Abstract
Bruciano le infezioni continuano ad essere una causa importante di morbilità e mortalità. La crescente emergere di (MDR) batteri multiresistenti ha portato alla frequente fallimento dei trattamenti tradizionali antibiotici. terapie alternative sono urgentemente necessari per affrontare i batteri MDR.
Un approccio non antibiotico innovativo, antimicrobico luce blu (ABL), ha dimostrato efficacia contro le infezioni promettente MDR. Il meccanismo di azione di ABL non è ancora ben compreso. È comunemente ipotizzato che naturalmente cromofori fotosensibilizzanti endogeni nei batteri (ad esempio, porfirine esenti da ferro, flavine, etc.) sono eccitati da abl, che a sua volta produce specie reattive dell'ossigeno citotossici (ROS) attraverso un processo fotochimico.
A differenza di un altro approccio antimicrobico a base di luce, antimicrobico terapia fotodinamica (aPDT), la terapia ABL non richiede il coinvolgimento di un photosensitiz esogenaER. Tutto ciò che serve per entrare in vigore è l'irradiazione di luce blu; pertanto, è semplice e poco costoso. I recettori ABL sono i fotosensibilizzatori endogeni cellulari nei batteri, piuttosto che il DNA. Così, ABL è ritenuto essere molto meno genotossico alle cellule ospiti di irradiazione ultravioletta-C (UVC), che provoca direttamente danni al DNA in cellule ospiti.
In questo articolo, vi presentiamo un protocollo per valutare l'efficacia della terapia ABL per MDR Acinetobacter baumannii infezioni in un modello murino di ustioni. Utilizzando un ceppo bioluminescente ingegnerizzato, siamo stati in grado di monitorare in maniera non invasiva il grado di infezione in tempo reale in animali viventi. Questa tecnica è anche un efficace strumento di controllo della distribuzione spaziale delle infezioni negli animali.
Introduction
Bruciare infezioni, che sono riportati di frequente causa di infortuni termici cutanee, continuano ad essere una causa importante di morbilità e mortalità 1. La gestione delle infezioni ustione è stata ulteriormente compromessa dalla crescente emergere di (MDR) ceppi batterici multiresistenti 2 a causa dell'uso massiccio di antibiotici. Un importante batteri MDR Gram-negativi è Acinetobacter baumannii, che è noto per essere associato con le recenti ferite in battaglia ed è resistente a quasi tutti gli antibiotici disponibili 3. La presenza di biofilm in foci ferito 'stato segnalato 4, 5 e si crede ad aggravare la tolleranza agli antibiotici e difesa dell'ospite 6, 7, causando infezioni persistenti 8, 9. Pertanto, v'è una pressing bisogno per lo sviluppo di trattamenti alternativi. Nella strategia nazionale recentemente annunciato per la lotta contro batteri resistenti agli antibiotici, lo sviluppo di terapie alternative agli antibiotici è stato notato come un'azione da parte del governo degli Stati Uniti 10.
approcci antimicrobici basati leggeri, come indica il nome, impongono l'irradiazione di luce con o senza altri agenti. Questi approcci includono la terapia antimicrobica fotodinamica (aPDT), ultravioletto-C (UVC) irradiazione, e la luce blu antimicrobica (ABL). In studi precedenti, hanno dimostrato l'efficacia promettenti nell'uccidere MDR ceppi batterici 11, 12, 13. Tra i tre approcci basati sulla luce, ABL ha attirato sempre più attenzione negli ultimi anni grazie alle sue proprietà antibatteriche intrinseche senza l'uso di fotosensibilizzanti 14. in Comparison a aPDT, ABL coinvolge solo l'uso di luce, mentre aPDT richiede una combinazione di luce e un fotosensibilizzatore. Pertanto, ABL è semplice e poco costoso 14. In confronto a UVC, ABL si crede che sia molto meno citotossici e genotossici alle cellule ospiti 15.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di indagare l'efficacia della ABL per il trattamento delle infezioni causate da ustione MDR A. baumannii in un modello murino. Usiamo batteri patogeni bioluminescenti per sviluppare nuovi modelli murini di infezioni ustionati che permettono il monitoraggio non invasivo della carica batterica in tempo reale. Rispetto al metodo tradizionale di campionamento del fluido / tessuto e successiva placcatura e conteggio delle colonie 16, questa tecnica fornisce risultati accurati. Il processo di campionamento del tessuto potrebbe introdurre un'altra fonte di errore sperimentale. Poiché l'intensità di luminescenza batterica è linearmente proporzionale alla corresristagni batterica CFU 17, possiamo misurare direttamente la sopravvivenza dei batteri dopo una certa dose di irradiazione di luce. Monitorando la carica batterica negli animali che vivono ricevere il trattamento di luce in tempo reale, la cinetica di uccisione di batteri possono essere caratterizzati utilizzando un numero notevolmente ridotto di topi.
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Protocol
1. Preparazione di coltura batterica
- Aggiungere 7,5 ml di Brain Heart Infusion (BHI) medium ad un tubo da 50 ml per centrifuga. Seme cellule A. baumannii nel mezzo BHI e poi incubare la coltura A. baumannii in un incubatore orbitale (37 ° C) per 18 ore.
- Centrifugare la coltura delle cellule a 3500 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e lavare il pellet in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Risospendere i batteri pellets in PBS fresco e accuratamente pipetta la sospensione.
- Raccogliere 100 microlitri della sospensione batterica e fare una diluizione 1:10 usando PBS fresco.
- Trasferire la diluizione di 1,5 mL semi-micro cuvetta e misurare la densità ottica (OD) a una lunghezza d'onda di 600 nm (OD 600 nm).
- Calcolare la OD 600 nm della sospensione originale (non diluito) in PBS secondo il valore OD 600 nm misurato della diluizione e il fattore di diluizione (10).
- regolare °e sospensioni originali in PBS a OD 600 nm = 0,6 (corrispondente ad una densità cellulare di 10 8 UFC / mL).
2. modello murino di infezione causata da Masterizza bioluminescente A. baumannii
- Usa femmina adulta topi BALB / c di età compresa tra 7-8 settimane e del peso di 17-19 g. Lasciare i topi per acclimatarsi alle condizioni di laboratorio per almeno 3 giorni prima dell'inizio dell'esperimento. Mantenere i topi in un ciclo di 12 ore luce / buio a una temperatura ambiente di 21 ℃ e dare loro cibo e acqua ad libitum.
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Toccare leggermente la palpebra di ogni mouse con un batuffolo di cotone; l'assenza del riflesso palpebrale suggerisce una profondità dell'anestesia appropriato. Coprire gli occhi del mouse con il veterinario pomata per prevenire gli occhi dalla siccità durante l'anestesia.
- Radere i topi sul retro per esporre la pelle il più possibile utilizzando un 50-blade tagliatore di capelli.
- Posizionare il coperchio di 35 mm piastra di Petri sotto l'addome delle topi per mantenere la schiena in una posizione relativamente orizzontale.
- bollire l'acqua in un becher da 250 ml (80% pieno) con una x 10" , 220 VAC piastra 10" . Immergere un blocco di ottone (1 x 1 cm sezione trasversale) nel contenitore fino al raggiungimento equilibrio termico con l'acqua. equilibrazione termica richiede solitamente <5 min ed è indicato dal re-ebollizione dell'acqua nel bicchiere.
- Prima di creare l'ustioni, somministrare analgesici di prelazione (un'iniezione sottocutanea di 0,1 mg / kg) buprenorfina per alleviare il dolore.
- Dieci minuti dopo gli analgesici di opzione, premere delicatamente il blocco di ottone riscaldata alla zona rasata sul retro del mouse per 7 s per indurre ustioni.
NOTA: per evitare lesioni termiche al personale di lavoro, indossare guanti termici resistenti quando si esegue la procedura di masterizzazione. - Somministrare 0,5 ml di soluzione fisiologica sterile attraverso subcutaneous iniezione per prevenire la disidratazione.
- Cinque minuti dopo l'induzione del danno termico, inoculare 50 ml di sospensione batterica contenente 5 x 10 6 CFU in PBS sulle ustioni topo usando una pipetta. Muovendo un tampone di cotone sterile in un movimento a zigzag sulla pelle, spalmare le aliquote sulle ustioni di distribuire le cellule batteriche nella zona bruciata nel modo più uniforme possibile.
- Immediatamente dopo l'inoculazione batterica, eseguire l'imaging bioluminescenza per le ustioni infette, come descritto nella Sezione 4.
- Posizionare il mouse su un letto chirurgico-acqua riscaldata (37 ° C, zona di recupero) fino a quando i topi hanno completamente recuperato da anestesia. Casa i topi con un numero massimo di 5 per gabbia in un livello di biosicurezza 2-stanza degli animali.
- Somministrare analgesici (iniezione sottocutanea di 0,1 mg / kg di buprenorfina) due volte al giorno per i primi tre giorni dopo l'ustione.
3. La terapia antimicrobica Blue Light per A. & #160; baumannii infezione nei topi
- Iniziare la terapia Abl a 24 ore dopo l'inoculazione batterica.
- Usare un diodo emettitore di luce (LED) con un picco di emissione a 415 nm per ABl irradiazione. Montare il LED su un dissipatore di calore per evitare effetti termici sulla zona irradiata nei topi 18. Fissare il LED ad un'asta di supporto ottico di congiunzione di clip per consentire il LED di muoversi su e giù.
- Accendere l'unità / contatore di energia e premere il tasto per selezionare lunghezze d'onda 415 nm. Resettare il misuratore di potenza / energia per sottrarre lo sfondo (luce ambiente).
- Posizionare il misuratore di potenza / energia proprio sotto il LED. Indossare occhiali blu-light-protettivi. Accendere la luce LED e regolare la distanza tra l'apertura LED (una lente che converge la luce del LED) e il sensore di luce (2 cm di diametro) del misuratore di potenza / energia in modo che il punto luminoso copre l'intera area il sensore di luce.
- Attenzione sintonizzare il LED driver e registrare la lettura del power / contatore di energia. Calcola l'irraggiamento secondo la lettura: Irradiance = Lettura (W) / Area (cm 2). Regolare l'irraggiamento del LED a 100 mW / cm2 sintonizzando il LED driver.
- Spegnere il LED. Misurare la distanza tra l'apertura LED e il sensore di luce del misuratore di potenza / energia.
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). L'assenza del riflesso palpebrale suggerisce una profondità dell'anestesia appropriato.
- Casualmente dividere i topi in un gruppo abl-trattato (n = 10) e un gruppo non trattato di controllo (n = 10).
- Per il gruppo trattato con abl, coprire gli occhi di topi con un foglio di alluminio per evitare sovraesposizione alla luce. Collocare le bruciature del mouse direttamente sotto il LED, con il coperchio di una capsula di Petri da 35 mm sotto l'addome mouse per mantenere la schiena in una posizione orizzontale.
- Sostituire il misuratore di potenza / energia indicato nel passaggio 3.5 con un mouse su un quadrato di petrish. Regolare l'altezza del mouse avanti ad una posizione in cui la distanza tra l'apertura LED e la superficie della bruciatura mouse è uguale a quella tra l'apertura LED e il livello del sensore di luce / contatore di energia di potenza (come discusso nel passaggio 3.5).
- Irradiare le ustioni infette ad un irradiamento di 100 mW / cm 2. Fornire abl in dosi di 72 J / cm 2 fino ad una dose totale di 360 J / cm 2 è raggiunto (es, 0, 72, 144, 216, 288 e 360 J / cm 2). Dopo ogni dose di luce, eseguire l'imaging bioluminescenza per i topi, come discusso nella sezione 4.
- Per il gruppo di controllo non trattato, effettuare l'imaging bioluminescenza delle ustioni topo, come discusso nella sezione 4, utilizzando gli stessi intervalli di tempo come usati per il gruppo trattato con Abl.
- Prima della ripresa dei topi, i topi mettere sul letto chirurgico riscaldato-acqua per prevenire la perdita di calore e ipotermia. Osservare l'attività e il riflesso palpebrale dei topi fino al recupero. dopo esimoe recupero dei topi, ospitarli 2-3 per gabbia.
- Dopo la terapia abl, effettuare l'imaging bioluminescenza, come discusso nella sezione 4, giorno per i primi 3 giorni e poi a giorni alterni per monitorare la bio-temporale incidenza delle infezioni nei topi.
4. bioluminescenza Imaging di infezioni in topi
- Immagine topi usando un sistema di imaging scarsa illuminazione che comprende una telecamera intensificata ad accoppiamento di carica dispositivo, un controller della telecamera, una camera di campioni, e un processore di immagini 19.
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Toccare leggermente la palpebrale dei topi con un batuffolo di cotone; l'assenza del riflesso palpebrale suggerisce una profondità dell'anestesia appropriato.
- Avviare il software di imaging dal vivo. Nel pannello di controllo che appare, fare clic su Inizializza. Attendere finché il colore della casella temperatura diventa verde, indicando che la temperatura dello stadionella camera campione ha raggiunto 37 ° C.
- Posizionare i topi sulla scena (37 ° C) nella camera esemplare di sistema di imaging, con le ustioni infette direttamente sotto la telecamera.
NOTA: La bioluminescenza dei batteri potrebbe diminuire quando le bruciature diventano secche. Pertanto, si consiglia di idratare le bruciature del mouse con PBS prima di imaging. - Nel pannello di controllo, mettere un segno di spunta accanto a "Luminescence". Selezionare "esposizione automatica" in modo che il tempo di esposizione per l'imaging sarà ottimizzato per il software di imaging dal vivo in base all'intensità bioluminescenza.
- Selezionare "C" dall'elenco a discesa "Campo visivo". Selezionare l'opzione "Scan gamma media" per consentire al software di determinare la distanza focale. Mettere un segno di spunta accanto alla sovrapposizione.
- Fai clic su "Acquisisci" per acquisire l'immagine. Nella casella "Modifica immagine Label", fai clic su "OK"; apparirà una "finestra immagine" e "Toll Palette".
- Impostare i parametri di Auto ROI per la selezione automatica.
- Quantificare l'intensità bioluminescenza come unità di luminescenza relativa (RLU) e visualizzare la bioluminescenza in una scala falsi colori che vanno dal rosa (più intenso) al blu (almeno intenso) 19, 20.
- Calcolare la frazione sopravvivenza dei batteri nel topo ustioni a vari punti di tempo in base all'analisi intensità bioluminescenza. La frazione sopravvivenza dei batteri in un dato istante = l'intensità bioluminescenza misurata in quel punto di tempo / intensità bioluminescenza misurata subito prima dell'esposizione ABl 17.
5. L'eutanasia dei topi
- Gli endpoint dell'esperimento sono le seguenti: (a) risoluzione dell'infezione come evidenziato dalla perdita della bioluminescenza come determinato mediante imaging; (B) insorgenza di infezioni sistematiche come indicato dalla diffusione di bioluminescenza di fuori del bruciato sonoun; (C) la perdita di peso corporeo ≥15% rispetto ai topi normali di pari età, o la sofferenza dal dolore e angoscia, come indicato dalla mancanza di risposta alla stimolazione manuale, l'immobilità, l'incapacità di mangiare o bere. Durante lo studio, se ci imbattiamo in una situazione in cui siamo sicuri se un topo ha pienamente raggiunto lo status di moribondo, come indicato dalla nostra definizione, e / o non siamo sicuri se abbiamo bisogno di eutanasia esso, ti contatteremo un personale veterinario CCM per un piano d'azione; (D) altrimenti i topi sarà eutanasia 30 giorni dopo l'inizio dello studio.
- Riposizionare i topi in gabbie chiuse specificamente per eutanasia e eutanasia topi fornendo anidride carbonica (CO 2) gas compresso nelle gabbie.
- Aprire il serbatoio o valvola di regolazione di CO 2 per avviare il flusso di gas. Verificare che il regolatore di legge il psi corretta (libbre per pollice quadrato) in base a istruzioni indicate dall'unità, e regolare la rigulator alla psi corretto, se necessario, di solito non superiore a 5 psi.
- Riempire lentamente. La portata deve spostare non più del 30% del volume della camera / gabbia al minuto (per una gabbia tipica topo, ~ 2 L / min, per una gabbia ratto, ~ 7,5 L / min).
- Attendere circa 3-5 minuti per l'animale per fermare lo spostamento o la respirazione; Gli occhi devono essere fissi e dilatati. Spegnere serbatoio CO 2 o valvola di regolazione per arrestare il flusso di CO 2.
- Assicurarsi che il cuore non batte per sentire il petto tra il pollice e l'indice. Assicurarsi che non v'è alcun riflesso di ammiccamento toccando il bulbo oculare.
- Se c'è un battito cardiaco o riflesso corneale, ripetere il processo eutanasia o usare forbici per aprire la cavità toracica per creare un pneumotorace (l'animale deve essere non rispondenti ad una presa punta prima di eseguire questa procedura).
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Representative Results
Il ceppo A. baumannii che abbiamo usato è un isolato clinico MDR, come riportato in precedenza 12, 17. Il ceppo batterico è stata fatta bioluminescente dalla trasfezione di luxCDABE opera 11. La Figura 1A mostra le successive immagini di luminescenza batteriche da un mouse rappresentante bruciano infettati con 5 x 10 6 A. baumannii ed esposti ad una singola esposizione Abl a 24 h dopo l'inoculazione batterica. Una colorazione di Gram della sezione istologica di una pelle rappresentante del mouse bruciare campione (raccolte a 24 ore dopo l'inoculazione) ha dimostrato la presenza di biofilm A. baumannii sulla superficie della bruciatura infetta (Figura 1B). Come mostrato nella figura 1A, la luminescenza batterico è stato quasi sradicata dopo un'esposizione di 360 J / cm 2 ABL è stato consegnato (60 min di irradiazione aun irradiamento di 100 mW / cm 2). La figura 1C è la curva dose-risposta della luminescenza batterica medio da ustioni topo infettate con 5 x 10 6 A. baumannii e trattati con ABL a 24 ore dopo l'inoculo batterico (n = 10). Per ottenere un 3-log 10 inattivazione di A. baumannii ustioni del mouse, di circa 360 J / cm 2 ABL è stato richiesto. La luminescenza batterica del mouse brucia non esposta a ABL è rimasto pressoché invariato durante un periodo di tempo equivalente (dati non mostrati; p <0.001).
Figura 1: ABL Inattivazione dei batteri in mouse infetti Burns. (A) le immagini di luminescenza batteriche successive da un mouse rappresentante bruciarsi infettate con 5 x 10 6 CFU di A. baumannii ed esposti a 360 J / cm 2 a 24 Ablh dopo l'inoculazione batterica. (B) Gram-macchiato sezione istologica di un rappresentante ustioni del mouse che mostra la presenza di biofilm A. baumannii (frecce) nella scottatura del mouse. Il campione di pelle è stato raccolto a 24 ore dopo l'inoculazione batterica. (C) curva dose-risposta di luminescenza batterica medio di topo ustioni infette con 5 x 10 6 A. baumannii e trattato con un'esposizione di 360 J / cm 2 Abl a 24 ore (n = 10) dopo l'inoculazione batterica. Bar: deviazione standard. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
ABL è un nuovo metodo per il trattamento delle infezioni. Dal momento che il suo meccanismo d'azione è completamente diversa da quella della chemioterapia, è più di una fisioterapia. L'agente che media l'effetto antimicrobico è blu irradiazione di luce (400-470 nm). Con lo sviluppo di LED blu, abbiamo guadagnato l'accesso a un approccio antimicrobica a base di luce efficace e semplice per le infezioni MDR.
In questo protocollo, abbiamo descritto lo sviluppo di un modello murino di infezioni bruciature causate da un ceppo bioluminescente di MDR, A. baumannii. Con l'uso di batteri bioluminescenti, il grado di infezione può essere non invasivo monitorato in tempo reale negli animali che vivono via di imaging bioluminescente. L'uso di ceppi ingegnerizzati bioluminescenti di batteri e la tecnica di scarsa illuminazione di imaging crea una tecnica efficiente per monitorare infezioni in tempo reale durante la terapia antimicrobica. Questo metodo può essere utilizzato anche nelle indagini di infezionicausata da altre specie microbiche e situato in altri siti. Oltre alla valutazione di efficacia degli approcci antimicrobici, questo metodo può essere utilizzato anche per monitorare i progressi di infezione.
Utilizzando questo modello di topo, abbiamo dimostrato che ABL (415 nm) inattivato con successo batteri in infezioni stabiliti (Figura 1A e C). Prima della terapia Abl, gruppi di batteri sono stati osservati nelle infezioni stabiliti (Figura 1B), che è una caratteristica di biofilm. Biofilm sono più tolleranti di antibiotici tradizionali e difesa dell'ospite rispetto alle loro controparti planctonici 6, 7 e sono spesso associati con infezioni persistenti 8, 9. I risultati rappresentativi sono promettenti in quanto ABL 415-nm è biofilm-penetrante. Inoltre, insieme con precedenti relazioni 29,30, 31, 32, i nostri risultati dimostrano che l'efficacia di Abl persiste indipendentemente dal profilo farmaco-resistenza dei batteri.
Il protocollo qui descritto prevede tre procedure principali: (1) lo sviluppo di un modello murino di infezioni ustioni, (2) Terapia abl, e (3) di imaging bioluminescenza. Durante lo sviluppo di un modello murino di infezioni bruciare, abbiamo notato che ci sono stati diversi fattori che influenzano il grado di infezione e la conseguente efficacia della ABL: (1) Il tempo di combustione influenza la profondità della ferita e la proliferazione dei batteri. Quando il tempo di combustione è stato aumentato da 3 a 7 s, la luminescenza batterica era molto più forte (indicando in misura maggiore di infezione) a 24 ore dopo l'inoculazione e l'eradicazione dell'infezione richiesto molto più elevate esposizioni ABL (> 360 J / cm 2 ). (2) L'inoculo dei batteri è un parametro chiave per lo sviluppo oInfezioni f. Un inoculo batterico superiore provoca solitamente in misura maggiore di infezione, mentre un inoculo sufficientemente bassa spesso non riesce a sviluppare infezioni stabili nei topi. In quest'ultima condizione, luminescenza batterica di solito diventa inosservabile subito dopo l'inoculazione batterica. (3) L'interazione tra i batteri e gli host dipende dalla specie batterica. Abbiamo anche usato P. aeruginosa di sviluppare un modello di infezione. Abbiamo scoperto che, nelle stesse condizioni (ad esempio, il tempo e l'inoculo batterico di bruciato), le infezioni causate da P. aeruginosa progredito molto più rapidamente di quanto infezioni A. baumannii, e sepsi era sempre osservato nei topi entro 48 ore dopo l'inoculazione 25.
Per l'esecuzione della terapia ABL, ci sono diversi punti importanti che devono essere affrontati: (1) la luce irradianza adeguata è necessaria per l'efficacia della terapia massimizzato ABl. (2) La superficie della bruciatura nei topi should essere posizionato il più orizzontale possibile. La mancata posizionare opportunamente la superficie ustione può compromettere l'efficacia della terapia ABl. (3) Durante l'esposizione alla luce, si suggerisce che gli occhi di topi essere protetti con un foglio di alluminio, in particolare quando un laser viene utilizzato come fonte di luce. (4) Durante l'esposizione alla luce, si avrà cura di monitorare i topi nel caso si risveglia dall'anestesia. In questo caso, una piccola dose aggiuntiva di anestetici deve essere somministrato per mantenere gli animali anestetizzati. (5) sia nei topi trattati con Abl e topi non trattati devono essere collocati su un letto di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea quando sotto anestesia. Durante il processo di immagini bioluminescenza, la bioluminescenza di batteri potrebbe diminuire quando le bruciature diventano secche. Pertanto, si consiglia di idratare le bruciature del mouse con PBS prima di imaging.
Ci sono anche alcune limitazioni delle tecniche discusse in questo protocollo: (1) Ai fini del controllo del extent di infezione in tempo reale, è necessario utilizzare ceppi batterici bioluminescenti. Pertanto, prima di un ceppo clinico può essere testato nel modello animale, deve essere geneticamente modificato dalla trasfezione del lux CDABE operone 11. (2) L'efficacia di ABL è legato alle lunghezze d'onda 33 e specie batteriche / ceppi di 34 utilizzato. Le lunghezze d'onda blu, insieme ad altri parametri, dovrebbero essere ulteriormente ottimizzate per inattivare diverse batteriche specie / ceppi. (3) Abbiamo studiato solo infezioni superficiali nei topi. Per le infezioni profonde, la consegna topica di ABL potrebbe non essere in grado di raggiungere le infezioni, così consegna luce interstiziale può essere necessario 35. (4) Esiste un limite di sensibilità del sistema di imaging, specialmente quando l'imaging infezioni profonde 19. Come risultato, anche quando i pixel di bioluminescenza sono completamente eliminati, ci potrebbe essere ancora vicellule batteriche capaci rimanente, permettendo la ricrescita batterica a verificarsi. L'esposizione prolungata a ABL è consigliato dopo l'eliminazione di luminescenza batterica al fine di prevenire la ricrescita batterica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1x Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
References
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