأصلي في برنامج تلفزيوني لOD 600 نانومتر = 0.6 (المقابلة لكثافة خلية من 10 8 CFU / مل).

2. نموذج الفأر من العدوى الناجمة عن حرق إضاءة الحيوية A. baumannii

  1. أنثى استخدام الكبار BALB / ج الفئران تتراوح أعمارهم بين 7-8 أسابيع وزنها 17-19 غ. السماح للفئران إلى التأقلم على ظروف المختبر لمدة 3 أيام على الأقل قبل بدء التجربة. الحفاظ على الفئران في 12 ساعة دورة الضوء / الظلام تحت درجة حرارة الغرفة من 21 ℃ ومنحهم الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
  2. تخدير الفئران مع حقنة داخل الصفاق من كوكتيل الكيتامين زيلازين (100 ملغ / كغ - 20 ملغ / كلغ). مسة خفيفة على الجفن من كل فأر مع مسحة القطن. غياب المنعكس الجفني يدل على وجود عمق التخدير المناسب. تغطية عيون الماوس مع مرهم بيطري لمنع العينين من الجفاف أثناء التخدير.
  3. حلق الفئران على ظهره لفضح الكثير من الجلد ممكن باستخدام 50 شفرة المقص الشعر.
  4. وضع غطاء 35 مم طبق بيتري تحت البطن من الفئران للحفاظ على ظهورهم في وضع أفقي نسبيا.
  5. الماء يغلي في 250 مل دورق (80٪ كاملة) باستخدام 10 "× 10"، 220 VAC موقد. تزج كتلة من النحاس الأصفر (1 سم × 1 سم المقطع العرضي) في الدورق حتى يتم التوصل إلى موازنة الحرارية مع الماء. موازنة الحرارية عادة ما يستغرق <5 دقائق وأشارت قبل إعادة الغليان من الماء في الكأس.
  6. قبل خلق حروق وإدارة المسكنات وقائية (الحقن تحت الجلد من 0.1mg / البوبرينورفين كغم) لتخفيف الألم.
  7. بعد عشر دقائق من المسكنات وقائية، اضغط بلطف كتلة النحاس ساخنة لمنطقة حلق على الجزء الخلفي من الفئران لمدة 7 الصورة للحث على الحروق.
    ملاحظة: لتجنب الإصابة الحرارية إلى العاملين، وارتداء قفازات مقاومة الحرارية عند تنفيذ الإجراء حرق.
  8. إدارة 0.5 مل من محلول ملحي معقم من خلال subcutaneouالصورة حقن لمنع الجفاف.
  9. خمس دقائق بعد تحريض من الإصابة الحرارية، وتطعيم 50 ميكرولتر من تعليق البكتيرية تحتوي على 5 × 10 6 CFU في برنامج تلفزيوني على الحروق الماوس باستخدام ماصة. عن طريق تحريك قطعة من القطن المعقمة في حركة متعرجة على الجلد، وتشويه أجزاء مأخوذة على الحروق لتوزيع الخلايا البكتيرية في المنطقة المحروقة بشكل متساو قدر الإمكان.
  10. مباشرة بعد التلقيح البكتيرى، نفذ التصوير تلألؤ بيولوجي للحروق المصابة، كما هو موضح في القسم 4.
  11. وضع الفئران على سرير العمليات الجراحية-تسخين المياه (37 ° C، ومنطقة الشفاء) حتى استعادت الفئران تماما من التخدير. بيت الفئران مع أكبر عدد ممكن من 5 في قفص في السلامة الأحيائية المستوى 2 غرفة الحيوان.
  12. إدارة المسكنات (حقن تحت الجلد من 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين) مرتين يوميا لمدة الأيام الثلاثة الأولى بعد حروق.

3. مضادات الميكروبات العلاج الضوء الأزرق لA. & #160؛ العدوى baumannii في الفئران

  1. بدء العلاج ABL في 24 ساعة بعد التلقيح البكتيرى.
  2. استخدام الصمام الثنائي الباعثة للضوء (LED) مع الانبعاثات ذروتها عند 415 نانومتر لABL التشعيع. جبل الصمام على امتصاص الحرارة لمنع التأثيرات الحرارية على المنطقة المعرضة للإشعاع في الفئران (18). إصلاح الصمام إلى قضيب الدعم الضوئية مع موصلات كليب للسماح للLED للتحرك صعودا وهبوطا.
  3. بدوره على السلطة / متر الطاقة واضغط على زر لتحديد الطول الموجي 415 نانومتر. إعادة السلطة متر / الطاقة لطرح الخلفية (الإضاءة المحيطة).
  4. وضع السلطة متر / الطاقة اليمين تحت LED. ارتداء نظارات زرقاء ضوء واقية. بدوره على ضوء LED وضبط المسافة بين فتحة الصمام (العدسة التي يتقاطع ضوء من LED) وجهاز استشعار الضوء (2 سم في القطر) للمتر الطاقة / الطاقة بحيث بقعة ضوء تغطي كامل مساحة مستشعر الضوء.
  5. بعناية ضبط سائق الصمام وتسجيل قراءة بويص / متر الطاقة. حساب الإشعاع وفقا لقراءة: الإشعاع = القراءة (W) / المساحة (سم 2). ضبط الإشعاع من الصمام إلى 100 ميغاواط / CM2 من ضبط سائق الصمام.
  6. إيقاف LED. قياس المسافة بين فتحة الصمام وجهاز استشعار الضوء للمتر الطاقة / الطاقة.
  7. تخدير الفئران مع حقنة داخل الصفاق من كوكتيل الكيتامين زيلازين (100 ملغ / كغ - 20 ملغ / كلغ). غياب المنعكس الجفني يدل على وجود عمق التخدير المناسب.
  8. عشوائيا تقسيم الفئران إلى المجموعة التي عولجت ABL (ن = 10) وجماعة غير المعالجة التحكم (ن = 10).
  9. لمجموعة تعامل ABL، تغطية أعين الفئران مع رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض المفرط للضوء. ضع الماوس حروق مباشرة تحت LED، مع غطاء طبق بتري 35 ملم تحت البطن الماوس للحفاظ على ظهورهم في وضع أفقي.
  10. استبدال السلطة متر / الطاقة المذكورة في الخطوة 3.5 مع الماوس على بتري دي مربعش. ضبط ارتفاع الماوس إلى وضع يمكنها من حيث المسافة بين فتحة الصمام وسطح حرق الماوس تساوي ما بين فتحة الصمام ومستوى مستشعر الضوء من / متر الطاقة الكهربائية (كما هو مبين في الخطوة 3.5).
  11. أشرق الحروق المصابة في والإشعاع من 100 ميغاواط / سم 2. تقديم ABL في جرعة من 72 J / سم 2 حتى جرعة من مجموع 360 يتم التوصل إلى J / سم 2 (على سبيل المثال، 0، 72، 144، 216، 288 و 360 J / سم 2). بعد كل جرعة خفيفة، نفذ التصوير تلألؤ بيولوجي للفئران، كما نوقش في القسم 4.
  12. لمجموعة المراقبة غير المعالجة، نفذ التصوير تلألؤ بيولوجي من حروق الماوس، كما نوقش في القسم 4، وذلك باستخدام فترات زمنية نفس المستخدمة في المجموعة التي تلقت العلاج ABL.
  13. قبل الانتعاش من الفئران، ووضع الفئران على السرير الجراحية ساخنة المياه لمنع فقدان الحرارة وانخفاض حرارة الجسم. مراقبة النشاط ومنعكس الجفن من الفئران حتى الشفاء. بعد عشرالانتعاش (ه) من الفئران، وإيوائهم 2-3 في قفص.
  14. بعد العلاج ABL، نفذ التصوير تلألؤ بيولوجي، كما نوقش في القسم 4، يوميا لمدة 3 أيام الأولى ثم في أيام بديلة لمراقبة الزمني الحيوي عبء العدوى في الفئران.

4. ضوء بارد التصوير من التهابات في الفئران

  1. صورة الفئران باستخدام نظام التصوير الإضاءة المنخفضة يتضمن كاميرا كثفت إلى جانب المسؤول عن الجهاز، وحدة تحكم الكاميرا، وغرفة العينة، ومعالج الصور (19).
  2. تخدير الفئران مع حقنة داخل الصفاق من كوكتيل الكيتامين زيلازين (100 ملغ / كغ - 20 ملغ / كلغ). مسة خفيفة على جفني من الفئران مع مسحة القطن. غياب المنعكس الجفني يدل على وجود عمق التخدير المناسب.
  3. بدء برامج التصوير الحي. في لوحة التحكم التي تظهر، انقر فوق تهيئة. انتظر حتى لون مربع درجة الحرارة اللون الأخضر، مشيرا إلى أن درجة الحرارة في مرحلةفي غرفة عينة وصلت 37 درجة مئوية.
  4. وضع الفئران على المسرح (37 ° C) في غرفة عينة من نظام التصوير، مع الحروق المصابة مباشرة تحت الكاميرا.
    ملاحظة: تلألؤ بيولوجي من البكتيريا يمكن أن تقلل عندما تصبح الحروق الجافة. ولذلك، فمن المستحسن لترطيب الحروق الماوس مع برنامج تلفزيوني قبل التصوير.
  5. في لوحة التحكم، ووضع علامة الاختيار بجانب "التلألؤ." حدد "تعرض تلقائي" بحيث يكون الأمثل للوقت التعرض للتصوير بواسطة برنامج التصوير الحي على أساس شدة تلألؤ بيولوجي.
  6. حدد "C" من القائمة المنسدلة "مجال الرؤية". حدد الخيار "مسح منتصف النطاق" للسماح للبرنامج تحديد المسافة البؤرية. وضع علامة الاختيار بجانب تراكب.
  7. انقر على "الحصول على" لالتقاط صورة. في مربع "تحرير صورة تسمية"، انقر فوق "موافق"؛ وعلى "نافذة صورة" و "مكس لوحة" تظهر.
  8. تعيين المعلمات السيارات ROI لصناعة السيارات في الاختيار.
  9. قياس شدة تلألؤ بيولوجي وحدات التلألؤ النسبية (RLUs) وعرض تلألؤ بيولوجي في نطاق مموهة الألوان تتراوح بين الوردي (أشده) إلى اللون الأزرق (أقل كثافة) 19، 20.
  10. حساب نسبة بقاء البكتيريا في حروق الماوس متفاوتة في نقطة زمنية استنادا إلى تحليل تلألؤ بيولوجي كثافة. جزء بقاء البكتيريا في نقطة زمنية معينة = شدة تلألؤ بيولوجي قياسها في تلك المرحلة الزمنية / شدة تلألؤ بيولوجي قياس الحق قبل ABL تعرض 17.

5. القتل الرحيم من الفئران

  1. في النهاية التجربة هي كما يلي: (أ) قرار من العدوى كما يتضح من فقدان تلألؤ بيولوجي على النحو الذي يحدده التصوير. (ب) حدوث التهابات منهجية كما يدل على ذلك انتشار تلألؤ بيولوجي خارج حرق لا؛ (ج) فقدان ≥15٪ من وزن الجسم بالمقارنة مع الفئران في العمر كعينة العادية، أو المعاناة من الألم والضيق كما يدل على ذلك عدم استجابتها لتحفيز اليدوي، والجمود، وعدم القدرة على تناول الطعام أو الشراب. وخلال الدراسة، إذا واجهنا وضعا ما نحن فيه غير متأكد ما إذا كان الفأر قد وصلت بالكامل حالة الاحتضار، كما حددها تعريفنا، و / أو أننا غير متأكدين إذا نحن بحاجة إلى الموت ببطء، ونحن سوف نتصل الموظفين البيطري CCM لوضع خطة العمل؛ (د) وإلا سوف يتم التخلص من الفئران بعد 30 يوما من بدء الدراسة.
  2. انتقال الفئران في أقفاص مغلقة خصيصا للقتل الرحيم والموت ببطء الفئران عن طريق تقديم ثاني أكسيد الكربون (CO 2) الغاز المضغوط في أقفاص.
    1. فتح CO 2 خزان أو صمام منظم لبدء تدفق الغاز. تحقق من أن منظم يقرأ رطل الصحيح (جنيه لكل بوصة مربعة) بناء على تعليمات أرسلت بواسطة وحدة، وضبط إعادةgulator للرطل الصحيح حسب الحاجة، وعادة ما لا يزيد عن 5 رطل.
    2. ملء ببطء. معدل التدفق يجب أن تحل لا يزيد عن 30٪ من حجم الغرفة / قفص لكل دقيقة (للقفص الفأر العادي، ~ 2 لتر / دقيقة، لقفص الفئران، ~ 7.5 لتر / دقيقة).
    3. انتظر حوالي 3-5 دقائق للحيوان لوقف التحرك أو التنفس. عيون ينبغي أن تكون ثابتة والمتوسعة. إيقاف CO 2 خزان أو صمام منظم لوقف تدفق CO 2.
    4. تأكد من أن القلب لا ينبض عن طريق الشعور الصدر بين الإبهام والسبابة. ضمان عدم وجود أي رد فعل طرفة عن طريق لمس مقلة العين.
      1. إذا كان هناك ضربات القلب أو لا ارادي وميض، كرر عملية القتل الرحيم أو استخدام المقص لفتح تجويف الصدر لإنشاء استرواح الصدر (يجب أن يكون الحيوان غير استجابة لقرصة اصبع القدم قبل تنفيذ هذا الإجراء).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سلالة A. baumannii التي استخدمناها هو عزل السريري MDR، كما ذكرت سابقا 12 و 17. وقدم سلالة بكتيرية إضاءة الحيوية التي ترنسفكأيشن من luxCDABE أوبرا 11. ويبين الشكل 1A للالمتعاقبة الصور التلألؤ البكتيرية من ماوس تمثيلي حرق المصابة مع 5 × 10 6 A. baumannii وتتعرض لالتعرض ABL واحد في 24 ساعة بعد التلقيح البكتيرى. A غرام وصمة عار من قسم النسيجي للجلد الفأر تمثيلي حرق العينة (حصادها في 24 ساعة بعد التطعيم) أظهرت وجود الأغشية الحيوية A. baumannii على سطح حرق المصاب (الشكل 1B). كما هو مبين في الشكل 1A، تم القضاء على التألق البكتيرية تقريبا بعد تعرض 360 J / سم 2 وقام بتسليم ABL (60 دقيقة من الإشعاع فيوالإشعاع من 100 ميغاواط / سم 2). الشكل 1C هو منحنى الاستجابة للجرعة من التألق البكتيرية يعني من حروق الماوس المصابين 5 × 10 6 A. baumannii وتعامل مع ABL في 24 ساعة بعد التلقيح البكتيرى (ن = 10). لتحقيق 3-تسجيل 10 تثبيط A. baumannii في حروق الماوس، ما يقرب من 360 J / سم 2 كان مطلوبا ABL. التلألؤ البكتيرية من الفأرة حروق غير مصورة لABL بقي دون تغيير تقريبا خلال الفترة المماثلة من الزمن (لا تظهر البيانات؛ P <0.001).

شكل 1
الشكل 1: ABL التعطيل من البكتيريا في ماوس بيرنز المصابة. (A) المتعاقبة الصور التلألؤ البكتيرية من ماوس تمثيلي حرق المصابين 5 × 10 6 CFU من A. baumannii ويتعرض إلى 360 J / سم 2 ABL في 24ساعة بعد التلقيح الجرثومي. ( B ) القسم النسيجي الملون غرام من ممثل الجلد الماوس حرق تظهر وجود A. باوماني الأغشية الحيوية (السهام) في حرق الماوس. تم حصاد عينة الجلد في 24 ساعة بعد التلقيح البكتيري. ( C ) منحنى الجرعة الاستجابة لمتوسط ​​التلألؤ البكتيرية من حروق الماوس المصابة مع 5 × 10 6 أ. بوماني وعولج مع التعرض 360 ج / سم 2 أبل في 24 ساعة ( ن = 10) بعد التلقيح البكتيري. الحانات: الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ABL هو طريقة جديدة لعلاج الالتهابات. منذ آلية عملها هي مختلفة تماما عن تلك التي العلاج الكيميائي، وهو أكثر من العلاج الطبيعي. وكيل التي تتوسط تأثير مضاد للميكروبات باللون الأزرق أشعة الضوء (400-470 نانومتر). مع تطور المصابيح الزرقاء، حصلنا على الوصول إلى نهج المضادة للجراثيم فعال وبسيط قائم على ضوء للعدوى MDR.

في هذا البروتوكول، التي وصفناها تطوير نموذج الفأر من التهابات الحروق التي تسببها سلالة إضاءة الحيوية من MDR، A. baumannii. مع استخدام البكتيريا للإضاءة الحيوية، ومدى الإصابة يمكن أن يكون غير جراحية رصدها في الوقت الحقيقي في الحيوانات التي تعيش عبر التصوير إضاءة الحيوية. استخدام سلالات إضاءة الحيوية هندسة البكتيريا وتقنية التصوير الإضاءة المنخفضة يخلق تقنية فعالة لرصد العدوى في الوقت الحقيقي أثناء العلاج المضادة للميكروبات. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في التحقيقات من الالتهاباتالتي تسببها أنواع الجراثيم الأخرى والتي تقع في مواقع أخرى. وبالإضافة إلى تقييم فعالية النهج المضادة للميكروبات، يمكن هذه الطريقة أن تستخدم أيضا لتتبع التقدم المحرز في العدوى.

باستخدام هذا النموذج الماوس، أثبتنا أن ABL (415 نانومتر) المعطل البكتيريا في الالتهابات أنشئت (الشكل 1A و C) بنجاح. قبل العلاج ABL، لوحظت مجموعات من البكتيريا في الالتهابات أنشئت (الشكل 1B)، والذي هو سمة من سمات الأغشية الحيوية. الأغشية الحيوية هي أكثر تسامحا من المضادات الحيوية التقليدية ودفاع المضيف مقارنة مع نظرائهم العوالق على 6 و 7 و كثيرا ما ترتبط العدوى المستمرة 8 و 9. نتائج ممثلة واعدة في هذا ABL 415 نانومتر هي التي تخترق بيوفيلم. وبالإضافة إلى ذلك، جنبا إلى جنب مع التقارير السابقة 29،30، 31، 32، تظهر نتائجنا أن فعالية ABL استمرت بغض النظر عن المستوى مقاومة المخدرات من البكتيريا.

بروتوكول الموصوفة هنا يتضمن ثلاثة إجراءات رئيسية هي: (1) تطوير نموذج الفأر من التهابات الحروق، (2) العلاج ABL، و (3) التصوير تلألؤ بيولوجي. في حين وضع نموذج الفأر من إصابات الحروق، لاحظنا أن هناك العديد من العوامل التي تؤثر على مدى الإصابة وفعالية لاحقة من ABL: (1) الساعة حرق يؤثر على عمق الجرح وانتشار البكتيريا. عندما تمت زيادة حرق الوقت 3-7 ثانية، كان التألق البكتيرية أقوى بكثير (مما يدل على مدى أعلى من العدوى) في 24 ساعة بعد التطعيم، والقضاء على العدوى تتطلب التعرض ABL أعلى من ذلك بكثير (> 360 J / سم 2 ). (2) اللقاح من البكتيريا غير معلمة رئيسية لتنمية سالعدوى و. A اللقاح البكتيري أعلى النتائج عادة في حد أعلى للإصابة، في حين كثيرا ما فشل اللقاح منخفضة بما فيه الكفاية للاصابة بعدوى مستقرة في الفئران. في حالة الأخير، التلألؤ بكتيرية عادة ما تصبح غير قابلة للكشف في وقت قريب بعد التلقيح البكتيرى. (3) التفاعل بين البكتيريا والمضيفين يتوقف على الأنواع البكتيرية. كما استخدمنا P. الزنجارية لتطوير نموذج العدوى. لقد وجدنا أنه في ظل نفس الظروف (أي حرق الوقت واللقاح البكتيري)، والالتهابات التي تسببها P. الزنجارية تقدما سريعا أكثر بكثير من التهابات A. baumannii، ولوحظ تعفن الدم دائما في الفئران خلال 48 ساعة بعد التطعيم 25.

لتنفيذ العلاج ABL، وهناك العديد من النقاط الهامة التي تحتاج إلى معالجة: مطلوب (1) السليم ضوء الإشعاع لفعالية أقصى حد من العلاج ABL. (2) سطح حرق في الفئران الصورةتوضع hould معها كما أفقيا وقت ممكن. إن الفشل في وضع مناسب سطح حرق يمكن أن تعرض للخطر فعالية العلاج ABL. (3) وخلال التعرض للضوء، يقترح أن أعين الفئران تكون محمية مع رقائق الألومنيوم، وخصوصا عندما يستخدم الليزر كمصدر للضوء. (4) أثناء التعرض للضوء، ينبغي الحرص على مراقبة الفئران في حال الإفاقة من التخدير. في هذه الحالة، يجب أن تدار جرعة إضافية صغيرة من التخدير للحفاظ على الحيوانات تخدير. (5) كل من الفئران ABL المعاملة وينبغي أن توضع الفئران غير المعالجة على سرير التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند تحت التخدير. أثناء عملية التصوير تلألؤ بيولوجي، يمكن للتلألؤ بيولوجي من البكتيريا تنخفض عندما تصبح الحروق الجافة. ولذلك، فمن المستحسن لترطيب الحروق الماوس مع برنامج تلفزيوني قبل التصوير.

وهناك أيضا بعض القيود المفروضة على التقنيات التي نوقشت في هذا البروتوكول: (1) لغرض رصد يكستينت من العدوى في الوقت الحقيقي، يجب استخدام سلالات بكتيرية بيولومينسنت. لذلك، قبل سلالة سريرية يمكن اختبارها في نموذج حيواني، يجب أن يكون معدلة وراثيا من قبل ترنسفكأيشن من أوبيرس كديب لوكس 11 . (2) ترتبط فعالية أبل لأطوال الموجات 33 والأنواع البكتيرية / سلالات 34 المستخدمة. وينبغي زيادة الطول الموجي الأزرق، جنبا إلى جنب مع غيرها من المعالم، إلى أقصى حد لتعطيل أنواع مختلفة من البكتيريا / سلالات. (3) نحن فقط التحقيق الالتهابات السطحية في الفئران. أما بالنسبة للإصابات العميقة الجذور، فقد لا يكون التوصيل الموضعي للمضادات الحيوية (أبل) قادرا على الوصول إلى العدوى، لذا قد تكون هناك حاجة إلى توصيل الضوء الخلالي 35 . (4) هناك حساسية الحد من نظام التصوير، وخصوصا عندما التصوير الإصابات العميقة 19 . ونتيجة لذلك، حتى عندما يتم القضاء على بكسل تلألؤ بيولوجي تماما، قد يكون هناك لا يزال فيالخلايا البكتيرية قادرة المتبقية، مما يسمح إعادة نمو البكتيريا تحدث. ينصح التعرض الموسعة لABL بعد القضاء على البكتيريا التلألؤ من أجل منع إعادة نمو البكتيريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria. , https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014).
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination? J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond? Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Tags

علم المناعة، العدد 122، مضادات الميكروبات الضوء الأزرق، ومقاومة للأدوية المتعددة،
<em>في فيفو</em> التحقيق من مضادات الميكروبات العلاج الضوء الأزرق للمقاومة للأدوية المتعددة <em>baumannii الراكدة</em> حرق العدوى عن طريق تلألؤ بيولوجي التصوير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang,… More

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter