Abstract
Burn-infecties blijft een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. De toenemende opkomst van multiresistente (MDR) bacteriën heeft geleid tot het veelvuldig falen van de traditionele behandelingen met antibiotica. Alternatieve therapieën zijn dringend nodig om MDR bacteriën aan te pakken.
Een innovatieve non-antibioticum aanpak heeft antimicrobiële blauw licht (ABL), veelbelovende werkzaamheid tegen MDR infecties getoond. Het werkingsmechanisme van Abl is nog niet goed begrepen. Algemeen wordt verondersteld dat natuurlijk voorkomende endogene chromoforen fotosensibiliserende in bacteriën (bijvoorbeeld ijzer-vrije porfyrinen, flavinen, etc.) worden geëxciteerd door ABL, dat op zijn beurt cytotoxische reactieve zuurstof species (ROS) door middel van een fotochemisch proces.
In tegenstelling tot andere op basis van licht antimicrobiële aanpak, antimicrobiële fotodynamische therapie (APDT), ABL therapie niet de betrokkenheid van een exogene photosensitiz vereisener. Alles wat het nodig door te voeren is het bestralen van blauw licht; daarom is eenvoudig en goedkoop. ABL receptoren zijn de endogene cellulaire fotosensibilisatoren in bacteriën, in plaats van het DNA. Aldus Abl wordt aangenomen minder genotoxisch cellen dan ultraviolet C (UVC) straling, die direct veroorzaakt DNA-schade in gastheercellen hosten.
In deze paper presenteren we een protocol om de effectiviteit van ABL therapie voor MDR Acinetobacter baumannii infecties in een muismodel van brandwonden te beoordelen. Door het gebruik van een aangelegde lichtgevende stam, waren we in staat om niet-invasieve toezicht op de omvang van de besmetting in real time in levende dieren. Deze techniek is ook een effectief instrument om de ruimtelijke verdeling van infecties bij dieren.
Introduction
Burn-infecties, die vaak worden gerapporteerd als gevolg van cutane thermische verwondingen, nog steeds een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 1 zijn. Het beheer van branden infecties is verder aangetast door de toenemende opkomst van multidrug-resistente (MDR) bacteriestammen 2 als gevolg van het massale gebruik van antibiotica. Een belangrijke MDR Gram-negatieve bacteriën is Acinetobacter baumannii, waarvan bekend is dat in verband worden gebracht met de recente strijd wonden en is bestand tegen bijna alle beschikbare antibiotica 3. De aanwezigheid van biofilms bij gewonde brandpunten gerapporteerd 4, 5 en wordt verondersteld om de tolerantie voor antibiotica en afweer 6, 7 verergeren, waardoor persistente infecties 8, 9. Daarom is er een pressing nodig hebben voor de ontwikkeling van alternatieve behandelingen. In de onlangs aangekondigde nationale strategie ter bestrijding van antibiotica-resistente bacteriën, heeft de ontwikkeling van alternatieve therapieën voor de antibiotica is genoteerd als een actie van de regering van de Verenigde Staten 10.
Light-based antimicrobiële benaderingen, zoals aangegeven door de naam, licht nodig bestraling met of zonder andere middelen. Deze benaderingen omvatten antimicrobiële fotodynamische therapie (APDT), ultraviolet-C (UVC) straling en antimicrobiële blauw licht (ABL). In eerdere studies, hebben zij veelbelovende effectiviteit getoond in het doden van MDR bacteriestammen 11, 12, 13. Van de drie licht-gebaseerde benaderingen, heeft ABL trok steeds meer aandacht in de afgelopen jaren als gevolg van de intrinsieke antibacteriële eigenschappen zonder het gebruik van fotosensitizers 14. in Comparison APDT tot, Abl betreft slechts het gebruik van licht, terwijl APDT een combinatie van licht en een fotosensibilisator vereist. Daarom abl eenvoudig en goedkoop 14. In vergelijking met UVC wordt ABL vermoedelijk veel minder cytotoxische en genotoxische aan cellen 15 hosten.
Het doel van dit protocol is om de effectiviteit van ABL voor de behandeling van brandwonden infecties veroorzaakt door MDR A. baumannii in een muismodel onderzoeken. We maken gebruik van bioluminescente pathogene bacteriën om nieuwe muismodellen van burn infecties die de niet-invasieve monitoring van de bacteriële last in real time mogelijk te ontwikkelen. Vergeleken met de traditionele methode lichaamsvloeistof / weefsel bemonstering gevolgd door platen en kolonies tellen 16, verschaft deze techniek nauwkeurige resultaten. Werkwijze weefselmonsters kunnen andere bron van experimentele fouten introduceren. Aangezien de bacteriële luminescentie-intensiteit is lineair evenredig met de Correskomstige bacteriële CFU 17, kunnen we direct de overleving van bacteriën te meten na een bepaalde dosis van lichtbestraling. Door het bewaken van het aantal bacteriën in levende dieren die het lichtbehandeling in real time, kan de kinetiek van bacteriële doding worden gekarakteriseerd met een aanzienlijk verminderd aantal muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding bacteriekweek
- Voeg 7,5 ml Brain Heart Infusion (BHI) medium in een 50 ml centrifugebuis. Zaad A. baumannii cellen in BHI medium en incubeer de A. baumannii cultuur in een orbitale incubator (37 ° C) gedurende 18 uur.
- Centrifugeer de kweek van cellen bij 3500 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en was de pellets in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Resuspendeer de bacteriën pellets in vers PBS en grondig pipet de schorsing.
- Verzamel 100 pi bacteriesuspensie en een 1:10 verdunning met verse PBS.
- Breng de verdunning tot een 1,5 ml semi-micro cuvette en meet de optische dichtheid (OD) bij een golflengte van 600 nm (OD 600 nm).
- Bereken de OD 600 nm van de oorspronkelijke (onverdunde) gesuspendeerd in PBS volgens de OD 600 nm gemeten waarde van de verdunning en de verdunningsfactor (10).
- Pas the oorspronkelijke suspensie in PBS tot OD600 nm = 0,6 (overeenkomend met een celdichtheid van 10 8 CFU / ml).
2. muismodel van Burn infectie veroorzaakt door Bioluminescent A. baumannii
- Gebruik volwassen vrouwelijke BALB / c muizen 7-8 weken oud en een gewicht van 17-19 g. Laat de muizen om te acclimatiseren aan laboratoriumomstandigheden gedurende ten minste 3 dagen voor de start van het experiment. Handhaaf de muizen in een 12 uur licht / donker cyclus onder een kamertemperatuur van 21 ℃ en hen voedsel en water ad libitum.
- Verdoven de muizen een intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Licht de palpebra van elke muis met een wattenstaafje te raken; afwezigheid van de ooglidreflex stelt een geschikte verdoving diepte. Bedek de muis ogen met dierenarts zalf voor de ogen tegen uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen.
- Scheer de muizen op de rug om zoveel mogelijk huid bloot door een 50-blade tondeuse.
- Plaats het deksel van een 35 mm petrischaal onder de buik van de muizen om hun rug in een relatief horizontale positie te houden.
- Kook water in een beker van 250 ml (80 vol%) met een 10" x 10" , 220 VAC kookplaat. Dompel een koperen blok (1 cm x 1 cm doorsnede) in het bekerglas totdat thermisch evenwicht met het water wordt bereikt. Thermisch evenwicht duurt meestal <5 min en wordt aangegeven door het opnieuw koken van het water in het bekerglas.
- Voorafgaand aan het creëren van de brandwonden, bestuurt preëmptieve analgetica (een subcutane injectie van 0,1 mg / kg buprenorfine) voor pijnbestrijding.
- Tien minuten na de pre-emptieve analgetica, druk de verwarmde koperen blok aan het geschoren gebied op de rug van de muizen gedurende 7 s op brandwonden veroorzaken.
OPMERKING: Om thermische verwonding aan het werkende personeel te voorkomen, draagt warmte-resistente handschoenen bij het uitvoeren van de brandende procedure. - Toedienen 0,5 ml steriele zoutoplossing tot subcutaneous injectie om uitdroging te voorkomen.
- Vijf minuten na de inductie van thermische verwonding, enten 50 pl bacteriële suspensie die 5 x 10 6 CFU in PBS op de muis brandt met een pipet. Door het bewegen van een steriel wattenstaafje in een zigzag beweging op de huid smeren de aliquots van de brandwonden aan de bacteriële cellen in het verbrande gebied zo gelijkmatig mogelijk te verdelen.
- Onmiddellijk na bacteriële inoculatie verrichten bioluminescentie de geïnfecteerde brandwonden, zoals beschreven in Sectie 4.
- Plaats de muizen op een waterverwarming operatiebed (37 ° C, herstelgebied) totdat de muizen volledig hersteld zijn van de verdoving. Huis van de muizen met een maximum van 5 per kooi in een Biosafety Level 2-dierkamer.
- Dienen analgetica (subcutane injectie van 0,1 mg / kg buprenorfine) tweemaal per dag gedurende de eerste drie dagen na de brandwond.
3. Antimicrobiële Blue Light therapie voor A. & #160; baumannii Infectie in Muizen
- Begin ABL therapie na 24 uur na bacteriële inoculatie.
- Gebruik een lichtdiode (LED) en een maximale emissie bij 415 nm voor ABL bestraling. Mount de LED op een koellichaam van thermische effecten op het bestraalde gebied bij muizen 18 te voorkomen. Bevestig de LED optische draagstang met klem aansluitingen zodat de LED omhoog en omlaag.
- Schakel de stroom / energie meter en druk op de golflengte knop tot 415 nm te selecteren. Reset de kracht / energie meter op de achtergrond (omgevingslicht) af te trekken.
- Plaats de kracht / energie meter net onder de LED. Draag blue-light-veiligheidsbril. Zet de LED en de afstand tussen de LED opening (een lens die het licht convergeert door de LED) en de lichtsensor (2 cm diameter) van de stroom / energiemeter passen zodat de lichtvlek bestrijkt het hele gebied van de lichtsensor.
- Zorgvuldig tunen van de LED-driver en noteer de lezing van de power / energiemeter. Bereken de straling volgens de lezing Bestralingssterkte = Reading (W) / oppervlakte (cm2). Pas de bestraling van de LED tot 100 mW / cm2 door het afstemmen van de LED-driver.
- Schakel de LED. Meet de afstand tussen de LED diafragma en de lichtsensor van de kracht / energiemeter.
- Verdoven de muizen een intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Afwezigheid van de ooglidreflex stelt een geschikte verdoving diepte.
- Willekeurig verdelen de muizen in een abl-behandelde groep (n = 10) en een onbehandelde controlegroep (n = 10).
- Voor het Abl-behandelde groep, betrekking op de ogen van muizen met aluminiumfolie om overmatige blootstelling aan licht te vermijden. Plaats de muis brandwonden direct onder de LED, waarbij het deksel van een 35-mm petrischaal onder de muis buik om de rug in een horizontale positie te houden.
- Vervang in stap 3.5 genoemd met een muis vermogen / energiemeter op een vierkante petri dish. De hoogte van de muis naar een stand waarin de afstand tussen de LED opening en het oppervlak van de muis branden is gelijk aan die tussen de LED opening en het niveau van de lichtsensor van de kracht / energiemeter (zoals besproken in stap 3.5).
- Bestraal het geïnfecteerde brandwonden bij een stralingsintensiteit van 100 mW / cm2. Abl leveren in doses van 72 J / cm2, tot een totale dosis van 360 J / cm2 wordt bereikt (bijvoorbeeld 0, 72, 144, 216, 288 en 360 J / cm2). Na elke dosis licht, voeren bioluminescentie voor muizen, zoals besproken in sectie 4.
- Voor de onbehandelde controlegroep, voeren bioluminescentie van de muis brandwonden, zoals besproken in sectie 4, met dezelfde tijdsintervallen als voor de Abl-behandelde groep.
- Vóór het herstel van de muizen, plaats de muizen op het water verwarmd chirurgische bed om warmteverlies en onderkoeling te voorkomen. Let op de activiteit en de ooglidreflex van de muizen tot herstel. na the herstel van de muizen, te huisvesten 2-3 per kooi.
- Na abl therapie voeren bioluminescentie, zoals besproken in sectie 4, dagelijks gedurende de eerste 3 dagen en daarna de andere dag aanwezig om de biologische last van infecties bij muizen te volgen.
4. Bioluminescentie beeldvorming van infecties bij muizen
- Afbeelding muizen met een lage licht beeldvormingssysteem dat een geïntensiveerde charge-coupled device camera, een camera controller, een monsterkamer en een beeldprocessor 19 omvat.
- Verdoven de muizen een intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Licht de palpebrale van de muizen met een wattenstaafje raken; afwezigheid van de ooglidreflex stelt een geschikte verdoving diepte.
- Start de live-imaging software. In het bedieningspaneel dat wordt weergegeven op initialiseren. Wacht tot de kleur van de widget Temperatuur groen, wat aangeeft dat de temperatuur van het podiumin de monsterkamer bereikt 37 ° C.
- Plaats de muizen op het werkvlak (37 ° C) in de monsterkamer van het beeldvormingssysteem, waarbij de geïnfecteerde brandwonden direct onder de camera.
LET OP: De bioluminescentie van de bacteriën kan afnemen wanneer de brandwonden droog. Daarom is het raadzaam om de muis brandt met PBS hydrateren voor de beeldvorming. - In het bedieningspaneel zet een vinkje naast "Luminescentie". Kies "Automatische belichting", zodat de belichtingstijd voor de beeldvorming zal worden geoptimaliseerd door de live-imaging software op basis van de bioluminescentie intensiteit.
- Selecteer "C" van het "Field of View" drop-down lijst. Selecteer de optie "Scan mid range" te laten de software bepalen de brandpuntsafstand. Zet een vinkje naast Overlay.
- Klik op "Ophalen" om het beeld vast te leggen. In het vak "Edit Image Label", klik op "OK"; een "Afbeelding Window" en "Toll Palette" zal verschijnen.
- Stel Auto ROI parameters voor auto-selectie.
- Kwantificeren bioluminescentie intensiteit als relatieve luminescentie-eenheden (RLU's) en bioluminescentie geven in een kunstmatig gekleurde schaal van roze (meest intense) naar blauw (minst intense) 19 20.
- Bereken het voortbestaan fractie van de bacteriën in de muis brandwonden op verschillende tijdstippen op basis van bioluminescentie intensiteit analyse. De overlevingsfractie bacteriën op een bepaald tijdstip = de bioluminescentie intensiteit gemeten op dat tijdstip / de bioluminescentie intensiteit gemeten vlak voor ABl 17 belichting.
5. Euthanasie van Muizen
- De eindpunten van het experiment zijn als volgt: (a) de behandeling van de infectie zoals aangetoond door het verlies van bioluminescentie zoals bepaald door beeldvorming; (B) aanwezigheid van systematische infecties zoals aangegeven door de verspreiding van bioluminescentie buiten de gebrande zijneen; (C) verlies van ≥15% lichaamsgewicht in vergelijking met normale muizen van dezelfde leeftijd, of lijdt aan pijn en angst zoals aangegeven door het gebrek aan respons op handmatige stimulatie, immobiliteit, een onvermogen om te eten of te drinken. Tijdens het onderzoek, als we geconfronteerd met een situatie waarin we niet zeker weet of een muis volledig de status van stervende heeft bereikt, zoals die door onze definitie, en / of we zijn niet zeker of we nodig hebben om het te laten inslapen, nemen we contact met een CCM veterinair personeel voor een plan van aanpak; (D) anders de muizen worden gedood 30 dagen na het begin van de studie.
- Verplaats de muizen in gesloten kooien speciaal voor euthanasie en euthanaseren de muizen door het leveren van kooldioxide (CO2) samengeperst gas in de kooien.
- Open de CO 2 tank of klep regulator om de gasstroom te leiden. Controleert de regelaar leest de correcte psi (pound per vierkante inch) op basis van instructies die door de eenheid en pas de regulator de correcte psi indien nodig, meestal niet hoger dan 5 psi.
- Vul langzaam. De stroomsnelheid moet verplaatsen ten hoogste 30% van de volumekamer / kooi per minuut (voor een typische muizenkooi, ~ 2 L / min voor een rattenkooi, ~ 7,5 l / min).
- Wacht ongeveer 3-5 minuten om het dier te stoppen met bewegen of ademen; de ogen moet worden vastgesteld en verwijde. Zet CO2 tank of regelklep om de stroming van CO2 stopt.
- Zorg ervoor dat het hart niet klopt door het gevoel van de borst, tussen de duim en wijsvinger. Zorg ervoor dat er geen knipperreflex door het aanraken van de oogbol.
- Als er een hartslag of knipperreflex, herhaalt u de euthanasie proces of gebruik schaar om de borstholte te openen om een pneumothorax (het dier moet niet reageren op een teen knijpen voorafgaand aan het uitvoeren van deze procedure zijn) te creëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A. baumannii stam die we gebruikten een MDR klinische isolaat, zoals eerder 12, 17 gemeld. De bacteriële stam werd bioluminescente gemaakt door transfectie van luxCDABE opera 11. Figuur 1A toont de opeenvolgende bacterieel luminescentie beelden van een representatieve muis branden geïnfecteerd met 5 x 10 6 A. baumannii en blootgesteld aan één blootstelling Abl 24 uur na bacteriële inoculatie. Een Gram-kleuring van histologische doorsnede van een representatieve muis brandwonden specimen (geoogst op 24 uur na inoculatie) toonde de aanwezigheid van A. baumannii biofilms op het oppervlak van de geïnfecteerde brandwonden (Figuur 1B). Zoals getoond in figuur 1A, werd de bacteriële luminescentie bijna uitgeroeid na een blootstelling van 360 J / cm2 abl werd opgeleverd (60 min bestraling bijeen stralingsintensiteit van 100 mW / cm2). Figuur 1C is de dosis-responscurve van de gemiddelde bacterieel luminescentie van muizen brandwonden geïnfecteerd met 5 x 10 6 A. baumannii en met Abl 24 uur na bacteriële inoculatie (n = 10). Te komen tot een 3-log inactivatie van 10 A. baumannii in muizen brandwonden ongeveer 360 J / cm2 was vereist ABl. De bacteriële luminescentie van de muis met brandwonden onbelichte ABL bleef vrijwel onveranderd gedurende een even lange tijd (gegevens niet getoond; p <0,001).
Figuur 1: ABL Inactivering van bacteriën in geïnfecteerde muis Burns. (A) Opeenvolgende bacterieel luminescentie beelden van een representatieve muis brandwond geïnfecteerd met 5 x 10 6 CFU A. baumannii en blootgesteld aan 360 J / cm2 bij 24 ABLuur na bacteriële inoculatie. (B) Gram-gekleurde histologische doorsnede van een representatieve muizenhuid brandwond toont de aanwezigheid van A. baumannii biofilms (pijlen) in de muis branden. De huid monster werd geoogst op 24 uur na bacteriële inoculatie. (C) Dosis-respons curve van de gemiddelde bacterieel luminescentie van muis brandwonden geïnfecteerd met 5 x 10 6 A. baumannii en behandeld met een blootstelling van 360 J / cm2 Abl na 24 uur (n = 10) na bacteriële inoculatie. Bars: standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
abl is een nieuwe werkwijze voor het behandelen van infecties. Omdat het werkingsmechanisme is volledig verschillend van die van de chemotherapie, het is meer een fysiotherapie. Het middel dat het antimicrobiële effect medieert is bestraling met blauw licht (400-470 nm). Met de ontwikkeling van blauwe LED's, kregen we toegang tot een effectieve en eenvoudige licht gebaseerde antimicrobiële aanpak voor MDR infecties.
In dit protocol hebben we beschreven de ontwikkeling van een muismodel van burn infecties veroorzaakt door een lichtgevende stam van MDR, A. baumannii. Met het gebruik van bioluminescente bacteriën, kan de mate van infectie niet-invasief bewaakt in real time in levende dieren via bioluminescentie beeldvorming. Het gebruik van technisch bioluminescente bacteriestammen en weinig licht beeldvormende techniek leidt tot een efficiënte techniek voor het monitoren van infecties in real-time tijdens antimicrobiële therapie. Deze werkwijze kan ook worden toegepast bij de onderzoeken van infectiesveroorzaakt door andere microbiële soort en zich op andere sites. Behalve de beoordeling van de effectiviteit van antimicrobiële benaderingen, kan deze werkwijze ook worden gebruikt om de voortgang van de infectie te volgen.
Via dit muismodel, we aangetoond dat Abl (415 nm) succesvol geïnactiveerde bacteriën in gevestigde infecties (Figuur 1 A en C). Vóór abl therapie clusters van bacteriën werden waargenomen in de gevestigde infecties (figuur 1B), die een kenmerk van biofilms. Biofilms zijn meer tolerant ten opzichte van traditionele antibiotica en afweer in vergelijking met hun planktonische tegenhangers 6, 7 en worden vaak geassocieerd met hardnekkige infecties 8, 9. De representatieve resultaten zijn veelbelovend in dat 415-nm ABL-biofilm doordringend. Bovendien, samen met eerdere rapporten 29,30, 31, 32, onze resultaten tonen aan dat de effectiviteit van ABL blijft, ongeacht de drug-resistentie profiel van bacteriën.
De hier beschreven protocol omvat drie werkwijzen: (1) de ontwikkeling van een muismodel burn infecties, (2) ABl therapie, en (3) bioluminescentie. Bij de ontwikkeling van een muismodel van burn-infecties, we vast dat er verschillende factoren die invloed hebben op de omvang van de infectie en de daaropvolgende effectiviteit van ABL: (1) De brandtijd van invloed op de wond diepte en de verspreiding van bacteriën. Wanneer de brandduur werd verhoogd 3-7, zal de bacteriële luminescentie was veel sterker (hetgeen een hogere mate van infectie) bij 24 uur na inoculatie en het uitroeien van infectie vereist veel hogere Abl blootstelling (> 360 J / cm2 ). (2) De entstof van de bacteriën is een belangrijke parameter voor de ontwikkeling of infecties. Een hogere bacterieel inoculum leidt gewoonlijk tot een hogere mate van infectie, terwijl een voldoende lage inoculum vaak niet stabiel infecties bij muizen ontwikkelen. In deze laatste voorwaarde bacterieel luminescentie wordt gewoonlijk niet waarneembare snel na bacteriële inoculatie. (3) De interactie tussen bacteriën en gastheer is afhankelijk van de bacteriële soorten. Wij gebruikten ook P. aeruginosa tot een infectie model te ontwikkelen. We vonden dat, onder dezelfde omstandigheden (dwz brandduur en bacterieel inoculum), infecties veroorzaakt door P. aeruginosa vorderde veel sneller dan A. baumannii infecties en sepsis werd altijd in muizen waargenomen binnen 48 uur na inoculatie 25.
Voor de uitvoering van ABL therapie, er een aantal belangrijke punten die moeten worden aangepakt: (1) Juiste licht straling nodig voor het maximaliseren van de effectiviteit ABL therapie. (2) Het oppervlak van de verbranding in de muizen should als horizontaal worden geplaatst mogelijk. Een gebrek aan de juiste wijze de positie van de burn oppervlak kan de effectiviteit van ABL therapie in gevaar brengen. (3) Bij belichting wordt voorgesteld dat de ogen van muizen beschermd met aluminiumfolie, vooral wanneer een laser wordt gebruikt als lichtbron. (4) Bij belichting, moet erop worden gelet dat de muizen indien zij ontwaken uit de anesthesie te volgen. In dit geval moet een kleine extra dosis verdovingsmiddelen worden toegediend aan de dieren verdoofd te houden. (5) zowel ABL-behandelde muizen en onbehandelde muizen moeten op een verwarmingsplaat bed worden geplaatst om de lichaamstemperatuur te handhaven wanneer het onder narcose. Tijdens het proces van bioluminescentie, kunnen de bioluminescentie bacteriën verminderen wanneer de verbranding droog. Daarom is het raadzaam om de muis brandt met PBS hydrateren voor de beeldvorming.
Er zijn ook enkele beperkingen van de technieken die in dit protocol: (1) Voor de monitoring van de extent van de infectie in real time, moet bioluminescent bacteriestammen worden gebruikt. Daarom, voordat een klinische stam kan worden getest in het diermodel, moet worden genetisch gemodificeerd door de transfectie van de lux operon CDABE 11. (2) De doeltreffendheid van ABL houdt verband met de golflengten 33 en bacteriële species / stammen 34 gebruikt. De blauwe golflengte, samen met andere parameters verder worden geoptimaliseerd voor het inactiveren van verschillende bacteriële species / stammen. (3) We onderzochten slechts oppervlakkige infecties bij muizen. Voor diepliggende infecties kan de topische afgifte van Abl niet in staat infecties komen, zodat interstitiële lichtafgifte nodig zijn 35. (4) Er is een beperking gevoeligheid van het beeldvormingssysteem, vooral wanneer het afbeelden diepe infecties 19. Dientengevolge, zelfs wanneer de pixels van bioluminescentie volledig worden geëlimineerd, kunnen er nog VIkunnen bacteriecellen resterende, waardoor bacteriële hergroei plaatsvinden. Een langdurige blootstelling aan ABL wordt aanbevolen na de eliminatie van bacteriële luminescentie om bacteriële hergroei te voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1x Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
References
- Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
- Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
- Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
- Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
- Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
- Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
- Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
- National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria. , https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014).
- Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
- Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
- Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination? J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
- Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond? Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
- Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
- Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
- Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
- Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
- Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
- Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
- Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
- Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
- Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
- Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
- Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
- Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
- Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
- Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
- Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
- Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
- Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
- Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).
