Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vivo חקירת טיפול באור כחול אנטימיקרוביים multidrug עמידים baumannii Acinetobacter צרוב דלקות באמצעות הדמיה פליטת אור

Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/54997
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 4, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology, Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service, Brooke Army Medical Center

Abstract

צרוב זיהומים ממשיכים להיות גורם חשוב לתחלואה ותמותה. הופיע גדלו וההולך של עמידים multidrug (MDR) חיידקים הובילו לכישלון התכוף של טיפולים אנטיביוטיים מסורתיים. תרופות אלטרנטיביות נדרשות בדחיפות כדי להתמודד עם חיידקי MDR.

גישה חדשנית הלא אנטיביוטי, אור כחול מיקרוביאלית (ABL), הוכיח יעילות מבטיחה נגד זיהומים MDR. מנגנון הפעולה של ABL עדיין לא הבין היטב. ההשערה היא כי בדרך כלל טבעי chromophores photosensitizing אנדוגני חיידקים (למשל, פורפירינים חופשי-ברזל, flavins, וכו ') הם נרגשים ABL, אשר בתורו מייצר מינים חמצן תגובתי ציטוטוקסיות (ROS) באמצעות תהליך פוטו.

בניגוד מבוסס אור אחר גישה מיקרוביאלית, טיפול פוטודינמי מיקרוביאלית (aPDT), טיפול ABL אינו מחייב המעורבות של photosensitiz אקסוגנייםאה. כל מה שהיא צריכה להיכנס לתוקף הוא הקרנה של אור כחול; ולכן, זה פשוט וזול. הקולטנים ABL הם הפוטוסנסיטייזרים הסלולר אנדוגני חיידקים, ולא את ה- DNA. לפיכך, הוא האמין ABL להיות הרבה פחות genotoxic לארח תאים מ אולטרה סגול-C (UVC) הקרנה, אשר באופן ישיר גורמת נזק לדנ"א בתאים המארח.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול להעריך את האפקטיביות של הטיפול ABL עבור זיהומים baumannii Acinetobacter MDR במודל של עכברים של פגיעה כוויה. באמצעות זן bioluminescent מהונדס, הצלחנו לעקוב אחר מידת הזיהום פולשנית בזמן אמת בחיות חיים. טכניקה זו היא גם כלי יעיל עבור ניטור הפריסה המרחבית של זיהומים אצל בעלי חיים.

Introduction

זיהומים צרובים, אשר מדווחים לעתים קרובות בגלל פציעות תרמית עורית, ממשיכים להיות גורם חשוב לתחלואה והתמותה 1. הנהלת זיהומי כוויית נפרץ נוספת על ידי הופעתה הגדלה וההולך של עמידים multidrug (MDR) זני חיידקי 2 עקב השימוש המסיבי של אנטיביוטיקה. MDR אחד חשוב גראם שליליים חיידקים הוא baumannii Acinetobacter, אשר ידוע להיות מזוהה עם פצעי הקרב האחרונות והוא עמיד כמעט לכל זמין אנטיביוטיקה 3. הנוכחות של biofilms במוקדי הפצוע דווחה 4, 5, והוא האמין להחריף את הסובלנות לאנטיביוטיקה ומארח הגנה 6, 7, גרימת זיהומים מתמשכים 8, 9. לכן, קיים pressing צריך לפיתוח טיפולים אלטרנטיביים. באסטרטגיה הלאומית הודיעה לאחרונה למאבק עמידים לאנטיביוטיקה חיידקים, פיתוח תרופות חלופיות לאנטיביוטיקה כבר ציין כפעולה על ידי ממשלת ארצות הברית 10.

אור מבוסס גישות אנטי-מיקרוביאלית, כפי שמלמדות השם, דורשות הקרנת אור עם או בלי סוכנים אחרים. גישות אלה כוללים טיפול פוטודינמי מיקרוביאלית (aPDT), סגול-C (UVC) הקרנה, ואור כחול מיקרוביאלית (ABL). במחקרים קודמים, הם הראו יעילים מבטיחים הרג זני MDR חיידקי 11, 12, 13. בין גישות אור מבוסס השלוש, ABL משך תשומת לב גוברת בשנים האחרונות עקב תכונות אנטיבקטריאליות הפנימיות שלה ללא שימוש הפוטוסנסיטייזרים 14. בשנת comparison כדי aPDT, ABL רק כרוך בשימוש באור, בעוד aPDT דורש שילוב של אור פוטוסנסיטייזר. לכן, ABL היא פשוטה וזולה 14. בהשוואה UVC, ABL הוא האמין להיות הרבה פחות ציטוטוקסיות genotoxic לארח תאים 15.

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את האפקטיביות של ABL לטיפול בזיהומים הנגרמים על ידי כוויה baumannii א MDR במודל של עכברים. אנו משתמשים חיידקים פתוגניים bioluminescent לפתח מודלים העכבר החדש של זיהומים כוויה המאפשרים ניטור פולשני של הנטל חיידקי בזמן אמת. לעומת השיטה המסורתית של דגימת גוף נוזלת / רקמות ציפוי עתידי מושבה לספור 16, טכניקה זו מספקת תוצאות מדויקות. תהליך דגימת רקמות יכול להציג מקור נוסף של שגיאה ניסיונית. מאז עוצמת הארת החיידקים היא מידתית באופן ליניארי corresponding חיידקי CFU 17, אנו יכולים למדוד את ההישרדות של החיידקים ישירות אחרי מנה מסוימת של הקרנת אור. על ידי ניטור ניטל חיידקי חיים וחיות קבלת טיפול האור בזמן אמת, קינטיקה של הרג חיידקים ניתן לאפיין באמצעות מספר מופחת משמעותי של עכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תרבית חיידקים

  1. להוסיף 7.5 מ"ל של המוח הלב עירוי (BHI) בינוני צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. א זרע תאי baumannii במדיום BHI ואז דגירת תרבות א baumannii באינקובטור מסלולית (37 מעלות צלזיוס) במשך 18 שעות.
  2. צנטריפוגה התרבות של תאים ב 3500 × g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant, ולשטוף את הכדורים ב-בופר פוספט (PBS).
  3. Re- להשעות את כדורי חיידקי PBS טרי ביסודיות פיפטה ההשעיה.
  4. אסוף 100 μL של השעית החיידקים ולבצע דילול 01:10 באמצעות PBS הטרי.
  5. מעבירים את דילול קובט 1.5 מ"ל למחצה ומיקרו ולמדוד את צפיפות אופטית (OD) באורך גל של 600 ננומטר (OD 600 ננומטר).
  6. חשב את 600 ננומטר OD של ההשעיה המקורית (לא מהול) ב PBS בהתאם לערך ננומטר OD 600 נמדד של דילול לבין גורם לדילול (10).
  7. התאם הדואר ההשעיה המקורית ב PBS OD 600 ננומטר = 0.6 (המקביל ל צפיפות התאים של 10 8 CFU / mL).

2. עכבר דגם של Burn זיהום הנגרם על ידי Bioluminescent A. baumannii

  1. השתמש מבוגר נקבה BALB / c עכברים בגילאי 7-8 שבועות ומשקלו 17-19 גרם. אפשר העכברים כדי להתאקלם לתנאי מעבדה עבור 3 ימים לפחות לפני תחילת הניסוי. שמרו על העכברים במחזור 12 h בהיר / כהה מתחת לטמפרטורת החדר של 21 ℃ ולתת להם כרצונך מזון ומים.
  2. להרדים את העכברים עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל קטמין-xylazine (100 מ"ג / ק"ג - 20 מ"ג / ק"ג). בעדינות לגעת palpebra של כל עכבר עם מקלון צמר גפן; בהעדר של רפלקס palpebral מרמז עומק ההרדמה המתאים. מכסה את עיני עכבר עם משחת וטרינר כדי למנוע את העיניים מפני יובש במהלך הרדמה.
  3. לגלח את העכברים על הגב לחשוף עור ככל האפשר באמצעות 50-להב גוזז שיער.
  4. מניחים את המכסה של צלחת 35 מ"מ פטרי מתחת הבטן של עכברים כדי לשמור גבם במצב מאוזן יחסית.
  5. מרתיחים מים בכוס מ"ל 250 (80% מלא) באמצעות 10" x 10" , 220 חמום VAC. לטבול בלוק פליז (1 ס"מ x 1 ס"מ חתך) לתוך הכוס עד איזון תרמי עם המים הגיעו. איזון תרמי בדרך כלל לוקח <5 דקות והוא מסומן על ידי מחדש רתיחת המים בכוס.
  6. לפני יצירת שפצע הכווייה, לנהל משככי כאבים מנע (הזרקה תת עורית של עצירות 0.1mg / kg) לשיכוך כאבים.
  7. עשר דקות לאחר משככי הכאבים מנעו, לחץ בעדינות על בלוק פליז מחומם לאזור המגולח בצד האחורי של העכברים עבור 7 ים לגרום פצעי כווייה.
    הערה: כדי למנוע פגיעת תרמית על אנשי העבודה, ללבוש כפפות תרמית עמידה בעת ביצוע הליך השריפה.
  8. נהל 0.5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית דרך subcutaneouהזרקת הים כדי למנוע התייבשות.
  9. חמש דקות לאחר האינדוקציה של פציעה התרמית, לחסן 50 μL של השעית חיידקים המכילה 5 x 10 6 CFU ב PBS על כוויות העכבר בעזרת פיפטה. מאת נעה מקלון צמר גפן סטרילי בתנועה זיגזג על העור, למרוח את aliquots על כוויות להפיץ תאים חיידקיים באזור נשרפו בצורה שווה ככל האפשר.
  10. מייד לאחר חיסון חיידקים, לבצע הדמית פליטת אור עבור הכוויות הנגועות, כמפורט בסעיף 4.
  11. מניחים את העכברים על מצע כירורגיים מים מחומם (37 מעלות צלזיוס, אזור התאוששות) עד העכברים החלימו לחלוטין מן ההרדמה. בית העכברים עם מספר מרבי של 5 לכל כלוב בחדר חית בטיחות ביולוגי רמה-2.
  12. נהל משככי כאבים (הזרקה תת עורית של עצירות 0.1 מ"ג / ק"ג) פעמיים ביום למשך שלושה הימים הראשונים לאחר הפציעה כוויה.

3. טיפול באור כחול אנטימיקרוביים A. & #160; זיהום baumannii עכברים

  1. התחל טיפול ABL ב 24 שעות לאחר חיסון חיידקים.
  2. השתמש אור דיודה (LED) עם פליטת שיא 415 ננומטר עבור הקרנת ABL. הר LED על גוף קירור כדי למנוע תופעות תרמית על האזור המוקרן בעכברים 18. תקן את ביאת מוט תמיכה אופטית עם מחברי קליפ לאפשר LED לנוע מעלה ומטה.
  3. הפעל את מד הכוח / אנרגיה ולחץ על כפתור הגל כדי לבחור 415 ננומטר. איפוס מד כוח / אנרגיה כדי להפחית את (אור הסביבה) ברקע.
  4. מניח את מד כוח / אנרגיה ממש מתחת LED. תלבש משקפי אור כחול מגן. הפעל את נורית ה- LED ולהתאים את המרחק בין הצמצם LED (עדשה כי מתכנס בין האור ובין LED) ואת חיישן אור (2 ס"מ קוטר) של מד הכוח / אנרגיה כך כתם אור מכסה את כל האזור של חיישן האור.
  5. בזהירות לכוון את הנהג LED ולהקליט את הקריאה של power / מד אנרגיה. חשב את והקרינה פי הקריאה: וקרינה = קריאה (W) / שטח (סנטימטר 2). התאם את והקרינה של LED אל 100 mW / cm2 ידי כוונון נהג LED.
  6. כבה את הנורית. מדוד את המרחק בין צמצם LED וחיישן האור של מד כוח / אנרגיה.
  7. להרדים את העכברים עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל קטמין-xylazine (100 מ"ג / ק"ג - 20 מ"ג / ק"ג). היעדרות של רפלקס palpebral מרמזת עומק הרדמה מתאים.
  8. אקראי לחלק את העכברים לתוך קבוצת ABL שטופלה (n = 10) וכן קבוצת ביקורת ללא טיפול (n = 10).
  9. עבור קבוצת ה- ABL שטופל, לכסות את העיניים של עכברים עם רדיד אלומיניום על מנת להימנע מחשיפת יתר לאור. מניחים את העכבר כוויות ישירות תחת LED, עם מכסה של צלחת פטרי 35 מ"מ מתחת לבטן העכבר כדי לשמור גבם במצב מאוזן.
  10. החלף את מד הכוח / אנרגיה כאמור בשלב 3.5 עם העכבר על di פטרי רבועיםsh. התאם את גובה העכבר בחזרה למצב שבו המרחק בין צמצם LED ואת השטח של כוויית העכבר שווה כי בין צמצם LED ורמת חיישן האור של מד הכח / האנרגיה (כפי שפורטו צעד 3.5).
  11. מקרין את הכוויות הנגועות irradiance של 100 mW / cm 2. לספק ABL במינונים של 72 J / cm 2 עד מינון כולל של 360 J / cm 2 הוא הגיע (למשל, 0, 72, 144, 216, 288 ו 360 2 J / ס"מ). אחרי כל מנה אור, לבצע הדמיה פליטת אור על עכברים, כפי שפורט בסעיף 4.
  12. עבור קבוצת הביקורת שלא טופלה, לבצע הדמית פליטת אור של כוויות העכבר, כפי שפורט בסעיף 4, תוך שימוש באותה המרווחים הזמן כפי שמוצג עבור הקבוצה שטופלה-ABL.
  13. לפני ההתאוששות של העכברים, למקם את העכברים על מיטת כירורגי המים מחוממים כדי למנוע איבוד חום היפותרמיה. שימו לב הפעילות רפלקס palpebral של עכברים עד להחלמה. לאחר ההתאוששות דואר של העכברים, לשכן אותם 2-3 בכל כלוב.
  14. לאחר טיפול ABL, לבצע הדמיה פליטת אור, כפי שפורט בסעיף 4, מדי יום במשך 3 הימים הראשונים ולאחר מכן לסירוגין כדי לפקח על ביו-עול הזמני של זיהומים אצל עכברים.

4. הדמיה פליטת אור של דלקות עכברים

  1. תמונת העכברים באמצעות מערכת הדמיה בתאורה חלשה שכוללת מצלמת מכשיר התעצמה תשלום מצמיד, בקר מצלמה, בתא דגימה, לבין מעבד תמונה 19.
  2. להרדים את העכברים עם זריקה intraperitoneal של קוקטייל קטמין-xylazine (100 מ"ג / ק"ג - 20 מ"ג / ק"ג). בעדינות לגעת palpebral של עכברים עם מקלון צמר גפן; בהעדר של רפלקס palpebral מרמז עומק ההרדמה המתאים.
  3. הפעל את תוכנת הדמית חיים. בלוח הבקרה שמופיע, לחץ אתחול. מתן עד צבע תיבת הטמפרטורה הופך לירוק, המציין כי הטמפרטורה של הבמהבתא הדגימה הגיעה 37 מעלות צלזיוס.
  4. מניח את העכברים על הבמה (37 ° C) בתא הדגימה של מערכת ההדמיה, עם הכוויות הנגועות ישירות תחת המצלמה.
    הערה: פליטת האור של החיידק יכול להקטין כאשר הכוויות להיות יבשות. לכן, מומלץ לחות כוויות העכבר עם PBS לפני ההדמיה.
  5. בלוח הבקרה, לשים סימן ביקורת לצד "הארה". בחר "חשיפה אוטומטית", כך זמן החשיפה לדימות יהיה מותאם על ידי תוכנת הדמיה החיה שמבוססת על עוצמת פליטת האור.
  6. בחר "C" מתוך "מבט שדה" הרשימה הנפתחת. בחר באפשרות "סרוק אמצע הטווח" לתת את התוכנה לקבוע מרחק המוקד. לשים סימון ליד שכבת העל.
  7. לחץ "לרכוש" כדי ללכוד את התמונה. בתיבה "ערוך תמונה לייבל", לחץ על "אישור"; "חלון תמונה" ו "Palette אגרה" יופיע.
  8. גדר פרמטרי ROI האוטומטי עבור בחירה אוטומטית.
  9. לכמת את עוצמת פליטת האור כיחידות הארה יחסית (RLUs) ולהציג את פליטת האור בקנה מידה בצבעים מלאכותיים החל ורוד (האינטנסיבי ביותר) לכחול (אינטנסיבי לפחות) 19, 20.
  10. חשבתי את שבריר ההישרדות של חיידקי כוויות עכבר על משתנה נקודות זמן המבוססת על ניתוח עוצם פליטת אור. שבר ההישרדות של חיידקים בנקודת זמן נתונה = עוצמת פליטת האור נמדדה באותה נקודת הזמן / עוצמת פליטת האור נמדדה ממש לפני חשיפת ABL 17.

5. המתת חסד של עכברים

  1. את נקודות הקצה של הניסוי הם כדלקמן: (א) ברזולוציה של הזיהום כפי שמעיד הפסד של פליטת אור כפי שנקבע על ידי הדמיה; (ב) התרחשות של זיהומים שיטתיים כפי שצוין על ידי ההתפשטות של פליטת אור מחוץ שרפה הםא; (ג) אובדן משקל גוף ≥15% בהשוואה לעכברים רגילים לפי גילים, או הסובלים מכאב ומצוקה כפי שצוין על ידי חוסר היענות גירוי ידני, חוסר תנועה, חוסר יכולת לאכול או לשתות. במהלך המחקר, אם אנו נתקלים במצב שבו אנחנו לא בטוחים אם עכבר במלואו הגיע למעמד של גוססת, כפי שתואר על ידי ההגדרה שלנו, ו / או איננו בטוחים אם אנחנו צריכים להרדים אותו, נפנינו צוות וטרינרי CCM עבור תוכנית פעולה; (ד) אחרת העכברים יהיו מורדם 30 ימים לאחר תחילת המחקר.
  2. מקם מחדש את העכברים לתוך כלובים סגורים במיוחד עבור המתת חסד להרדים את העכברים ידי אספקת פחמן דו חמצני (CO 2) גז דחוס לתוך הכלובים.
    1. פתח את רגולטור טנק או שסתום CO 2 ליזום את זרימת הגז. ודא כי הרגולטור קורא את psi הנכונה (פאונד לאינץ 'מרובע) מבוסס על הוראות שפורסמו על ידי היחיד, ולהתאים מחדשgulator אל psi הנכון לפי הצורך, בדרך כלל לא יותר מ 5 psi.
    2. מלאו לאט. קצב הזרימה צריך לתפוס לא יותר מ 30% של נפח תא / כלוב לדקה (עבור כלוב עכבר טיפוסי, ~ 2 L / min; עבור כלוב חולדה, ~ 7.5 L / min).
    3. יש להמתין כ 3-5 דקות על החיה להפסיק לזוז או לנשום; צריכות להיות קבועות ומורחבות העיניים. בטל טנק CO 2 או שסתום הרגולטור כדי לעצור את זרימת CO 2.
    4. ודא כי הלב חדל לפעום ידי מרגיש את החזה בין האגודל לאצבע. ודא כי אין רפלקס מצמוץ ידי נגיעת גלגל העין.
      1. אם יש דופק או רפלקס מצמוץ, לחזור על תהליך מתת החסד או להשתמש במספריים כדי לפתוח את בית החזה כדי ליצור pneumothorax (החיה חייבת להיות ללא תגובה קמצוץ בוהן לפני ביצוע הליך זה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זן א baumannii כי השתמשנו הוא לבודד קליני MDR, כפי שדווח בעבר 12, 17. זן החיידקים נעשה bioluminescent ידי transfection של אופרת luxCDABE 11. האיור 1 א מציג את תמונות ההארה הרצופות חיידקים מכל עכבר נציג לשרוף נגועות עם 5 x 10 6 א baumannii חשופים חשיפת ABL יחידה 24 שעות לאחר חיסון חיידקים. מגרם-כתם של הסעיף היסטולוגית של עור עכבר נציג לשרוף דגימה (שנקטפה ב 24 שעות לאחר חיסון) הפגין הנוכחות של biofilms א baumannii על פני השטח של הכווייה הנגועה (האיור 1B). כפי שניתן לראות בתרשים 1 א, הארת החיידקים מוגרה כמעט אחרי חשיפה של 360 J / cm 2 ABL נמסרה (60 דקות של קרינה בביתirradiance של 100 mW / cm 2). איור 1C הוא עקום מנת התגובה של הארת חיידקי ממוצע מכוויות עכבר נגוע 5 x 10 6 א baumannii ומטופלים עם ABL ב 24 שעות לאחר חיסון חיידקים (n = 10). כדי להשיג 3-log 10 איון של baumannii א כוויות העכבר, כ 360 J / cm 2 ABL נדרשה. הארת החיידקים של העכבר שורף שלא נחשף עד ABL נותר כמעט ללא שינוי במהלך תקופה מקבילה של זמן (מידע לא מוצג; P <0.001).

איור 1
איור 1: ABL איון של חיידקים מאשרום עכבר ברנס. (א) תמונות הארת חיידקי רצופים מתוך עכבר נציג לשרוף נגועות 5 x 10 6 CFU של baumannii א ו חשוף 360 J / cm 2 ABL ב 24שעות לאחר חיסון חיידקים. (ב) גראם מוכתם בסעיף היסטולוגית של כווייה בעור עכבר נציג מראה את הנוכחות של biofilms baumannii א (חיצים) ב כוויית העכבר. מדגם העור היה לקצור ב 24 שעות לאחר חיסון חיידקים. (ג) עקום מנה-תגובה של הארת חיידקי ממוצע של עכבר כוויות נגוע 5 x 10 6 א baumannii ומטופלים עם חשיפה של 360 J / cm 2 ABL ב 24 h (n = 10) לאחר חיסון חיידקים. ברים: סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ABL היא שיטה חדשנית לטיפול בזיהומים. מאז מנגנון הפעולה שלה שונה לחלוטין מזו של כימותרפיה, זה יותר של פיזיותרפיה. הסוכן המתווך את ההשפעה מיקרוביאלית הוא הקרנת אור כחול (400-470 ננומטר). עם ההתפתחות של נוריות כחולות, רכשנו גישת גישה מיקרוביאלית מבוסס אור יעילה ופשוט עבור זיהומי MDR.

בפרוטוקול זה, שתיארנו את התפתחות מודל העכבר של זיהומים כוויה הנגרמת על ידי זן bioluminescent של MDR, baumannii א. עם שימוש בחיידקים bioluminescent, היקף הזיהום יכול להיות פולשני במעקב בזמן אמת לחיות חיים באמצעות הדמיה bioluminescent. השימוש זנים מהונדסים bioluminescent של חיידקים ואת טכניקת הדמיה בתאורה חלשה יוצר טכניקה יעילה לניטור זיהומים בזמן אמת במהלך טיפול אנטי-מיקרוביאלי. שיטה זו יכולה לשמש גם בחקירות של זיהומיםנגרם על ידי מינים של חיידקים אחרים הממוקמים באתרים אחרים. מלבד הערכה היעילות של גישות אנטי-מיקרוביאלית, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לעקוב אחר ההתקדמות של זיהום.

באמצעות מודל העכבר הזה, הראינו כי ABL (415 ננומטר) מומת חיידקים בהצלחה זיהומים הוקמו (איור 1A ו- C). לפני טיפול ABL, אשכולות של חיידקים נצפו זיהומים הוקמה (איור 1B), אשר היא תכונה של biofilms. Biofilms סובלני יותר של אנטיביוטיקה מסורתית מארח הגנה לעומת עמיתיהם פלנקטוניים שלהם 6, 7 ו קשור לעתים קרובות עם זיהומים מתמשכים 8, 9. תוצאות הנציגים מבטיחות כי ABL 415 ננומטר הוא ביופילם חודר. בנוסף, יחד עם דיווחים קודמים 29,30, 31, 32, התוצאות שלנו מראות כי האפקטיבי של ABL נמשכת ללא קשר לפרופיל של חיידקים לתרופות התנגדות.

הפרוטוקול המתואר כאן כרוך שלושה ניתוחים עיקריים: (1) פיתוח של מודל עכבר של זיהומי כווייה, (2) טיפול ABL, ו (3) הדמית פליטת אור. תוך פיתוח מודל עכבר של זיהומי כווייה, שציינו כי היו כמה גורמים המשפיעים על מידת זיהום ואת האפקטיביות הבאות של ABL: (1) שעת השריפה משפיעה על עומק פצע ואת ההתפשטות של חיידקים. כאשר הזמן הבוער הוגדל מ 3 עד 7 ים, הארת החיידקים הייתה הרבה יותר חזקה (מה שמעיד על מידה גבוהה של זיהום) בשעת 24 שעות לאחר חיסון, לבין מיגור הזיהום נדרש הרבה יותר גבוהות חשיפות ABL (> 360 J / cm 2 ). (2) הבידוד של החיידקים הוא פרמטר מרכזי עבור o הפיתוחזיהומי F. בידוד חיידקים גבוה בדרך כלל תוצאה היא במידה גבוהה של זיהום, בעוד בידוד נמוך דיה נכשל לעתים קרובות לפתח זיהומים יציבים בעכברים. בשנת "במים", הארת חיידקי בדרך כלל הופכת לגילוי מוקדם לאחר חיסון חיידקים. (3) האינטראקציה בין חיידקים ומארחים תלוי מהחיידקים. אנחנו גם בשימוש פ aeruginosa לפתח מודל זיהום. מצאנו כי, באותם תנאים (כלומר, שריפת זמן בידוד חיידקים), הזיהומים הנגרמים על ידי פ aeruginosa התקדמו הרבה יותר מהר מאשר זיהומי baumannii א, ו ספסיס תמיד נצפה בעכברים תוך 48 שעות לאחר החיסון 25.

לביצוע טיפול ABL, ישנם מספר נקודות חשובות שיש צורך לטפל: (1) וקרינת אור פרופר נדרש ליעילות מרבית של הטיפול ABL. (2) משטח של כוויה בעכברים יםhould יוצב ככל אופקי ככל האפשר. כישלון כדי למקם את שטח הכווייה כראוי יכול להתפשר את היעילות של טיפול ABL. (3) במהלך חשיפה לאור, הוא הציע כי העיניים של עכברים להיות מוגן עם רדיד אלומיניום, במיוחד כאשר לייזר משמש כמקור האור. (4) במהלך חשיפה לאור, יש להקפיד לפקח על עכברים במקרה שהם להתעורר מההרדמה. במקרה זה, מנה קטנה נוספת של הרדמה צריכה להיות מנוהלת על מנת לשמור על החיות המורדמות. (5) שני ABL שטופל עכברי עכברים שלא טופלו צריכים להיות ממוקמים על מצע חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף כאשר תחת הרדמה. במהלך התהליך של הדמית פליטת אור, פליטת האור של חיידקים עלולה להקטין כאשר הכוויות להיות יבשות. לכן, מומלץ לחות כוויות העכבר עם PBS לפני ההדמיה.

ישנם גם מספר מגבלות של טכניקות דנו בפרוטוקול זה: (1) לצורך ניטור של exteNT של זיהום בזמן אמת, זני חיידקים bioluminescent חייב לשמש. לכן, לפני זן קליני ניתן לבדוק במודל חיה, זה חייב להיות מהונדסים גנטית על ידי transfection של לוקס CDABE operon 11. (2) היעילות של ABL קשורה אורכי הגל 33 ומיני חיידקים / זני 34 בשימוש. אורכי הגל הכחול, יחד עם פרמטרים אחרים, צריך להיות מותאם יותר עבור inactivating מינים / זני חיידקים שונים. (3) חקרנו זיהומים שטחיים רק עכברים. עבור זיהומים עמוקים, המשלוח האקטואלי של ABL לא תוכל להגיע הזיהומים, כך מסירת אור הביניים עשויה להידרש 35. (4) יש מגבלת רגישות של מערכת ההדמיה, במיוחד כאשר הדמית זיהומים עמוקים 19. כתוצאה מכך, גם כאשר פיקסלים של פליטת אור בוטלו לחלוטין, עדיין ייתכן שיש viתאים חיידקיים יכולים הנותרים, המאפשר צמיחה מחדש חיידקים להתרחש. חשיפה ממושכת ל ABL מומלץ לאחר החיסול של הארת חיידקים על מנת למנוע צמיחה מחודשת חיידקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria. , https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014).
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination? J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond? Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Tags

אימונולוגיה גיליון 122 אור כחול מיקרוביאלית התנגדות multidrug, כוויה במודל של עכברים זיהום הדמיה פליטת אור
<em>In vivo</em> חקירת טיפול באור כחול אנטימיקרוביים multidrug עמידים <em>baumannii Acinetobacter</em> צרוב דלקות באמצעות הדמיה פליטת אור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang,… More

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter