Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

В Vivo Исследовании антимикробной Синяя Светотерапии для Полирезистентного Acinetobacter baumannii Ожог инфекции с помощью биолюминесценции визуализации

Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/54997

Abstract

Ожог инфекция продолжает оставаться важной причиной заболеваемости и смертности. Растущее появление множественных лекарственной устойчивости (МЛ) бактерий привело к частым неудачам традиционного лечения антибиотиков. Альтернативные терапевтические срочно необходимы для борьбы с МЛ бактерий.

Инновационный подход, не антибиотик, противомикробный синий свет (ABL), показал многообещающую эффективность против МЛ-инфекции. Механизм действия ABL пока еще недостаточно хорошо изучен. Это обычно выдвинута гипотеза , что в природе эндогенных фотосенсибилизирующих хромофоров бактерий (например, железа , свободные порфирины, флавины и т.д.) возбуждается ABL, который в своей очереди , производит цитотоксические активные формы кислорода (ROS) через фотохимический процесс.

В отличие от другого света на основе антимикробного подхода, противомикробное фотодинамическая терапия (APDT), ABL терапия не требуют участия экзогенного photosensitizэ. Все, что нужно, чтобы вступить в силу является облучением синего света; Поэтому, это просто и недорого. В ABL рецепторы эндогенные клеточные фотосенсибилизаторов в бактериях, а не ДНК. Таким образом, ABL, как полагают, значительно менее генотоксичен к клеткам-хозяевам, чем ультрафиолетового-С (УФС) облучения, которое непосредственно вызывает повреждение ДНК в клетках-хозяевах.

В этой статье мы приводим протокол для оценки эффективности терапии ABL для MDR Acinetobacter baumannii инфекций в мышиной модели ожоговой травмы. При использовании сконструированного биолюминесцентном штамма, мы смогли неинвазивно контролировать степень заражения в режиме реального времени в живых животных. Этот метод также является эффективным инструментом для мониторинга пространственного распределения инфекций у животных.

Introduction

Ожог инфекции, которые часто сообщалось из - за термических повреждений кожных, по- прежнему является важной причиной заболеваемости и смертности 1. Управления ожоговых инфекций еще более скомпрометированы увеличивающегося появления множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) штаммов бактерий 2 в связи с массовым применением антибиотиков. Одним из важных MDR грамотрицательные бактерии Acinetobacter baumannii, который , как известно, связано с недавними боевыми ранами и устойчив к воздействию практически всех доступных антибиотиков 3. Наличие биопленок на травмированных очагах было сообщено 4, 5 и , как полагает, усугубить толерантность к антибиотикам и иммунной защите 6, 7, вызывая хронические инфекциям 8, 9. Таким образом, существует прессовог потребность в разработке альтернативных методов лечения. В недавно объявленной Национальной стратегии по борьбе с устойчивыми к антибиотикам бактерий, развитие альтернативных терапевтических антибиотикам было отмечено как действие со стороны правительства Соединенных Штатов 10.

Легкие на основе противомикробные подходы, как указано в названии, требует облучения светом с или без других агентов. Эти подходы включают в себя антимикробной фотодинамической терапии (APDT), ультрафиолет-С (УФС) облучение, и противомикробное синий свет (ABL). В предыдущих исследованиях, они показали многообещающую эффективность в уничтожении MDR бактериальных штаммов 11, 12, 13. Среди трех легких подходов , основанный, ABL привлекает все большее внимание в последние года из - за его собственные антибактериальные свойства без применения фотосенсибилизаторов 14. В COMPARисоном к APDT, ABL предполагает использование только света, в то время как APDT требует сочетания света и фотосенсибилизатора. Поэтому, ABL является простым и недорогим 14. По сравнению с УФС, ABL , как полагают , будет намного меньше цитотоксических и генотоксичен к клеткам - хозяевам 15.

Целью данного протокола является исследование эффективности ABL для лечения ожоговых инфекций , вызванных МЛУ А. baumannii в мышиной модели. Мы используем биолюминесцентные патогенные бактерии разрабатывать новые модели мышей ожоговых инфекций, которые позволяют неинвазивный мониторинг бактериальной нагрузки в режиме реального времени. По сравнению с традиционным методом отбора проб жидкости тела / ткани и последующего покрытия и колонии подсчета 16, этот метод дает точные результаты. Процесс отбора проб ткани может ввести другой источник погрешности эксперимента. Поскольку интенсивность свечения бактерий линейно пропорциональна соот- ветствоватьзапруживании бактериальных КОЕГО 17, мы можем измерить непосредственно выживание бактерий после определенной дозы облучения света. Контролируя бактериальной нагрузки в живых животных, получавших светолечение в режиме реального времени, кинетика бактериального убийства могут быть охарактеризованы с использованием значительно меньшего числа мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка бактериальной культуры

  1. Добавить 7,5 мл Brain Heart Infusion (BHI) среда к 50 мл центрифужной пробирки. Семенной А. baumannii клеток в среде BHI , а затем инкубировать А. baumannii культуры в орбитальном инкубаторе (37 ° С) в течение 18 часов.
  2. Центрифуга культуры клеток при 3500 х г в течение 5 мин, удалить супернатант, и мыть гранул в фосфатно-солевом буфере (PBS).
  3. Повторные приостановить гранулы бактерий в свежей PBS и тщательно пипетка суспензии.
  4. Собрать 100 мкл бактериальной суспензии и сделать разведение 1:10 с использованием свежих PBS.
  5. Передача разбавление до 1,5 мл полу-микро кювету и измеряют оптическую плотность (OD) при длине волны 600 нм (OD 600 нм).
  6. Вычислить OD 600 нм исходного (неразбавленном) виде суспензии в PBS в соответствии с измеренной OD 600 нм величины разбавления и коэффициент разбавления (10).
  7. Отрегулировать-йе оригинальные суспензии в PBS до OD 600 нм = 0,6 ( что соответствует плотности клеток 10 8 КОЕ / мл).

2. Модель мыши ожоговой инфекции , вызванной Биолюминесцентный A. baumannii

  1. Использование взрослых самок мышей BALB / с в возрасте 7-8 недель и весом 17-19 г. Разрешить мышей, чтобы акклиматизироваться в лабораторных условиях в течение по крайней мере 3 дней до начала эксперимента. Поддерживать мышей в течение 12 ч свет / темнота цикла при комнатной температуре 21 ℃ и дать им пищу и воду без ограничений.
  2. Обезболить мышей с внутрибрюшинной инъекцией кетамина-ксилазином коктейля (100 мг / кг - 20 мг / кг). Прикоснувшись к palpebra каждой мыши с помощью ватного тампона; отсутствие глазного рефлекса предполагает соответствующую глубину анестетика. Закройте глаза мыши с ветеринаром мазью, чтобы предотвратить глаза от сухости во время анестезии.
  3. Бритье мышей на спине, чтобы выставить как можно больше кожи, как это возможно с помощью 50 лезвие машинки для стрижки волос.
  4. Поместите крышку на 35 мм чашку Петри под брюшком мышей, чтобы держать их спинами в относительно горизонтальном положении.
  5. Кипение вода в 250-мл стакана (80% полный) с использованием 10" х 10" , 220 В переменном токе конфорки. Погружают медный блок (1 см в поперечном сечении х 1 см) в химическом стакане до теплового равновесия с водой, пока не будет достигнута. Термическая уравновешивания обычно занимает <5 мин и обозначается повторным кипячением воды в химическом стакане.
  6. До создания ожогов, администрировать преимущественные анальгетики (подкожную инъекцию 0,1 мг / кг бупренорфина) для облегчения боли.
  7. Через десять минут после того, как преимущественных анальгетиков, слегка нажмите на медную блок нагревают до бритой области на задней части мышей в течение 7 секунд, чтобы вызвать ожог раны.
    Примечание: Для того, чтобы избежать тепловой травмы работающего персонала, износ термостойких перчаток при выполнении процедуры записи.
  8. Администрирование 0,5 мл стерильного физиологического раствора через subcutaneouинъекции s, чтобы предотвратить обезвоживание.
  9. Через пять минут после индукции термической травмы, инокуляции 50 мкл бактериальной суспензии , содержащей 5 × 10 6 КОЕ в PBS на ожоги мыши с помощью пипетки. При перемещении стерильного ватного тампона в зигзагообразном движении по коже, намазать аликвот на ожогах, чтобы распределить бактериальные клетки в обожженной области настолько равномерно, насколько это возможно.
  10. Сразу же после бактериальной инокуляции, выполняет визуализацию биолюминесценции для инфицированных ожогов, как описано в разделе 4.
  11. Поместите мышей на водяной нагреваемый хирургической кровати (37 ° C, область восстановления) до тех пор, пока у мышей полностью извлекают из анестезии. Дом мыши с максимальным числом 5 в клетку в биологической безопасности уровня 2 животных комнаты.
  12. Администрирование анальгетиков (подкожная инъекция 0,1 мг / кг бупренорфина) два раза в день в течение первых трех дней после ожога.

3. Антимикробная Синий свет терапия для A. & #160; baumannii инфекции у мышей

  1. Начать ABL терапии в течение 24 ч после бактериального заражения.
  2. Используйте светоизлучающий диод (СИД) с пиковой эмиссии при 415 нм для облучения ABL. Смонтировать светодиод на радиаторе , чтобы предотвратить тепловое воздействие на облученной области у мышей 18. Закрепить светодиод оптического опорного стержня с зажимом разъемов, чтобы индикатор для перемещения вверх и вниз.
  3. Включите питание / счетчика энергии и нажмите на кнопку длины волны, чтобы выбрать 415 нм. Сброс счетчика мощности / энергии для вычитания фона (окружающего света).
  4. Перенесите измеритель мощности / энергии прямо под светодиодом. Надевайте голубой свет защитные очки. Включите свет СИД и отрегулировать расстояние между светодиодом отверстием (объектив, который сходится свет от светодиода) и датчиком света (2 см в диаметре) измерителя мощности / энергии так, что световое пятно покрывает всю площадь датчик освещенности.
  5. Тщательно настроить светодиодный драйвер и записать чтение Poweг / счетчик энергии. Вычислить освещенности в соответствии с чтением: облученность = Чтение (Ш) / Площадь (см 2). Регулировка освещенности светодиода до 100 мВт / см2, настраивая светодиодный драйвер.
  6. Выключите светодиод. Измерьте расстояние между СИД диафрагмы и датчика света измерителя мощности / энергии.
  7. Обезболить мышей с внутрибрюшинной инъекцией кетамина-ксилазином коктейля (100 мг / кг - 20 мг / кг). Отсутствие рефлекса глазного предполагает соответствующую глубину анестетика.
  8. Случайным разделить мышей в ABL-обработанной группы (п = 10) и необработанной контрольной группы (n = 10).
  9. Для ABL-обработанной группы, покрывают глаза мышей с алюминиевой фольгой, чтобы избежать чрезмерного воздействия света. Поместите ожоги мышей непосредственно под светодиодом, с крышкой чашки Петри 35 мм под живот мыши, чтобы держать их спины в горизонтальном положении.
  10. Заменить измеритель мощности / энергию, упомянутый в шаге 3.5 с помощью мыши на квадратную чашку дишиллинг Отрегулируйте высоту мыши обратно в положение, в котором расстояние между светодиодом отверстием и поверхностью ожога мышей равно, что между светодиодом отверстием и уровнем светового датчика силовым / счетчиком энергии (как описано на стадии 3,5).
  11. Облучают инфицированные ожоги при освещенности 100 мВт / см 2. Не Deliver ABL в дозах 72 Дж / см 2 до общей дозы 360 Дж / см 2 достигается (например, 0, 72, 144, 216, 288 и 360 Дж / см 2). После каждой дозы света, выполняет визуализацию биолюминесценции для мышей, как описано в разделе 4.
  12. Для необработанной контрольной группы, выполняет биолюминесценцию визуализацию ожогов мыши, как описано в разделе 4, используя те же временные интервалы, как используемые для ABL-обработанной группы.
  13. Перед восстановлением мышей, мышей поместить на воде нагреваемого хирургической кровати, чтобы предотвратить потерю тепла и гипотермии. Обратите внимание на активность и глазной рефлекс мышей до выздоровления. После того, как гое восстановление мышей, дом их 2-3 в клетке.
  14. После того, как ABL терапии, выполняют визуализацию биолюминесценции, как описано в Разделе 4, ежедневно в течение первых 3 дней, а затем в разные дни, чтобы следить за временной био-бремя инфекций у мышей.

4. Биолюминесценция Визуализация инфекций у мышей

  1. Изображение мышей с использованием системы визуализации с низким уровнем света , который включает в себя усиленную камеру прибора с зарядовой связью, контроллер камеры, образец камеру, и процессор 19 изображения.
  2. Обезболить мышей с внутрибрюшинной инъекцией кетамина-ксилазином коктейля (100 мг / кг - 20 мг / кг). Прикоснувшись к глазным мышей с помощью ватного тампона; отсутствие глазного рефлекса предполагает соответствующую глубину анестетика.
  3. Запустите программное обеспечение живого изображения. В панели управления, которая появляется, нажмите кнопку Initialize. Подождите, пока цвет коробки температура не станет зеленым, указывая, что температура на стадиив камере образца достигла 37 ° C.
  4. Поместите мышей на стадии (37 ° C) в камере образца системы формирования изображения, с инфицированными ожогами непосредственно под камерой.
    Примечание: биолюминесценции бактерий может уменьшиться, если ожоги становятся сухими. Поэтому рекомендуется увлажнять ожоги мыши с PBS, прежде чем визуализации.
  5. В панели управления, поставьте галочку рядом с «люминесценцией.» Выберите «Автоматическую экспозицию», так что время экспозиции для получения изображения будет оптимизировано с помощью программного обеспечения живого изображения на основе интенсивности биолюминесценции.
  6. Выберите «C» из «поля зрения» в раскрывающемся списке. Выберите опцию «Сканирование в середине диапазона», чтобы программа определения фокусного расстояния. Поставьте галочку рядом с Overlay.
  7. Нажмите «Приобретать», чтобы захватить изображение. В поле "Edit Image Label", нажмите кнопку "OK"; «Окно изображения» и «Toll Palette» появится.
  8. Настройка параметров автоматического ROI для автоматического выбора.
  9. Количественно интенсивность биолюминесценции как относительные единицы люминесценции (RLUS) и отображать биолюминесценции в ложном цветовой гамме , начиная от розового (наиболее интенсивных) до синего ( не менее интенсивного) 19, 20.
  10. Вычислить фракцию выживаемости бактерий в ожогах мыши при различных моментов времени, основанные на анализе интенсивности биолюминесценции. Фракция выживаемости бактерий в данный момент времени = интенсивность биолюминесценции измеряется в этот момент времени / интенсивность биолюминесценции измеряется непосредственно перед воздействием ABL 17.

5. Эвтаназия мышей

  1. Конечные точки эксперимента заключаются в следующем: (а) разрешение инфекции, о чем свидетельствует потеря биолюминесценции, как определено визуализации; (Б) возникновение систематических инфекций, как показано распространение биолюминесценции снаружи сгоревший являютсяа; (С) потеря ≥15% массы тела по сравнению с нормальным соответствует возрасту мышей, или страдающий от боли и страданий, как указано на отсутствие чувствительности к ручной стимуляции, неподвижность, неспособность есть или пить. В ходе исследования, если мы сталкиваемся с ситуацией, когда мы не уверены, является ли мышь полностью достиг статуса умирающий, как указано по нашему определению, и / или мы не уверены, что нам нужно усыпить его, мы свяжемся с ветеринарным персоналом СКК для плана действий; (Г) в противном случае мышей будут умерщвлены через 30 дней после начала исследования.
  2. Перенесите мышей в закрытые клетки специально для эвтаназии и эвтаназия мышей путем доставки диоксида углерода (СО 2) сжатый газ в клетки.
    1. Открыть бак или клапан регулятора CO 2 , чтобы инициировать поток газа. Убедитесь, что регулятор читает правильный пси (фунтов на квадратный дюйм) на основе команд, размещенных в блоке, и отрегулируйте повторноне gulator к правильному фунтов на квадратный дюйм при необходимости, как правило, не выше, чем 5 фунтов на квадратный дюйм.
    2. Заполните медленно. Скорость потока не должна вытеснить не более 30% от объема камеры / клетки в минуту (для типичной клетки мыши, ~ 2 л / мин; для клетки крысы, ~ 7,5 л / мин).
    3. Подождите примерно 3-5 мин для животного, чтобы остановить движение или дыхание; глаза должны быть закреплены и расширены. Выключение CO 2 , бак или регулирующий клапан , чтобы остановить поток СО 2.
    4. Убедитесь в том, что сердце не бьется, ощупывая грудь между большим и указательным пальцами. Убедитесь в том, что нет никакого мерцания рефлекса, коснувшись глазным яблоком.
      1. Если есть сердцебиение или мигают рефлекс, повторите процесс эвтаназии или использовать ножницы, чтобы открыть грудную полость для создания пневмоторакса (животное должно быть не реагирующее на носок щепотку перед выполнением этой процедуры).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Штамм A. baumannii , что мы использовали это клинический изолят MDR, как сообщалось ранее 12, 17. Бактериальный штамм был сделан биолюминесцентным с помощью трансфекции luxCDABE оперы 11. Фигура 1А показывает последовательные бактериальные люминесценции изображения из репрезентативной мыши сжигают инфицированных 5 × 10 6 A. baumannii и подвергаются одной экспозиции ABL через 24 ч после бактериального заражения. Грамотрицательное пятно гистологического среза репрезентативной кожи мыши сжечь образец (собранный на 24 ч после инокуляции) показало наличие А. baumannii биопленки на поверхностях инфицированного ожога (Фиг.). Как показано на фигуре 1А, бактериальная люминесценция была почти ликвидирована после воздействия 360 Дж / см 2 ABL был доставлен (60 мин при облученииоблученность 100 мВт / см 2). Фигура 1С является кривой доза-ответ средней бактериальной люминесценции от ожогов мышей , зараженных 5 × 10 6 A. baumannii и обработанных ABL через 24 ч после бактериальной инокуляции (п = 10). Для достижения 3-10 войти инактивацию A. baumannii в ожогах мыши, приблизительно 360 Дж / см 2 ABL требовалось. Бактериальной люминесценции мыши ожоги неэкспонированные к ABL оставалась почти неизменной в течение эквивалентного периода времени (данные не показаны; P <0,001).

Рисунок 1
Рисунок 1: ABL Инактивация бактерий в инфицированных мышей Бернса. (А) Последовательные бактериальные люминесценции изображения из репрезентативной мыши ожога инфицированных 5 × 10 6 КОЕ A. baumannii и экспонировали на 360 Дж / см 2 при 24 ABLч после бактериального заражения. (B) , окрашивали по Граму гистологический срез репрезентативной кожи мыши ожога , показывающий присутствие А. baumannii биопленок (стрелки) в ожога мыши. Образец кожи собирали через 24 ч после бактериального заражения. (С) кривой доза-реакция средней бактериальной люминесценции мыши ожоги инфицировали 5 × 10 6 A. baumannii и обрабатывают с экспозицией 360 Дж / см 2 ABL в 24 ч (N = 10) после бактериальной инокуляции. Бары: стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ABL представляет собой новый способ лечения инфекций. Поскольку механизм действия полностью отличается от химиотерапии, более физиотерапии. Агент, который опосредует противомикробное действие синего света облучения (400-470 нм). С развитием синих светодиодов, мы получили доступ к эффективному и простому основе света антимикробного подходу к MDR инфекций.

В этом протоколе, мы описали развитие мышиной модели ожоговых инфекций , вызванных биолюминесценции штаммом МЛУ, А. baumannii. При использовании светящихся бактерий, степень заражения может быть неинвазивным мониторинг в реальном времени в живых животных с помощью биолюминесценции визуализации. Использование сконструированных штаммов биолюминесценции бактерий и технике низкой освещенности изображения создает эффективную методику для мониторинга инфекций в реальном времени во время антибактериальной терапии. Этот метод также может быть использован в исследованиях инфекцийвызванные другими видами микроорганизмов и расположено в других местах. Помимо оценки эффективности антимикробных подходов, этот метод также может быть использован для отслеживания прогресса инфекции.

Используя эту модель мыши, мы показали , что ABL (415 нм) успешно инактивируют бактерии в установленных инфекций (рис 1А и С). До начала терапии ABL, наблюдались скопления бактерий в установленных инфекциях (Фигура 1В), что является признаком биопленок. Биопленки более терпимы к традиционным антибиотикам и иммунной защиты по сравнению с их аналогами планктонных 6, 7 и часто связаны с постоянными инфекциями 8, 9. Представительные результаты являются многообещающими в том, что 415-нм ABL является биопленки-проникающей. Кроме того, вместе с предыдущими докладами 29,30, 31, 32, наши результаты показывают , что эффективность ABL сохраняется независимо от профиля лекарственной устойчивости бактерий.

Протокол, описанный здесь, включает в себя три основные процедуры: (1) разработка модели мыши ожоговых инфекций, (2) ABL терапии, и (3) обработки изображений биолюминесценции. При разработке модели мыши ожоговых инфекций, мы отметили, что существует несколько факторов, которые влияют на степень заражения и последующую эффективность ABL: (1) Время горения влияет на глубину раны и распространение бактерий. Когда время горения было увеличено с 3 до 7 с, бактериальный люминесценции был гораздо сильнее ( что указывает на более высокую степень инфекции) на 24 ч после инокуляции, и искоренение инфекции требуется гораздо более высокие ABL экспозиции (> 360 Дж / см 2 ). (2) Посевные бактерий является ключевым параметром для развития OF инфекции. Чем выше бактериального инокулят, как правило, приводит к более высокой степени инфекции, в то время как достаточно низкий инокулят часто не развивать устойчивые инфекции у мышей. В последнем состоянии, бактериальная люминесценция обычно становится невозможно обнаружить вскоре после бактериального заражения. (3) Взаимодействие между бактериями и хостов зависит от вида бактерий. Мы также использовали синегнойные разработать модель инфекции. Мы обнаружили , что при тех же самых условиях (т.е., время и бактериального инокулята горения), инфекции , вызванные P.aeruginosa , прогрессировала гораздо быстрее , чем А. baumannii инфекций и сепсиса всегда наблюдалось у мышей в течение 48 ч после прививки 25.

Для выполнения ABL терапии, существует несколько важных моментов, которые необходимо решить: (1) Правильный свет освещенность необходима для развернутой эффективности ABL терапии. (2) Поверхность ожога у мышей сhould быть размещены в горизонтальном направлении, как это возможно. Неспособность надлежащим образом расположить поверхность ожога может поставить под угрозу эффективность ABL терапии. (3) Во время воздействия света, предполагается, что глаза мышей быть защищены с алюминиевой фольгой, особенно, когда лазер используется в качестве источника света. (4) При воздействии света, следует соблюдать осторожность, чтобы контролировать мышей в случае, если они пробуждают от наркоза. В этом случае небольшая дополнительная доза анестетиков должна вводиться, чтобы держать животное наркоз. (5) И ABL-мышей, обработанные и необработанный мышей, должен быть помещен на нагревательный слой, чтобы поддерживать температуру тела, когда под анестезией. В процессе визуализации биолюминесценции, биолюминесценции бактерий могут уменьшаться, когда ожоги становятся сухими. Поэтому рекомендуется увлажнять ожоги мыши с PBS, прежде чем визуализации.

Существуют также некоторые ограничения методов, обсуждаемых в данном протоколе: (1) Для целей мониторинга Exteнт инфекции в режиме реального времени, должны быть использован биолюминесцентные бактериальные штаммы. Поэтому, перед тем, как клинический штамм может быть испытан в животной модели, она должна быть генетически модифицирована трансфекциями люкса CDABE оперона 11. (2) Эффективность ABL связана с длиной волны 33 и видов бактерий / штаммов 34 используется. Синие волны, вместе с другими параметрами, должны быть дополнительно оптимизированы для инактивации различных видов бактерий / штаммов. (3) Мы только исследовали поверхностные инфекции у мышей. Для глубоких инфекций, местная поставка ABL не может быть в состоянии достигнуть инфекции, поэтому интерстициальная доставка света может потребоваться 35. (4) Существует ограничение чувствительности системы формирования изображений, особенно при визуализации глубоких инфекций 19. В результате, даже когда пиксели биолюминесценции полностью устранены, там еще может быть VIбактериальные клетки, способные остальные, что позволяет происходить бактериальный подрост. Длительное воздействие на ABL рекомендуются после ликвидации бактериальной люминесценции в целях предотвращения бактериального подроста.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria. , https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014).
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination? J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond? Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Tags

Иммунологии выпуск 122 Антимикробный синий свет множественная лекарственная устойчивость, Ожог модель мыши инфекция биолюминесценции изображения
<em>В Vivo</em> Исследовании антимикробной Синяя Светотерапии для Полирезистентного <em>Acinetobacter baumannii</em> Ожог инфекции с помощью биолюминесценции визуализации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang,More

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter